專利名稱：：茶多酚的用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及茶多酚或其溶劑化物在制備用于治療人結直腸腫瘤藥物中的用途。二
背景技術：
：茶多酚Teapolyhenols是從茶葉中提取，包括黃垸醇類、羥基-[4]-黃烷醇類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類等。其中以兒茶素(Catechin，屬黃垸醇類)最為重要，約占多酚類總量的60-80%;兒茶素類主要由GEC、D，L-C、EC、沒食子酸酯EGCG、GCG、ECG等幾種單體組成。兒茶素類化合物因多含酚性羥基，故極易發(fā)生氧化，聚合，縮合等變化，決定其具有較好的抗氧化能力和清除自由基的能力。其抗氧化能力是人工合成抗氧化劑BHT、BHA的4-6倍，是VE的6-7倍，VC的5-10倍，且用量少0.01-0.03%即可起作用，而無合成物的潛在毒副作用；兒茶素對食品中的色素和維生素類有保護作用，使食品在較長時間內保持原有色澤與營養(yǎng)水平，能有效防止食品、食用油類的哈敗，并能消除異味。目前應用包括1.油脂抗氧化劑其功效優(yōu)于維他命e及人工合成bha,bht。2.自由基清除劑可保護細胞膜,減緩人體老化、抗衰老。3.色素保護劑防止天然食品著色劑的降解退色，效果比維他命C高。4.天然除臭劑日本人用兒茶素對豬、雞及人體實驗,服用兒茶素二周后，糞便臭味顯著減輕。5.抗菌、抗病毒及改變人體腸內微生物分布相中國及俄羅斯，有以茶汁治療痢疾的紀錄。日本有以兒茶素提煉治療陰部皮膚黏膜之皮膚病。6.防止感冒經實驗結果茶中的多酚類對流行性感冒病毒〈influenzavirus〉有極強的不活化作用。7.防齲齒，臨床證明兒茶素類可減少菌斑及牙周指數。在醫(yī)藥上的作用在過去十年中，已發(fā)表了數百篇論文和大量的基礎研究均表明了茶多酚對下列疾病有明顯的防治效果降血壓、抗血凝、降血脂、減肥、防治動脈粥樣硬化和血栓形成等心血管病、降血糖、防治糖尿病、殺菌抗病毒；防治胃腸道、呼吸道、流感等疾病；防治肝炎、脂肪肝、抗衰老和增強免疫機能；抑制血壓上升根據人體實驗,每天攝取500毫克兒茶素類,經三個月測定其飲食前后之血壓，發(fā)現舒張壓與收縮壓均明顯降低。也有抗高血脂、抗心血管疾病、清除自由基及除臭等作用。健齒、防治牙周炎、防齲、消臭解毒等療效。可以作為上述疾病患者的輔助藥品和保健藥品的原料。但未見用于治療人結直腸腫瘤的報導。三
發(fā)明內容本發(fā)明目的是提出一種茶多酚或其溶劑化物在制備用于治療人結直腸腫瘤藥物中的用途。本發(fā)明的技術解決方案是茶多酚或其溶劑化物在制備用于治療人結直腸腫瘤藥物中的用途。本發(fā)明的茶葉提取物——茶多酚用普通的賦形劑、稀釋劑或載體配制，并壓制成片，或配制成便于口服或肌肉或靜脈內給藥的藥劑或溶液劑。還可經皮施用，并可以用腸溶包衣成援釋劑型等，如口服給藥劑型、注射給藥劑型、粘膜給藥劑型或經皮給藥劑型，即片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液、注射液、貼劑或凝膠劑形式。適于這些配方的賦形劑、稀釋劑和載體包括下列物質填充劑和增量劑如淀粉、蔗糖、甘露醇以及硅衍生物；粘合劑如羧甲基纖維素和其它纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠、和聚乙烯吡咯垸酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如羧甲基淀粉鈉、聚乙烯聚吡咯烷酮、低取代羥丙基纖維素等；溶解抑制劑如石蠟；助溶促進劑如季胺化合物；表面活性劑如十六垸醇、單硬脂酸甘油酯、吸附載體如高嶺土和膨潤土；以及潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂和微粉硅膠。本發(fā)明的茶多酚也可配制成適于肌肉、皮下或靜脈內途徑施用的溶液劑。此外，本發(fā)明的化合物非常適于作為緩釋劑型。