專(zhuān)利名稱(chēng)：：人造侵襲素復(fù)合物的制作方法
背景技術(shù)：
：1發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供了制備人造侵襲素復(fù)合物(Invaplex)的新方法，所述人造侵襲素復(fù)合物包含至少兩種侵襲素蛋白和來(lái)自侵襲性革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖。本發(fā)明的人造侵襲素復(fù)合物可以用作疫苗、疫苗佐劑、生化試劑、或其他物質(zhì)，和用作診斷工具。
背景技術(shù)：
：描述志賀氏菌病(Shigellosis)是發(fā)展中國(guó)家人腹瀉性疾病的主要原因，據(jù)估計(jì)每年超過(guò)1億6千3百萬(wàn)病例，1百萬(wàn)死亡病例[1]。世界范圍內(nèi)引起疾病的最普遍志賀氏桿菌種是弗氏志賀氏菌(S.flexneri)和宋內(nèi)氏志賀氏菌(S.sonnei)[1]。工業(yè)化國(guó)家中志賀氏菌病發(fā)生率低(1.5百萬(wàn)病例/年)[1]暗示成年群體是非免疫性的且易感。即使在相對(duì)無(wú)志賀氏菌病的區(qū)域，由于戰(zhàn)爭(zhēng)或自然災(zāi)害造成的嚴(yán)重破壞，例如1999年土耳其科賈埃利的地震，可以突然引起多種類(lèi)多病灶痢疾增加[2]。相似地，當(dāng)部署的來(lái)自工業(yè)化國(guó)家的軍隊(duì)、救援工人或旅行者處于志賀氏桿菌地方性區(qū)域或處于當(dāng)?shù)鼗驹O(shè)施已經(jīng)倒塌的區(qū)域時(shí)，暴露于多種志賀氏桿菌種的威脅可能相當(dāng)嚴(yán)峻。痢疾志賀氏菌(S.dysenteriae)1引起最嚴(yán)重形式的志賀氏菌病且常常伴發(fā)溶血尿毒癥綜合征[3]。盡管痢疾志賀氏菌1的發(fā)生率不如弗氏志賀氏菌或宋內(nèi)氏志賀氏菌那么高，但是由痢疾志賀氏菌1引起的流行病常常每10至12年發(fā)生一次[4]。該周期性發(fā)生也許是因?yàn)楹芏嘁蛩?，其中之一是可能?duì)痢疾志賀氏菌1無(wú)免疫力。更重要的是最近的發(fā)現(xiàn)-在最近爆發(fā)中分離的痢疾志賀氏菌1中證明對(duì)氟喹啉類(lèi)抗生素具有抗生素抗性[5，6]。另一種痢疾志賀氏菌1流行病的可能性高，并且如果是由抗生素(包括氟喹啉)抗性廣泛的菌株引起的，則后果可能很?chē)?yán)重。志賀氏桿菌種被證明是為數(shù)不多的生物恐怖活動(dòng)的物質(zhì)之一。極其低的感染劑量(對(duì)于痢疾志賀氏菌1，據(jù)報(bào)道是10個(gè)細(xì)菌)[7]和該生物在簡(jiǎn)單細(xì)菌培養(yǎng)基上容易生長(zhǎng)是考慮志賀氏桿菌種作為強(qiáng)力生物武器的合適因素。已證實(shí)作為生物恐怖活動(dòng)物質(zhì)的有效性的一個(gè)例子是，一位忿忿不平的同事故意使醫(yī)院職員感染了痢疾志賀氏菌2，該同事有“涂抹過(guò)”該生物的松餅[8]。明確記錄過(guò)其他食物傳染的志賀氏桿菌感染爆發(fā)-從航線(xiàn)上的冷食到游船上的生菜[9，10]證明了志賀氏菌可輕易地在易感人群中引起疾病。志賀氏桿菌感染的預(yù)防通過(guò)環(huán)境控制最好實(shí)現(xiàn)，包括好的衛(wèi)生設(shè)備和清潔水供應(yīng)。如果志賀氏菌被故意安置在食物或飲料中，那么這種基本設(shè)施改善容易克服。此外，容易從自然分離志賀氏菌[5]和在實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)抗生素抗性痢疾志賀氏菌1菌株的簡(jiǎn)便性確認(rèn)這個(gè)物質(zhì)作為潛在主要生物恐怖主義威脅。盡管在非免疫群體中初始爆發(fā)可能難以完全終止，但是重要的是限制二次擴(kuò)散。不考慮抗生素抗性，預(yù)防的有效措施是有效對(duì)抗志賀氏菌的疫苗。志賀氏菌種的發(fā)病機(jī)理歸于該生物侵入結(jié)腸上皮內(nèi)部、并在其細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散的能力。志賀氏菌的最初入侵通過(guò)稱(chēng)為M細(xì)胞的專(zhuān)門(mén)腸上皮細(xì)胞而發(fā)生。幾個(gè)高度保守、毒性質(zhì)粒編碼蛋白，被稱(chēng)為侵入質(zhì)?？乖?IpaA、IpaB、IpaC和IpaD)，是侵入過(guò)程中必需的參與者并且可能是志賀氏菌屬感染效率的關(guān)鍵因素。一接觸或附著于宿主細(xì)胞，III型分泌機(jī)構(gòu)[12]就釋放志賀氏菌侵襲素[11]并誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞事件，引起細(xì)菌被宿主細(xì)胞吞食和內(nèi)在化[13]。活性成分包括IpaB:IpaC復(fù)合物，其整合入宿主細(xì)胞膜，形成其他志賀氏菌蛋白獲得進(jìn)入宿主細(xì)胞入口的通道[14]。最近我們分離了完整的、有毒力志賀氏菌細(xì)胞，侵襲素蛋白-LPS復(fù)合物，其充當(dāng)有效疫苗和佐劑[15-19]。志賀氏菌侵襲素復(fù)合物(侵襲素復(fù)合物)通過(guò)用水提取完整的有毒力志賀氏菌，隨后對(duì)水提取物進(jìn)行陰離子交換層析而制備。兩個(gè)級(jí)分，稱(chēng)為侵襲素復(fù)合物24和侵襲素復(fù)合物50，包含主要抗原，包括LPS、IpaB和IpaC。侵襲素復(fù)合物(侵襲素復(fù)合物)與培養(yǎng)的上皮細(xì)胞表面結(jié)合，而由非侵入性志賀氏菌制備的相似制備物不顯示出這個(gè)特性。附著之后不久，侵襲素復(fù)合物變得定位于宿主細(xì)胞內(nèi)部，這是通過(guò)可能由侵襲素復(fù)合物誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白依賴(lài)性?xún)?nèi)吞事件而發(fā)生?？磥?lái)IpaC和IpaB在附著和內(nèi)在化過(guò)程中具有重要作用，因?yàn)榭笽paC或IpaB的抗體抑制侵襲素復(fù)合物與宿主細(xì)胞膜結(jié)合[20]。LPS的抗體不改變吸收事件。一旦被內(nèi)在化，侵襲素復(fù)合物通行通過(guò)早期內(nèi)涵體、晚期內(nèi)涵體，然后是高爾基體和最后游離在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中結(jié)束。與真核宿主細(xì)胞表面結(jié)合和刺激細(xì)胞內(nèi)吞作用的能力表明侵襲素復(fù)合物保持活躍的天然毒力結(jié)構(gòu)，類(lèi)似于在侵入性志賀氏菌中所發(fā)現(xiàn)的。歷史上，成功的志賀氏菌疫苗強(qiáng)調(diào)LPS以引發(fā)保護(hù)的有效方式呈遞。對(duì)志賀氏菌疫苗已經(jīng)使用很多方法，包括活減毒疫苗[21，22]，滅活完整細(xì)胞疫苗[23，24]，和用載體遞送志賀氏菌LPS或O-多糖，所述載體例如蛋白體[25]、破傷風(fēng)類(lèi)毒素[26]、核糖體[27]或侵襲素復(fù)合物(17，18；見(jiàn)下文)。僅僅活減毒疫苗利用志賀氏菌的天然侵入性將LPS和蛋白抗原大概通過(guò)連濾泡上皮遞送至粘膜免疫系統(tǒng)[14]。減毒疫苗菌株的殘留致病力可能限制這個(gè)方法，除非達(dá)到進(jìn)一步減毒[28]。分離推測(cè)的天然表面結(jié)構(gòu)(例如顯示出與侵入性志賀氏菌類(lèi)似的活性和免疫原性的侵襲素復(fù)合物)的能力在疫苗設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)中具有重要意義。首先，分離的天然復(fù)合物可以加強(qiáng)遞送至適當(dāng)?shù)那秩肟?M-細(xì)胞)，類(lèi)似于活減毒疫苗菌株所靶向的那個(gè)。侵襲素復(fù)合物與宿主細(xì)胞(和可能是腸M細(xì)胞或其他粘膜組織中的M-樣細(xì)胞)的附著允許由于其遞送效率而使用相對(duì)低劑量的這種亞細(xì)胞復(fù)合物用于免疫。與活減毒疫苗類(lèi)似，侵襲素復(fù)合物包含全部主要的志賀氏菌抗原(包括IpaB、IpaC和LPS)并具有刺激等同于自然感染過(guò)程中產(chǎn)生的免疫反應(yīng)的潛力，包括識(shí)別僅在天然結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的表位。這種表位可能不存在于僅遞送LPS或O-多糖作為抗原的疫苗中。此外，在所有志賀氏菌種中發(fā)現(xiàn)的Ipa蛋白的保守序列和免疫交叉反應(yīng)性可能使包含侵襲素(或其他保守抗原)的疫苗能夠有效對(duì)抗一個(gè)以上的志賀氏菌種。由弗氏志賀氏菌制備的志賀氏菌侵襲素復(fù)合物(侵襲素復(fù)合物)疫苗包含主要抗原LPS、IpaB和IpaC，并在豚鼠角膜結(jié)膜炎和小鼠肺攻擊(challenge)模型中具有對(duì)抗同種攻擊的保護(hù)性[17，18]。免疫后，產(chǎn)生了LPS、IpaB和IpaC的抗體，類(lèi)似于在人自然感染后觀(guān)察到的抗體特異性。另外的研究表明從所有志賀氏菌和EIEC種中可以分離到相似的有效侵襲素復(fù)合物疫苗產(chǎn)物[15]。盡管侵襲素復(fù)合物24和50制備物由很多不同蛋白組成，侵襲素復(fù)合物24的優(yōu)勢(shì)免疫抗原是LPS、IpaB和IpaC和對(duì)于侵襲素復(fù)合物50，關(guān)鍵抗原是LPS、IpaB、IpaC和84kDa(EF-G)和72kDa(DnaK)蛋白抗原[18]。如Western印跡技術(shù)使用從侵襲素復(fù)合物免疫的動(dòng)物收集的血清測(cè)定，侵襲素復(fù)合物制備物內(nèi)的其他蛋白沒(méi)有免疫原性。侵襲素復(fù)合物24和侵襲素復(fù)合物50可以從所有野生型志賀氏菌種分離出來(lái)，盡管通常侵襲素復(fù)合物24型一致含有較高量的IpaB、IpaC和LPS，和較少量的非免疫原性蛋白。使用侵襲素復(fù)合物疫苗，當(dāng)免疫的侵襲素復(fù)合物(侵襲素復(fù)合物24或侵襲素復(fù)合物50)用作ELTSA抗原時(shí)，常常產(chǎn)生對(duì)抗它們的最高滴度。這被認(rèn)為反映了當(dāng)侵襲素復(fù)合產(chǎn)物被用作ELlSA抗原時(shí)，對(duì)Ipa蛋白和LPS以及對(duì)侵襲素復(fù)合產(chǎn)物的一組保守構(gòu)象表位產(chǎn)生的復(fù)合應(yīng)答。鑒定和純化天然侵襲素復(fù)合物內(nèi)的有效部分的努力已經(jīng)鑒定了用大小排阻層析法從天然侵襲素復(fù)合物24制備物中分離的高分子量復(fù)合物。這個(gè)高分子量復(fù)合物，稱(chēng)為“高純化”或HP侵襲素復(fù)合物24，主要由IpaB、IpaC和LPS組成。HP侵襲素復(fù)合物24在與天然侵襲素復(fù)合物所顯示水平可比較或超過(guò)其水平的水平上具有免疫原性和保護(hù)性。大小排阻層析法獲得的級(jí)分中沒(méi)有其他級(jí)分顯示出可與天然侵襲素復(fù)合物相比的免疫原性或保護(hù)能力，和因此認(rèn)為HP侵襲素復(fù)合物24是天然侵襲素復(fù)合物內(nèi)負(fù)責(zé)其作為疫苗的免疫原性和功效的活性部分。有毒力志賀氏菌通過(guò)侵入結(jié)腸上皮、在上皮內(nèi)復(fù)制和擴(kuò)散，借助于由一系列質(zhì)粒編碼毒力因子配合的復(fù)雜系列的細(xì)胞和分子事件引起疾病，這些因子當(dāng)中是Ipa蛋白[49]。