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用于預(yù)防和治療眼部病癥的內(nèi)皮分化基因亞家庭3(edg-3,s1p3)受體的拮抗劑的制作方法

文檔序號(hào):1222272閱讀:227來(lái)源:國(guó)知局

專利名稱::用于預(yù)防和治療眼部病癥的內(nèi)皮分化基因亞家庭3(edg-3,s1p3)受體的拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及用于減弱內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的組成物的領(lǐng)域,所述減弱用來(lái)在涉及CTGF積累的眼部病癥中下調(diào)受體信號(hào)傳導(dǎo)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)產(chǎn)生的下游減少。
背景技術(shù)
:大多數(shù)眼部病癥與包括細(xì)胞增殖、存活、遷移、分化和血管生成的細(xì)胞過(guò)程有關(guān)。CTGF被認(rèn)為是作為這些細(xì)胞過(guò)程中的中心中介體的一種分泌的細(xì)胞因子。尤其是,已知CTGF通過(guò)I型膠原蛋白和纖連蛋白的儲(chǔ)存增加來(lái)增加細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生。暗示CTGF的過(guò)量表達(dá)是例如硬皮病、纖維增生性疾病和細(xì)胞外基質(zhì)成分過(guò)量積累的瘢痕的病況中的主要致病因素。在小梁網(wǎng)(TM)區(qū)域中的細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)量積累是某些形式青光眼的標(biāo)志;認(rèn)為這種增加導(dǎo)致對(duì)水流出阻力的增加以及因此提高的眼內(nèi)壓(IOP)。屬于Fleenor等人在2003年11月13日作為W003/092584公布并轉(zhuǎn)讓給Alcon,Inc.的國(guó)際專利申請(qǐng)序號(hào)PCT/US2003/012521描述了相對(duì)正常TM細(xì)胞,在青光眼的TM細(xì)胞中CTGFmRNA的存在升高。于是,認(rèn)為CTGF在小梁網(wǎng)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生中起作用小梁網(wǎng)(TM)是一種復(fù)合組織,其包括內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)締組織和位于角膜和虹膜之間夾角的提供維持正常IOP所需的正常阻力的細(xì)胞外基質(zhì)。需要適當(dāng)?shù)腎OP來(lái)維持眼的形狀并且提供壓力梯度從而允許眼房水流進(jìn)入無(wú)血管的角膜和晶狀體。通常在青光眼中出現(xiàn)的過(guò)高IOP,對(duì)視神經(jīng)具有有害作用,引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和軸突的損失,并導(dǎo)致漸進(jìn)的視覺(jué)喪失而且如不治療可導(dǎo)致失明。青光眼是世界范圍內(nèi)失明的首要原因之一。原發(fā)性青光眼起因于具有解剖學(xué)、生物化學(xué)或生理基礎(chǔ)的眼房水流的擾亂。繼發(fā)性青光眼發(fā)生是眼睛的損傷或創(chuàng)傷或先在疾病的結(jié)果。原發(fā)性開(kāi)角型青光眼(P0AG),也就是所知的慢性或簡(jiǎn)單型青光眼,占美國(guó)所有原發(fā)性青光眼的90%。P0AG的特征為導(dǎo)致對(duì)眼的流體排水的異常高阻力的TM病理改變。這種阻力的結(jié)果是IOP的增加。已知例如潑尼松、地塞米松和氫化可的松的某些藥物通過(guò)提高IOP誘導(dǎo)青光眼。此外,施用方式似乎影響IOP。例如,地塞米松的眼內(nèi)施用比全身性施用導(dǎo)致IOP的更強(qiáng)的升高。由施用類固醇導(dǎo)致的青光眼被稱為類固醇誘導(dǎo)的青光眼。目前抗青光眼的治療通過(guò)使用藥物治療來(lái)壓制眼房水形成或促進(jìn)水流出來(lái)降低IOP,也可通過(guò)手術(shù)程序,例如激光小梁成形術(shù)、或小梁切除術(shù)來(lái)改善水排出。藥物性抗青光眼方法已經(jīng)顯現(xiàn)多種不希望的副作用。例如,縮瞳劑(如匹魯卡品)可引起視覺(jué)模糊和其他負(fù)面的局部副作用。全身性使用碳酸酐酶抑制劑可引起惡心、消化不良、疲勞和代謝性酸中毒。此外,已將p-阻斷劑與肺部副作用聯(lián)系起來(lái)是由于其對(duì)肺部組織中的p-2受體的作用。Alpha2-激動(dòng)劑可引起心動(dòng)過(guò)速、心律不齊和高血壓。這類負(fù)面的副作用可導(dǎo)致患者依從性的降低或治療終止。公布于2005年10月20日屬于Fleenor等人的美國(guó)公布專利申請(qǐng)序號(hào)2005/0234075(將其通過(guò)引用并入本文),提供了GSK-3和CDK抑制劑對(duì)在人小梁網(wǎng)細(xì)胞中基礎(chǔ)的以及TGFP2誘導(dǎo)的CTGF的表達(dá)具有抑制活性。黃斑變性是在中央視網(wǎng)膜的部分(稱為黃斑)的光受體的丟失,黃斑負(fù)責(zé)高敏銳視覺(jué)。黃斑的變性與細(xì)胞外基質(zhì)組分在視網(wǎng)膜色素上皮與脈管脈絡(luò)膜之間的膜上的異常沉積有關(guān)。這種碎片樣物質(zhì)稱為脈絡(luò)膜小疣。通過(guò)眼底檢查觀察到脈絡(luò)膜小疣。正常眼睛可具有無(wú)脈絡(luò)膜小疣的黃斑,然而在視網(wǎng)膜周邊有豐富的脈絡(luò)膜小疣。在黃斑視覺(jué)無(wú)任何損失的情況下,黃斑上柔軟脈絡(luò)膜小疣的存在被認(rèn)為是早期AMD。