專利名稱：內(nèi)膜增生和相關病狀的治療的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于預防細胞侵入到植入體內(nèi)的材料的方法和組合物。特別地， 本發(fā)明涉及預防由內(nèi)膜增生和加速的動脈粥樣硬化導致的再狹窄引起的血管移植 失敗，并且還涉及預防由內(nèi)膜增生導致的植入物或假體的阻塞。
背景技術：
動脈粥樣硬化是血管病的最常見形式，并導致身體重要器官的供血不足，造 成心臟病發(fā)作、中風和腎臟衰竭。吸煙者和高血壓、代謝綜合征或糖尿病患者的 主要并發(fā)癥也由動脈粥樣硬化引起。動脈粥樣硬化是血管的慢性損傷形式，其中 動脈壁的一些正常的通常情況下控制血管張力以調(diào)節(jié)血流的血管平滑肌細胞 (VSMC)的性質(zhì)發(fā)生改變并發(fā)展出類癌行為。這些VSMC形成非正常增殖，并 分泌如生長因子、組織降解酶和其他蛋白質(zhì)的物質(zhì)，使其侵入并擴散至血管內(nèi)層， 阻斷血流并使該血管非正常地易被局部血凝塊完全阻塞，最終導致由該動脈供血 的組織死亡。
靜脈旁路移植是治療阻塞性動脈斑塊的最常見的血管再造方法。自體靜脈移 植仍然是用于多種類型血管再造的唯一手術替代方法，但是這些移植術的失敗率 在一年以后達到20%，其中主動脈-冠狀動脈和外周靜脈移植的失敗率在一年后達 到10%至40%， 10年后達到50%至60%。移植的血管中新生內(nèi)膜或動脈粥樣硬化 的發(fā)展經(jīng)常引起閉塞性狹窄。新生內(nèi)膜斑塊的標志是單核細胞浸潤、平滑肌細胞 增殖和細胞外基質(zhì)沉積。該病的發(fā)病機理仍然知之甚少，并且尚未鑒定出成功的 臨床干預手段。
患有阻塞性疾病(經(jīng)血管造影術證明)的患者進行靜脈移植后，早在手術后6 至12月就己經(jīng)由組織學證明移植物內(nèi)有動脈粥樣硬化斑塊形成。靜脈旁路移植物 結構改變來源于進展迅速的結構上不同形式的動脈粥樣硬化的發(fā)展，通常將這種 動脈粥樣硬化稱為加速的動脈粥樣硬化，其在形態(tài)學上與原發(fā)的動脈粥樣硬化 (native artherosclerosis)不同。靜脈移植性動脈粥樣硬化斑塊通常更加彌散、同 中心和易碎，其纖維帽形成不佳或缺少纖維帽；而原發(fā)的血管動脈粥樣化則近基 底部位、偏心并且不易碎，具有形成較好的纖維帽。加速的動脈粥樣硬化斑塊比 原發(fā)的動脈粥樣硬化斑塊還含有更多的泡沫細胞、程度不同的脂類積聚和巨噬細 胞/單核細胞和炎性細胞浸潤。
再狹窄，即矯正手術后的狹窄或動脈狹窄的復發(fā)，是加速的動脈粥樣硬化。 近期證據(jù)一致支持血管損傷假說，其中該假說認為冠狀動脈再狹窄、冠狀靜脈移植和同種異體心臟移植性動脈粥樣硬化能代表導致自發(fā)性動脈粥樣硬化的同一發(fā) 病過程的進展更加迅速的形式(Ip a/. (1990) J爿m CoZ/ a/Wio/ 15: 1667-1687; Muller W a/. (1992) J爿w Co〃 CaW/o/ 19: 418-432)。
提示再狹窄是血管損傷引起的一系列復雜的纖維增殖反應引起的，該反應包 含包括血小板源生長因子(PDGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)在內(nèi)的有 效的生長調(diào)節(jié)分子，這兩種生長因子在動脈粥樣硬化斑塊晚期也很常見，導致血 管平滑肌細胞增殖、遷移和新生內(nèi)膜積聚。
再狹窄發(fā)生于冠狀動脈旁路手術、動脈內(nèi)膜切除術(endarterectomy)和心臟 移植術之后，并且特別發(fā)生于心臟球囊血管成形術、經(jīng)皮腔內(nèi)斑塊旋切術 (atherectomy)、激光切除術或血管內(nèi)支架置入術之后，其中每種手術均有三分之 一的患者術后6個月重新發(fā)展成再狹窄，并且是癥狀復發(fā)或死亡的原因。經(jīng)常需 要重復進行血運重建(revascularization)。經(jīng)過十多年的研究，盡管使用各種藥物 治療和手術治療動脈粥樣硬化癥(包括血管成形術、旁路移植術和動脈內(nèi)膜切除 術)的首次成功率顯著改善，但是30%至50%的患者由于晚期再狹窄而導致繼發(fā) 失敗。
血管狹窄也是器官移植遠期成功的主要限制因素，最終導致缺血性移植失敗。 盡管該現(xiàn)象(稱為同種異體移植加速的移植硬化)的發(fā)病機理并未完全知曉，但 是它確實包含內(nèi)皮細胞損傷、單核細胞浸潤、平滑肌細胞增殖和基質(zhì)蛋白質(zhì)的沉 積。己經(jīng)獲得這種癥狀的幾個小鼠模型(Xu (2004) Jwen'ca" Jo,""/o/i^/w/ogy 165(1): 1-10)。
由內(nèi)膜增生(IH)和加速的動脈粥樣硬化導致的早期內(nèi)膜增厚的發(fā)展被認為 是靜脈移植物壁上炎性反應的結果，該炎性反應由手術中的機械損傷、環(huán)形牽張 和動脈循環(huán)中的較高切應力所啟動。這兩種現(xiàn)象都可造成移植最終失敗。
內(nèi)膜增生，也稱為新生內(nèi)膜增生，是由血管內(nèi)膜層中的血管平滑肌細胞非正 常遷移和增殖而形成，伴有相關的細胞外結締組織基質(zhì)的沉積。
在這個重塑過程中出現(xiàn)的第一個現(xiàn)象是趨化現(xiàn)象，然后是炎性細胞主要是單 核細胞粘附和遷移進入靜脈移植物壁的內(nèi)膜。這些炎性細胞是促炎性細胞因子和 生長因子的來源，這些促炎性細胞因子和生長因子是平滑肌細胞遷移和泡沫細胞 積聚的有效刺激劑。平滑肌細胞和泡沫細胞在靜脈移植物內(nèi)膜中的積聚導致血管 壁增厚和腔內(nèi)直徑減小。
包含如紫杉醇、Picrolimus、雷帕霉素等試劑的藥物涂層或藥物洗脫支架已經(jīng) 廣泛用于嘗試克服支架重阻塞的問題(通過宿主動脈內(nèi)膜層細胞的內(nèi)生長) (Bhargava et.al (2003) 5hto/z 7kfe&ca/Jowma/ 327: 274-279)。雖然這些藥物洗脫支 架取得了部分成功，但其主要抑制VSMC的侵入。他們并不針對內(nèi)膜增生的整體 問題。
Pexeluzimab (Alexion Pharmaceuticals, Inc.),直接抗C5的人源化單克隆單鏈抗體片段，用作溶栓試劑或罹患急性心肌梗塞患者的首次經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀血管成形術 (PCA)的輔助性治療已經(jīng)過試驗。Pexeluzimab與溶栓劑聯(lián)合使用并未觀察到有 益效果，并且盡管PCA組死亡率下降，但是未減小梗塞區(qū)大小(Granger et al, (2003) C,Vcwtoz.朋108: 1184-1 190; Shernan at al. (2004) J朋.r/zorac. Si/rg. 77: 942-949)。在 另一項對接受冠狀動脈旁路移植患者進行的研究中(Verrier etal. (2004) JJM4 291: 2319-2327)， Pexeluzimab未降低僅接受旁路移植的患者的死亡或心肌梗塞風險， 但確實降低了接受有或無瓣膜的移植物手術的患者的一些風險。但是，據(jù)我們所 知，無論Pexeluzimab還是eculizamab (Alexion生產(chǎn)的另一種抗C5抗體)都不建 議將其用于抑制內(nèi)膜增生。
需要減輕或預防血管阻塞的成功的化學療法的治療方法。預防這個疾病的最 有效的方法是在細胞水平，該方法與并發(fā)癥或死亡的風險顯著增加、耗費時間和 金錢并不便于患者的反復的血運重建術相反。
發(fā)明概述
對內(nèi)膜增生中包含的趨化過程和細胞激活過程的抑制可潛在地導致炎性細胞 粘附、侵入和激活的抑制，并最終抑制靜脈移植物增厚和支架內(nèi)再狹窄。在內(nèi)膜 增生的病因?qū)W中，已經(jīng)提示有眾多生長因子，如血小板源生長因子(PDGF)和趨 化因子以及其他靶標如某些G蛋白偶聯(lián)受體的參與，但是這個病狀的機理仍然未 明。
C5a，補體級聯(lián)的生物學活性成分之一，是有效的趨化蛋白。補體級聯(lián)是免疫 系統(tǒng)的重要部分，由一組循環(huán)中的蛋白質(zhì)和幾種膜結合的調(diào)節(jié)酶構成。補體級聯(lián) 的激活引起補體成分C3的剪切，后者依次導致包括C5a的生物活性終產(chǎn)物的形成。
C5a通過C5a受體(C5aR)實現(xiàn)其功能，并且它對于包括單核細胞、T-和B-淋巴細胞和中性粒細胞的很多類型的細胞都具有趨向作用。已經(jīng)表明C5a在如膿 毒血癥、支氣管哮喘和缺血/再灌注損傷的幾種炎性過程發(fā)揮重要作用。但是，C5a 在血管炎性過程如動脈粥樣硬化和在如血管成形術后的再狹窄和靜脈移植物增厚 情形的干預性血管再造之后的作用(如果有的話)依舊尚未完全明了，在這一點 上迄今沒有任何特異性研究。