侵入結(jié)腸粘膜的腸上皮細(xì)胞后，產(chǎn)生以引起中性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞募集的促炎細(xì)胞因子增加為特征的粘膜炎癥應(yīng)答。所產(chǎn)生的疾病-志賀氏菌病或桿菌性痢疾-引起中度至重度腹瀉、發(fā)熱和腸損害。由于在人和非人類(lèi)靈長(zhǎng)目動(dòng)物中測(cè)試疫苗功效包括免疫后用有毒力志賀氏菌攻擊，因此疫苗候選物初期試驗(yàn)使用小動(dòng)物模型降低人類(lèi)志愿者和靈長(zhǎng)目動(dòng)物的疾病風(fēng)險(xiǎn)。小動(dòng)物模型例如志賀氏菌試驗(yàn)性感染的豚鼠角膜結(jié)膜炎模型或小鼠肺模型被大量地用在發(fā)病機(jī)理和臨床前疫苗評(píng)價(jià)的研究中[18，44，50]，小鼠模型常常用于初期評(píng)價(jià)和豚鼠模型用于測(cè)試在小鼠模型中有保護(hù)性的疫苗。志賀氏菌感染鼻內(nèi)攻擊小鼠模型對(duì)評(píng)價(jià)志賀氏菌疫苗有用[18，31，51，52]。在肺模型中觀(guān)察到的發(fā)病機(jī)理和免疫生物學(xué)與在結(jié)腸中見(jiàn)到的那些平行；也就是說(shuō)，有毒力志賀氏菌菌株侵入上皮內(nèi)、在上皮內(nèi)復(fù)制和擴(kuò)散，和隨后引發(fā)抗體以及細(xì)胞因子應(yīng)答[52]。感染后小鼠體重減輕并最終死亡，除非存在保護(hù)性免疫。測(cè)定分泌型抗體反應(yīng)、細(xì)胞免疫反應(yīng)和細(xì)胞因子反應(yīng)(主要由于商業(yè)試劑的可獲性)的能力使得小鼠模型對(duì)于志賀氏菌病免疫生物學(xué)的研究具有高度吸引力。豚鼠模型是可用于研究野生型和減毒志賀氏菌菌株毒力，和用于評(píng)價(jià)潛在疫苗候選物功效的可接受模型[18，44，45，53-56]。根據(jù)疫苗可以使用幾種免疫途徑進(jìn)行免疫口服、鼻內(nèi)、眼內(nèi)和非腸道免疫全部用于保護(hù)不受眼睛攻擊的損害。志賀氏菌疫苗在豚鼠角膜結(jié)膜炎模型中的免疫原性和功效現(xiàn)在被用作1期臨床研究的墊腳石。需要化學(xué)上明確的人造侵襲素復(fù)合物部分，其生物活性類(lèi)似或優(yōu)于天然侵襲素復(fù)合物。還需要侵襲素復(fù)合物制備方法，其可以容易地放大并產(chǎn)生更具體明確的產(chǎn)物，依賴(lài)于使用的各個(gè)組分部分的比率。還需要人造侵襲素復(fù)合物，其能夠設(shè)計(jì)用于專(zhuān)門(mén)的應(yīng)用或定制功能。還需要侵襲素復(fù)合物疫苗，其可以由其組分部分快速制備，可以貯存以備預(yù)期未來(lái)疫苗需要。發(fā)明概述本發(fā)明涉及人造侵襲素復(fù)合物及其制備方法。人造侵襲素復(fù)合物(侵襲素復(fù)合物AR)在組成上與HP侵襲素復(fù)合物24類(lèi)似。HP侵襲素復(fù)合物24包含IpaB、IpaC和脂多糖。人造侵襲素復(fù)合物作用如同天然來(lái)源獲得的侵襲素復(fù)合物，盡管它可能具有優(yōu)越的活性。人造侵襲素復(fù)合物具有明確的組分包含侵入蛋白IpaB和IpaC的復(fù)合物，該復(fù)合物另外與來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌的血清型特異性脂多糖組分復(fù)合。脂多糖是免疫原，如同IpaB和IpaC。侵襲素復(fù)合物AR可以起粘膜佐劑的作用并增強(qiáng)血清和粘膜抗原特異性抗體反應(yīng)以及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。還可能使用來(lái)自其他細(xì)菌種的其他侵襲素，包括SipB、SipC或與細(xì)胞內(nèi)吞事件或組織嗜性相關(guān)的病毒(reo病毒)蛋白。血清型相關(guān)脂多糖從革蘭氏陰性細(xì)菌獲得，所述革蘭氏陰性細(xì)菌例如弗氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)、宋內(nèi)氏志賀氏菌(Shigellasonnei)、痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)、鮑氏志賀氏菌(Shigellaboydii)、腸侵襲性大腸桿菌(enteroinvasiveE.coli)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)或沙門(mén)氏菌(Salmonella)。更優(yōu)選的種包括弗氏志賀氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌或腸侵襲性大腸桿菌。在制備人造侵襲素復(fù)合物，例如侵襲素復(fù)合物AR中，使用的侵襲素蛋白是高度純化的(hp-)或重組(r-)制備的IpaB和IpaC，和純化的脂多糖被用作起始材料。IpaB和IpaC蛋白混合形成IpaB:IpaC復(fù)合物。這個(gè)復(fù)合物與至少一種脂多糖混合以形成人造侵襲素復(fù)合物，所述脂多糖與革蘭氏陰性細(xì)菌的血清型相關(guān)。從該混合物中回收人造侵襲素復(fù)合物。典型地，基于其電荷取出人造侵襲素復(fù)合物。可以使用其他純化技術(shù)。添加順序可以變化。脂多糖可以與任何一種侵襲素蛋白復(fù)合，然后與另一種侵襲素蛋白復(fù)合形成人造侵襲素復(fù)合物。典型地，存在的IpaC量相對(duì)于存在的IpaB落在0.08∶1至80∶1的比率范圍內(nèi)，優(yōu)選0.8∶1至20∶1，更優(yōu)選至少8∶1。更加優(yōu)選第一個(gè)混合步驟中的IpaC量以相對(duì)于IpaB至少10倍過(guò)量存在。在第二個(gè)混合步驟中，脂多糖和蛋白(IpaB和IpaC)以0.01∶1至10∶1范圍內(nèi)的比率存在，優(yōu)選至少1∶2。有可能在第二個(gè)混合步驟中包括兩種或更多種類(lèi)型的脂多糖，產(chǎn)生適于用在多價(jià)免疫原性組合物中作為疫苗的人造侵襲素復(fù)合物。除脂多糖之外，還可能包括想引入細(xì)胞內(nèi)的檢測(cè)劑(detectant)標(biāo)記，抗生素，治療劑或生物分子，包括酶、蛋白質(zhì)、多糖、RNA或DNA、或其衍生物。這產(chǎn)生可能的治療和分析/診斷用途。本發(fā)明的人造侵襲素復(fù)合物包括那些，其中IpaC和IpaB以選自0.08∶1至80∶1的比率存在，優(yōu)選0.8∶1至20∶1，更加優(yōu)選大約8∶1的比率存在，和脂多糖(LPS)相對(duì)于存在的總蛋白(IpaB和IpaC)以選自0.01∶1至10∶1范圍的比率存在，優(yōu)選0.5∶1至5∶1，更加優(yōu)選大約0.5∶1的比率存在。優(yōu)選的人造侵襲素復(fù)合物包括弗氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物AR、痢疾志賀氏菌侵襲素復(fù)合物AR或宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物AR。本發(fā)明的人造侵襲素復(fù)合物可以被配制形成適于用作免疫原性組合物或疫苗的組合物。侵襲素復(fù)合物可以用作免疫原和/或用作佐劑。除了人造侵襲素復(fù)合物之外，該組合物會(huì)包括至少一種藥學(xué)上可接受的載體。侵襲素復(fù)合物存在的量是有效產(chǎn)生期望作用的量，和至少在第一種情況下，由經(jīng)驗(yàn)確定。預(yù)計(jì)這個(gè)量與用于相似作用的天然侵襲素復(fù)合物例如侵襲素復(fù)合物24的量相似。此外，人造侵襲素復(fù)合物促進(jìn)分子和相關(guān)材料跨越細(xì)胞膜運(yùn)輸。這些分子可以緊密接近感興趣細(xì)胞和人造侵襲素復(fù)合物，或可以存在于人造侵襲素復(fù)合物內(nèi)部和/或之上。該分子可以是檢測(cè)劑標(biāo)記、抗生素、治療劑和生物分子，包括蛋白質(zhì)、酶、RNA、DNA、脂多糖、多糖等等。人造侵襲素復(fù)合物可以用在已經(jīng)用過(guò)天然侵襲素復(fù)合物的方法中，例如免疫方法、促進(jìn)生物分子例如DNA、RNA、蛋白跨越細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)姆椒ǖ鹊?。人造侵襲素復(fù)合物可以被設(shè)計(jì)為多價(jià)的或相對(duì)于天然侵襲素復(fù)合物具有優(yōu)越的活性。這將改善現(xiàn)在方法的性能或其效用。由重組IpaB、IpaC和宋內(nèi)氏志賀氏菌LPS或弗氏志賀氏菌2aLPS制備的侵襲素復(fù)合物AR誘導(dǎo)出比得上或高于天然侵襲素復(fù)合物誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)強(qiáng)度的免疫反應(yīng)。侵襲素復(fù)合物AR免疫后IpaB和IpaC的反應(yīng)強(qiáng)度一致高于用天然侵襲素復(fù)合物免疫后誘導(dǎo)的反應(yīng)。與天然侵襲素復(fù)合物免疫相比，用侵襲素復(fù)合物AR免疫在小鼠和豚鼠模型中提供比得上或更高水平的攻擊保護(hù)作用。用侵襲素復(fù)合物AR免疫誘導(dǎo)出比用天然侵襲素復(fù)合物誘導(dǎo)的志賀氏菌特異性反應(yīng)更高強(qiáng)度的細(xì)胞免疫。參見(jiàn)例如表7和8。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了用于組合侵襲素復(fù)合物AR的純化的IpaB、IpaC和LPS的SDS-PAGE分析；圖2顯示了弗氏志賀氏菌2a(圖A)、宋內(nèi)氏志賀氏菌(圖B)和痢疾志賀氏菌1(圖C)侵襲素復(fù)合物AR的純化；圖3顯示了用于制備痢疾志賀氏菌1侵襲素復(fù)合物AR的組分的SDS-PAGE(考馬斯藍(lán)、Western印跡和銀染)和最終的侵襲素復(fù)合物AR產(chǎn)物的SDS-PAGE；圖4顯示了檢測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中內(nèi)在化的天然和人造痢疾志賀氏菌1侵襲素復(fù)合物；圖5顯示了用弗氏志賀氏菌2a天然侵襲素復(fù)合物24、侵襲素復(fù)合物AR、純化的IpaB、IpaC或弗氏志賀氏菌2aLPS鼻內(nèi)免疫后第42天，侵襲素復(fù)合物50、侵襲素復(fù)合物24和LPS特異性血清IgG和IgA的終點(diǎn)滴度；圖6顯示了用弗氏志賀氏菌2a天然侵襲素復(fù)合物24、侵襲素復(fù)合物AR、純化的IpaB、IpaC或弗氏志賀氏菌2aLPS鼻內(nèi)免疫后第24天，抗IpaB和IpaC血清IgG的終點(diǎn)滴度；圖7顯示了從天然弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物或侵襲素復(fù)合物AR鼻內(nèi)免疫的小鼠第35天收集的腸洗滌物中的抗原特異性IgA；圖8顯示了從天然弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物或侵襲素復(fù)合物AR鼻內(nèi)免疫的小鼠第35天收集的肺洗滌物中的抗原特異性IgA；圖9顯示了OVA單獨(dú)或OVA與侵襲素復(fù)合物AR、天然侵襲素復(fù)合物或霍亂毒素組合鼻內(nèi)免疫后，小鼠中的侵襲素復(fù)合物特異性血清IgG和IgA終點(diǎn)滴度；圖10顯示了OVA單獨(dú)或OVA與侵襲素復(fù)合物AR、天然侵襲素復(fù)合物或霍亂毒素組合鼻內(nèi)免疫后，小鼠中的弗氏志賀氏菌2aLPS特異性血清IgG和IgA終點(diǎn)滴度；圖11顯示了OVA單獨(dú)或OVA與侵襲素復(fù)合物AR、天然侵襲素復(fù)合物或霍亂毒素組合鼻內(nèi)免疫后，小鼠中的志賀氏菌侵入-特異性血清IgG和IgA終點(diǎn)滴度；圖12顯示了OVA單獨(dú)或OVA與侵襲素復(fù)合物AR、天然侵襲素復(fù)合物或霍亂毒素組合鼻內(nèi)免疫后，小鼠中的卵白蛋白-特異性血清IgG和IgA終點(diǎn)滴度；圖13顯示了OVA單獨(dú)或OVA與侵襲素復(fù)合物AR、天然侵襲素復(fù)合物或霍亂毒素組合鼻內(nèi)免疫后，小鼠中的弗氏志賀氏菌2aLPS、侵襲素復(fù)合物24和卵白蛋白特異性肺IgG和IgA終點(diǎn)滴度。