除其他眼部病癥之外,在黃斑變性中通常還發(fā)生脈絡(luò)膜新生血管形成,并其與脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)量產(chǎn)生以及維管亞視網(wǎng)膜形成有關(guān)。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖和血管生成因子的產(chǎn)生似乎影響脈絡(luò)膜新生血管形成。糖尿病性視網(wǎng)膜病變是一種在糖尿病中由于毛細(xì)血管基底膜增厚癥。周細(xì)胞的丟失增加毛細(xì)血管的滲漏并引起血-視網(wǎng)膜屏障的瓦解。膜和纖維性膜的細(xì)胞增殖有關(guān)。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖和遷移常見(jiàn)于此眼部病癥中。與增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變有關(guān)的膜包含細(xì)胞外基質(zhì)組分,例如I、II和IV型膠原蛋白以及纖連蛋白,并逐漸地變成纖維變性(fibroUc)。創(chuàng)傷愈合病癥可引起嚴(yán)重的眼組織損害,其通過(guò)炎性細(xì)胞的激活、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子釋放、眼細(xì)胞的增殖和分化、毛細(xì)血管滲透性的增加、基底膜基質(zhì)組成物的改變、細(xì)胞外基質(zhì)沉積(deposition)的增加、纖維化、新生血管形成和組織重塑。鑒于如上所述的眼部病癥的重要性,尤其是小梁網(wǎng)的病理?yè)p害和由于細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)量產(chǎn)生造成的損害,需要有一種治療這些眼部病癥的改良的方法來(lái)解決其進(jìn)展的潛在原因。本文所有縮寫(xiě)包括:AC腺苷酸環(huán)化酶AP-1激活蛋白1轉(zhuǎn)錄因子CTGF結(jié)締組織生長(zhǎng)因子DG二?;视虴dg3內(nèi)皮分化基因亞家族3受體,見(jiàn)S1P3ERK細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶G12/13,Gq/11,Gi鳥(niǎo)噪呤核苷酸結(jié)合蛋白亞類IOP眼內(nèi)壓IP3三磷酸肌醇LPA溶血磷脂酸PAI-1纖溶酶原激活物抑制劑1PKC蛋白激酶CPLC磷脂酶CPLD磷脂酶DRaf蛋白激酶raf-lRas小GTP-結(jié)合蛋白R(shí)ho小GTP-結(jié)合蛋白SIP鞘氨醇-l-磷酸S1P3或S1PR3鞘氨醇-1-磷酸受體3Smad-l、-2、-3受體調(diào)節(jié)的Smad轉(zhuǎn)錄因子Smad—4^〉共伴4呂(commonpartner,Co—)Smad轉(zhuǎn)錄因子TGFP轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子PTGFPR、TpRI、TpRII轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子e受體、I型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子p受體、II型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子p受體本發(fā)明概述本發(fā)明探討本領(lǐng)域如上所述的問(wèn)題并且提供了一種通過(guò)提供SIP-3受體的拮抗劑用于減弱受試者眼內(nèi)的Smad信號(hào)傳導(dǎo)的方法。減弱受試者眼內(nèi)的Smad信號(hào)傳導(dǎo)的方法包括向受試者施用一種組成物,該組合物含有有效量的內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的拮抗劑或其藥物學(xué)可接受的鹽、以及藥物學(xué)可接受的載體。從而減弱受試者眼內(nèi)的Smad信號(hào)傳導(dǎo)。受試者可能具有導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)慕Y(jié)締組織生長(zhǎng)因子積累的Smad信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)眼部病癥或處于發(fā)展成這類眼部病癥的危險(xiǎn)中。Smad信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)眼部病癥可以是例如高眼壓、青光眼、青光眼性視網(wǎng)膜病變、視神經(jīng)病變、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變或眼創(chuàng)傷愈合。內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的拮抗劑降低天然配體與該受體的結(jié)合。所述拮抗劑包括該受體的天然配體的類似物一一鞘氨醇-l-磷酸。該拮抗劑可為取代的噻唑烷、取代的噢溱烷(thiazinane)、或具有如下所述結(jié)構(gòu)III的S1P類似物。所述拮抗劑可為例如蘇拉明的多磺化萘脲、對(duì)S1P3受體具有結(jié)合親和性和特異性的抗體、其生物活性片段、或?qū)λ鍪荏w具有結(jié)合親和性和特異性的肽或擬肽。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種治療與有此需要的受試者體內(nèi)的不適當(dāng)?shù)慕Y(jié)締組織生長(zhǎng)因子積累關(guān)聯(lián)的Smad信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)眼部病癥的方法。