我們假設C5a在靜脈移植物疾病中具有促炎、促狹窄的作用，并且干預C5a 功能應該引起內(nèi)膜增生的抑制和增生的內(nèi)膜中巨噬細胞來源的泡沫細胞數(shù)目減 少。我們在這里第一次提供證據(jù)證明C5a在靜脈移植物增厚的發(fā)展中具有功能性 作用，阻斷C5a是為克服靜脈移植物失敗和支架內(nèi)再狹窄的治療的潛在靶標。
第一方面，本發(fā)明提供了預防或治療血管壁內(nèi)膜增生的方法，該方法包含對 哺乳動物使用治療有效量的C5a功能抑制劑的步驟。
第二方面，本發(fā)明提供了抑制血管移植物增厚的發(fā)展的方法，該方法包含對 哺乳動物使用治療有效量的C5a功能抑制劑的歩驟。第三方面，本發(fā)明提供了抑制支架內(nèi)再狹窄的發(fā)展的方法，該方法包含為植 入了支架的哺乳動物使用治療有效量的C5a功能抑制劑的步驟。
第四方面，本發(fā)明提供了預防或治療哺乳動物血管壁或其他解剖結構的狹窄、 再狹窄或細胞的非預期增殖、遷移或肥大的方法，該方法包括對哺乳動物使用治 療有效量的C5a功能抑制劑的步驟。
哺乳動物血管壁或其他解剖結構的狹窄、再狹窄或細胞的非預期增殖、遷移 或肥大可是下列病狀之一的結果動脈粥樣硬化、慢性阻塞性肺病、移植、血管 移植、靜脈手術、動脈手術、旁路移植失敗、整形手術、組織移植、腫瘤、黃斑 變性、新生血管形成、異常創(chuàng)傷修復、子宮內(nèi)膜異位、血管炎、血栓癥后血運再 造缺陷、假體手術、瘢痕形成、動脈瘤手術/修復、淋巴手術/修復、脊柱損傷/手術 /修復、內(nèi)皮腫瘤、瘢痕瘤、肉芽瘤、血管瘤、血栓性疾病后治療/修復、血管成形 術和再造步驟。


圖l顯示用于本發(fā)明的優(yōu)選的環(huán)肽C5a受體拮抗劑的結構。 圖2表明免疫組織化學方法檢測術后不同時間靜脈旁路移植物中的C5。術后 可直接在粘附的白細胞中看到C5。術后7天可看到C5達最高數(shù)量，并且在后期 時間點C5仍然在內(nèi)皮細胞、泡沫細胞和外膜纖維母細胞中占主導(放大150-400 倍)。
圖3顯示半定量RT-PCR檢測的與腔靜脈中基礎表達相比的靜脈移植物中C5a 受體mRNA的表達(每個時間點n=4)。腔靜脈中只有很少量的C5a受體mRNA。 在植入移植物后看到C5a受體mRNA表達上調(diào)，術后7天達峰值表達，之后表達 水平回歸正常。
圖4顯示C5a應用于高膽固醇血癥小鼠靜脈移植物的效應(每組11=8)。 A行僅用20%普朗尼克(pluronic)凝膠處理的，用含有0.5昭重組C5a蛋
白質(zhì)的20%普朗尼克凝膠處理的或用含有5叫重組C5a蛋白質(zhì)的20%普朗尼克凝
膠處理的靜脈移植物的代表性橫截面。
B行內(nèi)膜增生在C5a處理小鼠中呈劑量依賴性增加(0.5 p=0.1; 5pg:
p=0.002;箭頭指向增生的內(nèi)膜；放大200倍)。
圖5表明C5a對靜脈移植物中促進內(nèi)膜增生的泡沫細胞的效應。
A行增加C5a劑量導致促進內(nèi)膜增生的泡沫細胞顯著增加，該效應通過用
免疫組織化學方法檢測抗巨噬細胞抗體來估計(0.5昭p=0.1; 5昭pO.001;
放大200倍)。
B行泡沫細胞增加的定量估計，用占整個區(qū)域的百分比表示。
圖6顯示C5a受體拮抗劑HC和AcF處理靜脈移植物的效應。
A行術后28天，對照組和處理組的靜脈移植物的代表性橫截面；在用0.3mg/kg/天的劑量的AcF或HC處理(劑量為0.3 mg/kg/天)組中可見內(nèi)膜增生減 輕(蘇木精-焰紅染料-藏紅花染色，放大200倍)。
B行術后28天，對照組和處理組的靜脈移植物增生內(nèi)膜表面的定量，以 mn^表示(每組『7; M戈表pO.05);術后28天，C5a受體拮抗劑處理導致靜脈 移植物中內(nèi)膜增生減輕。
C行免疫組織化學法定量測定促進內(nèi)膜增生的巨噬細胞來源的泡沫細胞，以 占增生內(nèi)膜總表面的百分比表示；C5a受體拮抗劑處理導致血管壁中的泡沫細胞含 量減少(每組11=7; M戈表p0.05)。
發(fā)明詳述
第一方面，本發(fā)明提供了預防或治療血管壁內(nèi)膜增生的方法，該方法包括對 哺乳動物使用治療有效量的C5a功能抑制劑的步驟。
在一個具體實施方式
中，哺乳動物是血管移植物或假體的受體。移植物可是 靜脈或動脈移植物。在另一個具體實施方式
中，哺乳動物是器官移植如心臟、心 肺或腎臟移植的受體。
第二方面，本發(fā)明提供了抑制血管移植物增厚發(fā)展的方法，該方法包括對哺 乳動物使用治療有效量的C5a功能抑制劑的步驟。
移植物可是靜脈或動脈移植物。
第三方面，本發(fā)明提供了抑制支架內(nèi)再狹窄發(fā)展的方法，該方法包括為已植 入支架的哺乳動物使用治療有效量的C5a功能抑制劑的歩驟。
第四方面，本發(fā)明提供了預防或治療哺乳動物血管壁或其他解剖結構的狹窄、 再狹窄或細胞的非預期增殖、遷移或肥大的方法，該方法包括對哺乳動物使用治 療有效量的C5a功能抑制劑的歩驟。
哺乳動物血管壁或其他解剖結構的狹窄、再狹窄或細胞的非預期增殖、遷移 或肥大可是下列病狀的結果動脈粥樣硬化、慢性阻塞性肺病、移植、血管移植、 靜脈手術、動脈手術、旁路移植失敗、整形手術、組織移植、腫瘤、黃斑變性、 新生血管形成、異常創(chuàng)傷修復、子宮內(nèi)膜異位、血管炎、血栓癥后血運再造缺陷、 假體手術、瘢痕形成、動脈瘤手術/修復、淋巴手術/修復、脊柱損傷/手術/修復、 內(nèi)皮腫瘤、瘢痕瘤、肉芽瘤、血管瘤、血栓性疾病后的治療/修復、血管成形術和 再造術步驟。
在一個具體實施方式
中，抑制劑位于可植入腔內(nèi)裝置之上或之內(nèi)，并且化合 物通過將裝置植入哺乳動物體內(nèi)以使化合物從植入裝置上洗脫的方式給藥。
裝置可包含支架，并且裝置可植入哺乳動物的動脈或靜脈內(nèi)以使治療有效量 的化合物從支架上洗脫并阻止植入了支架的動脈或靜脈的重阻塞。動脈可是冠狀 動脈。
在一個具體實施方式
中，化合物被已經(jīng)接受或?qū)⒁邮苎艹尚涡g、經(jīng)皮腔
12內(nèi)斑塊旋切術和/或支架植入術以治療血管阻塞的患者使用，并且化合物以有效阻 止血管重阻塞的給藥量和給藥途徑使用。
在另一個具體實施方式
中，化合物可被動脈粥樣硬化發(fā)展風險增高的患者，
如吸煙或罹患高血壓、代謝綜合征或糖尿病的患者用于預防動脈粥樣硬化的發(fā)展。 在本發(fā)明這些方面的一個具體實施方式
中，C5a功能抑制劑是C5a受體(C5aR) 拮抗劑。在另一個具體實施方式
中，C5a功能抑制劑為直接抗C5a的抗體，優(yōu)選 為單克隆抗體。在第三個具體實施方式
中，C5a功能抑制劑是C5a片段。
優(yōu)選地，C5a受體拮抗劑是具有通式I的環(huán)肽或擬肽(peptidomimetic)化合
物.-
通式I
其中A是H、垸基、芳基、NH2、 NH-烷基、N(垸基)2、 NH-芳基、NH-?；?、 NH-苯甲酰、NHS03、 NHS02-烷基、NHS02-芳基、OH、 O-垸基或O-芳基。
B是烷基、芳基、苯基、苯甲基、萘基或吲哚基團，或如L-苯丙氨酸或L-苯 甘氨酸的D-或L-氨基酸側鏈，但不是甘氨酸、D-苯甘氨酸、L-高苯丙氨酸、L-色 氨酸、L-高色氨酸、L-酪氨酸或L-高酪氨酸的側鏈；
C是小的取代基，是如甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸 或硫代脯氨酸的D-、 L-或高氨基酸的側鏈，但優(yōu)選地不是如異亮氨酸、苯丙氨酸 或環(huán)己基丙氨酸的大的取代基(bulky substituent);
D是如D-亮氨酸、D-高亮氨酸、D-環(huán)己基丙氨酸、D-環(huán)己基高丙氨酸、D-纈 氨酸、D-正亮氨酸、D-高正亮氨酸、D-苯丙氨酸、D-四氫異喹啉、D-谷氨酰胺、 D-谷氨酸鹽或D-酪氨酸的中性D-氨基酸側鏈，但優(yōu)選地不是如甘氨酸或D-丙氨 酸的側鏈的小的取代基，如D-色氨酸的大的平面?zhèn)孺?，或如D-精氨酸或D-賴氨酸 的大的帶電側鏈；
E是大的取代基，如選自L-苯丙氨酸、L色氨酸或L-高色氨酸的氨基酸的側鏈，或是L-l-萘基或L-3-苯并噻吩基丙氨酸，但不是D-色氨酸、L-N-甲基色氨酸、 L-高苯丙氨酸、L-2-萘基L-四氫異喹啉、L-環(huán)己基丙氨酸、D-亮氨酸、L-芴基丙氨 酸、L-組氨酸的側鏈；
F是L-精氨酸、L-高精氨酸、L-瓜氨酸或L-刀豆氨酸或其生物等排物的側鏈， 即側鏈中保留末端胍或脲基團，但碳主鏈被具有不同結構的基團所取代，但是作 為整體與耙蛋白通過與專利基團相同的方式發(fā)生反應的側鏈；和
X是-(CH2)nNH-或(CH2)nS-，其中n是l、 2、 3或4的整數(shù)，優(yōu)選為2或3; -(CH2)20-; -(CH2)30-; -(CH2)3-; -(CH2)4-; -CH2COCHRNH-^-CH2-CHCOCHRNH-， 其中R是任意常見或不常見氨基酸的側鏈。
在C中，羥脯氨酸和硫代脯氨酸的順式和反式形式都可使用。
優(yōu)選地，A是乙酰胺基團、氨基甲基基團，或者取代的或未取代的氨磺酰基團。