發(fā)明詳述人造侵襲素復(fù)合物的生物化學(xué)重組IpaB和IpaC和天然弗氏志賀氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌和痢疾志賀氏菌1LPS的生產(chǎn)和純化Ipa蛋白的純化Ipa蛋白在全部志賀氏菌種中高度保守[32，33]。以前已經(jīng)描述了表達(dá)IpaB或IpaC的重組大腸桿菌?？梢岳脙煞N策略純化重組Ipa蛋白。組氨酸標(biāo)記(HisTag)的重組IpaC通過(guò)使用鎳柱的親和層析法來(lái)純化。組氨酸殘基對(duì)Ipa蛋白的生物學(xué)或免疫功能或該蛋白形成侵襲素復(fù)合物的能力的影響未知，但是HisTag-IpaC看起來(lái)保持著生物活性[30]。已經(jīng)使用替換的純化步驟生產(chǎn)重組IpaB。這個(gè)方法運(yùn)用了IpaB對(duì)于伴侶IpgC的天然親和力[34，35]。在同一重組生物中共表達(dá)IpaB和HisTag-伴侶IpgC，可以純化IpaB/伴侶復(fù)合物。純化后，HisTag-IpaC/IpaB蛋白復(fù)合物變性產(chǎn)生單體IpaB蛋白和HisTag-IpgC，允許在鎳柱上選擇性除去His標(biāo)記的伴侶，而游離Ipa蛋白通過(guò)柱流過(guò)。HisTag-IpaC的純化使用IPTG誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)(pET質(zhì)粒)在大腸桿菌背景中表達(dá)重組IpaC。具體地說(shuō)，ipaC基因克隆入pET15b質(zhì)粒(Novagen)并在大腸桿菌載體BL21(DE3)pLysS中表達(dá)[30]。重組IpaC蛋白在氨基末端具有幾個(gè)組氨酸殘基，其允許隨后在鎳柱上純化[30]。重組體中表達(dá)的IpaC蛋白位于包涵體中并且需要用尿素增溶。如果IpaC濃度太高(＞1mg/ml)，除去尿素常常引起不溶。因此，從鎳柱洗脫的IpaC保持在尿素中以保持可溶性。使用小規(guī)模培養(yǎng)(3L)，已經(jīng)可以生產(chǎn)大約75mg純化的IpaC，產(chǎn)率為大約8mg/L。產(chǎn)物純度大于90％并且與抗IpaCmAb2G2具有反應(yīng)性[32](圖1)。純化的蛋白是可溶的并且可以冰凍保存。純化的IpaC的實(shí)例在圖1中。IpaB的純化表達(dá)IpaB的重組生物是大腸桿菌BL21(DE3)背景。ipgC基因克隆入pET15b；ipgB基因分開(kāi)克隆入pACYC-二重載體。IPTG誘導(dǎo)后，將HisTagIpgC/IpaB復(fù)合物溶解并在鎳親和柱上純化。HisTag-IpgC/IpaB復(fù)合物用EDTA釋出，除去EDTA并添加非離子型洗滌劑OPOE(N-辛基-寡-環(huán)氧乙烷)至終濃度1％v/v，準(zhǔn)備第二次施加到鎳親和柱上。OPOE將破壞HisTag-IpgC/IpaB復(fù)合物，因此允許游離HisTag-IpgC蛋白結(jié)合鎳(鎳-瓊脂糖)柱和未標(biāo)記的游離IpaB流過(guò)柱進(jìn)行收集。用抗IpaBmAb2F1探測(cè)空隙容積級(jí)分的IpaB。SDS-PAGE(染色)分析陽(yáng)性級(jí)分以確定是否存在污染的HisTag-IpgC。倘若如此，用OPOE再次處理物質(zhì)，并再施加到鎳柱以除去殘留HisTag-IpgC。生成的可溶IpaB產(chǎn)物具有很少至無(wú)HisTag-IpgC“污染”，純度在90％以上并且與抗IpaBmAb2F1反應(yīng)(圖1)。每升起始培養(yǎng)物的IpaB產(chǎn)率是大約3.5mg/L。弗氏志賀氏菌2a、宋內(nèi)氏志賀氏菌或痢疾志賀氏菌1LPS的純化用Westphal程序[36]生產(chǎn)弗氏志賀氏菌2a、宋內(nèi)氏志賀氏菌和痢疾志賀氏菌1LPS，其包括熱酚/水抽提志賀氏菌。有毒力或減毒志賀氏菌菌株可以用作LPS源，只要表達(dá)平滑LPS表型。在如下所述的實(shí)驗(yàn)中，使用野生型弗氏志賀氏菌2a(菌株2457T)和宋內(nèi)氏志賀氏菌(Mosely)。對(duì)于痢疾志賀氏菌1，使用WRSdI減毒株，使實(shí)驗(yàn)室職員感染風(fēng)險(xiǎn)降至最低。WRSdI以前在WRAIR生產(chǎn)時(shí)virG、stx被敲除[37]。LPS的提取、純化和表征用Westphal程序[36]提取LPS。簡(jiǎn)言之，細(xì)菌細(xì)胞沉淀懸浮于熱(68℃)蒸餾水(每克沉淀5ml水)中。添加加熱到68℃的等量苯酚，用力搖動(dòng)沉淀溶液15分鐘。然后瓶冷卻至大約10℃±5℃。樣品離心，除去水相并保存在4℃。再次進(jìn)行細(xì)胞團(tuán)提取并混合所有水相。水相對(duì)著蒸餾水透析兩天，然后離心(8000xg，30分鐘)以除去無(wú)關(guān)細(xì)胞雜質(zhì)。這種上清液接受超速離心(90,000xg)2小時(shí)并保留沉淀。用無(wú)菌蒸餾水漂洗沉淀，重懸于無(wú)菌蒸餾水中，4℃過(guò)夜，合并和凍干。對(duì)最終的凍干產(chǎn)物稱(chēng)重，然后取出小部分(＜10mg)，溶于1ml無(wú)內(nèi)毒素的水中并進(jìn)行生物化學(xué)表征(見(jiàn)下文)。用生色LAL進(jìn)行純化LPS的內(nèi)毒素含量測(cè)定。大腸桿菌內(nèi)毒素在這個(gè)分析中充當(dāng)對(duì)照試劑。所有結(jié)果以國(guó)際內(nèi)毒素單位(EU)報(bào)道。也用SDS-PAGE銀染分析純化的LPS以確定是否存在典型的平滑LPS的多條帶譜。圖1顯示了純化的痢疾志賀氏菌1LPS的銀染凝膠，證明了平滑LPS的典型的多條帶模式。最終的LPS產(chǎn)物具有殘余量的蛋白(＜5％，Bradford試驗(yàn)測(cè)定)和DNA(＜5％，Hoechst染色測(cè)定)，和通過(guò)Western印跡或ELISA測(cè)定，對(duì)于痢疾志賀氏菌1LPS，其與LPS血清型特異性抗體(抗痢疾志賀氏菌1LPSmAbMAB753(Chemicon國(guó)際(ChemiconInternational))反應(yīng)；對(duì)于弗氏志賀氏菌2aLPS，其與mAb2E8反應(yīng)；對(duì)于宋內(nèi)氏志賀氏菌LPS，其與MAB755(Chemicon)反應(yīng)。通過(guò)免疫測(cè)定法定量侵襲素復(fù)合物AR中IpaB和IpaC的含量使用改進(jìn)的ELISA程序測(cè)定侵襲素復(fù)合物(人造或天然)中IpaB和IpaC的量。ELISA使用純化的重組IpaB或IpaC蛋白以產(chǎn)生測(cè)定侵襲素復(fù)合物制備物中抗原的量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。ImmulonIBELISA板(ThermoLab系統(tǒng))用50μl重組IpaB、重組IpaC或侵襲素復(fù)合物AR4℃包被過(guò)夜。使用在碳酸鹽包被緩沖液(0.2M碳酸鹽，pH9.8)中的2倍系列稀釋物滴定抗原，起始濃度125ng/ml(IpaB)、200ng/ml(IpaC)和10ug/ml(侵襲素復(fù)合物)。洗滌和用酪蛋白封閉后，對(duì)于IpaB(2F1)或IpaC(2G2)特異性的親和純化單克隆抗體[32]與抗原包被板溫育2小時(shí)。洗滌后，使用與堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)(Kirkegaard&Perry)檢測(cè)抗原特異性抗體。使用底物對(duì)硝基苯基磷酸酯，在與底物溫育60分鐘后，用ELISA平板讀數(shù)器(分子裝置(MolecularDevices)，MenloPark，CA)測(cè)定在405nm的光密度(OD405)。使用SoftmaxPro4.5(分子裝置(MolecularDevices))程序，確定OD405對(duì)濃度(ng/ml)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪圖。然后將未知樣品的濃度插入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。侵襲素復(fù)合物AR被設(shè)計(jì)成具有多個(gè)IpaB和IpaC濃度和IpaC/IpaB比率類(lèi)似于HP侵襲素復(fù)合物24。測(cè)定侵襲素復(fù)合物AR的IpaC與IpaB量的比率并與最純形式的侵襲素復(fù)合物，HP-侵襲素復(fù)合物24，相比。HP侵襲素復(fù)合物中的IpaC/IpaB摩爾比是大約8。對(duì)于IpaB和IpaC，這通過(guò)密度測(cè)定法分析SDS-PAGE凝膠和基于定量抗體的試驗(yàn)來(lái)測(cè)定。此外預(yù)期LPS含量處于與HP-侵襲素復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)的相同的相對(duì)質(zhì)量比(每1mg蛋白大約0.5至0.6mgLPS)。侵襲素復(fù)合物中LPS的測(cè)定通過(guò)測(cè)定每個(gè)制備物中2-酮-3-脫氧辛酸(deoxyoctonate)(KDO)[43]或通過(guò)使用鱟阿米巴細(xì)胞溶解產(chǎn)物試驗(yàn)(CambrexInc.)來(lái)測(cè)定侵襲素復(fù)合物制備物中LPS含量。侵襲素復(fù)合物AR的形成方法弗氏志賀氏菌2a、宋內(nèi)氏志賀氏菌和痢疾志賀氏菌1的人造侵襲素復(fù)合物的制備純化的組分以類(lèi)似于高度純化的天然侵襲素復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)的比率混合以形成人造侵襲素復(fù)合物。弗氏志賀氏菌2aHP侵襲素復(fù)合物的分析表明IpaC/IpaB摩爾比是大約8.0和LPS與總蛋白比率是大約0.56mgLPS/mg總蛋白。使用這些參數(shù)作為從純化的IpaB、IpaC和LPS重構(gòu)侵襲素復(fù)合物的指導(dǎo)，進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生侵襲素復(fù)合物AR。一旦形成，用離子交換FPLC純化人造侵襲素復(fù)合物。純化的可溶IpaB和IpaC，各自在它們相應(yīng)最終緩沖液中，以IpaC/IpaB摩爾比為8混合在一起。IpaB和IpaC混合后，將該溶液緩慢添加至干燥L(fēng)PS粉末(LPS與總蛋白比率是0.56)?？梢允褂脕?lái)自任何志賀氏菌種的LPS；對(duì)于描述的實(shí)驗(yàn)，使用弗氏志賀氏菌2a、宋內(nèi)氏志賀氏菌或痢疾志賀氏菌1LPS。