專利名稱：施陶丁格連接在生物活性化合物的體內(nèi)組裝中的用途的制作方法
施陶丁格連接在生物活性化合物的體內(nèi)組裝中的用途發(fā)明領域本發(fā)明涉及生物活性化合物和用于遞送生物活性化合物的方法，它們 使通過作為允許體內(nèi)再組裝的單獨組分給藥完整化合物以防止完整化合物 的缺點或毒性作用變得可能。發(fā)明背景全身給藥缺乏選擇性是主要的問題。有效濃度的長期給藥可被劑量限 制性全身毒性阻礙。而且，在非靶組織經(jīng)常觀察到強烈的副作用。因此， 已在實現(xiàn)藥物在靶部位選擇性釋放的藥物遞送系統(tǒng)中投入了大量的努力。 已經(jīng)提出的一個概念是在靶部位原位組裝藥物而不是全身性的給藥活性藥物[Rideout (1986) Sc/e"ce， 233, 561-563; Rideout (1994) Gawcer /wve"&a"o" 12,189-202]。在這個概念中，給藥單獨的、相對無活性的藥物組分?；钚?藥物通過兩種組分在二者都被吸收的部位發(fā)生選擇性反應來形成。由于單 獨的組分相對無活性，毒性局限在靶部位，從而最小化劑量限制性副作用。 而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與由單一分子作用引起的生物效應相比，生物效應所需 的雙分子作用可以導致更陡峭的的劑量-反應曲線。該對濃度的敏感性增加 可以導致治療窗的增大，提供更為有效、更小副作用的藥物。為了在靶細胞上或靶細胞內(nèi)完成兩種藥物組分間的反應且不與其它生 物分子發(fā)生副反應，必須利用非常有選擇性的化學反應。這種化學反應的 成功應用的一個條件是兩種參與反應的官能團必須具有精確的反應性，從 而避免對共存官能團的干擾。理想地，反應配偶子(reactionpartners)在生 理條件下是生物性、反應性的，并且僅識別彼此而忽視它們的細胞/生理環(huán) 境(生物正交的)。生物環(huán)境所強加的選擇性要求排除使用大多數(shù)常規(guī)的反 應，而且迄今僅將肼-醛席夫堿(腙)形成成功地用于體外原位藥物組裝。 羰基化合物(即酮類和醛類)可以與伯胺形成可逆席夫堿，但在水中的平衡有利于羰基。但是，酰肼或氨基氧基與羰基的產(chǎn)物(分別提供腙類和肟 類)在水中是有利的，且在生理條件下是相當穩(wěn)定的。在一份報告中表明，癸醛和辛基氨基胍原位反應形成含腙的細胞裂解洗滌劑[Rideout (1994) Owe"/m;""ga /o" 12， 189-202]。并且，使用相同的反應，由兩種無活性 單陽離子鱗鹽原位組裝雙陽離子蛋白激酶C抑制劑[Rotenberg等人，(1991) iVaf/.Sc/. 88， 2490-2494; Rideout等人，(1990)所o/ ofymea 29, 247-262]。在這種情況下，獲得某些癌癥選擇性，因為由于較高的跨膜電位， 與健康細胞相比，單陽離子四苯基鱗鹽在癌細胞中的吸收增加。不幸的是，席夫反應中的腙或肟形成沒有滿足所有上述的體內(nèi)藥物組 裝的條件。最為重要的是，醛類和酮類不是完全非生物的。含有這些官能 團的生物分子和代謝產(chǎn)物存在于細胞內(nèi)。因此，該反應不是完全生物正交 的。而且，這些反應的最佳pH為大約5-6，其不完全是生理學相關的范圍。肼-酸席夫系統(tǒng)的另外的缺點是反應產(chǎn)物為腙或肟。這意味著組裝成的 活性藥物將總是含有這種基團。