專利名稱：調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)的方法及用于該方法的肽的制作方法
調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)的方法及用于該方法的肽 被伊微奴鄉(xiāng)
00011本申請要求享有2006年3月6日提交的美國專利申請11/367,449的 優(yōu)先權(quán)，后一申請是2004年3月17日提交的美國專利申請10/802,644的 部分延續(xù)申請，后一申請是2002年6月26日提交、現(xiàn)已放棄的美國專利 申請10/180,753的繼續(xù)申請，后一申請要求享有2001年6月26日提交的 美國臨時(shí)申請60/300,933的優(yōu)先權(quán)，上述申請公開的內(nèi)容在此完整引入作 為參考。
微攻淑鄉(xiāng)聲努
10002
本發(fā)明是在美國聯(lián)邦政府的資助下完成的，國立衛(wèi)生研究院項(xiàng)目號 R01HL36982。美國政府對本發(fā)明享有一定權(quán)利。
發(fā)剪銀統(tǒng)
10003本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞分泌過程的方法。更具體地，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié) 炎性介質(zhì)的釋放。本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞中膜結(jié)合的囊泡或者顆粒分 泌炎性介質(zhì)的胞內(nèi)信號機(jī)制。
10004在人類和非人類動物中，粘液的分泌過多導(dǎo)致大量氣道炎性疾病的 發(fā)病。以下情形中經(jīng)?？梢砸姷皆黾拥恼骋悍置诼约膊?，例如哮喘， 慢性梗阻性肺病(COPD)和慢性支氣管炎；遺傳性疾病例如囊性纖維化；變 應(yīng)性疾病(特應(yīng)性，變態(tài)反應(yīng)性炎癥)；支氣管擴(kuò)張癥；和許多急性、傳 染性呼吸道疾病例如肺炎，鼻炎，流感或者普通感冒。
00051在這些呼吸性疾病中伴隨粘液分泌過多的是氣道中炎性細(xì)胞的持久 存在。這些細(xì)胞對這類疾病的病理學(xué)作用很大，其通過這些細(xì)胞釋放的炎 性介質(zhì)造成組織損傷。該慢性炎癥造成的這類損傷的一個(gè)實(shí)例存在于囊性纖維化患者，其中中性粒細(xì)胞釋放的介質(zhì)(例如，髓過氧化物酶)誘導(dǎo)氣 道上皮組織的脫落。
0006]粘液的分泌不足(under-secretion)也具有不良影響。氣道粘液作為物 理屏障可以抗吸入的生物學(xué)活性顆粒，并且可以預(yù)防氣道的細(xì)菌定殖和滅 活白細(xì)胞釋放的細(xì)胞毒性產(chǎn)物。King等，62:47-59 (1985); Vishwanath禾口 Ramphal， /"/e". /wmw". 45:197 (1984); Cross 丄awcef 1:1328(1984)。在眼部，粘液維持淚膜，對眼睛健康和舒適非常重要。胃腸 道的粘液分泌還具有細(xì)胞保護(hù)功能。粘液作為化學(xué)、生物學(xué)和機(jī)械屏障的 作用說明，粘膜分泌異常低的粘液是有害的。
0007哺乳動物氣道布滿由氣道上皮(杯狀)細(xì)胞和粘膜下腺產(chǎn)生和分泌 的粘液薄層。在氣道疾病例如哮喘、慢性支氣管炎和囊性纖維化中，粘液 的分泌過多是共同癥狀。過量的粘液可能導(dǎo)致阻塞和對傳染的易感性。粘 液的主要成分是由分泌細(xì)胞合成并保存在胞質(zhì)粒中的粘蛋白。粘蛋白是由 呼吸道、胃腸道和雌性生殖道中包括的上皮細(xì)胞分泌的糖蛋白家族。粘蛋 白造成粘液的粘彈性質(zhì)，已知至少8種粘蛋白基因。Thornton,箏, / AW. C7/em. 272, 9561-9566 (1997)。由粘蛋白分泌過多和/或粘液細(xì)胞增生造成的 粘液纖毛損傷導(dǎo)致氣道粘液填塞，這將加速慢性感染、氣流阻塞，有時(shí)甚 至是死亡。許多氣道疾病，例如慢性支氣管炎，慢性阻塞性肺病，支氣管 擴(kuò)張，哮喘，囊性纖維化和細(xì)菌感染的特征在于粘蛋白的過度產(chǎn)生。E. Prescott,等，/ —r. / ， 8:1333-1338 (1995); K. C. Kim，等 /， 10:1438 (1997); D. Steiger,寧爿m. / 化一.Ce〃 Mo/. /.， 12:307-314 (1995)。在合適的剌激下，粘蛋白顆粒通過胞吐過程釋放，其中顆粒轉(zhuǎn)移到 細(xì)胞外周，在那里所述顆粒的膜與質(zhì)膜融合，允許內(nèi)容物的腔分泌。 MARCKS， 一種大約82 KD的蛋白，具有3個(gè)進(jìn)化-保守區(qū) (Aderem等，Nature 1988; 332:362-364; Thelen等，Nature 1991; 351:320-322; Hartwig等，Nature 1992; 356:618-622; Seykora等，J Biol Chem 1996; 271:18797-18802): N-端，磷酸化位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域(PSD)和多重同源2 (MH2) 結(jié)構(gòu)域。所述N-端(24氨基酸序列，具有與末端甘氨酸殘基連接的肉豆蔻 酸部分)涉及MARCKS與膜的結(jié)合(Seykora等，J Biol Chem 1996; 271:18797-18802)，并可能涉及MARCKS與鈣調(diào)蛋白的結(jié)合(Matsubara等, J Biol Chem 2003; 278:48898-48902)。該24氨基酸序列被稱為MANS肽。 在細(xì)胞中MANS肽和其活性片段能夠與天然的MARCKS競爭膜結(jié)合。 MARCKS蛋白在浸潤白細(xì)胞的顆粒釋放炎性介質(zhì)過程中的參與和所有組織 和器官中疾病的炎癥有關(guān)，包括特征為氣道炎癥的肺疾病，例如哮喘、COPD 和囊性纖維化。但是，氣道中炎癥和粘液分泌是兩個(gè)分離并且獨(dú)立的過程(Li 等，J Biol Chem 2001; 276:40982-409卯;Singer等，Nat Med 2004;10:193-196)。盡管許多因子包括炎性細(xì)胞釋放的介質(zhì)都能引起粘液產(chǎn)生和 分泌，但是在過量粘液和炎癥之間還沒有已知的直接聯(lián)系。