混合物在37℃搖動(dòng)溫育大約2小時(shí)。然后蛋白/LPS混合物稀釋至20mMTris-HCl、0.10MNaCl和1.2M尿素，以降低離子交換層析前NaCl濃度。接著稀釋的混合物在HiTrapTMQHP陰離子交換柱上純化。裝配實(shí)驗(yàn)弗氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物AR的形成通過(guò)將IpaC和IpaB蛋白保持在包含≥4M尿素的緩沖液中，初步裝配實(shí)驗(yàn)可通融IpaC的不溶性。一旦IpaC/IpaB混合物添加了LPS，可溶性不再是個(gè)問(wèn)題，其允許最終除去尿素。典型地純化的IpaC本身在稀釋時(shí)將沉淀。在初步混合實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)將8μMHisTagIpaC與1μMIpaB添加在1ml終體積中，保持8IpaC/IpaB的摩爾比。兩個(gè)蛋白起初都制備于20mMTris-HCl、0.5MNaCl、6M尿素，pH7.9中。在玻璃試管中混合蛋白并在37℃不搖動(dòng)溫育15分鐘。干燥L(fēng)PS(230μg)在分開(kāi)的玻璃管中也37℃不搖動(dòng)溫育15分鐘。溫育15分鐘后，用IpaB+IpaC混合物沿著管側(cè)面緩慢添加至蛋白混合物中，隨后渦旋來(lái)溶解預(yù)熱的LPS。沒(méi)有觀(guān)察到明顯的絮凝或沉淀。接著IpaB/IpaC/LPS混合物在37℃搖動(dòng)(200rpm)溫育2小時(shí)。在用于離子交換層析(IEC)的制備中，混合物用預(yù)熱的20mMTris緩沖液pH9.0稀釋5倍以降低鹽濃度?；旌衔锢鋮s至室溫時(shí)，沒(méi)有觀(guān)察到沉淀。對(duì)于最后的純化，稀釋的IpaB/IpaC/LPS混合物施加到陰離子交換柱(HiTrapTMQHP)，使用由20mMTris-HCl，pH9.0組成的緩沖液A，和由1MNaCl，20mMTris-HCl，pH9.0組成的緩沖液B，和階梯梯度0％(5柱體積)至24％(10柱體積)至50％(6柱體積)至100％緩沖液B(5柱體積)。從1mlHiTrapTMQHP柱收集1ml級(jí)分，洗脫流速1ml/分鐘。用點(diǎn)印跡(spotblot)分析每個(gè)步驟的級(jí)分中IpaB、IpaC和LPS的存在。50％B步驟中洗脫的弗氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物AR(圖2)，其中包含最大量的全部三個(gè)組分(IpaB、IpaC和LPS)，如Western印跡和銀染凝膠所測(cè)定(圖2A)。當(dāng)施加到大小排阻柱時(shí)，IpaB/IpaC/LPS復(fù)合物在1MDa和669kDa標(biāo)準(zhǔn)物之間洗脫，與HP侵襲素復(fù)合物是相同的大小范圍。痢疾志賀氏菌1人造侵襲素復(fù)合物的形成和更大規(guī)模生產(chǎn)重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，但反應(yīng)物增加十倍以增加侵襲素復(fù)合物AR產(chǎn)率。此外，用痢疾志賀氏菌1LPS代替弗氏志賀氏菌LPS。因此，含3.28mgIpaC的20mMTris-HCl、0.5MNaCl、6M尿素pH7.9與含0.62mgIpaB的20mMTris-HCl、0.5MNaClpH7.9混合，總體積5ml。蛋白混合物和LPS(2.1mg)的分開(kāi)管預(yù)熱至37℃。將IpaB+IpaC混合物添加到LPS管并渦旋以溶解LPS。沒(méi)有觀(guān)察到沉淀。反應(yīng)混合物在37℃搖動(dòng)(200rpm)溫育2小時(shí)。接下來(lái)，添加預(yù)熱的IEC緩沖液A(20mMTris-HCl，pH9.0)，1∶5稀釋鹽濃度，產(chǎn)生25ml的終體積。冷卻至室溫后，稀釋的反應(yīng)混合物施加到1mlHiTrapTMQHPIEC柱并經(jīng)受侵襲素復(fù)合物純化階梯梯度(參見(jiàn)上面)。痢疾志賀氏菌1侵襲素復(fù)合物AR在50％緩沖液B步驟中洗脫。它含有IpaB、IpaC和痢疾志賀氏菌LPS(圖2C)。0.24M和1.0MNaCl峰的分析沒(méi)有檢測(cè)到顯著量的IpaB、IpaC或LPS。侵襲素復(fù)合物AR生產(chǎn)的產(chǎn)率是用于啟動(dòng)裝配方法的總蛋白量的大約10至20％。對(duì)宋內(nèi)氏志賀氏菌已經(jīng)進(jìn)行了相似的裝配實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)生宋內(nèi)氏志賀氏菌的侵襲素復(fù)合物AR(參見(jiàn)圖2B)。弗氏志賀氏菌2a的侵襲素復(fù)合物AR的大規(guī)模生產(chǎn)反應(yīng)物增加五十倍用來(lái)生產(chǎn)更多侵襲素復(fù)合物AR進(jìn)行深入研究。使用8IpaC/1IpaB摩爾比，16.4mgIpaC(在20mMTris-HCl、0.5MNaCl、6M尿素，pH7.9中)與3.1mgIpaB(在20mMTris-HCl、0.5MNaCl，pH7.9中)混合，總體積20ml。該蛋白混合物和弗氏志賀氏菌2aLPS(11.4mg)的分開(kāi)管預(yù)熱至37℃。將該IpaB+IpaC混合物添加到LPS管并渦旋以溶解LPS。反應(yīng)混合物在37℃搖動(dòng)(200rpm)溫育2小時(shí)。接下來(lái)，添加預(yù)熱的IEC緩沖液A(20mMTris-HCl，pH9.0)，1∶5稀釋鹽濃度，產(chǎn)生100ml的終體積。冷卻至室溫后，稀釋的反應(yīng)混合物施加到5mlHiTrapTMQHPIEC柱并經(jīng)受侵襲素復(fù)合物純化階梯梯度(參見(jiàn)上面)。弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR在50％緩沖液B步驟中洗脫。它含有IpaB、IpaC和弗氏志賀氏菌2aLPS。0.24M和1.0MNaCl峰的分析沒(méi)有檢測(cè)到顯著量的IpaB、IpaC或LPS。侵襲素復(fù)合物AR生產(chǎn)的產(chǎn)率是用于啟動(dòng)裝配方法的總蛋白量的大約9％。電泳和Western印跡分析侵襲素復(fù)合物AR制備物的IpaB和IpaC通過(guò)染色的SDS-PAGE凝膠測(cè)定侵襲素復(fù)合物AR制備物的總蛋白組成。使用Western印跡測(cè)定IpaB和IpaC的存在、大小和相對(duì)濃度。使用銀染凝膠評(píng)價(jià)LPS譜[18]。使用IpaB或IpaC蛋白特異性的單克隆抗體探測(cè)硝酸纖維印跡[32]。用堿性磷酸酶-偶聯(lián)蛋白A探測(cè)后，用ASMx磷酸鹽(Sigma)和FastRedTR鹽(Sigma)使印跡顯色。使用CCD攝影機(jī)(Cohu)，印跡的視頻圖像顯示在Macintosh電腦上并用NIH影像軟件(1.62版)捕捉。用GelPro圖像分析軟件(2.0.10版，MediaCybernetics，Inc.)進(jìn)行數(shù)字影像的密度測(cè)定分析?？偟鞍啄z圖譜和IpaB和IpaC含量應(yīng)該與HP-侵襲素復(fù)合物24或HP-侵襲素復(fù)合物50中發(fā)現(xiàn)的類(lèi)似。大小排阻層析使用大小排阻層析測(cè)定離子交換峰中發(fā)現(xiàn)的侵襲素復(fù)合物AR的組分是否確實(shí)復(fù)合在一起。這是與用于生產(chǎn)HP-侵襲素復(fù)合物相同的方法。侵襲素復(fù)合物AR(大約3mg)加載到用藍(lán)色葡聚糖(BlueDextran)200(2MDa)、甲狀腺球蛋白(669kDa)和卵白蛋白(43kDa)校準(zhǔn)的Superose6HR10/30柱(AmershamPharmacia)上。收集各級(jí)分(0.5ml，流速0.25ml/分鐘)并用免疫點(diǎn)印跡分析IpaB、IpaC和LPS的存在。在2MDa和669kDa之間的級(jí)分中洗脫全部三個(gè)侵襲素復(fù)合物AR組分(IpaB、IpaC和LPS)，表明它們結(jié)合為復(fù)合物，因?yàn)樗鼈兿疵摰拇笮∵h(yuǎn)遠(yuǎn)大于單獨(dú)組分(IpaC43kDa；IpaB62kDa)。侵襲素復(fù)合物AR的SEC大小類(lèi)似于HP-侵襲素復(fù)合物洗脫物中的大小。評(píng)價(jià)內(nèi)在化組織培養(yǎng)模型中的痢疾志賀氏菌1侵襲素復(fù)合物AR侵襲素復(fù)合物與培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合并刺激該細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)吞作用。這個(gè)特性依賴(lài)于侵襲素IpaB和IpaC的存在和在內(nèi)吞過(guò)程中利用宿主細(xì)胞肌動(dòng)蛋白[38]。侵襲素復(fù)合物內(nèi)在化試驗(yàn)是用于測(cè)定侵襲素復(fù)合物制備物功能活性的體外模型。該試驗(yàn)仿照志賀氏菌噬菌斑法[39]和志賀氏菌吸收試驗(yàn)[40，41]。該試驗(yàn)包括侵襲素復(fù)合物AR與BHK-21成纖維細(xì)胞(60-70％匯合)在玻片(chamberslides)中溫育。溫育5、15、30或60分鐘后，用PBS洗滌細(xì)胞3次并用福爾馬林固定。固定的細(xì)胞用補(bǔ)充0.1％三硝基甲苯(Triton)X-100和0.1％BSA的PBS(洗滌緩沖液)滲透并用LPS、IpaB和IpaC特異性的多克隆小鼠血清探測(cè)。用GAM-IgG-俄勒岡綠(OregonGreen)488(分子探針(MolecularProbes))檢測(cè)結(jié)合的多克隆小鼠抗體，隨后用DAPI復(fù)染色以鑒定核。用帶數(shù)字圖像捕捉的熒光顯微術(shù)檢測(cè)侵襲素復(fù)合物處理的細(xì)胞。對(duì)天然和人造痢疾志賀氏菌1侵襲素復(fù)合物用相似的細(xì)胞質(zhì)染色模式，天然和人造痢疾志賀氏菌1侵襲素復(fù)合物都被BHK細(xì)胞內(nèi)在化，表明侵襲素復(fù)合物AR保持刺激通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的內(nèi)在化的能力(圖4)。這表明重組IpaB和IpaC與痢疾志賀氏菌1LPS裝配為離子交換FPLC分離的復(fù)合物產(chǎn)生了保持與天然復(fù)合物相同生物活性的合成產(chǎn)物。天然和人造侵襲素復(fù)合物疫苗的免疫原性、佐劑活性和保護(hù)性功效使用小鼠肺感染[31]和豚鼠角膜結(jié)膜炎模型[44]測(cè)定用弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR鼻內(nèi)免疫是否刺激有效對(duì)抗同種弗氏志賀氏菌2a攻擊的保護(hù)性免疫反應(yīng)。使用分開(kāi)的小鼠研究確定用宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物AR免疫是否可以保護(hù)對(duì)抗同種宋內(nèi)氏志賀氏菌攻擊和對(duì)抗弗氏志賀氏菌2a的異種攻擊。進(jìn)行另外的研究，使用卵白蛋白(OVA)作為免疫原評(píng)價(jià)侵襲素復(fù)合物AR的佐劑活性。在佐劑活性實(shí)驗(yàn)中，用OVA單獨(dú)免疫后誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)與OVA和天然侵襲素復(fù)合物、侵襲素復(fù)合物AR或霍亂毒素組合誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)進(jìn)行比較，所述天然侵襲素復(fù)合物、侵襲素復(fù)合物AR或霍亂毒素是已經(jīng)確定的有效粘膜佐劑。