這些制劑可以適當組成，以使它們能在一段時間內只釋放活性成分或者優(yōu)選在腸道特定部分釋放活性成分。根據本發(fā)明，具體劑量，將依據病情的嚴重程度、施藥途徑和相關因素決定，這由主治醫(yī)生確定。一般，可接受的和有效的每日劑量從約10至200mg/天，且更常見的是從30至120mg/天。將上述劑量給需要治療的患者每天施用一次至三次或者按需要采用緩控釋制劑或注射液進行治療。本發(fā)明使用錯配修復基因MSH2基因缺失的Lovo細胞作為研究對象，在使用不同劑量的茶多酚對Lovo細胞治療研究中發(fā)現，茶多酚在150mg/ral劑量即對Lovo產生80-90%以上的抑制率，隨著劑量的增加并不能增加其抑制效果，而對于錯配修復基因表達正常的SW480細胞其抑制效果較差，而且其呈現劑量與增殖抑制的正相關關系，與Lovo細胞的增殖曲線不同，提示茶多酚對于Lovo細胞的抑制作用。本發(fā)明尤其是適用于微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)結直腸癌的治療，其機制是微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)結直腸癌是由于錯配修復基因突變導致的結直腸癌，約占結直腸癌20-30%,MSI結直腸癌分子病理學特點是由于錯配修復基因表達缺失、導致DNA復制錯誤增加、MSI而導致結直腸癌。本發(fā)明發(fā)現使用茶多酚可以特異性的錯配修復基因表達缺失的結直腸癌細胞株。四圖1是茶多酚對SW480和Lovo細胞增殖抑制率曲線圖2是茶多酚處理結腸造口的結腸癌原位移植模型的腫瘤生長曲線五具體實施例方式(一)實施材料與方法1、細胞株Lovo細胞(hMSH2缺失結腸癌細胞株)、SW480細胞(錯配修復基因正常的結腸癌細胞株)購自南京中醫(yī)藥大學細胞庫。2、茶多酚制備茶多酚購自杭州茶葉有限公司，以蒸餾水配置成50mg/ml的溶液，滅菌后備用。3、MTT檢測(活細胞數量Promega經典的細胞增殖檢測方法)測定細胞增殖抑制和MSI檢測按MTT檢測，每個劑量3個重復，茶多酚溶液共0、50、100、150、200、250和300ng/mL8個劑量，設計空白對照一個，分別于24小時、72小時和一周后檢測細胞增殖情況；留取細胞抽提DNA，以Genescan方法(DetectionofmismatchrepairgenegermlinemutationcarrieramongChinesepopulationwithcolorectalcancer.BMCCancer2008,8:44)檢測藥物處理后細胞24h、72h和一周的微衛(wèi)星不穩(wěn)定情況和TGFe1、TGF02和IGF片段的大小，與未使用藥物和空白對照的細胞的微衛(wèi)星進行比較。4、結腸造口結腸癌原位移植模型的建立和茶多鼢的處理(1)試驗動物BALB/Cnu/nu裸鼠，SPF級，購自北京科麗華實驗動物中心，體重2428g,分籠飼養(yǎng)于獨立送風籠具，室溫控制在24°C25°C，相對濕度50%60%。(2)細胞株及細胞培養(yǎng)人結腸腺癌細胞株(Lovo)購自中國科學院上海細胞生物研究所。Lovo細胞以RPMI-1640培養(yǎng)基，10%小牛血清，在37。C，5XC02培養(yǎng)，0.25y。胰酶-EDTA消化，PBS洗2次，調整細胞濃度制成1X106的細胞懸液。(3)裸鼠皮下接種模型的建立裸鼠頸部右側皮膚消毒，用一次性lmL注射器將Lovo細胞懸液注入皮下0.2mL/只。注射完畢后，對注射部位進行觀察，約4周成瘤，對成瘤小鼠進行觀察，待其自然死亡后解剖觀察腫瘤特點，腫瘤在肺、肝、腸系膜處轉移情況。(4)裸鼠結腸造口氯胺酮(0.17mg/ml)裸鼠腹腔注射麻醉，左腹部碘BJ消毒，將皮膚及腹膜剪一小口，將裸鼠盲腸提出腹壁約0.5cm，以5—0縫線將盲腸與周圍皮膚縫合固定，術后注意補充葡萄糖生理鹽水，加強營養(yǎng)，術后23天造口部位會結痂，約一周結痂脫落，露出腸道。術后兩周可進行下一步手術。