所述方法包括向受試者施用一種組成物,所述組成物包含有效量的內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的拮抗劑或其藥物學(xué)可接受的鹽,以及藥物學(xué)可接受的載體。從而治療Smad信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)眼部病癥。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,提供一種在受試者中治療青光眼的方法。所述方法包括向受試者施用一種組成物,該組成物包含有效量的內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的拮抗劑或其藥物學(xué)可接受的鹽,以及藥物學(xué)可接受的栽體,其中青光眼從而被治療。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中,提供了一種治療受試者中的青光眼性視網(wǎng)膜病變、視神經(jīng)病變、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變或眼創(chuàng)傷愈合的方法。所述方法包括向受試者施用一種組成物,該組成物包含有效量的內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的拮抗劑或其藥物學(xué)可接受的鹽,以及藥物學(xué)可接受的載體。青光眼性視網(wǎng)膜病變、視神經(jīng)病變、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變或眼創(chuàng)傷愈合從而被治療。附圖簡(jiǎn)述圖1提供了顯示信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的示意圖,其包括SlP和Smad,并包括TGF-(3和Smad;S1P-1、-2、-3、S1P受體;TGF卩R、l型和2型TGF-p受體(改編自Xin等人,潔,Vol.279(34):35255-35262,2004;Blom:等人,"/o/o^r,Vol.21:473-482,2002;Takuwa,Y.,^r.oc力/邁"/o;力/sJc".,Vol.1582:112—120,2002;Pyne等人,^/oc力e/z/,Vol.349:385-402,2000;和Xu等人,^"a尸/sr則co/57".,Vol.25:849-854,2004)。圖2A和圖2B。存在多種量的內(nèi)源Edg受體激動(dòng)劑S1P(圖2A)或存在多種量的S1P結(jié)構(gòu)類似物FTY720(圖2B)的情況下,使用(空?qǐng)A圏)或不使用(實(shí)圓團(tuán))Edg3受體亞型拮抗劑CAY10444來(lái)處理人小梁網(wǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物。24小時(shí)之后,是如實(shí)施例2中所述通過(guò)對(duì)來(lái)自的處理后培養(yǎng)物的上清等份試樣的ELISA確定分泌的PAI-1蛋白的水平。發(fā)明詳述SlP-3(Edg-3)受體屬于LPA或S1P作為其內(nèi)源配體的G蛋白偶聯(lián)受體家族。LPA是Edg-2、-4、和-7受體的配體而SlP是Edg-1、-3、-5、-6、和-8受體的配體。國(guó)際藥理學(xué)聯(lián)合會(huì)已經(jīng)將Edg受體重新命名為S1P(Chun等人,戶力ar軀o/執(zhí)Vol.54:265-269,2002)。因此,如本文所用,術(shù)語(yǔ)"Edg受體"是術(shù)語(yǔ)"S1P受體,,的同義詞。圖l提供了S1P受體與調(diào)節(jié)靶標(biāo)Smad之間以及TGFp受體和相同的調(diào)節(jié)靶標(biāo)Smad之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系的示意圖。Smad通過(guò)磷酸化激活并且與Smad4形成復(fù)合物以產(chǎn)生一個(gè)異源復(fù)合物,所述異源復(fù)合物進(jìn)入核內(nèi),其中該復(fù)合物與其他轉(zhuǎn)錄因子一起激活基因轉(zhuǎn)錄,例如編碼CTGF的基因的轉(zhuǎn)錄。較之于"正常,,眼睛,從青光型人眼中收集到的眼房水中發(fā)現(xiàn)顯著更高水平的TGFp2同種型(Tripathi等人,^r/7f/eiw,Vol.59(6):723—727,1994;Inatani等人,Crae尸esj"力輛Ma/邁o/,Vol.239(2):109-113,2001;Picht等人,toe尸e"rc/C72./3^77^7力Ma7/z/o厶Vol.239(3):199-207,2001;Ochiai等人,/;w/。/7雄"邁o/,Vol.46(3):249-253,2002)。此外,在灌注人眼前段模型中TGFp2可以激起IOP的大幅增加(Fleenor等人,/"mW0;力M"邁o/P7"c/,Vol.47(1):226-234,2006)。因此,TGF|3,尤其是TGFJ32,似乎在IOP相關(guān)病變?nèi)缜喙庋壑衅鹬虏∽饔谩1P-3受體似乎在腎系膜細(xì)胞中激活S隨d信號(hào)傳導(dǎo)通路(Xin等人,/戶力s7vzaco7,Vol.147:164-174,2006)。另外,已知Smad蛋白介導(dǎo)通過(guò)TGF亞家族成員激活的標(biāo)準(zhǔn)信號(hào)通路,包括TGF-(3信號(hào)通路(由圖l所示)。因此,SlP-3誘導(dǎo)的Smad蛋白信號(hào)激活似乎模擬了一些已知受TGFp調(diào)控的細(xì)胞反應(yīng)。