優(yōu)選地，當A是取代的氨磺酰時，取代基為K 2、 3、 4、 5或6個碳原子的 垸基鏈，優(yōu)選是l、 2、 3或4個碳原子的烷基鏈或苯基或甲苯?；鶊F。
在特別優(yōu)選的具體實施方式
中，化合物具有抗C5a受體的拮抗劑活性，并實 質(zhì)上無C5a激動劑活性。
化合物優(yōu)選是人和哺乳動物細胞(包括但不限于人多形核白細胞、單核細胞、 淋巴細胞和巨噬細胞)上的C5a受體拮抗劑?；衔飪?yōu)選與C5a受體有效地和選 擇性地結合，并更優(yōu)選在亞微摩爾濃度水平具有有效的拮抗劑活性。甚至更優(yōu)選 是化合物受體親和力IC50 < 25 pM和拮抗劑能力IC50 < 1 (iM。
最優(yōu)選的化合物是國際專利申請?zhí)朠CT/AU02/01427 (WO 2003/033528)中所 述的化合物1 ( PMX53 ; AcF[OP-DCha-WR])，化合物33 ( PMX273 ; AcF[OP-DPhe-WR])，化合物60 (PMX95; AcF[OP-DCha-FR])或化合物45 (PMX201; AcF[OP-DCha-WCit])，氫化肉硅酸鹽-[OPdChaWR] (PMX205)或氫 化肉硅酸鹽-[OPdPheWR] (PMX218)。在圖1中顯示了這些環(huán)肽的結構。
在特別優(yōu)選的具體實施方式
中，C5a受體拮抗劑是AcF-[OP-(D-Cha)WR]或氫 化肉硅酸鹽-[OP-(D-Cha)WR]。
其他C5a受體拮抗劑是已知的，參見如Sumichika (2004) CwrreW Op!'m'o" & /"ve勸'g""o"a/ Dn/gs 5(5):5 05-510; Sumiehika et al (2002) J歷o/ C7 e附.277(51): 49403-49407的綜述；和Neurogen公司的國際專利公布號WO02/49993和IBA GmbH的WO03/078457。已經(jīng)描述了 C5a的很多其他小分子的非肽抑制劑，并且 本領域技術人員將能夠容易地鑒別相關的公開和專利說明書。Ciba-Geigy的美國專 利號5,807,824的專利披露了人C5a的多肽類似物(是C5a受體的拮抗劑)、這些 類似物的二聚體形式和這些多肽的抗體。Scripps研究所的美國專利號5,480,974的 專利披露了與在人C5a受體的細胞外親水區(qū)發(fā)現(xiàn)的21個氨基酸的肽結合并阻斷 C5a活性的單克隆抗體。Pexeluzimab和eculizamab是直接抗C5的單克隆抗體，由Alexion Pharmaceuticals, Inc.生產(chǎn)。Pexeluzimab是人源化的單鏈抗體片段。這兩 種產(chǎn)品均處于臨床試驗中。
C5a功能抑制劑可通過任何方便的胃腸道外途徑系統(tǒng)給藥，例如經(jīng)皮下、靜脈 或肌肉注射。 一些C5a受體可通過腸道給藥，并由種給藥途徑于的方便性，因而 可是優(yōu)選的。本發(fā)明的優(yōu)選化合物可經(jīng)口或直腸給藥。
另外，C5a功能抑制劑可局部給藥，通過導管或類似的血管內(nèi)輸送裝置到達植 入物或假體部位。
有某些與血管手術相關的限制，肌肉細胞的過度生長能發(fā)生于通路移植術 (access graft surgery)后的血管壁(即內(nèi)膜增生)，否則的話則是健康的血管。這 是個嚴重的問題，因為它可引起血管的完全阻塞(重新狹窄)，通常需要進一歩手 術以避免嚴重并發(fā)癥。
而且，需要將腎臟衰竭患者的血液通過透析儀過濾以使他們免于死亡。通常 這個過程一星期內(nèi)進行至少兩次，并包括將兩支針頭插入患者體內(nèi)一一支抽取血 液，血液一旦過濾完，另一支將其輸回體內(nèi)。但是，正常的血管不能承受大的針 頭反復插入血管。 一個克服的方法是在患者手臂的靜脈和動脈之間手術插入一根 塑料管("通路移植")。然后針頭能反復地插入到移植物內(nèi)以使患者與透析儀連接。
但是，高達60%的血液透析通路移植物在插入一年內(nèi)就由于再狹窄而被阻塞， 以致需要進行反復的手術。由于可用的合適的部位更少并且這些部位只能進行有 限次數(shù)的手術，這樣反復手術也經(jīng)常然而是更快地失敗。所以需要替代的和更困 難的途徑使血液過濾。在這些情況下，患者的預期壽命縮短。
相應地，在另一個替代性的具體實施方式
中，C5a功能抑制劑可與血管移植物 或腔內(nèi)醫(yī)學裝置如支架或用于預防內(nèi)膜增生的內(nèi)移植物的表面進行可釋放的結 合。血管移植物可是動脈或靜脈移植物。
制備藥物洗脫支架等的方法是熟知的；參見如專利Boston Scientific Corporation的美國專利號6,358.556, Medtronic, Inc.的美國專利號5,545,208和 Cordis Corporation的美國專利號6，273,913。藥物洗脫支架由Cordis Corporation (Cypher支架，其釋放雷帕霉素)和Boston Scientific (Taxus支架，其釋放紫杉 醇)推向市場，并且其它這類支架由Medtronic, Inc開發(fā)。
特別地，Cordis Corporation的美國專利號6,140,127披露了用肽試劑包被支架 的方法。
哺乳動物可是人，或者可是家畜、陪伴動物或動物園動物。雖然特別考慮到 本發(fā)明的化合物適合用于人的醫(yī)學治療，本發(fā)明的化合物也可應用于獸醫(yī)學的治 療，包括治療陪伴動物如狗和貓，家畜如馬、牛和綿羊，或動物園動物如非人靈 長類、貓科、犬科、?？坪陀刑泐悇游?。
我們假設C5a在靜脈移植物疾病中具有促炎性、促狹窄的作用。如果這個假 設是正確的，干預C5a的功能應該引起內(nèi)膜增生的減輕和增生內(nèi)膜中巨噬細胞來源的泡沫細胞的數(shù)目減少。為了驗證這個假設，我們使用靜脈移植物疾病的小鼠 模型，其中靜脈移植物增厚伴隨內(nèi)膜增生和加速的動脈粥樣硬化。當在高膽固醇 血癥ApoE-Z-小鼠中進行靜脈移植時，手術后28天移植物的形態(tài)與人靜脈移植物 疾病中所見到的高度類似，這使這個模型在研究靜脈移植物增厚的臨床問題中極 其有用(Zwolaketal. (1987)/^^ Swrg. 5: 126-136)。
在這個小鼠模型中測定了 C5a及其受體(C5aR)的存在和表達。為了檢測用 C5a處理對靜脈移植物增厚的效應，將重組C5a應用于靜脈移植物。通過用兩種 有效的C5a受體拮抗劑AcF-[OP-(D-Cha)WR]或氫化肉硅酸鹽-[OP-(D-Cha)WR]處 理接受靜脈移植手術的小鼠來測定對C5a功能的消除效應。我們以前已經(jīng)證明這 些化合物能夠在體內(nèi)抑制C5a的功能，參見如國際申請公布號PCT/AU98/00490 (WO 99/00406)和PCT/AU02/01427 (WO 2003/033528) , Finch et al. (1999) J她d CAe附.42: 1965-1974; Woodruff et.al. (2003) J/附mww/. 171 ; 5514-5520; Woodruff et al. (2004)JSwgi 仏116: 81-90，這些文獻的全部內(nèi)容在這里引入作為參考。
如這里所用的單數(shù)形式"一"、"一種"和"這個"包括提及的相應的復數(shù)形式，除 非上下文另有明確說明。因此，如提及"一種酶"包括這些酶的復數(shù)，提及"一種氨 基酸"是指提及的一個或多個氨基酸。
當表達數(shù)值的范圍時，應該清楚地理解這個范圍包括該范圍的上限和下限， 以及所有介于限值內(nèi)的數(shù)值。
內(nèi)膜增生，也稱為新生內(nèi)膜增生，是血管內(nèi)層中的血管平滑肌細胞非正常遷 移和增殖，伴隨相關的細胞外結締組織基質(zhì)的沉積。
血管成形術，也稱為經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(PTCA)，是一種步驟，其中 使用導管引導的球囊打開狹窄的冠狀動脈以改善血流。在血管成形術中通常將支 架置于狹窄部分。血管成形術可用于治療冠狀動脈疾病或腿部外周動脈疾病。冠 狀動脈血管成形術與放置支架一起，也稱為經(jīng)皮冠狀動脈介入術(PCI)，因其損 傷較小且比旁路手術(也是為了增加心肌供血，但是需要開心手術)的恢復時間 更短，如果可以及時進行的話是治療突發(fā)性心臟病的首選。在主動脈或髂動脈的 血管成形術中，通常在同時放置一個稱為支架的小的可伸展的金屬網(wǎng)管。如果使 用支架，發(fā)生動脈重新關閉(再狹窄)的可能性較低。但是，在股動脈、胭動脈、 脛動脈的血管成形術通常不使用支架，因為這些血管更易受到外傷和損害。
支架是由金屬或塑料網(wǎng)制成的可伸展的管，該管被插入血管或解剖學通道中 以保持管腔開放，并預防由狹窄(stricture)或外部壓迫形成的關閉。支架通常在 放射線指引下插入，且能經(jīng)皮膚插入。在動脈狹窄由于動脈粥樣硬化或其他病狀 而變得危險的患者體內(nèi)，支架可插入血管中以恢復流至心臟的血流。支架在治療 心臟病中廣泛使用，已成為血管成形術操作的標準部分。支架通常也可應用于食 管(如果食管因縮窄或癌癥而狹窄)，應用于輸尿管以使尿液保持從腎臟的引流或 應用于膽管(如果膽管因胰腺癌或膽管癌而狹窄)。本說明書通篇使用常規(guī)的單字母和三個字母符號來代表氨基酸。