發(fā)欲縦或者其活性片段。所 述活性片段的長度為至少6個(gè)氨基酸。當(dāng)在本文中使用時(shí)，MARCKS蛋白 的"活性片段"是影響(抑制或者增強(qiáng))MARCKS蛋白-介導(dǎo)的釋放的片段。 活性片段可以選自N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA (SEQ ID NO: 3); N腳肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQ ID NO: 4);N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ ID NO: 5); N-肉豆蔻酰 -GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ ID NO: 6); N-肉豆蔻酰 -GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ ID NO: 7); N-肉豆蔻酰 畫GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID NO: 8); N-肉豆蔻酰 -GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID NO: 9); N畫肉豆蔻酰 國GAQFSKTAAKGEAAA (SEQ ID NO: 10); N- 肉豆蔻酰 -GAQFSKTAAKGEAA (SEQ ID NO: 11); N-肉豆蔻酰畫GAQFSKTAAKGEA (SEQ ID NO: 12); N-肉豆蔻酰畫GAQFSKTAAKGE (SEQ ID NO: 13); N-肉豆 蔻酰-GAQFSKTAAKG (SEQ ID NO: 14); N-肉豆蔻酰陽GAQFSKTAAK (SEQ ID NO: 15); N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAA (SEQ ID NO: 16); N-肉豆蔻酰 -GAQFSKTA (SEQ ID NO: 17); N-肉豆蔻酰-GAQFSKT (SEQ ID NO: 18); 和N-肉豆蔻酰-GAQFSK(SEQIDNO: 19)。這些肽中疏水性N端肉豆蔻酸 酯部分的存在能夠增強(qiáng)它們與質(zhì)膜的相容性，并有可能增強(qiáng)它們對質(zhì)膜的 滲透性，從而有可能使所述肽被細(xì)胞攝取。肉豆蔻酸酯在雙分子層的疏水 性插入能夠使脂的分配系數(shù)或者表觀吸附常數(shù)達(dá)104 M-l或者大約8 kcal/mol的單(unitary)Gibbs自由結(jié)合能(參見，例如，Peitzsch, R.M.,和 McLaughlin, S. 1993， Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins. Biochemistry. 32: 10436-10443)，這足以，至少部分允許MANS肽和本文描述的肉豆蔻酰化 MANS肽片段進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)膜，而其他官能團(tuán)以及它們在MANS肽(其被肉豆 蔻?；?和肉豆蔻?；疢ANS肽片段內(nèi)的相互作用能夠增強(qiáng)它們的相對膜 滲透性。所述片段均能顯示代表其各自結(jié)構(gòu)的分配系數(shù)和膜親和力。所述 片段可以通過本領(lǐng)域已知的肽合成方法制備，例如通過固相肽合成進(jìn)行(參 見，例如，Chan， Weng C.和White描述的方法，Peter D.Eds.， Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Oxford University Press, New York, New York (2000);禾口 Lloyd-Williams, P.等，Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (1997))并利用本領(lǐng)域已知的純化，例如通 過高壓液相層析進(jìn)行。各種肽的分子量均可以通過質(zhì)譜法確定，每個(gè)均顯示適當(dāng)分子量的峰值。利用本文公開的實(shí)施例中描述的步驟，無需過度實(shí)
驗(yàn)就可以輕易地確定本文方法中個(gè)體肽和個(gè)體肽組合(例如，2種肽的組合， 3種肽的組合，4種肽的組合)的功效。優(yōu)選的組合將包括兩種肽；肽的優(yōu) 選摩爾比例可以從50:50到99.99:0.01，該比例利用本文公開的實(shí)施例中描 述的步驟可以輕易地確定。
00014]優(yōu)選的MANS肽或者其活性片段被包含在用于阻斷炎癥的藥物組 合物中。本發(fā)明還包括在對象中調(diào)節(jié)細(xì)胞分泌過程的方法，包括給藥治療 有效量的包含MANS肽或者其活性片段的化合物，其調(diào)節(jié)對象的炎性介質(zhì)。 所述給藥通常選自局部給藥，經(jīng)腸胃外給藥，經(jīng)直腸給藥，經(jīng)肺部給藥、 經(jīng)吸入給藥和經(jīng)鼻給藥或者口服給藥，其中經(jīng)肺部給藥通常包括種氣霧劑 給藥，干粉吸入器給藥，干粉吸入器給藥，定量吸入器給藥或者噴霧器給 藥。