雖然獲得含有這些官能團的活性分子是可 能的，但大部分已知的藥物或類似藥物的分子不含有這些基團。因此，腙/ 肟系統(tǒng)并不直接適合普遍應用于可以受益于原位組裝方法的已知藥物。而且，肼-醛席夫系統(tǒng)不促進一種或兩種藥物組分的活性靶向作用。充 其量設計單獨的組分使它們在靶組織中的(被動)吸收增加(如關于鱗藥 物所示，Rotenberg等人，1991,上述)。雖然組分中的一種與例如受體-靶向 肽的綴合是可能的，但這種靶向部件在藥物組裝之后仍將連接在藥物上。 雖然這并不必然排除這種方法在靶向藥物的原位組裝中的應用，但它不是 一種用于當前已知未改性藥物的組裝的選擇。施陶丁格(Staudinger)反應是一種可供選擇的生物相容的、非生物的 和生物正交的化學反應。在施陶丁格反應(

圖1A)中-膦和疊氮化物相互 作用產(chǎn)生氮葉立德(aza-ylide)。在存在水的情況下，這種中間產(chǎn)物自發(fā)地 水解產(chǎn)生伯胺和對應的氧化膦[Kohn & Breinbauer 2004) ^4"gew. C/zem. ￡d 43, 3106-3116]。 Bertozzi和合作者基于經(jīng)典的施陶丁格反應，開發(fā)了一 種新的化學選擇性連接反應，施陶丁格連接(圖lB)[Saxon& Bertozzi (2000) 5Wewce 287, 2007-2010]。已幵發(fā)了所述連接反應的第二代變體("無痕"施 陶丁格連接)以由疊氮化物和膦試劑產(chǎn)生酰胺鍵(圖1C)。施陶丁格連接已成功地用于多種應用，例如肽連接、內(nèi)酰胺合成、生物結合物(bioconjugates)、細胞內(nèi)標記、代謝細胞工程和微陣列。已表明 施陶丁格連接甚至在體內(nèi)(大鼠)也有效，而且證實疊氮化物和膦衍生物 在體外和體內(nèi)均無毒性[Prescher等人，(2004) A^wre, 430, 873-877]。 Institut Curie的JC Florent已提出耙向遞送前藥。根據(jù)這個概念，向患者給藥含有 一個(或多個)疊氮化物官能團的單克隆抗體。在第二步中，給藥含有三 苯基膦基的無毒前藥。據(jù)推測，當前藥到達在體內(nèi)局部結合的抗體時，這 兩種官能團之間會發(fā)生施陶丁格反應，將疊氮基還原成胺，并隨后釋放藥 物[關于進一步的細節(jié)， 參見 http:〃www.curie.fr/upload/recherche/unites/unit 43/umrl 76cnrs ic_2001—gb.p 4f，第2頁]。但是，考慮到前藥在細胞培養(yǎng)基中的不穩(wěn)定性，這種概念未 曾實現(xiàn)過。施陶丁格連接用于藥物組分的體內(nèi)組裝的普遍有效性仍未被被揭示。 發(fā)明概述本發(fā)明的目的在于提供可供選擇的或改良的生物活性化合物，例如藥 物或前藥，和用于遞送生物活性化合物的方法。本發(fā)明的優(yōu)勢在于它使在 保持完整的生物活性化合物在原位的預期效應的同時防止所述完整的生物 活性化合物的缺點或毒性作用成為可能。這是通過作為單獨的組分給藥所 述生物活性化合物來實現(xiàn)的，所述單獨的組分確保所述生物活性化合物在 體內(nèi)(再)組裝。因此本發(fā)明的第一方面提供完整的生物活性化合物的兩種或更多種組 分的組合，其中這些組分基本上無生物活性，并且其中這些組分用施陶丁 格連接的相容性官能團官能化，從而在彼此接觸時導致所述生物活性化合 物或具有與所述完整的生物活性化合物基本上相同的活性的生物活性化合 物的(再)組裝。