為了本說明書的目的，術語"垸基"是指直鏈、支鏈或環(huán)形的取代或未取代l、 2、 3、 4、 5或6，優(yōu)選為1、 2、 3或4碳的烷基鏈。最優(yōu)選的垸基基團是甲基基 團。術語"?；?是指取代的或未取代的1、 2、 3、 4、 5或6，優(yōu)選為l、 2、 3或4 碳原子的酰基。最優(yōu)選的酰基基團是乙?；?。術語"芳基"是指取代的或未取代的同 素環(huán)或雜環(huán)芳基基團，其中環(huán)優(yōu)選具有5或6個原子。
"常見"氨基酸是選自以下的L-氨基酸甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、 丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、 半胱氨酸、蛋氨酸、精氨酸、賴氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或組氨酸。
"不常見"氨基酸包括但不限于D-氨基酸、高氨基酸、N-甲基氨基酸、脫氫氨 基酸、除苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸以外的芳香族氨基酸、鄰-、間、或?qū)?氨基苯 甲酸、鳥氨酸、瓜氨酸、刀豆氨酸、正亮氨酸、Y-谷氨酸、氨基丁酸、L-芴基丙氨 酸、L-3-苯并噻吩基丙氨酸和a,(x-二取代氨基酸。
通常，這里所用的術語"治療""處理"等是指影響受體、組織或細胞以獲得所想 要的藥理學和/或生理學效應。提及完全或部分預防疾病或其表現(xiàn)或其癥狀時，該 效應可是預防性的，而提及部分或完全治愈疾病時，該效應可是治療性的。
這里所用的"治療"涵蓋對脊椎動物、哺乳動物特別是人的疾病的任何治療或預 防，并包括預防患者疾病的發(fā)生(易于患病，但并未被診斷患病的患者)；抑制疾
病，即阻止其發(fā)展；或緩解或改善疾病的效應，即使疾病的效應衰退。
應該清楚理解本發(fā)明不限于這里所描述的特定材料和方法，因其可變。也應 該理解，這里所用的方法學只是為了描述特定的具體實施方式
的目的，并不是為 了限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由隨附的權利要求書所限定。
除非另有指明，否則本發(fā)明使用本領域技術人員能力范圍內(nèi)的常規(guī)的化學、 蛋白質(zhì)化學、分子生物學和酶學技術。這些技術都是本領域人員熟知的，并且在
文獻中有詳述。參見Coligan, Dunn， Ploegh， Speicher and Wingfield: "Current protocols in Protein Science" (1999) Volumes I and II (John Wiley & Sons Inc.); Sambrook, Fritsch and Maniatis: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2001); Shuler, M丄,Bioprocess Engineering: Basic Concepts (2nd Bdition, Prentice-Hall International, 1991); Glazer, A.N.， DcLange, R.J., and Sigman, D. S.: Chemical Modification of Proteins (North Holland Publishing Company, Amsterdam, 1975); Graves, D.J., Martin, B.L., and Wang, J, IL: Co- and post-translatkmal modification of proteins: chemical principles and biological effects (Oxford University Press, 1994) Lundblad, R丄.(1995) Techniques in protein modification. CRC Press, Inc. Boca Raton, Fl, USA; and Goding, J.W Monoclonal Antibodies: principles and practice (Academic Press, New York: 3rd. 19%)。
除非另有指明，否則這里所用的所有技術和科學術語的含義與本發(fā)明所屬領 域的普通技術人員之一通常所理解的含義相同。雖然與這里所描述的材料和方法相似或相同的任何材料和方法均能用于實踐或試驗本發(fā)明，但是本發(fā)明描述了優(yōu) 選的材料和方法。
Zou等人描述了在小鼠中進行靜脈旁路移植的方法。在這個靜脈旁路移植動脈 粥樣硬化模型中，描述了在正常膽固醇血C57B1/6小鼠中，主要由血管平滑肌細 胞增殖引起的靜脈移植物的動脈化。這種平滑肌增殖在ICAM敲除小鼠顯著減輕， 證明ICAM-1在靜脈移植物增厚中的作用(Zou et al (1998) Am J Pathol. 153: 1301-1310)。此外，用生長因子受體拮抗劑蘇拉明預處理靜脈移植物引起新生內(nèi)膜 增生的顯著減輕，提示PDGF受體參與靜脈移植物增厚(Hu等人，1999)。
動脈粥樣硬化小鼠模型，包括移植動脈粥樣硬化，見綜述Xu (2004) American Journal of Pathology 165(1):1-10，而加速的動脈粥樣硬化模型見于Lardenoye et al. (2002) Circulation Research 577- 584。
內(nèi)膜增生的家兔模型(Zwolak等人，1986; Alp et al (2002) Cardiovascular Research 56: 164-172)和犬模型(Petrofski et al. (2004) J Thorac Cardiovasc Surg. 127: 27-33)已有描述，可使用本發(fā)明對這些模型進行進一步的研究。
縮寫
Ac乙酰基
AcFAcF陽[OP-(D-Cha)WR]
bFGF堿性成細胞生長因子
C5aRC5a受體
C5aRAC5a受體拮抗劑
Cit瓜氨酸
dChaD-環(huán)己基胺
D-PheD-苯丙氨酸
HC氫化肉桂酸鹽-[OP-(D-Cha)WR]
IH內(nèi)膜增生
PCA經(jīng)皮冠狀動脈成形術
PDGF血小板源生長因子
PG普朗尼克凝膠
RT-PCR逆轉錄聚合酶鏈反應
VSMC血管平滑肌細胞
本發(fā)明包括用于改善疾病的各種藥物組合物的用途。這樣制備根據(jù)本發(fā)明的
一個具體實施方式
所述的藥物組合物使用載體、賦形劑和添加劑或輔料，將具 有通式I的化合物及其類似物、衍生物或鹽與一種或多種藥學活性試劑形成，或?qū)?具有通式I的化合物與一種或多種藥學活性試劑組合形成適合為受體給藥的形式。
經(jīng)常使用的載體或輔料包括碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露醇和其他糖類、 滑石、乳蛋白、明膠、淀粉、維生素、纖維素及其衍生物、動物和植物油、聚乙
18二醇和溶劑如無菌水、醇、甘油和多羥基醇。靜脈內(nèi)載體包括流質(zhì)和營養(yǎng)補充劑。 防腐劑包括抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體。其他藥學上可接受的載 體包括水制溶液、無毒賦形劑包括鹽、防腐劑、緩沖液等。如在Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed. Williams & Wilkins (2000)和The British National Formulary 43rd ed. (British Medical Association and Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, 2002; http:〃bnf.rhn.nef)中所描述的，這些內(nèi)容在這里弓I入作為參考。 藥物組合物各種成分的pH和精確濃度根據(jù)本領域常規(guī)技術進行調(diào)整。參見 Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics (7th ed.， 1985)。
藥物組合物優(yōu)選以劑量單元進行制備和給藥。固體劑量單元包括片劑、膠囊 和栓劑。對于受體的治療，可使用不同的日劑量，這取決于化合物的活性、給藥 方式、疾病的特性和嚴重程度、受體的年齡和體重。但是在某些情況下，較高的 或較低的日劑量可是合適的。日劑量的給藥能通過個體劑量單元或別的幾個較小 劑量單元的形式單次給藥，也可在特定間隔內(nèi)通過多個細分的劑量多次給藥。