00015]將組合物(包括脫顆粒抑制量的MANS肽或者脫顆粒抑制量的其 活性片段，例如MANS肽或者其活性片段的藥物組合物)用于人或者動物 至少將MANS肽或者其活性片段提供給組織內(nèi)或者組織上的位點(diǎn)或者與組 織表面接觸的體液-包含層或者粘液-包含層(在那里存在炎性粒細(xì)胞或者炎 性粒細(xì)胞將侵入那里)，從而使MANS肽或者其活性片段能夠接觸炎性粒 細(xì)胞。 一方面，在炎癥的最初發(fā)病或者最初檢出，或者人或者動物最初感 覺到炎癥，或者在人或者動物的炎癥水平最初出現(xiàn)可感知的變化時(shí)，可以 給藥這類組合物，以減少炎癥的量，所述炎癥將在不存在MANS肽或者其 活性片段的條件下發(fā)生。另一方面，可以在人或者動物組織的炎癥進(jìn)行期 間進(jìn)行給藥，以減少其他炎癥的量，所述其他炎癥將在不存在MANS肽或 者其活性片段的條件下發(fā)生。盡管給藥的劑量和頻率可以通過臨床評估來 確定，并且隨炎癥的疾病或者來源和組織涉及的程度以及患者的年齡和體 重而發(fā)生變化，但是可以預(yù)料在3到8小時(shí)之后可以重復(fù)藥物組合物的給 藥，優(yōu)選的在藥物組合物的第一次給藥后6到8小時(shí)進(jìn)行。100016本發(fā)明還包括減輕對象炎癥的方法，包括給藥治療有效量的抑制與 MARCKS相關(guān)的炎性介質(zhì)釋放的化合物，由此對象中至少一種炎性介質(zhì)的 釋放相對于沒有所述治療時(shí)發(fā)生的炎性介質(zhì)釋放減少。本文使用的"減少" 通常表示炎癥作用的減輕。優(yōu)選的，炎性介質(zhì)被所述公開的方法抑制或者 阻斷。 MANS肽和其活性片段可用于預(yù)防或者減少動物組織中炎性介質(zhì) 造成的炎癥的量。MANS肽和其活性片段可用于預(yù)防或者減少動物中炎性 介質(zhì)產(chǎn)生或者造成的組織損傷的量。
,微

圖14是條線圖，顯示8-溴-cGMP刺激對來自LPS-剌激的犬中性 粒細(xì)胞的MPO分泌幾乎沒有作用，直到以濃度-依賴的方式發(fā)生與PMA的 共剌激作用。
00033圖15是條線圖，顯示來自LPS-刺激的犬中性粒細(xì)胞的最大MPO 分泌需要用PMA+8-Br-cGMP共剌激。本發(fā)明將有效量的肽與炎性細(xì)胞接觸，其中有效量被定義為脫顆粒 抑制量的MANS肽或者其活性片段，與不存在MANS肽或者其活性片段的 條件下至少一種炎性細(xì)胞釋放的量相比，所述脫顆粒抑制量的MANS肽或 者其活性片段將至少一種炎性細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)的量減少大約1%到大 約99%。更優(yōu)選的，這種有效量的接觸肽包括脫顆粒抑制量的MANS肽或 者其活性片段，與不存在MANS肽或者其活性片段的條件下至少一種炎性 細(xì)胞釋放的量相比，所述脫顆粒抑制量的MANS肽或者其活性片段將至少 一種炎性細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)的量減少從大約5-50%之間到大約99%。其他促炎介質(zhì)已經(jīng)與各種疾病狀態(tài)建立聯(lián)系，所述疾病狀態(tài)與中性 粒細(xì)胞流入炎癥或者損傷位點(diǎn)有關(guān)。阻斷抗體已經(jīng)被證明是急性炎癥中抗 中性粒細(xì)胞相關(guān)組織損傷的有效療法(Harada等，1996, Mo/ecw/ar MeAc&e 7b&3/2,482)。除了中性粒細(xì)胞外還可以釋放炎性介質(zhì)的細(xì)胞包括其他白細(xì) 胞，例如嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，治療可以 針對這些細(xì)胞的分泌物。中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞是粒 細(xì)胞的各種類型，即，在其細(xì)胞質(zhì)中具有顆粒的白細(xì)胞。白細(xì)胞合成許多 在細(xì)胞質(zhì)顆粒中包裝和貯存的炎性介質(zhì)。這些介質(zhì)包括，例如，中性粒細(xì) 胞中的髓過氧化物酶[MPO](Borregaard N, Cowland JB. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood 1997; 89:3503-3521)， 嗜酸性粒細(xì)胞中的嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶[EPO]和主要堿性蛋白 [MBP](Gleich G J. Mechanisms of eosinophil-associated inflammation. J Allergy Clin Immunol 2000; 105:651-663)，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中的溶菌酶 (Hoff T， Spencker T, Emmendoerffer A., Goppelt匪Struebe M. Effects ofglucocorticoids on the TPA-induced monocytic differentiation. J Leukoc Biol 1992; 52:173-182; Balboa M A, Saez Y， Balsinde J. Calcium-independent phospholipase A2 is required for lysozyme secretion in U937 promonocytes. J Immunol 2003; 170:5276-5280)，以及天然殺傷(NK)細(xì)胞細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞 中的粒酶(Bochan MR, Goebel WS， Brahmi Z. Stably transfected antisense granzyme B and perforin constructs inhibit human granule-mediated lytic ability. Cell Immunol 1995; 164:234-239; Gong J H.