(5)造口處腫瘤原位移植取皮下接種小鼠腫瘤50mg，切取lmm的2塊，種植于結腸造口處，待腫瘤生長至5mm時開始進行茶多酚處理。(6)茶多酚的治療研究選取已結腸造口結腸癌原位移植模型40只，設空白對照對照組10只、茶多酚三個劑量50mg/kg、75mg/kg和100mg/kg處理組各10只，觀察腫瘤增長情況。分別于用藥前、用藥后3天、7天、14天、28天的腫瘤處取材，Genescan方法檢測微衛(wèi)星不穩(wěn)定情況和TGFP1、TGFe2和IGF片段的大小變化。腫瘤體積估計公式為(腫瘤長軸X腫瘤短軸2)/2;腫瘤抑制率估算公式(用藥后腫瘤體積-用藥開始腫瘤體積)/用藥開始腫瘤體積。5、結果5-1茶多酚對Lovo細胞和SW480細胞的增殖抑制作用在處理后藥物處理后24小時Lovo細胞抑制率明顯增加，而且在濃度超過150ug/ml后抑制率趨于穩(wěn)定，對SW480細胞的抑制率不明顯，72小時和一周后對Lovo細胞的抑制率具有同樣的趨勢，對SW480細胞的抑制率隨時間延長和濃度的增加逐漸上升。不同時間的細胞增殖抑制率見表l、表2和圖la、lb和lc。5-2、茶多酚(150ug/ml)處理后的Lovo細胞和SW480細胞微衛(wèi)星不穩(wěn)定和TGFe1、TGFP2和IGF片段的大小變化空白對照的Lovo細胞在BAT-25和D2S123出現片段的延長，提示為微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結腸癌細胞株而SW480空白對照未出現微衛(wèi)星不穩(wěn)定現象。在使用茶多酚治療的細胞Lovo細胞中，24小時后出現BAT-25和D2S123新的峰，提示為MSI，除D17S250在1周時出現片段長度變化以外，其余在72h和1周差異不明顯。TGFP1、TGFP2和IGF片段大小變化不大。在Lovo細胞中，BAT-26未擴增出。SW480細胞的變化不明顯。各微衛(wèi)星標志測量數值見表3。5-3、使用茶多酚處理結腸造口的結腸癌原位移植模型的結果50mg/kg、75mg/kg和100mg/kg三個治療組在注射査多酚后，一周開始出現腫瘤的縮小，2-3周左右腫瘤縮小最多，在3周以后腫瘤開始增長；而對照組腫瘤一直處理增長狀況，治療組和對照組差異有顯著意義，而3個治療組之間差異無顯著意義。經治療后的腫瘤生長曲線見圖2。5-4、結腸造口的結腸癌原位移植模型的腫瘤微衛(wèi)星不穩(wěn)定和TGFe1、TGFe2和IGF片段大小變化；在空白對照組，能擴增到的4個微衛(wèi)星標志和TGFP1、TGFP2和IGF均出現延長和縮短。茶多酚治療后微衛(wèi)星標志和TGFP1、TGFP2和IGF變化如表4。提示Lovo在增殖過程表現出明顯的含簡單重復序列基因的突變，符合Lovo細胞的增殖特點，但是在使用茶多酚治療后，微衛(wèi)星標志出現穩(wěn)定趨勢。在使用結腸造口的結腸癌原位移植模型進行茶多酚治療研究中發(fā)現，在3個不同的劑量，茶多酚可以使腫瘤縮小，特別在治療后3周內腫瘤縮小明顯。該結果在以往的研究中沒有見到相同的報道，特別在使用非細胞毒性藥物對腫瘤治療的研究中，在在體水平很難發(fā)現腫瘤縮小。但是Lovo細胞為MSI結直腸癌細胞，其C0X-2為低表達，因此不可能通過抑制C0X-2來達到抑制Lovo細胞的作用。本研究研究了Lovo細胞的微衛(wèi)星不穩(wěn)定變化和一些含有簡單重復序列基因如TGFP1、TGF02禾BIGF在茶多酚治療后的變化?？瞻讓φ盏腖ovo細胞在培養(yǎng)過程中出現了微衛(wèi)星不穩(wěn)定現象，符合Lovo作為錯配修復基因缺失的腫瘤細胞的特征，而在使用茶多酚治療后的Lovo細胞，24小時后出現BAT-25和D2S123新的峰，但是在在72h和1周差異不明顯。提示茶多酚可能具有抑制微衛(wèi)星不穩(wěn)定的特點，但是由于培養(yǎng)細胞無法長時間進行培養(yǎng)，因此很難出現明顯的微衛(wèi)星不穩(wěn)定的變化。