此外,已知TGFP和S1P都增強(qiáng)CTGF的表達(dá)(Xin等人,2004/cT.,Katsumaetal.,尸i^5^e〃ei^,Vol.579:2576-2582,2005),CTGF似乎是在青光眼過(guò)程中起重要作用的一個(gè)蛋白(屬于Fleenor等人在2003年11月13日作為WO03/092584公布并轉(zhuǎn)讓給Alcon,Inc.的國(guó)際專利申請(qǐng)序號(hào)PCT/US2003/012521)。因?yàn)門GFI3在組織中既有正面作用又有反面作用,所以希望得到TGF)3/S1P3信號(hào)通路的選擇性調(diào)制。正面作用包括,例如,TGFp作為抗炎劑、作為免疫抑制劑、以及作為T細(xì)胞遷移和歸巢的促進(jìn)劑。本文提供了這種選擇性調(diào)制。本發(fā)明人在本文提供了眼部S1P3受體的拮抗劑,所述拮抗劑導(dǎo)致經(jīng)由Smad受體的信號(hào)傳導(dǎo)降低,由此降低下游的CTGF積累。本文所提供的Smad下游通路的調(diào)制導(dǎo)致TGF(3信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)面的降低,同時(shí)保留TGFp的正面信號(hào)傳導(dǎo)效用基本上不受影響。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了拮抗S1P3受體結(jié)合從而干擾S1P3下游信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián),并尤其干擾Smad信號(hào)傳導(dǎo)的方法,所述方法用于治療其中Smad蛋白信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)慕Y(jié)締組織生長(zhǎng)因子積累的眼部病癥,。沖發(fā)為VA差厲亞家族憂雄(^/^-義57戶-"S1P-3受體的拮抗劑包括減弱S1P-3受體和其天然配體S1P之間的結(jié)合親和力或特異性的試劑。所述拮抗劑可以是S1P類似物。拮抗劑可以是取代的噢唑烷,尤其是烷基取代的噻唑烷或芳基烷基取代的噻唑烷;取代的噻溱烷,尤其是烷基取代的噻溱烷;多磺化萘脲,例如蘇拉明(最常見(jiàn)可得的是六鈉鹽;或具有如下所述結(jié)構(gòu)III的S1P類似物;對(duì)于S1P3受體具有結(jié)合特異性和親和力的抗體、其生物活性抗體片段、肽或擬肽;或拮抗劑的藥物學(xué)可接受的鹽。本文所述拮抗劑可以是外消旋混合物、非對(duì)映體或?qū)τ丑w。"拮抗劑的藥物學(xué)可接受的鹽"是保持S1P3受體拮抗活性并為人體可接受的拮抗劑的鹽。因?yàn)楸疚牡霓卓箘┛删哂邪被螋然〈?,所以鹽可以是酸性鹽或堿性鹽。取代的噻唑烷具有結(jié)構(gòu)I:HI其中R,為C6-C13烷基、或取代為C5-C9烷基的烷基取代的芳基。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,所述拮抗劑具有結(jié)構(gòu)I,其中R,為d。烷基或Cu烷基,(2-烷基噻唑坑-4-羧酸,其中烷基為d。或Cu)。當(dāng)R,為Cn烷基,所述拮抗齊'J為通過(guò)商業(yè)途徑從CaymanChemical(AnnArbor,Michigan)獲得的CAY10444。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中,所述拮抗劑具有結(jié)構(gòu)I,其中Ri是烷基-取代的苯基,并且苯環(huán)上的取代為邁-或;t~C廣烷基,也就是(2-(t或^"庚基苯基)瘞唑烷-4-羧13本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中,S1P3的拮抗劑具有結(jié)構(gòu)II:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中R2為C9-C13烷基。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中,S1P3的拮抗劑具有結(jié)構(gòu)III:其中R3為o-或iC廠"烷基;并且l是磷酸脂、磷酸脂類似物、膦酸酯或硫酸酯。本文所用"磷酸類似物"包括術(shù)語(yǔ)例如硫代磷酸脂、二硫代磷酸脂、硒代磷酸脂、二硒代磷酸脂、phosphoro-anilothioates、磷酸酰苯胺、氨基磷酸脂或磷酸硼2005年10月6日公布的屬于Lynch等人的美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2005/0222422(通過(guò)引用并入本文)以及Koide等人C力e邁,Vol.45:4629-4638,2002描述了S1P3信號(hào)傳導(dǎo)中有活性的其他化合物,。用于鑒定另外的S1P3受體拮抗劑的測(cè)定法使用竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定,所述測(cè)定包括組合候選拮抗劑、S1P、S1P3受體和對(duì)活化的S1P3受體具有活性的激酶,并測(cè)量所得磷酸化S1P3受體的量。將結(jié)果與在不存在候選拮抗劑的相同試驗(yàn)中所獲得的磷酸化S1P3受體的量相比較。當(dāng)磷酸化S1P3受體水平低于候選拮抗劑不存在時(shí)的水平,候選拮抗劑具有拮抗活性。進(jìn)一步的測(cè)定包括如下測(cè)定通過(guò)候選拮抗劑抑制受體特異性的抗體結(jié)合、通過(guò)候選拮抗劑減少CTGFmRNA的積累、或通過(guò)候選拮抗劑減少CTGF蛋白的積累。先前通過(guò)引用并入本文的2005年10月6日公布的屬于Lynch等人的美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2005/0222422,描述了用來(lái)測(cè)量SIP模擬物對(duì)人的SIP受體的SIP活性的GTP結(jié)合測(cè)定。使用本領(lǐng)域所知的方法合成取代的噻唑烷和取代的噻嗪烷,例如Koide等人描述的方法(/C力e邊,Vol.45:4629-4638,2002)。