， Maki G, Klingemann HG. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and fiinctional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia 1994; 8:652-658; Maki G， Klingemann HG， Martinson JA， Tam YK. Factors regulating the cytotoxic activity of the human natural killer cell line, NK-92. J Hematother Stem Cell Res 2001; 10:369-383;禾口 Takayama H， Trenn G， Sitkovsky MV. A novel cytotoxic T lymphocyte activation assay. J Immunol Methods 1987; 104:183-1907-10)。由于這些細(xì)胞浸潤損傷或者疾病的組織部位，這些介質(zhì) 可以在損傷部位被釋放，并可能導(dǎo)致炎癥和修復(fù)，例如在肺部和其他地方。 白細(xì)胞通過胞吐機(jī)制釋放這些顆粒(Burgoyne RD, Morgan A. Secretory granule exocytosis. Physiol Rev 2003; 83:581-632; Logan MR, Odemuyiwa SO, Moqbel R. Understanding exocytosis in immune and inflammatory cells: the molecular basis of mediator secretion. J Allergy Clin Immunol 2003; 111: 923-932)。
100051肥大細(xì)胞(其通常不在血流中循環(huán))和嗜堿性粒細(xì)胞包含分泌性細(xì) 胞質(zhì)顆粒，所述細(xì)胞質(zhì)顆粒保存并在細(xì)胞活化時(shí)釋放預(yù)先形成的炎性(過 敏性)介質(zhì)，例如組胺；蛋白多糖，例如肝素和硫酸軟骨素；蛋白酶例如 類胰蛋白酶，胃促胰酶，羧肽酶，和組織蛋白酶G-樣蛋白酶；趨化因子， 細(xì)胞因子和花生四烯酸的代謝物，它們作用于脈管系統(tǒng)，平滑肌，結(jié)締組 織，粘膜腺和炎性細(xì)胞。
肉豆蔻酸標(biāo)記過夜，然后 通過差速離心分離膜(第l道)和胞漿(第2道)部分。MARCKS作為粘 蛋白分泌途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)組分的作用可以用3種不同的方式證明。 i t"超銜^^—NHBE細(xì)胞用MANS或者RNS肽(I-IOO .mu.M)預(yù)保 溫15分鐘，然后添加PMA (100 nM)+8-Br-cGMP (1 pM)或者UTP (100 pM)，
所述細(xì)胞再分別保溫另外15分鐘或者2小時(shí)。通過ELISA測量粘蛋白分泌。 如圖2B所示，NHBE細(xì)胞與MANS肽的保溫導(dǎo)致響應(yīng)PKC/PKG活化或者 UTP剌激的粘蛋白分泌的濃度依賴的抑制，而對照肽(RNS)在這些相同 的濃度可能不影響分泌。在圖2B中，MANS肽以濃度依賴的方式阻斷 PMA+8-Br-cGMP或者UTP誘導(dǎo)的粘蛋白分泌過多。NHBE細(xì)胞與指定的 肽預(yù)保溫15分鐘，然后接觸PMA (100 nM)+8-Br-cGMP (1 .mu.M) 15分鐘 或者UTP(100pM)2小時(shí)。通過ELISA測量粘蛋白分泌。數(shù)據(jù)表示為平均 值+、S.E.(每點(diǎn)n=6)，其中*是顯著不同于培養(yǎng)基對照&<0.05);卞是顯著不 同于PMA+8-Br-cGMP刺激(pO.05);禾口J是顯著不同于UTP剌激(<0.05)。 MANS肽的作用很可能與細(xì)胞毒性或者細(xì)胞代謝活動的常規(guī)抑制無關(guān)，因 為MANS或者RNS肽均不影響乳酸脫氫酶釋放或者細(xì)胞攝取[3司脫氧葡萄 糖。正磷酸鹽標(biāo)記，然后接觸指定的試劑。通過免疫沉淀分析評估響 應(yīng)所述處理的MARCKS磷酸化作用。在圖5A中，8-Br-cGMP逆轉(zhuǎn)PMA 誘導(dǎo)的MARCKS磷酸化，而8-Br-cGMP的這種作用能夠被 Rp-8-Br-PET-cGMP (PKG抑制劑)或者岡田酸(PP1/2A抑制劑)阻斷。在圖5B 中，MARCKS的PMA-誘導(dǎo)磷酸化被后續(xù)細(xì)胞暴露于8-Br-cGMP所逆轉(zhuǎn)。 第1道，單獨(dú)的培養(yǎng)基8分鐘；第2道，100nMPMA3分鐘；第3道，100 nM PMA 3分鐘然后與1 nM 8-Br-cGMP 5分鐘；第4道，100 nM PMA 8 分鐘；第5道，單獨(dú)的培養(yǎng)基3分鐘然后100 nM PMA+1 pM 8-Br-cGMP 5 分鐘。在圖5C中，8-Br-cGMP-誘導(dǎo)的MARCKS脫磷酸作用被福司曲星 (fostriecin)以濃度依賴的方式減弱。為了弄清通過何種分子事件MARCKS將激酶活化與粘蛋白分泌聯(lián) 系起來，徹底研究了響應(yīng)PKC/PKG活化的MARCKS的磷酸化。