在WRAER，根據(jù)IACUC批準(zhǔn)的規(guī)程下進(jìn)行豚鼠和小鼠實(shí)驗(yàn)。小鼠實(shí)驗(yàn)已經(jīng)完成四個(gè)分開(kāi)的動(dòng)物試驗(yàn)，評(píng)價(jià)人造侵襲素復(fù)合物的免疫原性、佐劑活性和保護(hù)性功效。每個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用普通方法并在下列段落中概述。在單獨(dú)的章節(jié)中指出每個(gè)研究具體的方法和材料。免疫和攻擊在第0、14和28天免疫小鼠。25ml的總抗原體積以5至6小滴用微量吸管遞送施加到外鼻孔。在第0、28和42和攻擊后2周(第63天)，通過(guò)從全部小鼠尾巴放血而取血。在第35或42天將小鼠實(shí)施安樂(lè)死，立即收集粘膜洗出物并取出脾進(jìn)行體外增殖和細(xì)胞因子分析弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR。最后一次免疫后三周，用致死量(1.6×107cfu)弗氏志賀氏菌2a(2457T)或用宋內(nèi)氏志賀氏菌(Mosely，8×106cfu)如小鼠肺模型所述[34]鼻內(nèi)攻擊小鼠(每組15只)。鼻內(nèi)免疫或攻擊前，用鹽酸氯胺酮(40mg/kg)和甲苯噻嗪(12mg/kg)的混合物麻醉小鼠。每日監(jiān)測(cè)攻擊小鼠的重量減輕、皮毛起皺和嗜睡，監(jiān)測(cè)兩周，以死亡作為終點(diǎn)。幸存小鼠在攻擊后14天(第63天)放血。弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR免疫原性和保護(hù)性研究I在第0、14和28天用5ug天然弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物(批號(hào)JWJx)或2.5μg人造弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR(批號(hào)KF-D3D4)疫苗鼻內(nèi)免疫分開(kāi)組的雌性Balb/c小鼠(10-15只小鼠/組)。對(duì)照動(dòng)物接種鹽水。在第0、28、42和63天收集血液。在第49天鼻內(nèi)攻擊動(dòng)物。弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR免疫原性和保護(hù)性研究II在第0、14和28天用5ug天然弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物(批號(hào)JWJx)或2.5μg人造弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR(批號(hào)KR-C5)疫苗鼻內(nèi)免疫分開(kāi)組的雌性Balb/c小鼠(15-20只小鼠/組)。對(duì)照動(dòng)物接種鹽水。在第0、28、42和63天收集血液。第42天，從4只動(dòng)物/組收集肺和腸洗滌物。剩余動(dòng)物在第49天進(jìn)行鼻內(nèi)攻擊。弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR佐劑活性研究使用卵白蛋白(OVA)作為模型蛋白抗原，在小鼠中測(cè)定侵襲素復(fù)合物AR起粘膜佐劑作用的能力。在第0、14和28天用OVA(5μg)單獨(dú)、或OVA與弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR(批號(hào)KF-D3D4；2.5μg)、天然弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物(批號(hào)JWJx；5μg)或霍亂毒素(CT；5μg))組合對(duì)Balb/cByJ小鼠(5只小鼠/組)進(jìn)行鼻內(nèi)免疫。在第0、28和42天收集血液。對(duì)照動(dòng)物接種鹽水。第42天，收集肺和腸洗滌物。第0、28和42天通過(guò)ELISA測(cè)定侵襲素復(fù)合物24、侵襲素復(fù)合物50、LPS、OVA、IpaB和IpaC的特異性抗體的血清終點(diǎn)滴度。也評(píng)價(jià)粘膜洗滌物中的抗原特異性抗體。宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物AR免疫原性和保護(hù)性研究使用同種(宋內(nèi)氏志賀氏菌53G)和異種(弗氏志賀氏菌2a2457T)攻擊，在小鼠中測(cè)定宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物AR的免疫原性和保護(hù)性功效。在第0、14和28天用宋內(nèi)氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR(批號(hào)KF-D3D6；2.5μg)、天然宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物(批號(hào)JOJP；5μg)或天然弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物(批號(hào)JWJx；5μg)對(duì)Balb/cByJ小鼠(10-15只小鼠/組)進(jìn)行鼻內(nèi)免疫。對(duì)照動(dòng)物接種鹽水。在第0、28和42天收集血液。豚鼠實(shí)驗(yàn)用人造或天然侵襲素復(fù)合物疫苗(25ug/劑)鼻內(nèi)免疫豚鼠(Hartley種系，每組6至10只)。該劑量體積(100ul)等量分在每個(gè)鼻孔之中。使用鹽水免疫對(duì)照動(dòng)物。在第0、14和28天免疫豚鼠和第0、28、42天和攻擊后14天從耳緣靜脈取血。鼻內(nèi)免疫前，用氯胺酮(40mg/kg)和甲苯噻嗪(4mg/kg)的混合物麻醉豚鼠。第三次免疫后三周，用弗氏志賀氏菌2a(菌株2457T)眼內(nèi)攻擊豚鼠，每天觀(guān)察，觀(guān)察5天，如前描述[44]評(píng)價(jià)炎癥和角膜結(jié)膜炎的程度。ELISA使用ELISA試驗(yàn)測(cè)定血清和粘膜分泌物中的抗原特異性IgA和IgG抗體，所述分泌物包括來(lái)自免疫和/或攻擊的小鼠和豚鼠的肺和腸灌洗物和糞便提取物[18，29，46]。ELISA中使用的抗原，包括純化的弗氏志賀氏菌2aLPS、宋內(nèi)氏志賀氏菌LPS、水提取的志賀氏菌抗原、純化的IpaB和IpaC蛋白和弗氏志賀氏菌2a天然侵襲素復(fù)合物和OVA包被在ImmunlonIB96孔ELISA板(ThermoLab系統(tǒng))上，4℃過(guò)夜。用2％酪蛋白(在Tris-緩沖鹽pH7.5中)封閉后，血清和粘膜洗滌物一式兩份連續(xù)稀釋并與抗原包被板25℃溫育4小時(shí)。用含0.05％吐溫20的PBS洗滌后，用堿性磷酸酶偶聯(lián)抗小鼠IgG或抗小鼠IgA(Kirkegaard&Perry)探測(cè)抗原特異性抗體。用對(duì)硝基苯基磷酸酯(1mg/ml)檢測(cè)堿性磷酸酶活性。在底物中溫育30分鐘后，使用ELISA平板讀數(shù)器(分子診斷，MenloPark，CA)測(cè)定光密度(OD405)。測(cè)定每一動(dòng)物的終點(diǎn)滴度并用于計(jì)算在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組的幾何平均滴度。典型地，與預(yù)免疫樣品或鹽水對(duì)照動(dòng)物相比，用侵襲素復(fù)合物鼻內(nèi)免疫的動(dòng)物對(duì)志賀氏菌抗原的應(yīng)答是4至8倍高的血清(IgG和IgA)和粘膜(肺和腸)IgA滴度。總IgA試驗(yàn)使用捕捉酶免疫測(cè)定法測(cè)定粘膜樣品中的總IgA濃度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)確定樣品濃度，平行使用純化的小鼠IgA試驗(yàn)。用每個(gè)單獨(dú)粘膜樣品的終點(diǎn)滴度除以同一樣品中總IgA濃度來(lái)計(jì)算特異性粘膜IgA活性[47]。來(lái)自侵襲素復(fù)合物AR免疫的小鼠的培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的抗原刺激使用從侵襲素復(fù)合物免疫小鼠和天然小鼠收集的脾細(xì)胞測(cè)定抗原刺激后淋巴細(xì)胞增殖。單核細(xì)胞(每孔2×105)與侵襲素復(fù)合物、IpaB或IpaC或弗氏志賀氏菌2aLPS制備物溫育。同時(shí)在分開(kāi)的微滴定孔中，用伴刀豆球蛋白A刺激脾細(xì)胞以提供陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照包括單獨(dú)與完全培養(yǎng)基溫育的細(xì)胞和來(lái)自用抗原刺激的天然小鼠的細(xì)胞。用抗原溫育4至7天后，使用MTS(Promega)非放射性評(píng)定脫氫酶活性來(lái)測(cè)定細(xì)胞增殖[48]。在這個(gè)試驗(yàn)中光密度讀數(shù)增加和孔中活細(xì)胞數(shù)量有強(qiáng)烈相關(guān)性。測(cè)定增殖前，第3和5天收集細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行細(xì)胞因子測(cè)定(參見(jiàn)下文)?？乖碳ぜ?xì)胞的平均光密度除以?xún)H培養(yǎng)基刺激細(xì)胞的平均光密度來(lái)計(jì)算刺激指數(shù)(SI)。將侵襲素復(fù)合物免疫小鼠的細(xì)胞的SI與非免疫小鼠的細(xì)胞的SI相比較。侵襲素復(fù)合物AR鼻內(nèi)免疫后抗原特異性的全身抗體反應(yīng)在小鼠中評(píng)價(jià)人造弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物(侵襲素復(fù)合物AR)的免疫原性，所述人造弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物由單獨(dú)純化組分而不是有毒力生物(天然侵襲素復(fù)合物)制備。第0、14和28天，用天然弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物24(5或10μg)、侵襲素復(fù)合物AR(2.5μg)、純化的IpaB(2.5μg)、純化的IpaC(2.5μg)、LPS(2.5μg)或鹽水鼻內(nèi)免疫小鼠組(n＝6-10)。第三次免疫后三周(第49天)，用弗氏志賀氏菌2a(2457T)攻擊小鼠。第0、28、42和63天收集的血液通過(guò)ELISA分析對(duì)侵襲素復(fù)合物50、侵襲素復(fù)合物24、純化的LPS、IpaB和IpaC的血清IgG和IgA反應(yīng)。圖5和6概括了第42天(第三次免疫后兩周)收集的血液中測(cè)定的血清IgG和IgA終點(diǎn)滴度。接種鹽水的小鼠和來(lái)自免疫小鼠免疫前的血清沒(méi)有可檢測(cè)水平的抗原特異性抗體(數(shù)據(jù)未顯示)。用弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR免疫誘導(dǎo)出可比得上用天然侵襲素復(fù)合物24所誘導(dǎo)的量級(jí)的對(duì)侵襲素復(fù)合物50和侵襲素復(fù)合物24的血清IgG和IgA反應(yīng)(圖5)，并且顯著高于(p＜0.001)用鹽水接種后所誘導(dǎo)的。