根據(jù)本發(fā)明所述的藥物組合物可以以治療有效劑量局部或系統(tǒng)給藥。當然， 這個用途的有效量取決于疾病的嚴重程度和受體的體重和一般狀態(tài)。典型地，體 外使用劑量可為藥物組合物的原位給藥使用量提供指導，并且動物模型可用于確
定治療有效劑量的細胞毒性副作用。在Langer， Science, 249: 1527， (1990)中
描述了各種需考慮的因素。
用于口服的配方制劑可是硬明膠膠囊的形式，其中活性成分與惰性固體稀釋 物如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合。口服劑型也可是軟明膠膠囊的形式，其中活 性成分與水或油介質(zhì)(如花生油、液體石蠟或橄欖油)混合。
水制懸浮液通常含有與適合制備水質(zhì)懸浮液的賦形劑混合的活性物質(zhì)。這樣 的賦形劑可是懸浮試劑如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、 藻酸鈉、聚乙烯基吡咯啉、橡膠黃芪膠和橡膠阿拉伯樹膠；分散劑或潤濕劑，其 可能是
(a) 天然磷脂如卵磷脂；
(b) 烯基氧化物與脂肪酸的縮合產(chǎn)物，如聚氧乙烯硬脂酸酯；
(c) 環(huán)氧乙烷與長鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物，如heptadecacthylenoxycctanol;
(d) 環(huán)氧乙烷與源自脂肪酸和己糖醇的部分酯的縮合產(chǎn)物，如聚氧乙烯山梨 醇單油酸酯，或
(e) 環(huán)氧乙烷與源自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的縮合產(chǎn)物，如聚氧乙烯山 梨聚糖單油酸酯。
藥物組合物可是無菌注射液或油質(zhì)懸浮液的形式。這種懸浮液可根據(jù)已知的 方法使用合適的分散劑或潤濕劑和如以上所提及的懸浮劑配制。無菌注射制劑也 可是存在于無毒的胃腸道外可接受的稀釋劑或溶劑(如1,3-丁二醇的溶液)之中的 無菌注射溶液或懸浮液。所用的可接受的載體和溶劑為水、林格氏液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的不揮發(fā)性油可方便的用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為了這個目的， 可使用任何無味的不揮發(fā)性油，包括合成的單甘油酯或二甘油酯。此外，脂肪酸 如油酸可用于制備注射制劑。
具有通式I的化合物也可以脂質(zhì)體輸送系統(tǒng)的形式給藥，如小型單層脂囊 (small unilamellar vesicles)、大單層月旨囊(large unilamellar vesicles)禾口多層月旨囊 (multilamellarvesicles)。脂質(zhì)體能用眾多磷脂，如膽固醇、硬脂醇胺或磷脂酰膽堿 制成。
本發(fā)明的具有通式I化合物的劑量水平通常為每千克體重約0.5mg至約20mg 的順序，優(yōu)選的劑量范圍介于每千克體重約0.5 mg至約10 mg (每個患者每天約 0.5 g至約3 g)，更有選為每天0.1 mg/kg至10 mg/kg?？膳c載體材料組合制成單一 劑量的活性成分的量將根據(jù)待治療的受體和特定給藥方式而變化。例如，用于人 口服給藥的配方可含有5 mg至1 g的活性化合物連同合適的和方便數(shù)量的載體材 料，這些載體材料可占總組合物的約5%至95%。劑量單元形式通常含有約5 mg 至500 mg的活性成分。
但是，應該理解，用于任何特定患者的特定劑量水平將取決于眾多因素，這 些因素包括所用的特定化合物的活性、患者的年齡、體重、 一般健康狀況、性別、 飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄速率、藥物組合和接受治療的特定疾病的嚴重 程度。
此外，本發(fā)明的一些化合物可與水或普通有機溶劑形成溶劑化物。這樣的溶 劑化物包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
此外，本發(fā)明的化合物還可與其他治療性化合物組合以提供手術用組合藥物 (operative combination )。只要組合不削弱本發(fā)明化合物的活性，該組合旨在任 何包括藥學活性試劑的化學相容性組合。例如，本發(fā)明的化合物可與任何已知有 益于治療或預防內(nèi)膜增生的制劑相結合使用。這包括與植入藥物涂層支架結合的 口服、直腸或胃腸道外給藥。
為了更清楚地理解本發(fā)明的本質(zhì)，現(xiàn)參照以下非限定性實施例來描述本發(fā)明 的優(yōu)選形式。 實施例1
一般方法
肽的合成
具有通式I的環(huán)肽化合物根據(jù)我們以前的專利申請?zhí)朠CT/AU98/004卯(WO 99/00406)禾口 PCT/AU02/01427 (WO 2003/033528)中詳細描述的方法來制備，這 兩個專利申請的整個內(nèi)容在這里引入作為參考。雖然使用參考化合物 AcF-[OPdChaWR] (PMX53)(其相應的線性肽為Ac-Phe-Orn-Pro-dCha-Trp-Arg)和氫化肉桂酸鹽-[OP-(D-Cha)WR] (PMX205)(其相應的線性肽為氫化肉桂酸鹽 -Orn-Pro-dCha-Trp-Arg)對本發(fā)明加以特別闡明，但是應該清楚地理解為本發(fā)明不 限于這些化合物。
在國際專利申請?zhí)朠CT/AU98/00490(WO 99/00406)中披露的化合物1-6、 17、 20、 28、 30、 31、 36和44以及首次在PCT/AU02/01427 (WO 2003/033528)中披 露的化合物10-12、 14、 15、 25、 33、 35、 40、 45、 48、 52、 58、 60、 66和68-70 具有抗人中性粒細胞C5a受體的適合的拮抗劑能力(IC50< 1 pM)。 PMX205、 PMX53、 PMX273、 PMX201和PMX218為最優(yōu)選。
我們己發(fā)現(xiàn)，盡管個別化合物的物理化學特性、能效和生物可利用率根據(jù)特 定的取代基而有所不同，當目前所有試驗過的具有通式I的化合物具有廣泛相似的 藥理學活性，
以下所描述的一般試驗可用于初歩篩選候選C5a受體抑制劑。 藥物制備和配方
人C5a受體拮抗劑AcF-[OPdChaWR] (Ac-Phe-[Orn-Pro-D-環(huán)己基胺-Trp-Arg]) 和氫化肉桂酸鹽-[OP-(D-Cha)WR]按照如上所述進行合成，通過反相HPLC進行純 化，通過質(zhì)譜和質(zhì)子NMR光譜儀進行充分鑒定。C5a拮抗劑用30Q/。聚乙二醇制備 用于皮下注射。
受體結合試驗
以新鮮的人PMN (按照以前描述(Sanderson等人，1995)的方法進行分離)， 使用緩沖液(50mMHEPES、 1 mM CaCl2、 5mMMgCl2、 0.5%胎牛血清、0.1%桿 菌肽和100nM苯基甲基磺酰基氟化物(PMSF))進行試驗。試驗在4"進行，在 Millipore Multiscreen檢測皿(HV 0.45)中依次加入緩沖液、未標記的人重組C5a (Sigma)或待測肽、由Hunter/BoIton方法制備的標記125I-C5a ( 20pM) (New England Nuclear, MA)禾n PMN (0.2 x 106)，至最終體積為200 ^L/孔。在4。C下 溫育60分鐘，過濾樣品并用緩沖液沖洗一次平皿。將濾紙干燥、打孔(pouch) 并在LKB Y計數(shù)器中計數(shù)。通過加入1 mM肽或100 nM C5a來測定非特異性結合， 非特異性結合通常占總結合的10-15%。
數(shù)據(jù)用非線性回歸和Dunnett post-test統(tǒng)計分析。
拮抗劑活性的髓過氧化物酶釋放試驗
按照以前描述(Sanderson等人，1995)的方法分離細胞，并與細胞松弛素B (5嗎/mL， 15分鐘，37")溫育。將含有0.15%明膠和待測肽的Hank's平衡鹽溶 液加入到96孔板中(總體積為100 nL/孔)，然后加入25 的細胞(4 x 106/mL)。 為了測定每種肽的抗C5a的能力，在37。C下用每種肽溫育細胞5分鐘，然后加入 C5a (100nM)，再溫育5分鐘。然后向每種孔中加入50 的磷酸鈉(0.1 M, pH 6.8)，將板冷卻至室溫，向每孔中加入25 的新鮮的二甲基對二氨基聯(lián)苯(5.7 mg/mL)和11202 (0.51%)的等體積混合物。10分鐘后通過加入2%的疊氮化鈉終止反應。在450nm處通過Bioscan450板讀數(shù)器測定吸光值，以對照值(無肽)作 校正，通過非線性回歸分析。
材料和方法
小鼠