如圖4A 所示，PMA (100 nM)在NHBE細(xì)胞中可能誘導(dǎo)MARCKS磷酸化的顯著增 加(3-4倍)，而這種磷酸化被PKC抑制劑calphostin C (500 nM)減弱。 一旦 被磷酸化，MARCKS從質(zhì)膜移位到細(xì)胞質(zhì)(圖4B)。更具體地，圖4A顯 示PKC的活化導(dǎo)致NHBE細(xì)胞中MARCKS的磷酸化。細(xì)胞用["P]正磷酸 鹽標(biāo)記2小時(shí)，然后接觸刺激劑和/或抑制劑。按照描述通過免疫沉淀評估 響應(yīng)所述處理的MARCKS磷酸化作用。第1道，培養(yǎng)基對照；第2道，賦 形齊U， 0.1%Me.sub.2SO;第3道，100nM4a陽PMA;第4道，100nMPMA; 第5道，100 nMPMA+500nM calphostin C;第6道，500 nM calphostin C。 圖4B顯示磷酸化的MARCKS從質(zhì)膜移位到細(xì)胞質(zhì)。32P標(biāo)記的細(xì)胞接觸 PMA (100 nM)或者單獨(dú)的培養(yǎng)基5分鐘，然后分離膜和胞漿部分。 8-Br-cGMP (1 ^M)對PKG的活化，引起粘蛋白分泌必需的另一起激酶活化 事件，不導(dǎo)致MARCKS磷酸化，但實(shí)際上，觀察到相反的作用PMA誘 導(dǎo)的MARCKS磷酸化被8-Br-cGMP逆轉(zhuǎn)(圖5A)。 8-Br-cGMP的這種作用 不是歸因于PKC活性的抑制，因?yàn)镻MA誘導(dǎo)的磷酸化能夠被后續(xù)向細(xì)胞 中添加8-Br-cGMP來逆轉(zhuǎn)(圖5B)。因此，PKG活化有可能導(dǎo)致MARCKS 的脫磷酸作用。0001131進(jìn)一步的研究顯示PKG誘導(dǎo)的MARCKS脫磷酸作用被500 nM岡 田酸阻斷，所述岡田酸是蛋白磷酸酶(l禾口/或2A型(PP1/2A))抑制齊U(圖5A， 第6道)。因此，看起來脫磷酸作用通過PP1和/或PP2A介導(dǎo)。為了確定涉 及的蛋白磷酸酶的亞型，在其他的磷酸化研究中使用一種新的并且更特異 的PP2A抑制劑，福司曲星(ICs『3.2 nM)。如圖5C所示，福司曲星以濃度 依賴的方式(1-500 nM)抑制PKG誘導(dǎo)的MARCKS脫磷酸作用，表明PKG 通過PP2A的活化誘導(dǎo)脫磷酸作用。為了證實(shí)NHBE細(xì)胞中PKG對PP2A 的進(jìn)一步活化，在細(xì)胞接觸8-Br-cGMP后測定細(xì)胞溶質(zhì)PP1和PP2A的活 性。在低至0.1 .mu.M的8-Br-cGMP濃度，PP2A活性增加大約3倍(從0.1 至U0.3 nmol/分鐘/mg蛋白，p<0.01)，而PP1活性仍然沒有改變。該數(shù)據(jù)表 明PP2A可以被PKG活化，并且造成MARCKS的脫磷酸化作用。因此， 這種PP2A活性對粘蛋白分泌的發(fā)生非常關(guān)鍵；當(dāng)PKG誘導(dǎo)的MARCKS 脫磷酸作用被岡田酸或者福司曲星阻斷時(shí)，響應(yīng)PKC/PKG活化或者UTP 刺激的分泌被改善(圖6)。
MARCKS與細(xì)胞質(zhì)中的肌動蛋白和肌球蛋白結(jié)合
0001141圖7顯示放射標(biāo)記的免疫沉淀分析，其表明MARCKS可以與細(xì)胞 質(zhì)中的兩種其他蛋白(大約200和大約40kDa)結(jié)合。在圖7中，NHBE細(xì)胞 用[3司亮氨酸和[3司脯氨酸標(biāo)記過夜，然后按照"實(shí)驗(yàn)步驟"的描述制備膜 和胞漿部分。分離的部分用非免疫的對照抗體(6F6)預(yù)清除。所述胞漿然后 被等分成兩個(gè)部分，分別用于在10 nM細(xì)胞松弛素D (Biomol， Plymouth Meeting, Pa.)以及抗MARCKS抗體2F12 (第2道)和未免疫對照抗體6F6 (lane 3)存在條件下進(jìn)行的免疫沉淀。還利用抗體2F12通過免疫沉淀評價(jià)膜 部分的MARCKS蛋白(第1道)。所述沉淀的蛋白復(fù)合物經(jīng)過8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨，并通過增強(qiáng)放射自顯影術(shù)顯像。MARCKS看起 來分別與分子量為大約200和大約40 kDa的兩種胞質(zhì)蛋白結(jié)合。從凝膠上 切下這兩種MARCKS結(jié)合蛋白，并通過基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間 質(zhì)譜/內(nèi)部測序(洛克斐勒大學(xué)的蛋白/ DNA技術(shù)中心(Protdn/DNATechnology Center of Rockefeller University, N.Y.))進(jìn)行分析。通過因特網(wǎng)程 序ProFoimdandMS-Fit，利用得到的肽分子量和序列數(shù)據(jù)搜索蛋白數(shù)據(jù)庫。 結(jié)果表明它們分別是肌球蛋白(重鏈，非肌肉型A)和肌動蛋白?；|(zhì)輔 助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜/內(nèi)部測序分析表明這兩種MARCKS結(jié)合蛋 白分別是肌球蛋白(重鏈，非肌肉型A)和肌動蛋白。