在第42天測(cè)定，使用增加兩倍量的天然侵襲素復(fù)合物(批號(hào)JWJx)免疫沒(méi)有引起侵襲素復(fù)合物50、LPS或侵襲素復(fù)合物24特異性血清IgG或IgA反應(yīng)的大小增加(圖5)。用純化的IpaB免疫引起強(qiáng)烈的IpaB特異性(圖6)和侵襲素復(fù)合物24特異性反應(yīng)(分別地GMT＞5760和3800)和對(duì)侵襲素復(fù)合物50的中等反應(yīng)(GMT950)。用純化的LPS免疫在疫苗組的大多數(shù)(5/6)小鼠中沒(méi)有誘導(dǎo)出可檢測(cè)到的對(duì)ELISA使用的任何抗原的血清IgG或IgA反應(yīng)。類(lèi)似地，用純化的IpaC免疫也沒(méi)有誘導(dǎo)出對(duì)所試驗(yàn)任何抗原的可檢測(cè)到的免疫反應(yīng)，包括IpaC特異性ELISA。有趣的是，用侵襲素復(fù)合物AR免疫的小鼠具有最高的IpaC-特異性終點(diǎn)滴度(圖6和8)，顯著高于(p＜0.001)用天然侵襲素復(fù)合物免疫后誘導(dǎo)的那些。用侵襲素復(fù)合物AR鼻內(nèi)免疫后保護(hù)小鼠不受弗氏志賀氏菌致死攻擊的損害致死肺模型需要用致死量志賀氏菌鼻內(nèi)接種小鼠，其建立肺感染，引起嚴(yán)重的體重減輕、肺炎并在兩周觀(guān)察期期間最終死亡。用弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR或天然侵襲素復(fù)合物鼻內(nèi)免疫后三周，用致死量弗氏志賀氏菌2a(菌株2457T)攻擊小鼠。天然小鼠(用鹽水處理)中，13只小鼠中11只死亡，平均最大體重減輕占攻擊前重量的31.4％(參見(jiàn)表1)。用弗氏志賀氏菌2a致死攻擊，用弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR(p＜0.001)或天然侵襲素復(fù)合物(p＜0.001)免疫的全部小鼠幸存。關(guān)于體重減輕(其可能是保護(hù)性免疫更敏感的指示)，用侵襲素復(fù)合物AR免疫的小鼠減輕的它們攻擊前重量(21.3％)少于天然侵襲素復(fù)合物免疫的小鼠的體重減輕(23.8％至26.0％)。此外，體重反彈日(從攻擊中恢復(fù)的征兆)對(duì)于侵襲素復(fù)合物AR是7天，和13天(天然侵襲素復(fù)合物，5μg)或7天(天然侵襲素復(fù)合物，10μg)。此外，也評(píng)價(jià)小鼠致死肺模型中用于組建侵襲素復(fù)合物AR的單獨(dú)組分(IpaB、IpaC和LPS)的保護(hù)性能力(參見(jiàn)表1)。用純化的LPS和純化的IpaC免疫沒(méi)有保護(hù)小鼠不死亡(兩者P都＞0.05)，盡管用IpaB免疫保護(hù)6只小鼠中5只免于致死攻擊的損害，但是直到觀(guān)察期末，小鼠再未恢復(fù)體重并且保持有癥狀的(低體重、起皺皮毛)。攻擊后體重減輕平均最大值對(duì)于LPS是29.9％，對(duì)于IpaB是31.0％和對(duì)于IpaC是33.9％，它們?nèi)糠浅＝咏谔烊恍∈篌w重減輕值31.4％。用致死量弗氏志賀氏菌2a攻擊侵襲素復(fù)合物AR小鼠的結(jié)果表明侵襲素復(fù)合物AR刺激出可比得上或超過(guò)天然侵襲素復(fù)合物的保護(hù)水平。此外，看來(lái)需要IpaB、IpaC和LPS的復(fù)合物，因?yàn)閱为?dú)組分不能刺激完全有效的保護(hù)性免疫反應(yīng)。表1.用弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR或天然侵襲素復(fù)合物免疫的小鼠的致死攻擊1。1.最后一次免疫后三周，用1.5×107cfu弗氏志賀氏菌2a鼻內(nèi)攻擊，每天監(jiān)測(cè)體重減輕和癥狀，監(jiān)測(cè)14天。保護(hù)％＝[(％死亡對(duì)照-％死亡疫苗)/％死亡對(duì)照]×100*Fisher精確檢驗(yàn)侵襲素復(fù)合物AR鼻內(nèi)免疫后抗原特異性粘膜抗體反應(yīng)用ELISA評(píng)價(jià)第35天從弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR或天然侵襲素復(fù)合物免疫小鼠收集的腸和肺洗滌物的抗原特異性IgA水平。用侵襲素復(fù)合物AR免疫誘導(dǎo)出可比得上用天然侵襲素復(fù)合物免疫所誘導(dǎo)水平的LPS水平和侵襲素復(fù)合物特異性腸IgA(圖7)，和顯著更高水平(p＜0.001)的IpaB特異性IgA。用任何侵襲素復(fù)合物疫苗制備物免疫后引發(fā)最低的IpaC特異性腸IgA(表7和8)。侵襲素復(fù)合物AR鼻內(nèi)免疫在肺中引發(fā)針對(duì)LPS、侵襲素復(fù)合物50、IpaB和IpaC的強(qiáng)烈抗體反應(yīng)(圖8和表7和8)。用天然侵襲素復(fù)合物免疫后在肺中誘導(dǎo)出最低水平的LPS特異性IgA，未檢測(cè)到侵襲素復(fù)合物50、IpaB和IpaC特異性抗體水平。用侵襲素復(fù)合物AR鼻內(nèi)免疫后，抗原特異性細(xì)胞增殖反應(yīng)和分泌的細(xì)胞因子圖譜用侵襲素復(fù)合物24、IpaB或IpaC體外刺激從第35天免疫小鼠收集的脾細(xì)胞，以評(píng)價(jià)誘導(dǎo)的抗原特異性細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。與抗原溫育后細(xì)胞的增殖表明預(yù)先暴露和免疫記憶。非特異性活化T細(xì)胞增殖的伴刀豆球蛋白A(ConcavalinA)(ConA)用作陽(yáng)性對(duì)照以證明活細(xì)胞水平。用ConA刺激后的刺激指數(shù)(SIs)范圍從13.8到15.9(表2)。來(lái)自接種鹽水的動(dòng)物的細(xì)胞在與侵襲素復(fù)合物、IpaB或IpaC溫育后沒(méi)有增殖。用侵襲素復(fù)合物AR免疫的動(dòng)物(4/4)的脾細(xì)胞與侵襲素復(fù)合物(SI＝10.2)、IpaB(SI＝8.7)和IpaC(SI＝6.9)溫育后增殖，表明存在對(duì)這些抗原的免疫記憶。用侵襲素復(fù)合物AR免疫的各組中IpaB和IpaC特異性增殖反應(yīng)顯著高于(P＜0.01)天然侵襲素復(fù)合物免疫的各組中的增殖反應(yīng)。天然侵襲素復(fù)合物免疫的4/4動(dòng)物的脾細(xì)胞在與侵襲素復(fù)合物溫育后增殖(SI＝6.8)。用天然侵襲素復(fù)合物免疫的小鼠的脾細(xì)胞在體外(exvivo)與IpaB(1/4小鼠)或IpaC(0/4小鼠)溫育后，其中存在低至不可檢測(cè)到的增殖水平。表2.體外刺激后用弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR或天然侵襲素復(fù)合物鼻內(nèi)免疫的小鼠脾細(xì)胞的抗原特異性細(xì)胞增殖。a用ConA體外刺激3天后和用弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物24(批號(hào)JWJX)、IpaB或IpaC體外刺激5天后測(cè)定脾細(xì)胞中的增殖反應(yīng)。b(批號(hào)；免疫劑量)c平均刺激指數(shù)±ISD(應(yīng)答者數(shù)量/組中總數(shù)量)*與接種鹽水的組相比，P＜0.05(非配對(duì)t檢驗(yàn))。**與天然侵襲素復(fù)合物免疫的組相比，P＜0.01(非配對(duì)t檢驗(yàn))。證實(shí)使用不同批次侵襲素復(fù)合物AR用侵襲素復(fù)合物AR鼻內(nèi)免疫后保護(hù)小鼠不受弗氏志賀氏菌致死攻擊的損害用不同批次的弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR重復(fù)描述小鼠致死肺模型中侵襲素復(fù)合物AR的保護(hù)的實(shí)驗(yàn)。此外，與兩個(gè)純化組分的混合物(IpaB+IpaC；IpaB+LPS；IpaC+LPS)免疫的小鼠一起重復(fù)純化組分的評(píng)價(jià)。對(duì)于這次攻擊，用稍微高一點(diǎn)兒的弗氏志賀氏菌2a(菌株23457T)攻擊劑量(1.6×106cfu)鼻內(nèi)接種小鼠。在首次用于實(shí)驗(yàn)的(naive)小鼠(用鹽水處理的)中，14只小鼠中14只死亡，最大平均體重減輕占攻擊前體重的34.5％(參見(jiàn)表3)。用弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR免疫的小鼠在用弗氏志賀氏菌致死攻擊中幸存(14只有13只幸存；p＜0.001)，而用天然侵襲素復(fù)合物免疫的小鼠對(duì)于這個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用的攻擊劑量具有低得多的存活率(參見(jiàn)表3)。至于體重減輕，侵襲素復(fù)合物AR免疫的小鼠的體重減輕占它們攻擊前重量(26.6％)，與天然侵襲素復(fù)合物免疫小鼠的體重減輕31.6％和鹽水接種小鼠的34.5％相比較少。用于組建侵襲素復(fù)合物AR的單獨(dú)組分(IpaB、IpaC和LPS)或多對(duì)純化組分的保護(hù)能力證實(shí)之前的結(jié)果，即IpaC和LPS沒(méi)有保護(hù)性。純化的IpaB也沒(méi)有保護(hù)性(參見(jiàn)表3)。兩個(gè)純化組分的混合物得到IpaB+LPS組合和IpaC+LPS組合的保護(hù)性，而IpaB+IpaC組合保護(hù)性不完全。評(píng)價(jià)侵襲素復(fù)合物AR保護(hù)能力的第二次實(shí)驗(yàn)結(jié)果清楚表明侵襲素復(fù)合物AR刺激的保護(hù)水平超過(guò)天然侵襲素復(fù)合物的水平。此外，看來(lái)單獨(dú)組分(IpaB、IpaC或LPS)不能刺激完全有效的保護(hù)性免疫反應(yīng)。表3.弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR或天然侵襲素復(fù)合物免疫的小鼠的致死攻擊11.最后一次免疫后三周，用1.6×107cfu弗氏志賀氏菌2a鼻內(nèi)攻擊小鼠，每天監(jiān)測(cè)體重減輕和癥狀，監(jiān)測(cè)14天。2.保護(hù)％＝[(％死亡對(duì)照-％死亡疫苗)/％死亡對(duì)照]×1003.Fisher精確檢驗(yàn)(FisherExactTest)宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物AR小鼠免疫原性和保護(hù)性研究。ELISA測(cè)定針對(duì)宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物50、宋內(nèi)氏志賀氏菌LPS、IpaB和IpaC的血清抗體反應(yīng)。接種鹽水的小鼠(陰性對(duì)照)在第42天沒(méi)有可檢測(cè)水平的抗原特異性血清IgG或IgA(表4)。用宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物AR和天然侵襲素復(fù)合物免疫后達(dá)到相似的宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物50和LPS特異性血清IgG和IgA終點(diǎn)滴度(表4)。