所有實驗經(jīng)雷登(Leiden)大學醫(yī)學中心，動物福利委員會外科分會允許。所 有實驗使用12至16周齡雄性ApoE—z—小鼠。鼠以標準食物(chow)飲食喂養(yǎng)，隨 意接受水和食物。手術之前，通過腹膜內(nèi)注射咪達唑侖(Midazolam, 5 mg/kg， Roche)、美托咪定(Medetomidine, 0.5 mg/kg， Orion)和芬太尼(Fentanyl， 0.05 mg/kg， Janssen)將小鼠麻醉。在處死小鼠時測定血清膽固醇水平。
靜脈移植模型
按照Zou等人(1998) (Am JPathoI. 153: 1301-1310)描述的方法進行靜脈移 植手術。簡單來說，從具有遺傳同一性的供體小鼠體內(nèi)收取腔靜脈，移植前將其 保存在4"C含有100U/ml肝素的0.9%NaCl中。在移植受體身上，分離右側頸動脈 并從中間切斷。在該動脈兩個末端放置聚乙烯套管(cuff)。將該動脈沿套管外翻 并用8.0號縫合絲線扎緊。將腔靜脈套入兩個套管并扎緊。通過靜脈移植物中脈博 和血液湍流的存在來確定植入成功。全部步驟通常需要約30分鐘。
免疫組織化學檢測靜脈移植物中的C5
靜脈移植手術后，在以下時間點將24只小鼠處死術后立即處死、術后24 小時、術后3天、術后7天、術后14天和術后28天。處死時，以4%甲醛在體灌 注固定5分鐘后收取靜脈移植物。靜脈移植物用4%甲醛固定過夜，脫水和包埋于 石蠟中。將整個包埋血管樣品制成連續(xù)的5 pm垂直橫截面。使用直接抗小鼠C5 的抗體(HyCult Biotechnology; 1:25稀釋)通過免疫組織化學法來檢測靜脈移植 物中C5的存在。本領域技術人員明白C5a是C5的剪切產(chǎn)物，也明白如果產(chǎn)生了 C5a，則C5a將出現(xiàn)在經(jīng)鑒定是C5的位點。
RNA的分離、cDNA的合成和RT-PCR
于術后24小時以及術后3、 7、 28天，收取腔靜脈供體小鼠的16個靜脈移植 物的總RNA。
使用纖維組織用RNA分離微型試劑盒(Qiagen)，按照生產(chǎn)商提供的步驟分離 RNA。為了避免DNA污染，加入DNA酶(Dnase)(無RNase的DNase set， Qiagen) 處理。使用 Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beats 試齊(J盒 (Amersham Biosciences)按照生產(chǎn)商的步驟將RNA (250嗎)進行逆轉錄。
使用如下的C5a受體引物和p-肌動蛋白(Perkin-Elmer)進行半定量RT-PCR (Robocycler Gradient 96, Stratagene):
上游引物GACCCCATAGATAACAGCA 下游引物CAGAGGCAACACAAAACCCA (Van Beck等人(2000) Exp Neurol. 161 :373-382)。
2294°C， 2分鐘的最初循環(huán)之后進行35個循環(huán)以擴增樣品。每個循環(huán)由以下構 成94t:進行30秒，56。C進行30秒和65。C進行90秒，然后74'C， 4分鐘進行一 個延伸循環(huán)。在含有溴化乙錠的1.2。/。瓊脂糖凝膠上將PCR產(chǎn)物顯色。
內(nèi)膜增生的定量和組織學測定
使用常規(guī)方法，用蘇木精-焰紅染料-藏紅花將靜脈移植物的橫截面染色。靜脈 移植物增厚的內(nèi)膜增生表面使用圖像分析軟件(Qwin， Leica)進行測量。對于每 個靜脈移植物，使用6個相等面積的橫截面來確定血管壁增厚的程度。
為了鑒定巨噬細胞和巨噬細胞來源的泡沫細胞，使用抗小鼠巨噬細胞的 AIA31240 —抗(1:3000， Accurate Chemical)進行免疫組織化學分析。巨噬細胞 和泡沫細胞在內(nèi)膜增生中的作用大小通過計算機輔助分析(Qwin， Leica)測量抗 體AIA31240染色的區(qū)域來分析，以占總的內(nèi)膜增生表面的百分比來表示。
統(tǒng)計分析
所有數(shù)據(jù)以平均值iSEM表示。為了總體測定顯著性，所有組間使用單因素 ANOVA進行比較。如果差異顯著，再將每組與對照組用Student'st檢驗分別進行 比較。P值小于0.05認為是顯著性差異。 實施例2
C5存在于重塑靜脈移植物中
通過在手術后幾個時間點收取的靜脈移植物(t=6小時、1、 3、 7、 14和28 天)的免疫組織化學分析(每個時間點n=4)來檢測C5在內(nèi)膜增生發(fā)展中的存在。
術后6小時和1天收取的靜脈移植物中，能在粘附的單核細胞和外膜纖維母 細胞中檢測到大量C5。術后7天的再生內(nèi)皮中也檢測到C5。在這個階段，染色似 乎最顯著和廣泛地存在，提示在血管壁中存在大量的C5。在較晚的時間點(術后 14和28天)，在內(nèi)皮細胞、粘附的單核細胞、外膜纖維母細胞和泡沫細胞中可觀 察到C5的表達與內(nèi)膜增生的發(fā)展平行。有少量的平滑肌細胞顯示C5染色呈陽性， 如圖2所示。 實施例3
重塑的靜脈移植物中C5a受體mRNA呈時間依賴性表達
為了確定C5a受體是否存在于靜脈移植物中以及是否在靜脈移植物中產(chǎn)生， 分離總RNA并通過RT-PCR檢測了 C5aR mRNA的存在。在幾個時間點(t=24小 時、3天、7天和28天，每個時間點11=4)收取靜脈移植物，也收取正常的腔靜脈 作為對照。通過持家基因(3-肌動蛋白的存在來測定所有樣品中的總cDNA。
正常腔靜脈顯示C5aR的表達很少。在靜脈移植物中C5a的表達以時間依賴性 方式漸增。術后7天觀察到峰值表達，其后表達量下降至在術后28天正常腔靜脈 中所觀察到的水平；這在圖3中闡釋。
這些數(shù)據(jù)證實C5a受體在靜脈移植物中存在，并在靜脈移植物增厚過程的早 期表達上調(diào)。實施例4
C5a促進內(nèi)膜增生
為了檢測C5a參與靜脈移植物增厚的發(fā)展，我們將兩個濃度的重組C5a(0.5嗎 和5嗎，溶于100^120%普朗尼克凝膠，每組11=7)術后直接用于靜脈移植物。對 照組應用不含C5a的100 ^ 20%普朗尼克凝膠。手術時的血清膽固醇為10.4±1.2， 其在實驗中沒有顯著變化。三組間體重和血清膽固醇沒有不同。
28天后收取靜脈移植物，對靜脈移植物增厚進行定量。如圖4A和4B所示， C5a的過量表達導致內(nèi)膜增生引起的靜脈移植物增厚呈劑量依賴性增強。與對照靜 脈移植物相比，重組C5a處理導致內(nèi)膜增生表面呈劑量依賴性增加(對照:0.24±0.02 mm2; 0.5pgC5a: 0.29±0.03 mm2 vs， p=0.14， 5 ng C5a: 0.41±0.04 mm2'與対.照 組相比，p=0.002;與0.5嗎C5a處理組相比p4.037)。在三個不同組中沒有看到 內(nèi)腔面積的顯著性區(qū)別。 實施例5
C5a增加內(nèi)膜增生中的泡沫細胞含量
由于C5a是單核/巨噬細胞的有效趨化因子，因此研究了增厚的靜脈移植物中 巨噬細胞和巨噬細胞來源的泡沫細胞的數(shù)量。
將21只小鼠隨機分成三組。在處理組，將0.5昭或5嗎大腸桿菌來源重組小 鼠C5a (HyCult Biotechnology)溶于0.1 ml 20%普朗尼克凝膠，并在手術時在靜 脈穿刺部位周圍應用。在對照組，應用不含C5a的0.1m120。/。普朗尼克凝膠。28 天后處死小鼠。在C5a處理的靜脈移植物中觀察到巨噬細胞促進內(nèi)膜增生的作用 呈劑量依賴性增加，如圖5A和5B所示。
在對照組，約17±2%的內(nèi)膜增生由巨噬細胞和巨噬細胞來源的泡^*細胞構成。 當應用0.5嗎C5a時，這個百分比增加至22±3% (p-0.ll)。將5嗎C5a應用于靜 脈移植物導致巨噬細胞/泡沫細胞含量顯著增加33±2% (與對照移植物相比， p〈0.001;與0.5嗎C5a處理的移植物相比，p=0.008)。 實施例6
C5a受體拮抗劑處理抑制內(nèi)膜增生
為了抑制C5a的功能，將21只小鼠隨機分成三組，并用C5a環(huán)肽拮抗劑 AcF-[OP-(D-Cha)WR] (AcF)或氫化肉桂酸鹽-[OP-(D-Cha)WR] (HC)處理。兩個 化合物均表現(xiàn)出有效的抗C5a受體的活性，并通過以上描述和March et al. (2004) Mol Pharmacol 65: 868-879中描述的方法來合成。
AcF于0.1 ml 30%聚乙二醇和70%無菌水中，在手術前1天開始，以3 mg/kg 的曰劑量皮下給藥。由于HC在體內(nèi)以劑量依賴性的方式表現(xiàn)出比AcF更強的能 效(Woodruff et al. (2005) J Pharmacol exp Ther,)，所以HC以3 mg/kg/天和0.3 mg/kg/天兩個劑量給藥，二者均在于0.1 ml30。/。聚乙二醇和70%無菌水中。對照組 (n=7)每日注射0.1 ml 30%聚乙二醇和70%無菌水。術后28天處死所有小鼠。28只小鼠分別接受C5a受體拮抗劑AcF (在30%聚乙二醇中，3 mg/kg/天， 皮下(s.c)， n=7)、 C5a受體拮抗劑HC (在30%聚乙二醇中，3和0.3 mg/kg/天, 皮下，每個劑量n=7)或者每日皮下注射30%聚乙二醇(n=7)。手術時血清膽固 醇為11.7±2.0。在不同處理組沒有觀察到體重或血清膽固醇的差異。