根據(jù)特定的實施方案，所述組合包含生物活性化合物的兩種組分。 根據(jù)本發(fā)明的另外的特定實施方案，兩種或更多種組分的組合中至少 一種組分是靶向性的，從而保證所述組分在期望的靶部位的再組裝。所述 靶向性組分可以是固有地靶向性的。附加地或可供選擇地，它們可包含保證所述化合物靶向到體內(nèi)期望的靶部位的靶向部分。根據(jù)本發(fā)明的另外的特定實施方案，兩種或更多種組分的組合中至少 一種組分具有可探測的標記物，從而允許追蹤所述組分。本發(fā)明的特定實施方案提供根據(jù)本發(fā)明的完整的生物活性化合物的組 分的組合，其中所述生物活性化合物具有酰胺基，且所述組分的再組裝導 致該酰胺基的產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明的生物活性化合物的組分的組合是供單獨給藥所述組分使 用的，從而保證所述組分在體內(nèi)的(再)組裝。但是，可以設想本發(fā)明的 組合中的組分可以作為單獨的藥物組合物提供，所述組合物各自與藥學上可接受的載體或賦形劑混合；或者作為一種藥物組合物提供，條件是所述 化合物是物理上彼此分開的。本發(fā)明提供生物活性化合物的組分的組合，所述組分被官能化從而基 于無痕或非無痕施陶丁格連接(再)組裝成完整的生物活性化合物或具有 與所述生物活性化合物基本上相同的活性的化合物。更為具體而言，本發(fā)明提供完整的生物活性化合物的至少兩種組分的 組合，其中所述組分上提供的官能團代表相等數(shù)目的選自(a)和(b)的官能 團；其中(a)為被烷氧基羰基鄰位取代的三芳基膦基，借此所述組分通過非 活性連接在其中一個芳基的一個其余的位置上連接到所述三芳基膦上，或 為三芳基膦基，借此所述組分以這樣的方式連接所述三芳基膦被所述組 分通過羰基氧(-CO-O-)或羰基硫(-CO-S-)連接鄰位取代；和其中(b)為疊氮 基。在另外的特定實施方案中，本發(fā)明的組合中的至少一種含膦組分通過 靶向部分具有靶向性，所述靶向部分連接到所述三芳基膦的芳基上。根據(jù)可供選擇的實施方案，本發(fā)明的組合中的至少一種含膦組分包含 被烷氧基羰基鄰位取代的三芳基膦基，并且包含連接到所述垸氧基羰基的 垸基上的靶向部分。作為組分的組合而不是完整的生物活性化合物提供生物活性化合物使 防止所述完整的生物活性化合物的某些缺點成為可能。因此，根據(jù)一個實 施方案，本發(fā)明的組合中的組分的溶解度與對應的完整的生物活性化合物 相比得到改善。更特別地，本發(fā)明的組合中的含膦組分的溶解度可以通過修飾膦得到 提咼。附加地或可供選擇地，本發(fā)明的組合中的組分的穩(wěn)定性和/或毒性與對 應的完整的生物活性化合物的溶解度相比得到改善。本發(fā)明的特定實施方案涉及藥物甲氨蝶呤的組分的組合，其中所述組 分對應于在酰胺基各側(cè)的甲氨蝶呤分子部分。本發(fā)明的另一特定實施方案涉及藥物博來霉素的組分的組合，更特別 地涉及第一種和第二種組分的組合，其中所述第一種組分對應于博來霉素的金屬結合區(qū)域，而所述第二種組分對應于博來霉素的DNA結合區(qū)域。另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含與根據(jù) 本發(fā)明的完整的生物活性化合物的一種組分混合的藥用載體或賦形劑，所 述組分是基本上無生物活性且被在施陶丁格連接中具有反應性的基團官能 化的組分。