先前通過(guò)引用并入本文的2005年10月6日公布的屬于Lynch等人的美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2005/0222422描述了具有結(jié)構(gòu)III的SIP類似物的合成。市場(chǎng)上可買到對(duì)于S1P3受體具有結(jié)合特異性和親和性的抗體,例如鼠的單克隆抗體可從GENETEX,Inc.(CatalogNumberGTX12254,SanAntonio,TX)獲得,針對(duì)鞘脂受體Edg3/SlP3的兔多克隆抗體可從NovusBiologiesInc.(CatalogNumberNLS1031,Littleton,CO)獲得,而且EDG-3CT抗體可從ExalphaBiologicals,Inc.(WatertownMA)獲得。EDG-3CT對(duì)于人S1P3受體的獨(dú)特的C端肽具有結(jié)合親和性和特異性。也通過(guò)觀察在眼部病癥中的改善推斷人和哺乳動(dòng)物中S1P-3受體的拮抗作用以及產(chǎn)生的對(duì)CTGF積累的抑制作用。例如在年齡相關(guān)的黃斑變性中,視覺(jué)喪失的減緩和逆轉(zhuǎn)表明了CTGF積累的抑制作用,以及在青光眼患者中,在具有發(fā)展為青光眼的危險(xiǎn)的受試者中眼內(nèi)壓的降低和癥狀發(fā)生的延遲或預(yù)防表明了CTGF積累的抑制作用。本發(fā)明的拮抗刑可與用于治療CTGF積累或活性不適當(dāng)?shù)难鄄坎“Y的其他試劑組合使用,例如先前通過(guò)引用并入本文的2005年10月20日公布的屬于Fleenor等人的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?005/0234075描述的試劑。滋>55^#4:使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)將拮抗劑直接遞送到眼部(例如局部的眼部滴劑或軟骨劑;在官隆(cul-de-sac)中或植入臨近鞏膜(穿鞏膜)或在眼內(nèi)的緩釋裝置;眼周的、結(jié)膜的、筋膜下(sub—Tenons)、前眼房?jī)?nèi)(intracameral)、玻璃體內(nèi)、視網(wǎng)膜下、眼球后的、或小管內(nèi)注射)或全身性的遞送(例如口服;靜脈內(nèi)的、皮下的或肌肉內(nèi)的注射;腸胃外的、真皮遞送)。還包括本發(fā)明的拮抗劑可配制在一個(gè)定位裝置中例如視網(wǎng)膜丸劑、眼內(nèi)插入物、導(dǎo)管、栓劑或含有多空的、非多孔的或凝膠狀的材料的植入裝置。前眼房?jī)?nèi)注射可通過(guò)角膜進(jìn)入眼前房從而允許實(shí)際到達(dá)小梁網(wǎng)。小管內(nèi)注射可進(jìn)入鞏膜靜脈竇的排水靜脈收集通道或進(jìn)入鞏膜靜脈竇。愛(ài)試者需要治療眼部病癥或處于發(fā)展為眼部病癥的危險(xiǎn)中的受試者是具有與CTGF不適當(dāng)積累的Smad激活相關(guān)的病況或處于具有所述病況的危險(xiǎn)中的人或其他哺乳動(dòng)物。這種眼部病癥包括,例如,高眼壓、青光眼、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變、眼創(chuàng)傷愈合、以及具過(guò)度瘢痕、內(nèi)皮細(xì)胞增殖或纖維化增殖的病況。與這些病癥相關(guān)的眼部結(jié)構(gòu)包括例如視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、晶狀體、角膜、小梁網(wǎng)、視桿、視錐、神經(jīng)節(jié)、黃斑、虹膜、鞏膜、眼房、玻璃體小室、睫狀體、視神經(jīng)盤、視神經(jīng)乳頭或中央凹。W^和浙量藥物制劑包括拮抗劑、或其鹽,如本文所述多至重量99%的生理可接受的眼部的載體介質(zhì)混合,如水、緩沖劑、鹽水、甘氨酸、透明質(zhì)酸、甘露醇及諸如此類。本發(fā)明各方面包括的可能制劑的實(shí)例如下<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>化合物以重量%計(jì)量S1P-3受體拮抗劑多至99;0.1-99;0.1-50;0.5-10.0;0.01-5.0;0.01-2.0;0.02-2.0;0.1-1.0;0.5-2.0;0.001磷酸二氫鈉0.05磷酸氫二鈉(無(wú)水)0.15氯化鈉0.75二鈉EDTA0.05聚氧乙烯蓖麻油0.1苯扎氯胺0.01HC1和/或NaOHpH7.3-7.4純水適量至100%化合物以重量y。計(jì)量S1P-3受體拮抗劑多至99;0.1-99;0.1-50;0.5-10.0;0.01-5.0;0.01-2.0;0.02—2.0;0.1-1.0;0.5-2.0;0.0005磷酸緩沖鹽水1.0羥丙基-P-環(huán)糊精4.0純水適量至100%在另外的一個(gè)實(shí)施方案中,眼用的組合物經(jīng)配置以提供拮抗劑的眼內(nèi)濃度約0.1-100納摩爾(nM)或,在另外的一個(gè)實(shí)施方案中是l-10nM的拮抗劑。依據(jù)熟練的臨床醫(yī)師的常規(guī)的酌情決定將局部組合物每日l(shuí)-4次遞送到眼部表面。制劑的pH應(yīng)為4-9或4.5-7.4。全身性制劑可含有約10-1000mg的拮抗劑。"有效量"指能夠干擾S1P-3受體與Smad之間的結(jié)合的S1P-3受體拮抗劑的量。此干擾導(dǎo)致Smad活性的降低、CTGF基因轉(zhuǎn)錄的降低、CTGF蛋白積累的降低以及由此產(chǎn)生的受試者中眼部病癥的癥狀減輕。此干擾延遲或預(yù)防處于發(fā)展成本文所述的眼部病癥的危險(xiǎn)中的受試者中癥狀的發(fā)生。制劑的有效量依賴于如受試者的年齡、種族和性別或例如眼部狀況的嚴(yán)重程度的因素。