與天然宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物免疫小鼠組(GMT546)相比，宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物AR免疫的小鼠組具有較高水平的IpaB特異性血清IgG(GMT＞5760，P＜0.001)。侵襲素復(fù)合物AR免疫的動(dòng)物具有1091的抗IpaC血清IgG平均滴度(P＜0.001)，而天然侵襲素復(fù)合物或鹽水免疫的動(dòng)物沒(méi)有可檢測(cè)水平的IpaC特異性IgG。表4.宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物AR或天然宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物50鼻內(nèi)免疫后第42天小鼠中抗原特異性血清IgG和IgA終點(diǎn)滴度a組6b組3c終點(diǎn)滴度幾何均數(shù)±1標(biāo)準(zhǔn)差d使用自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換的終點(diǎn)滴度的雙向ANOVA分析完成組間比較。*與天然宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物50相比，p＜0.05**與天然宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物50相比，p＜0.001宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物AR鼻內(nèi)免疫后，保護(hù)小鼠不受宋內(nèi)氏志賀氏菌或異種弗氏志賀氏菌致死攻擊的損害使用小鼠致死肺模型也對(duì)由純化宋內(nèi)氏志賀氏菌LPS和重組IpaB和IpaC制備的侵襲素復(fù)合物AR的侵襲素復(fù)合物AR保護(hù)能力。它與天然宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物比較。此外，還評(píng)價(jià)了宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物AR保護(hù)對(duì)抗異種弗氏志賀氏菌攻擊的能力。在首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠(用鹽水處理的)中，15只小鼠中15只死亡，最大平均體重減輕占攻擊前體重的23.4％(參見(jiàn)表5)。宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物AR免疫的小鼠在用宋內(nèi)氏志賀氏菌致死攻擊中幸存(15只中15只幸存；p＜0.001)，而用天然侵襲素復(fù)合物免疫的小鼠也顯示出堅(jiān)實(shí)保護(hù)(14只中14只幸存，P＜0.001)(參見(jiàn)表5)。至于重量減輕，宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物AR免疫的小鼠的體重減輕較它們攻擊前重量減輕7.7％，相比之下，天然宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物免疫小鼠的體重減輕9.2％和鹽水接種小鼠體重減輕23.4％。有趣的是，宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物AR也提供了對(duì)抗異種弗氏志賀氏菌2a攻擊的顯著保護(hù)(15只攻擊小鼠15只幸存，P＜0.001))提示對(duì)IpaB或IpaC的免疫反應(yīng)可能顯著有助于保護(hù)性免疫反應(yīng)評(píng)價(jià)宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物AR保護(hù)能力的這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果清楚表明來(lái)自另一個(gè)志賀氏菌種的侵襲素復(fù)合物AR刺激出可比得上天然侵襲素復(fù)合物的保護(hù)水平。表5.宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物AR或天然宋內(nèi)氏志賀氏菌侵襲素復(fù)合物免疫的小鼠的致死攻擊1.同種和異種免疫的刺激1.最后一次免疫后三周，用1.6×107cfu弗氏志賀氏菌2a或8×106cfu宋內(nèi)氏志賀氏菌鼻內(nèi)攻擊小鼠，如所指出的。每天監(jiān)測(cè)體重減輕和癥狀，監(jiān)測(cè)14天。2.保護(hù)％＝[(％死亡對(duì)照-％死亡疫苗)/％死亡對(duì)照]×1003.Fisher精確檢驗(yàn)使用豚鼠角膜結(jié)膜炎模型，用弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR保護(hù)豚鼠。使用豚鼠角膜結(jié)膜炎模型評(píng)價(jià)志賀氏菌疫苗，豚鼠角膜結(jié)膜炎模型常常用作人體試驗(yàn)的前身。該模型包括用志賀氏菌感染豚鼠眼睛，在角膜上皮形成感染。這個(gè)結(jié)果(嚴(yán)重的角膜結(jié)膜炎)是志賀氏菌侵入角膜上皮和隨后宿主產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)的結(jié)果，與人腸道中觀(guān)察到的不同。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR或者天然侵襲素復(fù)合物鼻內(nèi)免疫豚鼠三次。也使用鹽水對(duì)照組。最后一次免疫三周后，用弗氏志賀氏菌2a通過(guò)眼睛攻擊動(dòng)物。侵襲素復(fù)合物AR(90保護(hù)％，P＜0.001)和天然侵襲素復(fù)合物(100保護(hù)％，P＜0.001)都提供了堅(jiān)實(shí)保護(hù)(參見(jiàn)表6)，表明侵襲素復(fù)合物AR比得上天然侵襲素復(fù)合物。表6.使用角膜結(jié)膜炎模型，用弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR保護(hù)豚鼠不受志賀氏菌感染的損害。1.用1×108cfu的弗氏志賀氏菌2a眼內(nèi)攻擊豚鼠。感染后5天如Hartman等[44]所述評(píng)價(jià)眼睛的角膜結(jié)膜炎。2.保護(hù)％＝[(％發(fā)病對(duì)照-％發(fā)病疫苗)/％發(fā)病對(duì)照]×1003.Fisher精確檢驗(yàn)弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR小鼠佐劑活性研究。OVA單獨(dú)或OVA與CT組合鼻內(nèi)免疫，或來(lái)自免疫動(dòng)物的免疫前樣品(0天)沒(méi)有誘導(dǎo)出對(duì)弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物50、弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物24(圖9)、弗氏志賀氏菌2aLPS(圖10)、IpaB或IpaC(圖11)特異性的可檢測(cè)水平的血清IgG或IgA。用OVA與侵襲素復(fù)合物AR或天然侵襲素復(fù)合物組合免疫，誘導(dǎo)出相似的侵襲素復(fù)合物50、侵襲素復(fù)合物24和LPS特異性的血清IgG和IgA終點(diǎn)滴度(圖9和10)。與用OVA+天然侵襲素復(fù)合物免疫的小鼠相比，在OVA+侵襲素復(fù)合物AR免疫的小鼠中，抗純化的IpaB(p＜0.05)和IpaC(p＜0.001)的終點(diǎn)滴度較高(圖11)。在用OVA與侵襲素復(fù)合物AR、天然侵襲素復(fù)合物或CT組合免疫的小鼠中，第42天引發(fā)出可比較水平的OVA特異性血清IgG和IgA，并顯著高于(p≤0.001)OVA單獨(dú)免疫后在小鼠中引發(fā)的反應(yīng)(圖12)。還通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)肺洗滌物中抗原特異性抗體，以研究免疫后誘導(dǎo)的粘膜免疫反應(yīng)(圖13)。與用OVA與天然侵襲素復(fù)合物組合免疫后的反應(yīng)相比，OVA與侵襲素復(fù)合物AR組合免疫在肺洗滌物中誘導(dǎo)出相似水平的LPS和侵襲素復(fù)合物24特異性IgG和IgA，并高于OVA單獨(dú)或OVA與CT組合免疫后誘導(dǎo)的水平。在OVA與侵襲素復(fù)合物AR、天然侵襲素復(fù)合物或CT組合免疫后，誘導(dǎo)出相似水平的OVA特異性肺IgG和IgA，其顯著(p≤0.001)高于OVA單獨(dú)免疫后誘導(dǎo)的水平。在用OVA與侵襲素復(fù)合物AR或天然侵襲素復(fù)合物組合免疫的小鼠的洗滌物中檢測(cè)到腸洗滌物中中等水平的LPS和侵襲素復(fù)合物特異性IgA(數(shù)據(jù)未顯示)，在OVA單獨(dú)或OVA與CT組合免疫的小鼠中未檢測(cè)到。在所有試驗(yàn)樣品中，OVA特異性腸IgA反應(yīng)低于檢測(cè)水平。表7.用弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物或侵襲素復(fù)合物AR鼻內(nèi)免疫小鼠后，抗IpaB和抗IpaC的血清(第42天)和粘膜(第35天)抗體水平a弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR小鼠研究I中的血清反應(yīng)來(lái)自第42天收集的血液。弗氏志賀氏菌2a侵襲素復(fù)合物AR佐劑活性研究中的血清反應(yīng)來(lái)自第35天收集的血液。b幾何均數(shù)±1平均標(biāo)準(zhǔn)差(n＝5只小鼠/組)(終點(diǎn)滴度范圍)*與天然侵襲素復(fù)合物免疫的動(dòng)物的終點(diǎn)滴度相比，顯著更高的終點(diǎn)滴度(對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換的終點(diǎn)滴度的單向ANOVA；p≤0.001)。ND未檢測(cè)；TBD待檢測(cè)表8用天然侵襲素復(fù)合物、侵襲素復(fù)合物AR或IpaB和IpaC的混合物鼻內(nèi)免疫的豚鼠中第42天的抗原特異性血清IgG和IgA終點(diǎn)滴度a弗氏志賀氏菌2aGMP穩(wěn)定性和侵襲素復(fù)合物AR豚鼠研究中的血清反應(yīng)來(lái)自第42天收集的血液。用于細(xì)胞內(nèi)遞送的與抗生素或其他治療分子復(fù)合的人造侵襲素復(fù)合物的形成和評(píng)價(jià)方法很多治療生物化學(xué)劑，包括抗生素，常常對(duì)細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)無(wú)效，因?yàn)樗鼈儾荒芡ㄟ^(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜或因?yàn)樗鼈冃枰募?xì)胞外濃度高，以使哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)達(dá)到治療濃度。人造侵襲素復(fù)合物提供了制造侵襲素、LPS和抗生素的復(fù)合物的機(jī)制，通過(guò)在裝配期混合組分以制造人造侵襲素復(fù)合物。一旦裝配好，侵襲素復(fù)合物的天然性質(zhì)允許它將復(fù)合的抗生素或治療分子輸送入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。