在細胞學研究中我們沒有發(fā)現TGFP1、TGFP2和IGF的片段變化證據，可能是由于培養(yǎng)細胞時間較短，使許多錯配修復基因缺失后的分子特點無法表達的緣故。我們使用結腸造口的結腸癌原位移植模型，在不同治療時間進行取樣后進行微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測發(fā)現使用在空白對照組，能擴增到的4個微衛(wèi)星標志和TGFei、TGFe2和IGF均出現延長和縮短，提示Lovo在增殖過程表現出明顯的含簡單重復序列基因的突變，符合Lovo細胞的增殖特點，但是在使用茶多酚治療后，3天可以檢測到微衛(wèi)星標志和TGFe1、TGFP2和IGF等基因的變化，但是在1周、2周禾tl3周后這些微衛(wèi)星序列有趨于穩(wěn)定的趨勢，提示茶多酚可能是抑制了這些含有簡單重復序列基因的突變而導致抗腫瘤的作用。(二)茶多酚、溶液在預防MSI結腸癌術后結腸息肉形成中的作用40例MSI結直腸癌術后的患者作為研究對象，其中20例從術后6月、9月開始給與茶多酚水溶液50mg/kg/天，連續(xù)用藥15天，20例不進行治療，6月后觀察患者結腸息肉形成情況并對其毒副作用進行研究。試驗組共4例患者中發(fā)現13枚息肉，發(fā)生息肉的比例為20%，而對照組ll例患者中發(fā)現54枚息肉，息肉的發(fā)現率為55%。2組息肉發(fā)生率和發(fā)生的個數統(tǒng)計學檢查差異有顯著意義。結論茶多酚水溶液可以預防MSI結腸癌患者息肉的形成，減少腫瘤的發(fā)生。下一步將繼續(xù)擴大樣本量并申請院內制劑批號。(三)實施例h人結腸腫瘤患者的癥狀改善作用選出一組20名人結直腸腫瘤患者，另有一組試驗組。對這些患者治療前后進行測定將上述患者以75mg/天的劑量給予茶多酚注射，持續(xù)給藥1周(茶多酚腸溶制劑)，治療組有明顯效果，血檢驗癌蛋白指標變好。實施例2:人直腸腫瘤患者的癥狀改善作用進行與試驗l同樣的試驗，給藥的時間為3周，治療前后進行癥狀選出一組20名人結直腸腫瘤患者，另有一組試驗組。對這些患者治療前后進行測定將上述患者以100mg/天的劑量給予茶多酚注射，持續(xù)給藥3周(茶多酚腸溶制劑)，治療組有明顯效果。血檢驗癌蛋白指標明顯變好。表l:茶多酚對Lovo細胞的增殖抑制率(3X)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2:茶多酚對SW480細胞的增殖抑制率(3X)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3:各微衛(wèi)星標志測量數值<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權利要求1、茶多酚或其溶劑化物在制備用于治療人結直腸腫瘤藥物中的用途。2、茶多酚或其溶劑化物在制備用于治療MSH2基因缺失人結直腸腫瘤藥物中的用途。3、根據權利要求1或2所述的治療人結直腸腫瘤藥物中的用途，其特征是采用賦形劑、稀釋劑或載體配制，與茶多酚壓制成片；或將茶多酚配制成口服或肌肉或靜脈內給藥的藥劑或溶液劑。4、根據權利要求1或2所述的治療人結直腸腫瘤藥物中的用途，其特征是將茶多酚配制成腸溶包衣成援釋劑型。5、根據權利要求1或2所述的治療人結直腸腫瘤藥物中的用途，其特征是使用的劑量為10至200mg/天。6、根據權利要求1或2所述的治療人結直腸腫瘤藥物中的用途，其特征是劑量30至120mg/天。全文摘要茶多酚或其溶劑化物在制備用于治療人結直腸腫瘤藥物中的用途。尤其是在制備用于治療MSH2基因缺失人結直腸腫瘤藥物中的用途。采用賦形劑、稀釋劑或載體配制，與茶多酚壓制成片；或將茶多酚配制成口服或肌肉或靜脈內給藥的藥劑或溶液劑。文檔編號A61K31/7042GK101336916SQ20081002113公開日2009年1月7日申請日期2008年8月8日優(yōu)先權日2008年8月8日發(fā)明者丁義江,丁曙晴,劉秀芳,談瑄忠,金黑鷹申請人:南京市中醫(yī)院