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述拮抗劑以治療劑量局部遞送到眼部并到達(dá)小梁網(wǎng)、視網(wǎng)膜或視神經(jīng)頭從而改善眼部病癥的進(jìn)展。17T接愛(ài)辨裁'伴眼用可接受的載體指那些最多引起極少至沒(méi)有眼部刺激、如果需要可提供合適的保護(hù)、并以均質(zhì)劑量遞送本發(fā)明的一種或多種S1P-3拮抗劑的載體。對(duì)于眼部遞送,SlP-3拮抗劑可以與眼科用可接受的防腐劑、共溶劑、表面活性劑、增稠劑、滲透促進(jìn)劑、緩沖劑、氯化鈉、或水組合形成一種水相的無(wú)菌的眼用混懸液或溶液。眼用溶液制劑可通過(guò)將拮抗劑溶解在生理可接受的等滲水緩沖劑中來(lái)制備。另外,眼用溶液可包括眼科用可接受的表面活性劑來(lái)輔助溶解拮抗劑。粘度生成試劑,如羥曱基纖維素、羥乙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或諸如此類,可添加到本發(fā)明的組合物中以增強(qiáng)化合物的保留。為了制備無(wú)菌的眼用軟膏制劑,將S1P-3拮抗劑與在合適載體(如礦物油、液態(tài)羊毛脂或白礦脂)中的防腐劑組合。依據(jù)用于其他眼用制劑的為本領(lǐng)域所知的方法,無(wú)菌的眼用凝膠制劑可通過(guò)將S1P-3拮抗劑懸浮在親水基質(zhì)中制備,所述親水基質(zhì)從例如CARBOPOL-940(BFGoodrich,Charlotte,NC)或諸如此類的組合中制備而成。例々口VISC0AT⑧(AlconLaboratories,Inc.,FortWorth,TX)可用于眼內(nèi)注射。在SlP-3拮抗劑在眼中滲透性較低的情況下,本發(fā)明的其他組合物含有滲透促進(jìn)劑如乳浮(cremophor)和TWEE^80(聚氧乙烯山梨醇酐單月硅酸酯,SigmaAldrich,St.Louis,MO)。試浙盒;本發(fā)明的實(shí)施方案提供了包括用于減弱細(xì)胞內(nèi)的S1P3受體信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗劑的試劑盒。所述試劑盒包括含本發(fā)明拮抗劑的密封的一個(gè)或多個(gè)容器、藥物學(xué)可接受的載體以及可選的印刷使用說(shuō)明。實(shí)施例1對(duì)SlP-刺激的CTGF基因表達(dá)的抑制Edg3受體拮抗作用對(duì)培養(yǎng)的人小梁網(wǎng)細(xì)胞中CTGF基因表達(dá)的作用可如下確定。用或不用刺激性量的鞘氨醇-l-磷酸(SIP)以及用或不用Edg3受體拮抗劑對(duì)轉(zhuǎn)化的或非轉(zhuǎn)化的人TM細(xì)胞培養(yǎng)物處理一定的時(shí)間(Pang等人,Cf/iTAes,Vol.13:51-63,1994;Steely等人,//zmW0//^Aa//z7o/r/s&/,Vol.33:2242-2250,1992;Wilson等人,C"r""麵Vol.12:783-793,1993;Stamer等人,Ci/rri/eies,Vol.14:611-617,1995)。用必需稀釋度的載體處理另外的培養(yǎng)物以用作對(duì)照。使用QiagenRNeasy96系統(tǒng)依照制造商的使用說(shuō)明(Qiagen)從TM細(xì)胞中分離總RNA?;旧先缦惹八?Shepard等人,IOVS,Vol.42:3173,2001)使用ABIPrism7700SequenceDetectionSystem(AppliedBiosystems),通過(guò)定量實(shí)時(shí)RT-PCR(QRT-PCR)驗(yàn)證細(xì)胞處理后的CTGF的差異表達(dá)。如屬于Fleenor等人于2004年10月8日提交的USSN10/510,585、于2005年10月20日公布的美國(guó)公布專利申請(qǐng)?zhí)?0050234075所述,^f吏用PrimerExpress軟件(AppliedBiosystems)設(shè)計(jì)用于CTGF擴(kuò)增的引物以退火到Genbank收錄號(hào)#賜001901.1的鄰近的外顯子上,從而產(chǎn)生76-bp的擴(kuò)增子。CTGF的擴(kuò)增相對(duì)于18S核糖體RNA表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,其中使用如屬于F1eenor等人的美國(guó)公布專利申請(qǐng)?zhí)?0050234075所述(同上)針對(duì)18SrRNA基因(GenBank收錄號(hào)#X03205)設(shè)計(jì)的引物來(lái)產(chǎn)生69-bp擴(kuò)增子。CTGFQRT-PCR與18S引物/探針集一起以50ul終體積進(jìn)行多重執(zhí)行,所述終體積由40nM18S或900nMCTGF引物;lOOnM18S探針或lOOnMCTGF;5ulRNA;IXMultiscribeandRNaseInhibitorMix(ABI);以及IXTaqManUniversalMix(ABI)組成。熱循環(huán)條件由481C30min和95"C10min,隨后40個(gè)循環(huán)的95t:15sec和60X:1min構(gòu)成。用SDS軟件1.9.1版本(AppliedBiosystems)和MSExcel2002(Microsoft)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用PEBiosystemsUserBulletin#2中所述的AACt法進(jìn)行相對(duì)RNA濃度的定量。用四份QRT-PCR測(cè)定的平均土SEM表示擴(kuò)增產(chǎn)物的水平。