純化的可溶IpaB和IpaC(它們各自在它們的最終緩沖液中)以IpaC/IpaB摩爾比率為8混合在一起。IpaB和IpaC混合后，將抗生素例如慶大霉素的溶液以5至100μg/ml添加至混合物中。接下來(lái)，將IpaB、IpaC和抗生素溶液緩慢加入干燥L(fēng)PS粉末中(LPS與總蛋白的比率是0.56)?？梢允褂脕?lái)自任何志賀氏菌種的LPS；對(duì)于描述的實(shí)驗(yàn)，使用弗氏志賀氏菌2a、宋內(nèi)氏志賀氏菌或痢疾志賀氏菌1LPS。該混合物在37℃搖動(dòng)溫育大約2小時(shí)。然后將蛋白/LPS/抗生素混合物稀釋至20mMTris-HCl、0.10MNaCl和1.2M尿素以降低離子交換層析前NaCl的濃度。對(duì)于最后的純化，將稀釋的IpaB/IpaC/LPS/抗生素混合物施加到陰離子交換柱(HiTrapTMQHP)上，使用的緩沖液A由20mMTris-HClpH9.0組成，緩沖液B由1MNaCl、20mMTris-HClpH9.0組成，和階梯梯度0％(5個(gè)柱體積)至24％(10個(gè)柱體積)至50％(6個(gè)柱體積)至100％緩沖液B(5個(gè)柱體積)。從1mlHiTrapTMQHP柱以1ml/分鐘的洗脫流速收集1ml級(jí)分。通過(guò)點(diǎn)印跡分析每個(gè)階梯的級(jí)分中IpaB、IpaC和LPS的存在。含IpaB、IpaC和LPS的級(jí)分是人造侵襲素復(fù)合物級(jí)分。人造侵襲素復(fù)合物-抗生素復(fù)合物的有效性以其殺死細(xì)胞內(nèi)微生物(例如在組織培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)的志賀氏菌)的能力來(lái)評(píng)價(jià)。人造侵襲素復(fù)合物-抗生素復(fù)合物與感染志賀氏菌的組織培養(yǎng)細(xì)胞共同溫育。2至24小時(shí)后，將通過(guò)將所處理的細(xì)胞(和未處理的對(duì)照細(xì)胞)的裂解物平鋪在胰蛋白酶大豆瓊脂平板上測(cè)定細(xì)胞內(nèi)志賀氏菌的數(shù)量，從而測(cè)定用人造侵襲素復(fù)合物-抗生素復(fù)合物處理的細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)殺死水平。上文的進(jìn)一步變型和改進(jìn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的并且意欲包括在后附權(quán)利要求中。參考文獻(xiàn)隨后的參考文獻(xiàn)在說(shuō)明書(shū)中以數(shù)字標(biāo)識(shí)。這些文獻(xiàn)中每一篇的內(nèi)容以理解本發(fā)明所需的程度明白地引入這里。1.Kottoff，K.L.，JP.Winickoff，B.Ivanoff，J.D.Clemens，D.L.Swerdlow，PJ.Sansonetti，G.K.Adak，和M.M.Levine，GlobalburdenofShigellainfectionsimplicationsforvaccinedevelopmentandimplementationofcontrolstrategies.Bull.WHO，1999.77.651-666.2.Vahaboglu，H.，S.Gundes，A.Karadenizli，B.Mutlu，S.Cetin，F(xiàn).Kolayli，F(xiàn).Coskunkan，和V.Dundar，TransientincreaseindiarrhealdiseasesafterthedevastatingearthquakeinKocaeli，Turkeyresultsofaninfectiousdiseasesurveillancestudy.Clin.Infect.Dis.，2000.31(6).1386-1389.3.Koster，F(xiàn).，J.Levin，L.Walker，K.S.K.Tung，R.H.Gilman，M.M.Rahaman，M.A.Majid，S.Islam，和R.C.Williams，Hemolytic-uremicsyndromeaftershigellosisRelationtoendotoxemiaandcirculatingimmunecomplexes.NewEnglandJ.Med.，1978.298(17).927-933.4.Talukder，K.A.，D.K.Dutta，A.Safa，M.Ansaruzzaman，F(xiàn).Hassan，K.Alam，K.M.N.Islam，N.I.A.Carlin，G.B.Nair，和D.A.Sack，AlteringTrendsintheDominanceofShigellaflexneriSerotypesandEmergenceofSerologicallyAtypicalS.StrainsinDhaka，Bangladesh.J.lin.Microbiol.，2001.39(10).3757-3759.5.Hoge，CW.，J.M.Gambel，A.Srijan，C.Pitarangsi，和P.Echeverria，TrendsinantibioticresistanceamongdiarrhealpathogensisolatedinThailandover15years.Clin.Infect.Dis.，1998.26(2).341-345.6.Sarkar，K.，S.Ghosh，S.K.Niyogi，和S.K.Bhattacharya，Shigelladysenteriaetype1withreducedsusceptibilitytofluoroquinolones.TheLancet，2003.361(9359).785.7.DuPont，H.L.，M.M.Levine，R.B.Homick，和S.B.Formal，Inoculumsizeinshigellosisandimplicationsforex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fù)合物，其中所述血清型特異性脂多糖組分包括選自至少兩種不同血清型的革蘭氏陰性細(xì)菌的兩種或更多種脂多糖。12.權(quán)利要求1的人造侵襲素復(fù)合物，其中所述IpaC和IpaB以0.08∶1至80∶1的范圍內(nèi)的比率存在。13.權(quán)利要求12的人造侵襲素復(fù)合物，其中所述比率范圍是0.8∶1至20∶1。14.權(quán)利要求13的人造侵襲素復(fù)合物，其中所述比率是大約8∶1。15.權(quán)利要求1的人造侵襲素復(fù)合物，其中所述LPS相對(duì)于總蛋白(IpaB和IpaC)以選自0.01∶1至10∶1的范圍內(nèi)的比率存在。16.權(quán)利要求15的人造侵襲素復(fù)合物，其中所述比率的范圍是從0.5∶1至5∶1。17.權(quán)利要求16的人造侵襲素復(fù)合物，其中所述比率是大約0.5∶1。18.權(quán)利要求1的人造侵襲素復(fù)合物，進(jìn)一步包含標(biāo)記的檢測(cè)劑、抗生素、治療劑或生物分子。19.權(quán)利要求18的人造侵襲素復(fù)合物，其中所述生物分子包括蛋白質(zhì)、酶、多糖或核酸。20.一種制備人造侵襲素復(fù)合物的方法，包括A)將IpaB、IpaC或等同侵襲素與至少一種與革蘭氏陰性細(xì)菌血清型相關(guān)的脂多糖組合以形成人造侵襲素復(fù)合物；和B)回收所述人造侵襲素復(fù)合物。21.權(quán)利要求20的方法，其中步驟A)以?xún)蓚€(gè)分開(kāi)的混合步驟進(jìn)行，所述兩個(gè)分開(kāi)的混合步驟包括混合IpaB和IpaC以形成IpaB:IpaC復(fù)合物和將所述IpaB:IpaC復(fù)合物與至少一種脂多糖(LPS)混合，以形成人造侵襲素復(fù)合物。22.權(quán)利要求20的方法，其中所述IpaB是r-IpaB并且IpaC是r-IpaC。23.權(quán)利要求20的方法，其中IpaC和IpaB以選自0.08∶1至80∶1的范圍內(nèi)的比率存在。24.權(quán)利要求20的方法，其中所述LPS相對(duì)于總蛋白(IpaC和IpaB)以選自0.01∶1至10∶1的范圍內(nèi)的比率存在。25.一種組合物，包含權(quán)利要求1的人造侵襲素復(fù)合物和藥學(xué)上可接受的載體。26.權(quán)利要求25的組合物，其另外包含免疫原。27.權(quán)利要求25的組合物，其中存在的人造侵襲素復(fù)合物足以增強(qiáng)對(duì)免疫原的免疫反應(yīng)或使該免疫反應(yīng)多樣化。28.權(quán)利要求25的組合物，其中存在的人造侵襲素復(fù)合物的量足以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)。29.權(quán)利要求25的組合物，其中所述人造侵襲素復(fù)合物進(jìn)一步包含標(biāo)記的檢測(cè)劑、抗生素、治療劑或生物分子。30.權(quán)利要求29的組合物，其中所述生物分子包括蛋白質(zhì)、酶、多糖或核酸。31.一種組合物，包含權(quán)利要求11的人造侵襲素復(fù)合物和藥學(xué)上可接受的載體。32.一種使受試者免疫的方法，包括將有效量的權(quán)利要求1的人造侵襲素復(fù)合物施用于受試者。33.一種使受試者免疫的方法，包括將有效量的權(quán)利要求11的人造侵襲素復(fù)合物施用于受試者。34.一種將分子跨越細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)姆椒?，包括在?quán)利要求1的人造侵襲素復(fù)合物的存在下，使細(xì)胞接觸所述分子。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述分子是標(biāo)記的檢測(cè)劑、抗生素、治療劑或生物分子。36.一種將標(biāo)記的檢測(cè)劑、抗生素、治療劑或生物分子跨越細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)姆椒?，包括使?xì)胞接觸權(quán)利要求18的人造侵襲素復(fù)合物。37.權(quán)利要求36的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)所述標(biāo)記的檢測(cè)劑、抗生素、治療劑或生物分子的存在。全文摘要從純化或重組制備的侵襲素和革蘭氏陰性細(xì)菌脂多糖制備了人造侵襲素復(fù)合物。典型地，IpaB與IpaC混合形成IpaB:IpaC復(fù)合物。然后這個(gè)侵襲素蛋白復(fù)合物與脂多糖混合形成人造侵襲素復(fù)合物。制備過(guò)程中可以將另外的生物活性分子結(jié)合到該復(fù)合物中。這個(gè)人造侵襲素復(fù)合物在功能上類(lèi)似天然侵襲素復(fù)合物24或侵襲素復(fù)合物50。該人造侵襲素復(fù)合物具有相對(duì)于天然復(fù)合物更優(yōu)越的免疫原性并可以裁剪(taylor)制備。它的制備方法適于其大規(guī)模制備。該人造侵襲素復(fù)合物可以以與天然志賀氏菌侵襲素復(fù)合物類(lèi)似的方式促進(jìn)生物分子、治療劑和抗生素跨越細(xì)胞膜的輸送。文檔編號(hào)A61K39/108GK101711165SQ200780053096公開(kāi)日2010年5月19日申請(qǐng)日期2007年3月27日優(yōu)先權(quán)日2007年3月27日發(fā)明者埃德溫·V·奧克斯,凱文·R·特比菲爾,羅伯特·W·卡閔斯基申請(qǐng)人:以沃爾特里德軍事研究所的名義,由美國(guó)陸軍部部長(zhǎng)為代表的美國(guó)政府