000115這些研究提供一種控制氣道粘蛋白顆粒胞吐分泌的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的 新范式，以及提供被認(rèn)為是證明MARCKS在生理過程中特異生物功能的第 一個(gè)直接證據(jù)。MARCKS作為關(guān)鍵介質(zhì)分子調(diào)節(jié)人氣道上皮細(xì)胞的粘蛋白 顆粒釋放。普遍認(rèn)為氣道粘蛋白分泌的引發(fā)需要PKC和PKG的雙重活化 和協(xié)同作用?；罨腜KC磷酸化MARCKS，導(dǎo)致MARCKS從質(zhì)膜內(nèi)表面 移位到細(xì)胞質(zhì)。PKG的活化依次活化PP2A，然后PP2A去磷酸化細(xì)胞質(zhì)中 的MARCKS。因?yàn)镸ARCKS的膜結(jié)合能力取決于其磷酸化狀態(tài)，這種脫 磷酸作用允許MARCKS恢復(fù)其膜結(jié)合能力，并且使MARCKS能夠粘附到 細(xì)胞質(zhì)粘蛋白顆粒的膜上。還通過與細(xì)胞質(zhì)中肌動蛋白和肌球蛋白的相互 作用(圖7)，然后MARCKS能夠?qū)㈩w粒栓系到細(xì)胞收縮裝置，介導(dǎo)到細(xì) 胞外圍的顆粒運(yùn)動和后續(xù)的胞吐釋放。MARCKS的廣泛分布表明，有可能 這種或者類似的機(jī)制可以在正?；蛘卟±?xiàng)l件下調(diào)節(jié)不同細(xì)胞類型中膜結(jié) 合顆粒的分泌。
000116本發(fā)明還涉及一種阻斷任意細(xì)胞胞吐分泌過程的新方法，尤其涉及 炎性細(xì)胞內(nèi)包含的顆粒的炎性介質(zhì)釋放，所述刺激途徑涉及蛋白激酶C (PKC)底物MARCKS蛋白和膜結(jié)合囊泡的內(nèi)容物釋放。具體地，本發(fā)明 人證明，人(圖9)或者犬(圖10)中性粒細(xì)胞的炎性介質(zhì)髓過氧化物酶 的受激釋放被MANS肽以濃度依賴的方式阻斷。具體地，圖9顯示被100 nM PMA和10 .mu.M 8-Br-cGMP刺激分泌髓過氧化物酶(MPO)的分離的中性粒 細(xì)胞。相對對照水平，100 pMMANS肽減少M(fèi)PO的分泌C^p0.05)。 10 MANS造成MPO分泌的輕微下降。10或者100 的對照肽(RNS)對MPO 分泌沒有效果。在圖10中，分離的中性粒細(xì)胞被100 nM PMA和10 |iM8-Br-cGMP刺激分泌髓過氧化物酶(MPO)。相對對照水平，100 pM MANS 肽減少M(fèi)PO的分泌(bp0.05)。 10 pM MANS造成MPO分泌的輕微下降。 IO或者100 nM的對照肽(RNS)對MPO分泌沒有效果。因此，可以治療性 使用所述肽以阻斷任意組織中浸潤炎性細(xì)胞分泌的炎癥介質(zhì)的釋放。許多 這類被釋放的介質(zhì)造成各種慢性炎性疾病(即，呼吸性疾病例如哮喘，慢 性支氣管炎和COPD，炎性腸病包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病，自身免 疫病，皮膚病例如紅斑痤瘡，濕疹；和重度痤瘡，關(guān)節(jié)炎和疼痛綜合癥例 如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和纖維肌痛)中觀察到的大范圍組織損傷。本發(fā)明可用 于治療疾病關(guān)節(jié)炎、慢性支氣管炎、COPD和囊性纖維化。因此本發(fā)明可 用于人類和動物疾病的治療，尤其是那些影響馬、犬、貓和其他家庭寵物 的疾病。
000117j圖11-15顯示人和犬的MPO分泌。在所有這些實(shí)驗(yàn)中，在添加如圖 所示的刺激劑前，分離的中性粒細(xì)胞用濃度為1X1(^M的LPS在37 'C刺 激IO分鐘。LPS激發(fā)細(xì)胞使它們能夠?qū)Υ俜置趧┳龀鰬?yīng)答。磷酸酯標(biāo)記時(shí)，細(xì)胞在包含 0.2%牛血清白蛋白的無磷酸鹽Dulbecco's改良的Eagle's培養(yǎng)基中預(yù)保溫2 小時(shí)，然后用0.1 mCi/ml [32 ]正磷酸鹽(9000 Ci/mmol, PerkinElmer Life Sciences)標(biāo)記2小時(shí)。為了用卩H]肉豆蔻酸311-氨基酸標(biāo)記，細(xì)胞在包含50 pCi/ml [3H]肉豆蔻酸(49 Ci/mmol， PerkinElmer Life Sciences)或者0,2 mCi/ml 卩H]亮氨酸(159 Ci/mmol， PerkinElmer Life Sciences)加0.4 mCi/ml [3印脯氨酸(IOO Ci/mmol， PerkinElmer Life Sciences)的培養(yǎng)基中保溫過夜。標(biāo)記后， 細(xì)胞接觸剌激劑5分鐘。當(dāng)使用抑制劑時(shí)，在剌激前細(xì)胞與抑制劑預(yù)保溫 15分鐘。處理結(jié)束時(shí)，在包含50mMTris-HCl(pH7.5)、150mMNaC1、1 mM EDTA、 10%甘油、l%NonidetP-40、 1 mM苯甲基磺酰氟、1 mM苯甲脒、 10嗎/ml抑胃肽A和10ng/ml亮肽素的緩沖液中裂解細(xì)胞。三氯乙酸沉淀 和閃爍計(jì)數(shù)可以確定每個(gè)培養(yǎng)物中的放射性標(biāo)記效率。利用包含相等計(jì)數(shù)/ 分鐘的細(xì)胞裂解產(chǎn)物，按照Spizz和Blackshear的方法進(jìn)行MARCKS蛋白 的免疫沉淀。Spizz等，J. B/o/. CT e附.271, 553-562 (1996)。沉淀蛋白經(jīng)8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨，并通過放射自顯影術(shù)顯像。該分析使用抗 人MARCKS抗體(2F12)和未免疫的對照抗體(6F6)。相同，其中MA 是通過酰胺鍵與肽的N端胺連接的肉肉豆蔻酰，所述錯義對照肽[RNS:隨 機(jī)N端序列肽；MA-GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF (SEQ ID NO: 2)] 包括相同的24個(gè)氨基酸，但是按照隨機(jī)順序序列排列，所述隨機(jī)順序序列 與MANS肽序列具有低于13%的序列同一性。