用SDS軟件1.9.1版本(AppliedBiosystems)和MSExcel97(Microsoft)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)施例2對(duì)SlP-刺激的細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白表達(dá)中的變化的抑制Edg3受體拮抗劑對(duì)培養(yǎng)的人小梁網(wǎng)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白表達(dá)的作用如下確定。將人TM細(xì)胞培養(yǎng)物分成重復(fù)的和/或?qū)嶒?yàn)組和/或?qū)φ战M,向其中加入對(duì)照溶液或?qū)嶒?yàn)溶液,所述溶液含有稀釋載體(作為對(duì)照)和/或S1P(作為刺激劑)和/或Edg3受體拮抗劑。隨后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)試每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物組中細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的水平,例如纖連蛋白、纖溶酶原激活物抑制劑I(PAI-1)、膠原蛋白、肌原纖蛋白、玻連蛋白、層纖連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白I、蛋白聚糖或整合素。此測(cè)定為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知并且是靈敏的免疫測(cè)定,其使用連接至抗體或抗原的酶作為檢測(cè)特定蛋白的標(biāo)簽。通過(guò)這些方法,在組之間比較不同的細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的水平用來(lái)確定試驗(yàn)溶液的作用。圖M和卩B顯示了Edg3受體對(duì)處理后的人TM細(xì)胞培養(yǎng)物而來(lái)的上清中PAI-1的水平的拮抗作用的一個(gè)實(shí)例。對(duì)于這些研究,在不同量的內(nèi)源Edg受體激動(dòng)劑S1P存在時(shí)和/或在不同量的一種S1P結(jié)構(gòu)類似物FTY720存在時(shí),用或不用Edg3受體亞型拮抗劑CAY10444處理人TM細(xì)胞培養(yǎng)物。24小時(shí)后,隨后通過(guò)來(lái)自處理后的培養(yǎng)物的上清等量試樣的ELISA確定分泌的PAI-1蛋白水平。從這些數(shù)據(jù)表明CAY10444強(qiáng)有力地和有效地拮抗了兩種激動(dòng)劑的作用(數(shù)據(jù)代表平均和SEM)。本文所引用的文獻(xiàn)以提供了對(duì)于本文所述那些補(bǔ)充的示例性的程序性或其它細(xì)節(jié)的程度,通過(guò)特定地引用并入本文。本領(lǐng)域的技術(shù)人員依照本公開(kāi),會(huì)理解可產(chǎn)生本文所公開(kāi)的實(shí)施方案的明顯修飾而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。依據(jù)本公開(kāi)無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)可進(jìn)行或執(zhí)行本文所公開(kāi)的全部實(shí)施方案。本公開(kāi)和其等價(jià)的實(shí)施方案陳述了本發(fā)明的全部范圍。說(shuō)明書(shū)不應(yīng)該解釋為過(guò)度使本發(fā)明給予的保護(hù)的全部范圍狹窄。除非另外指明,如本文所用的屬于"一"和"一個(gè)"意為"一個(gè)""至少一個(gè)"或"一個(gè)或多個(gè)"。權(quán)利要求1.一種減弱受試者眼內(nèi)的Smad信號(hào)傳導(dǎo)的方法,包括向受試者施用一種組合物,該組合物包含有效量的內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的拮抗劑或其藥物學(xué)可接受的鹽;以及藥物學(xué)可接受的載體;其中所述受試者眼內(nèi)的Smad信號(hào)傳導(dǎo)從而被減弱。2.權(quán)利要求1的方法,其中所述受試者患有具有不適當(dāng)?shù)慕Y(jié)締組織生長(zhǎng)因子積累的Smad信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)眼部病癥。3.權(quán)利要求1的方法,其中受試者處于發(fā)展成具有不適當(dāng)?shù)慕Y(jié)締組織生長(zhǎng)因子積累的Smad信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)眼部病癥的危險(xiǎn)。4.權(quán)利要求2的方法,其中所述Smad信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)眼部病癥是高眼壓、青光眼、青光眼性視網(wǎng)膜病變、視神經(jīng)病變、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變或眼創(chuàng)傷愈合。5.權(quán)利要求l的方法,其中所迷拮抗劑是鞘氨醇-l-磷酸類似物。6.權(quán)利要求l的方法,其中所述拮抗劑是取代的噻唑烷。7.權(quán)利要求l的方法,其中所述拮抗劑是取代的噻溱烷。8.權(quán)利要求l的方法,其中所述拮抗劑具有結(jié)構(gòu)I:其中l(wèi)是C6-Cu烷基、或烷基取代的芳基,其中芳基取代是C「C,烷基。9.權(quán)利要求8的方法,其中Ri是d?;騞烷基。10.權(quán)利要求8的方法,其中R,是烷基取代的苯基并且取代是邁-或;"C廣烷基。11.權(quán)利要求i的方法,其中所述拮抗劑具有結(jié)構(gòu)n:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中R2是C廣d3烷基。