與對照組小鼠相比，AcF處理引起靜脈移植物增厚顯著減輕53% (0.19±0.03 mm2，對照0.39±0.06 mm2; p=0.046)，而相似劑量的HC處理沒有引起靜脈移植 物增厚減輕(0.33 士0.03mm2， p=0.23)。但是，與對照組動物相比，以低10倍劑 量的HC (0.3 mg/kg)處理確實引起內(nèi)膜增生顯著性減輕(0.23±0.03 mm2, p=0.035。 這些結果總結于圖6A和圖6B。
在對照組與AcF和3 mg/kg HC組之間沒有看到管腔大小的差異，而0.3 mg/kg HC處理確實引起管腔面積的顯著增加(對照0.42±0.04 mm2; AcF: 0.41±0.08 mm2， p=0.48; HC 3 mg/kg: 0.48±0.03 mm2， p=0.15; HC 0.3 mg/kg: 0.61±0.04 mm2， p=0.005)。 實施例7
C5aRA處理減少內(nèi)膜增生中的泡沫細胞數(shù)量
對照的、未處理的靜脈移植物內(nèi)膜增生由約30±4%泡沫細胞構成。在AcF處 理的靜脈移植物中看到泡沫細胞數(shù)量顯著減少(16±3%，與對照組相比p=0.01 )。 在3mg/kg/天的HC處理的組中未看到顯著減少(增生內(nèi)膜中泡沫細胞為22±3%， 與對照組相比p407)。但是，使用0.3mg/kg沃的日劑量的HC確實引起內(nèi)膜增生 中泡沫細胞的顯著減少(16±3%， p=0.01)。這些結果總結于圖6C。 實施例8
C5aRA在動脈粥樣硬化模型中的效應
為了進一歩研究C5a受體拮抗劑在動脈粥樣硬化細胞模型中的效應，可使用 血管平滑肌細胞(VSMC)、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞進行體外研究，以及轉基因小鼠 模型(ApoE敲除小鼠)用于體內(nèi)研究。也可使用大鼠再狹窄模型和家兔動脈粥樣 硬化的剝脫/高膽固醇血癥模型。
PMX C5a受體拮抗劑最初用于體外研究以確定他們對單獨培養(yǎng)的VSMC和與 內(nèi)皮細胞和/或巨噬細胞共培養(yǎng)的VSMC增殖的效應。
化合物也用于疾病模型的體內(nèi)試驗，如ApoE敲除小鼠模型、家兔剝脫/高膽 固醇血癥模型和大鼠再狹窄模型?；衔锛扔糜陬A防性也用于治療性步驟的給藥。 實施例9
討論
我們首次證明了補體成分C5a參與靜脈移植物增厚過程。C5a是包括單核細 胞、中性粒細胞和T細胞的免疫和炎性細胞高度有效的趨化劑，并證實其在幾種 疾病中調(diào)節(jié)促炎性效應，但是它在靜脈移植物增厚中的作用以前從未被檢測過。
在本研究中，通過手術后幾個時間點的免疫組織化學分析證明了 C5蛋白存在于靜脈移植物中。C5主要在增生內(nèi)膜的粘附的單核細胞、外膜纖維母細胞、內(nèi)皮 細胞和泡沫細胞中表達，手術后7天染色似乎是最深的。但是，由于所用的抗體 對于C5a來說不是特異性的，因此當使用C5、 C5a和C5b-9抗體時也是如此。
此外，通過RT-PCR檢測了編碼C5a受體m RNA表達的時間過程。在基礎水 平，正常腔靜脈中只檢測到非常低水平的C5aRmRNA。靜脈植入術后第1天觀察 到C5aRmRNA表達水平迅速上調(diào)。術后第7天出現(xiàn)峰值表達，與使用免疫組織化 學分析看到的染色的C5最高水平相符合。接著，在植入術后28天后表達下降至 基礎水平。
為了研究C5a在增生內(nèi)膜形成過程中的功能性參與，通過為靜脈移植物應用 小鼠重組C5a蛋白研究了增加C5a量的效應。由于炎性細胞向靜脈移植物的趨化 現(xiàn)象是內(nèi)膜增生發(fā)展過程中最早觀察到的現(xiàn)象之一，我們假設增加C5a量將導致 促進內(nèi)膜增生形成。我們發(fā)現(xiàn)增加C5a量不僅加速了內(nèi)膜增生的形成，而且還促 進增生內(nèi)膜中巨噬細胞來源的泡沫細胞含量增加；這兩個對C5a的反應為劑量依 賴性的。
此外，當使用有效的C5aR拮抗劑AcF和HC阻斷C5a的功能時，看到了相 反的效應。抑制C5aR的功能引起內(nèi)膜增生發(fā)展的抑制，伴有泡沫細胞促進內(nèi)膜增 生的作用減弱。
這些數(shù)據(jù)表明C5a對于小鼠靜脈移植疾病體內(nèi)模型具有促狹窄、促動脈粥樣 硬化的效應。
我們發(fā)現(xiàn)HC的效應是劑量依賴性的。但使用最高劑量，3 mg/kg/天時，HC 處理在我們的模型中未抑制內(nèi)膜增生。這與我們在大鼠炎性腸疾病模型中使用HC 的結果一致(Woodruff等人.(2005)J Pharmacol Exp Ther.)。我們假設以高劑量使 用HC對炎性腸疾病缺少治療性效應可能由于是對未鑒定的受體的有害效應、局部 毒性或其他尚未識別的因素。在本研究中發(fā)現(xiàn)相似的結果，其中使用的較高劑量 的HC， 3mg/kg，沒有效應，但是當使用低于此劑量IO倍的HC時內(nèi)膜增生顯著 減輕。
本研究的這些結果，使用兩個不同的C5a受體拮抗劑，清楚地表明C5aR在內(nèi) 膜增生的發(fā)病機理中的作用。
對于C5a在其他形式的炎癥相關血管重塑中的作用知之甚少。盡管有幾項對 補體在自發(fā)性動脈粥樣硬化中的作用存在爭議的研究，但是這些研究報告了非結 論性的結果。C5 mRNA和蛋白均存在于正常動脈中，在動脈粥樣硬化動脈中C5 mRNA和蛋白質(zhì)有實質(zhì)性的增加(Yasojima et al.(2001) Am J Pathol. 158: 1039-1051)。 ApoE/C5雙敲除小鼠與其同胞ApoE-A小鼠以相似的速率發(fā)展成自發(fā) 性動脈粥樣硬化(Patel et al.(2001) Biochem Biophys Res Commun. 286: 164-170)。 但是，C5敲除小鼠不適合于C5a作用的特異性鑒定，因為C5缺失也抑制補體成 分C5b-9的形成。在晚期動脈粥樣硬化患者血清中C5a水平增加與心血管風險增
26加相關，這一點由主要不利心血管事件的發(fā)生確定(Speidl et al. (2005) Eur Heart J.)，提示C5a可作為患者風險評估的有價值的標志。
迄今還沒有C5a在第三種形式的血管重塑即血管成形術后再狹窄中的作用的 報道。盡管這些斑塊通常主要由新生內(nèi)膜中的平滑肌細胞構成，并且僅存在極少 量炎性細胞，但是已經(jīng)表明炎癥反應在這個過程中起到關鍵作用(Danenbergetal. (2002) Circulation. 105: 2917-2922; Toutouzas et al. (2004) Eur Heart J. 25: 1679-1687)。而且，已經(jīng)表明其他趨化因子參與再狹窄的發(fā)展(Chen et al. (2004) Arterioscler Thromb Vase Biol. 24: 709- 714; Usui et al. (2002) FASEB J. 16: 1838-1840)。
我們的結果表明C5a可能也參與動脈粥樣硬化和再狹窄，因此C5a受體拮抗 劑在治療和預防這些病狀中也是有用的。
這里所引用的參考文獻在下頁列出，在這里引入作為參考。
在本說明書的通篇，詞語"包含"或其變體如"包括"或"含有"，將理解為包括所 指明的元素、整數(shù)或步驟，或元素、整數(shù)或步驟的組，但是不排除任何其他元素、 整數(shù)或歩驟，或元素、整數(shù)或步驟的組。
在這里引入本說明書中提到的所有出版物作為參考。本說明書中包括的對文 件、法案、材料、裝置、論文等的任何討論只是為了提供本發(fā)明上下文。不應認 為是承認這些主題的任何或全部內(nèi)容構成本發(fā)明相關領域的現(xiàn)有技術基礎部分或 公知常識，因這些內(nèi)容在本申請的每種權利要求的優(yōu)先權日之前存在于澳大利亞 或其他任何地方。
本領域技術人員將理解，在未偏離如廣泛描述的本發(fā)明的要義或范圍內(nèi)，正 像在特定的具體實施方式
所顯示的那樣，可對本發(fā)明進行多種改變和/或修改。因 此，這些具體實施方式
在各個方面均應認為是例證性的而不是限制性的。
權利要求
1、一種治療或預防血管壁內(nèi)膜增生的方法，該方法包含對哺乳動物使用治療有效量的C5a功能抑制劑的步驟。
2、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中哺乳動物是血管移植物或假體受體。
3、 根據(jù)權利要求2所述的方法，其中移植物是靜脈移植物或動脈移植物。
4、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中哺乳動物是器官移植受體。
5、 根據(jù)權利要求4所述的方法，其中器官移植選自心臟移植、心肺移植或腎 臟移植。
6、 一種抑制血管移植物增厚發(fā)展的方法，該方法包含對哺乳動物使用治療有 效量的C5a功能抑制劑的歩驟。
7、 根據(jù)權利要求6所述的方法，其中移植物是靜脈或動脈移植物。