，溶菌酶，粒酶，組胺，蛋白多糖，蛋白酶，趨化因子，細(xì)胞因子， 花生四烯酸的代謝物，防衛(wèi)素，殺菌性通透性-增加蛋白(BPI)，彈性蛋白酶， 組織蛋白酶G，組織蛋白酶B，組織蛋白酶D， beta-D-葡糖醛酸糖苷酶，alpha-甘露糖苷酶，磷脂酶A2，軟骨素-4-硫酸酯，蛋白酶3，乳鐵蛋白，膠原酶， 補(bǔ)體活化劑，補(bǔ)體受體，N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(FMLP)受體， 層粘連蛋白受體，細(xì)胞色素b558，單核細(xì)胞-趨化因子，組胺酶，維生素B12 結(jié)合蛋白，明膠酶，纖溶酶原激活物，beta-D-葡糖醛酸糖苷酶，及其組合。
10. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述炎性介質(zhì)選自髓過氧化物酶 (MPO)，嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶(EPO)，主要堿性蛋白(MBP)，溶菌酶， 粒酶及其組合組成的組。
11. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述有效量的所述肽包括脫顆粒抑制量的MANS肽或者其活性片段，與在不存在MANS肽或者其活性片段的條 件下至少一種炎性細(xì)胞釋放的量相比，所述脫顆粒抑制量的MANS肽或者 其活性片段使得所述至少一種炎性細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)的量減少大約1% 到大約99%。
12. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述有效量的所述肽包括脫顆粒抑制 量的MANS肽或者其活性片段，與在不存在MANS肽或者其活性片段的條 件下至少一種炎性細(xì)胞釋放的量相比，所述脫顆粒抑制量的MANS肽或者 其活性片段使得所述至少一種炎性細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)的量減少大約5 — 50%到大約99%。
13. 抑制對象的組織和/或體液中至少一種炎性細(xì)胞的至少一種炎性介 質(zhì)釋放的方法，包括給藥所述對象的組織和/或體液治療有效量的藥物組合物，其中所述組 織和/或所述體液包括含有至少一種炎性介質(zhì)的至少一種炎性細(xì)胞，所述炎 性介質(zhì)包含在該細(xì)胞的囊泡內(nèi)，所述藥物組合物包括治療有效量的選自 MANS肽和其活性片段的至少一種肽，與在不存在所述至少一種肽的條件 下至少一種相同類型炎性細(xì)胞的所述炎性介質(zhì)釋放相比，所述的方法將減 少自所述至少一種炎性細(xì)胞的所述炎性介質(zhì)釋放。
14. 權(quán)利要求13所述的方法，其中所述減少炎性介質(zhì)的釋放包括阻斷 或者抑制使得所述炎性細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)的機(jī)制。
15.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述肽是包括SEQ ID NO:l的 MANS肽。
16. 權(quán)利要求13所述的方法，其中所述活性片段包括至少一種包含至 少6個(gè)氨基酸的肉豆蔻?；疭EQ ID NO:l N端片段，所述至少一種包含至 少6個(gè)氨基酸的肉豆蔻酰化SEQ ID NO:l N端片段的第一個(gè)氨基酸起始于 SEQ ID NO: 1的N端甘氨酸。
17. 權(quán)利要求16所述的方法，其中所述活性片段選自以下片段組成的 組N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV (SEQ ID NO: 20); N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA (SEQ ID NO: 3); N-肉豆蔻 酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQ ID NO: 4); N-肉豆蔻酰 -GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ ID NO: 5); N-肉豆蔻酰 -GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ ID NO: 6); N-肉豆蔻酰 -GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ ID NO: 7); N-肉豆蔻酰 -GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID NO: 8); N-肉豆蔻酰 -GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID NO: 9); N- 肉豆蔻酰 -GAQFSKTAAKGEAAA (SEQ ID NO: 10); N- 肉豆蔻酰 -GAQFSKTAAKGEAA (SEQ ID NO: 11); N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEA (SEQ ID NO: 12); N陽肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGE (SEQ ID NO: 13); N-肉豆 蔻酰-GAQFSKTAAKG (SEQ ID NO: 14); N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAK (SEQ ID NO: 15); N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAA (SEQ ID NO: 16); N-肉豆蔻酰 -GAQFSKTA (SEQ ID NO: 17); N誦肉豆蔻酰-GAQFSKT (SEQ ID NO: 18); 和N-肉豆蔻酰-GAQFSK (SEQ ID NO: 19)。