12.權(quán)利要求l的方法,其中所述拮抗劑是多磺化萘脲。13.權(quán)利要求l的方法,其中所述拮抗劑具有結(jié)構(gòu)III:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中R3為o-或/~Cs-Cs烷基;并且R4為磷酸脂、磷酸脂類似物、膦酸脂或硫酸脂。14.權(quán)利要求l的方法,其中所述拮抗劑是對(duì)所迷受體具有結(jié)合親和性和特異性的抗體或其生物活性片段。15.權(quán)利要求l的方法,其中所迷拮抗劑是對(duì)所迷受體具有結(jié)合親和性和特異性的肽或擬肽。16.權(quán)利要求l的方法,其中通過(guò)局部、前眼房?jī)?nèi)、玻璃體內(nèi)、經(jīng)鞏膜或植入途徑施用所述組合物。17.權(quán)利要求l的方法,其中所述組合物中的所述拮抗劑的濃度為0.01%-2%。18.—種在有此治療的受試者中治療具有不適當(dāng)?shù)慕Y(jié)締組織生長(zhǎng)因子積累的Smad信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)眼部病癥的方法,包括向受試者施用一種組合物,該組合物包含有效量的內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的拮抗劑或其藥物學(xué)可接受的鹽;以及藥物學(xué)可接受的載體;其中所述Smad信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)眼部病癥從而被治療。19.權(quán)利要求18的方法,其中所述受試者患有高眼壓或青光眼。20.權(quán)利要求18的方法,其中所述受試者處于發(fā)展成高眼壓或青光眼的危險(xiǎn)。21.權(quán)利要求18的方法,其中所述拮抗劑是鞘氨醇-l-磷酸類似物。22.權(quán)利要求18的方法,其中所述拮抗劑是取代的噻唑烷。23.權(quán)利要求18的方法,其中所述拮抗劑是取代的噻溱烷。24.權(quán)利要求18的方法,其中所述拮抗劑具有結(jié)構(gòu)I:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R,是C6-Cu烷基、或烷基取代的芳基,其中芳基取代是C5-C,烷基。25.權(quán)利要求24的方法,其中R,是d。或Cn烷基。26.權(quán)利要求24的方法,其中K是烷基取代的苯基并且取代是ZZ7一或/7~C廣坑基。27.權(quán)利要求18的方法,其中所述拮抗劑具有結(jié)構(gòu)II:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R2是C廣d3烷基。28.權(quán)利要求18的方法,其中所述拮抗劑是多磺化萘脲。29.權(quán)利要求18的方法,其中所述拮抗劑具有結(jié)構(gòu)III:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R3為o-或iC廣Cs烷基;并且R4為磷酸脂、磷酸脂類似物、膦酸脂或硫酸脂。30.權(quán)利要求18的方法,其中所述拮抗劑是對(duì)所述受體具有結(jié)合親和性和特異性的抗體或其生物活性片段。31.權(quán)利要求18的方法,其中所述拮抗劑是對(duì)所述受體具有結(jié)合親和性和特異性的肽或擬肽。32.權(quán)利要求18的方法,其中通過(guò)局部、前眼房?jī)?nèi)、玻璃體內(nèi)、經(jīng)鞏膜或植入途徑施用所述組合物。33.權(quán)利要求18的方法,其中所述組合物中的所述拮抗劑的濃度為0.01%-2%。34.—種在受試者中治療青光眼的方法,包括向受試者施用一種組合物,該組合物包含有效量的內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的拮抗劑或其藥物學(xué)可接受的鹽;以及藥物學(xué)可接受的栽體;其中青光眼從而被治療。35、一種在受試者中治療青光眼性視網(wǎng)膜病變、視神經(jīng)病變、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變或眼創(chuàng)傷愈合的方法,包括向受試者施用一種組合物,該組合物包含有效量的內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的拮抗劑或其藥物學(xué)可接受的鹽;以及藥物學(xué)可接受的載體;其中青光眼性視網(wǎng)膜病變、視神經(jīng)病變、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變或眼創(chuàng)傷愈合從而被治療。全文摘要提供S1P3(Edg-3)受體的拮抗劑用來(lái)在涉及CTGF積累的眼部病癥中下調(diào)受體信號(hào)和下游減少產(chǎn)生的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子產(chǎn)物的方法中減弱Smad信號(hào)傳導(dǎo)。涉及不適當(dāng)CTGF積累的眼部病癥包括例如高眼壓、青光眼、青光眼性視網(wǎng)膜病變、視神經(jīng)病變、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變和眼創(chuàng)傷愈合。通過(guò)施用本發(fā)明的拮抗劑治療這些病癥。文檔編號(hào)A61K31/426GK101505744SQ200780031138公開(kāi)日2009年8月12日申請(qǐng)日期2007年7月25日優(yōu)先權(quán)日2006年7月25日發(fā)明者A·R·謝帕德,D·L·弗里諾爾,彭玉豪申請(qǐng)人:愛(ài)爾康研究有限公司
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