8、 一種抑制支架內(nèi)再狹窄發(fā)展的方法，該方法包含為植入了支架的哺乳動物 使用治療有效量的C5a功能抑制劑的步驟。
9、 一種預防或治療哺乳動物血管壁或其他解剖結構的狹窄、再狹窄或細胞非 預期的增殖、遷移或肥大的方法，該方法包含對哺乳動物使用治療有效量的C5a 功能抑制劑的步驟。
10、 根據(jù)權利要求9所述的方法，其中哺乳動物血管壁或其他解剖結構的狹 窄、再狹窄或細胞的非預期的增殖、遷移或肥大是選自下列的一種或多種病狀的 結果動脈粥樣硬化、慢性阻塞性肺病、移植、血管移植、靜脈手術、動脈手術、 旁路移植失敗、整形手術、組織移植、腫瘤、黃斑變性、新生血管形成、異常創(chuàng) 傷修復、子宮內(nèi)膜異位、血管炎、血栓癥后的血管再生缺陷、假體手術、瘢痕形 成、動脈瘤手術/修復、淋巴手術/修復、脊柱損傷/手術/修復、內(nèi)皮腫瘤、瘢痕、 肉芽瘤、血管瘤、血栓性疾病后的治療/修復、血管成形術和再造步驟。
11、 根據(jù)權利要求9或權利要求10所述的方法，其中C5a功能抑制劑為已經(jīng) 接受或?qū)⒁邮苎艹尚涡g、經(jīng)皮腔內(nèi)斑塊旋切術和/或支架植入術以治療血管阻 塞的患者使用，并且其中化合物以有效量并通過有效預防血管再阻塞的給藥途徑使用。
12、 根據(jù)權利要求1-11任一項所述的方法，其中C5a功能抑制劑是C5a受體 (C5aR)拮抗劑。
13、 根據(jù)權利要求12所述的方法，其中C5a受體拮抗劑是具有通式I的環(huán)肽 或擬肽化合物F通式i其中A是H、烷基、芳基、NH2、 NH-垸基、N(烷基)2、 NH-芳基、NH-?；?、 HN-苯甲酰、NHS03、 NHSOr垸基、NHS(V芳基、OH、 O-烷基或O-芳基；B是垸基、芳基、苯基、苯甲基、萘基或吲哚基團，或D-或L-氨基酸的側鏈， 但不是甘氨酸、D-苯甘氨酸、L-高苯丙氨酸、L-色氨酸、L-高色氨酸、L-酪氨酸或 L-高酪氨酸的側鏈；C是D-、 L-或高氨基酸的側鏈，但不是異亮氨酸、苯丙氨酸或環(huán)己基丙氨酸 的側鏈；D是中性D-氨基酸的側鏈，但不是甘氨酸或D-丙氨酸的側鏈，大的平面的側 鏈或大的帶電的側鏈；E是大的取代基，但不是D-色氨酸、L-N-甲基色氨酸、L-高苯丙氨酸、L-2-萘基L-四氫異喹啉、L-環(huán)己基丙氨酸、D-亮氨酸、L-芴基丙氨酸或L-組氨酸的側 鏈；F是L-精氨酸、L-高精氨酸、L-瓜氨酸或L-刀豆氨酸的側鏈或其生物等排物；并且X1是-(CH2)nNH-或(CH2)nS-，其中n是1至4的整數(shù)；-(CH2)20-; -(CH2)30-;-(CH2)3-; -(CH2)4-; -CH2COCHRNH-;或-CH2-CHCOCHRNH-，其中R是任意常 見或不常見氨基酸的側鏈。
14、根據(jù)權利要求13所述的方法，其中n是2或3。
15、 根據(jù)權利要求13或權利要求14所述的方法，其中A是乙酰胺基團、氨 甲基基團，或者取代的或未取代的氨磺?；鶊F。
16、 根據(jù)權利要求13或權利要求14所述的方法，其中A是取代的氨磺酰， 并且取代基為1至6個碳原子的烷基鏈，或苯基或甲苯甲?；鶊F。
17、 根據(jù)權利要求16所述的方法，其中取代基是1至4個碳原子的烷基鏈。
18、 根據(jù)權利要求13至17任一項所述的方法，其中B是L-苯丙氨酸或L-苯甘氨酸的側鏈。
19、 根據(jù)權利要求13至18任一項所述的方法，其中C是甘氨酸、丙氨酸、 亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸或硫代脯氨酸的側鏈。
20、 根據(jù)權利要求13至19任一項所述的方法，其中D是D-亮氨酸、D-高亮 氨酸、D-環(huán)己基丙氨酸、D-高環(huán)己基丙氨酸、D-纈氨酸、D-正亮氨酸、D-高-正亮 氨酸、D-苯丙氨酸、D-四氫異喹啉、D-谷氨酰胺、D-谷氨酸或D-酪氨酸的側鏈。
21、 根據(jù)權利要求13至20任一項所述的方法，其中E是選自L-苯丙氨酸、 L-色氨酸或L-高色氨酸，或L-l-萘基或L-3-苯并噻吩基丙氨酸的氨基酸的側鏈。
22、 根據(jù)權利要求13至21任一項所述的方法，其中化合物無可檢測到的C5a 受體的激動劑活性。
23、 根據(jù)權利要求13至22任一項所述的方法，其中化合物具有IC5Q <25 pM 的受體親和力和IC5o < 1 nM拮抗劑性能。
24、 根據(jù)權利要求13至23任一項所述的方法，其中化合物選自 PCT/AU02/01427 (公布號WO 2003/033528)中所述的化合物1-6、 10-15、 17、 19、 20、 22、 25、 26、 28、 30、 31、 33-37、 39-45、 47-50、 52-58或化合物60-70。
25、 根據(jù)權利要求24所述的方法，其中化合物選自AcF[OP-DCha-WR]、AcF[OP-DPhe-WR]、 AcF[OP-DCha-FR] AcF[OP-DCha-WCit]、 HC-[OP-DCha-WR]、 AcF-[OP-DCha-WCit]或HC-[OP陽DPhe-WR]。
26、 根據(jù)權利要求25所述的方法，其中化合物是AcF[OP-DCha-WR]或 HC-[OP-DCha-WR]。
27、 根據(jù)權利要求1至26任一項所述的方法，其中C5a功能抑制劑是局部給藥。
28、 根據(jù)權利要求27所述的方法，其中抑制劑位于可植入腔內(nèi)裝置之上或之 內(nèi)，并且化合物通過將裝置植入哺乳動物體內(nèi)以使該化合物從植入裝置上洗脫的 方式給藥。
29、 根據(jù)權利要求28所述的方法，其中裝置包含植入到哺乳動物的動脈或靜 脈中的支架。
30、 根據(jù)權利要求27所述的方法，其中C5a功能抑制劑是局部給藥，通過 血管內(nèi)輸送裝置到達植入物或假體的部位。
31、 根據(jù)權利要求30所述的方法，其中血管內(nèi)輸送裝置是導管。
32、 根據(jù)權利要求l-26任一項所述的方法，其中C5a功能抑制劑是系統(tǒng)給藥。
33、 根據(jù)權利要求32所述的方法，其中系統(tǒng)給藥途徑選自皮下、靜脈注射、 肌肉注射、腸道給藥、口服給藥、直腸給藥或胃腸道外給藥。
34、 根據(jù)權利要求33所述的方法，其中系統(tǒng)給藥是口服或直腸給藥。
35、 根據(jù)權利要求l-34任一項所述的方法，其中哺乳動物選自人、陪伴動物、 家畜或動物園動物。
36、 根據(jù)權利要求35所述的方法，其中哺乳動物是人。
37、 治療有效量的C5a功能抑制劑在制備用于治療或預防哺乳動物血管壁內(nèi) 膜增生的藥物中的用途。
38、 治療有效量的C5a功能抑制劑在制備用于抑制哺乳動物血管移植物增厚 發(fā)展的藥物中的用途。
39、 治療有效量的C5a功能抑制劑在制備用于抑制哺乳動物支架內(nèi)再狹窄發(fā) 展的藥物中的用途。
40、 治療有效量的C5a功能抑制劑在制備用于預防或治療哺乳動物血管壁或 其他解剖結構的狹窄、再狹窄或者非預期的細胞增殖、細胞的遷移或肥大的藥物 中的用途。
41、 根據(jù)權利要求37-40任一項所述的用途，其中C5a功能抑制劑是具有通 式I的環(huán)肽或擬肽化合物<formula>formula see original document page 6</formula>通式I其中A是H、烷基、芳基、NH2、 NH-烷基、N(烷基)2、 NH-芳基、NH-?；?、 NH-苯甲酰、NHS03、 NHS02-烷基、NHS02-芳基、OH、 O-烷基或O-芳基；B是垸基、芳基、苯基、苯甲基、萘基或吲哚基團，或D-或L-氨基酸的側鏈， 但不是甘氨酸、D-苯甘氨酸、L-高苯丙氨酸、L-色氨酸、L-高色氨酸、L-酪氨酸或 L-高酪氨酸的側鏈；C是D-、 L-或高氨基酸的側鏈，但不是異亮氨酸、苯丙氨酸或環(huán)己基丙氨酸 的側鏈；D是中性D-氨基酸的側鏈，但不是甘氨酸或D-丙氨酸的側鏈、大的平面?zhèn)孺?或大的帶電側鏈；E是大的取代基，但不是D-色氨酸、L-N-甲基色氨酸、L-高苯丙氨酸、L-2-萘基L-四氫異喹啉、L-環(huán)己基丙氨酸、D-亮氨酸、L-芴基丙氨酸或L-組氨酸的側 鏈；F是L-精氨酸、L-高精氨酸、L-瓜氨酸或L-刀豆氨酸或其生物等排物的側鏈；并且X1是-(CH2)nNH-或(CH2)nS-，其中n是l至4的整數(shù)；-(CH2)20-; -(CH2)30-; -(CH2)3-; -(CH2)4-; -CH2COCHRNH-;或-CH2-CHCOCHRNH-，其中R是任意常 見或不常見氨基酸的側鏈。
全文摘要
本發(fā)明提供了預防或治療血管壁內(nèi)膜增生的方法，該方法包含對哺乳動物使用治療有效量的C5a功能抑制劑的步驟。
文檔編號A61P9/10GK101553244SQ200780027783
公開日2009年10月7日 申請日期2007年7月20日 優(yōu)先權日2006年7月21日
發(fā)明者A·施內(nèi)普斯, P·H·A·夸克斯 申請人:普羅米克斯有限公司