18. 權(quán)利要求13所述的方法，其中所述炎性細(xì)胞是白細(xì)胞。
19. 權(quán)利要求13所述的方法，其中所述炎性細(xì)胞是粒細(xì)胞。
20. 權(quán)利要求13所述的方法，其中所述炎性細(xì)胞選自中性粒細(xì)胞、嗜 堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和其組合組成的組。
21. 權(quán)利要求13所述的方法，其中所述炎性細(xì)胞是單核細(xì)胞或者巨噬 細(xì)胞。
22. 權(quán)利要求13所述的方法，其中所述炎性介質(zhì)選自以下物質(zhì)組成的 組髓過氧化物酶(MPO)，嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶(EPO)，主要堿性蛋白 [MBP]，溶菌酶，粒酶，組胺，蛋白多糖，蛋白酶，趨化因子，細(xì)胞因子， 花生四烯酸的代謝物，防衛(wèi)素，殺菌性通透性-增加蛋白(BPI)，彈性蛋白酶， 組織蛋白酶G，組織蛋白酶B，組織蛋白酶D， beta-D-葡糖醛酸糖苷酶，alpha-甘露糖苷酶，磷脂酶A2，軟骨素-4-硫酸酯，蛋白酶3，乳鐵蛋白，膠原酶， 補(bǔ)體活化劑，補(bǔ)體受體，N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(FMLP)受體， 層粘連蛋白受體，細(xì)胞色素b^，單核細(xì)胞-趨化因子，組胺酶，維生素B12 結(jié)合蛋白，明膠酶，纖溶酶原激活物，beta-D-葡糖醛酸糖苷酶，及其組合。
23. 權(quán)利要求13所述的方法，其中所述炎性介質(zhì)選自髓過氧化物酶 (MPO)，嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶(EPO)，主要堿性蛋白(MBP)，溶菌酶，粒酶及其組合組成的組。
24. 權(quán)利要求13所述的方法，其中所述有效量的所述肽包括脫顆粒抑 制量的MANS肽或者其活性片段，與在不存在MANS肽或者其活性片段的 條件下至少一種炎性細(xì)胞釋放的量相比，所述脫顆粒抑制量的MANS肽或 者其活性片段使得至少一種炎性細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)的量減少大約1%到 大約99%。
25. 權(quán)利要求13所述的方法，其中所述有效量的所述肽包括脫顆粒抑 制量的MANS肽或者其活性片段，與不存在MANS肽或者其活性片段的條 件下至少一種炎性細(xì)胞釋放的量相比，所述脫顆粒抑制量的MANS肽或者 其活性片段使得至少一種炎性細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)的量減少大約5 — 50%到大約99%。
26. 權(quán)利要求13所述的方法，其中所述對象患有呼吸系統(tǒng)疾病。
27. 權(quán)利要求26所述的方法，其中所述呼吸系統(tǒng)疾病選自哮喘、慢性 支氣管炎和COPD組成的組。
28. 權(quán)利要求13所述的方法，其中所述對象是哺乳動物。
29. 權(quán)利要求28所述的方法，其中所述哺乳動物選自人、犬、馬和貓 組成的組。
30. 權(quán)利要求13所述的方法，其中所述給藥選自局部給藥、經(jīng)腸胃外 給藥、經(jīng)直腸給藥、經(jīng)肺部給藥、經(jīng)鼻給藥和口服給藥組成的組。
31. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述肺部給藥選自氣霧劑給藥、干 粉吸入器給藥、定量吸入器給藥和噴霧器給藥組成的組。
32. 權(quán)利要求13所述的方法，還包括給藥所述對象選自抗生素、抗病 毒化合物、抗寄生蟲化合物、抗炎化合物和免疫抑制劑的第二分子組成的 組。
33. 權(quán)利要求13所述的方法，其中所述對象患有選自腸疾病、皮膚病、 自身免疫病、疼痛綜合癥及其組合組成的組的疾病。
34. 權(quán)利要求33所述的方法，其中所述腸疾病選自潰瘍性結(jié)腸炎、克 羅恩氏病和腸易激綜合征組成的組。
35. 權(quán)利要求33所述的方法，其中所述皮膚病選自紅斑痤瘡、濕疹、 銀屑病和重度痤瘡組成的組。
36. 權(quán)利要求13所述的方法，其中所述對象患有關(guān)節(jié)炎或者囊性纖維化。
全文摘要
本發(fā)明包括調(diào)節(jié)細(xì)胞分泌過程的方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過抑制與炎性細(xì)胞內(nèi)囊泡或者顆粒釋放炎性介質(zhì)有關(guān)的機(jī)制，調(diào)節(jié)或者減少炎性細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)。在這方面，本發(fā)明公開了一種胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，說明了幾種新的用于疾病的藥理學(xué)介入的胞內(nèi)靶標(biāo)，所述疾病涉及炎性細(xì)胞內(nèi)囊泡的炎性介質(zhì)分泌。MANS肽和其活性片段可用于這種方法。
文檔編號A61K38/00GK101500593SQ200780016272
公開日2009年8月5日 申請日期2007年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月6日
發(fā)明者I·帕里克, K·B·阿德勒, L·D·馬丁, S·鷹司, Y·李 申請人:拜歐馬克醫(yī)藥有限公司;北卡羅來納州大學(xué)