在再一個方面，本發(fā)明提供完整的生物活性化合物的第一組分，所述 第一組分基本上無生物活性且其進一步的特征在于其被在施陶丁格連接中 具有反應性的基團官能化，使得與第二組分接觸時導致所述完整的生物活 性化合物或具有與所述完整的生物活性化合物基本上相同的活性的化合物 的(再)組裝，并且其中所述組分進一步的特征在于其包含靶向部分。本發(fā)明的再一方面提供制備根據(jù)本發(fā)明的生物活性化合物的組分的方 法。本發(fā)明的這方面的具體實施方案涉及制備博來霉素的組分的方法，所述組分彼此接觸時能夠再組裝成完整的博來霉素。所述方法包括以下步驟 (a)提供博來霉素的金屬結合區(qū)域；(b)提供博來霉素的DNA結合區(qū)域； 和(c)在博來霉素的每個這些區(qū)域上，在完整藥物中連接這些區(qū)域的位置， 提供能夠在施陶丁格連接中相互作用的各個官能團。本發(fā)明的再一方面涉及增加完整的生物活性化合物的吸收的方法，所 述方法包括以下步驟(a)提供所述完整的生物活性化合物的兩種組分，所 述組分在再組裝時產(chǎn)生所述完整的生物活性化合物或具有與所述完整的生 物活性化合物基本上相同的活性的化合物；和(b)給每一種所述組分提供能 夠在施陶丁格連接中一起反應的三芳基膦或疊氮化物官能團，以允許所述 (完整的)生物活性化合物的(再)組裝；更特別地，所述兩種組分中更具疏水性的組分用三芳基膦基修飾。任選地，所述三芳基膦基進一步由增 加所述組分的水溶性的附加基團修飾。
再一方面，本發(fā)明提供對用完整的生物活性化合物治療易感的疾病的 治療方法，所述方法包括向患有這種疾病的患者給藥根據(jù)本發(fā)明的完整的 生物活性化合物的組分的組合。
本發(fā)明防止目前所用的席夫反應的上述局限性，并且通過使用選擇性 生物正交的施陶丁格連接擴大了藥物組裝方法的范圍。施陶丁格連接的反 應配偶子，膦和有機疊氮化物，是完全非生物的，基本上對細胞內(nèi)或細胞 表面上的生物分子不起反應，并在生理條件下反應。而且，這種反應是唯 一已被證明在細胞環(huán)境和大鼠中有效的連接反應。
使用施陶丁格連接的化合物的自組裝，例如生物活性化合物或可被活 化成生物活性化合物的化合物的體內(nèi)組裝，與其它聲稱的生物正交反應相 比具有許多優(yōu)點l)它是真正地生物正交的和生物相容的反應，并且也可 以在細胞內(nèi)使用，2)無痕連接允許已知的含酰胺生物活性化合物的無痕組 裝，3)無痕連接允許一種組分的無痕靶向作用，所述無痕靶向作用增加生 物活性化合物的有效性并減少對健康組織的損害。換句話說，與基于目前 已知的肼-醛席夫系統(tǒng)的雙組分系統(tǒng)相比，可以增加劑量-反應曲線的斜率 (并因此增加治療窗)。
根據(jù)以下的詳細說明，并結合以舉例的方式闡述本發(fā)明原理的附圖， 可以明顯看出本發(fā)明的上述和其它特征、特點和優(yōu)點。提供這些說明僅用 于例證而不限制本發(fā)明的范圍。以下引證的參考圖指附圖。
附圖的簡要說明
圖1為施陶丁格反應(A)、施陶丁格連接(B)和無痕施陶丁格連接(C)的 示意圖。
圖2為根據(jù)本發(fā)明的實施方案，用膦和疊氮化物官能化的生物活性化 合物的兩種組分的反應的示意圖。 圖3顯示非無痕施陶丁格連接。
圖4顯示根據(jù)本發(fā)明的特定實施方案，官能化的博來霉素的DNA結合 區(qū)域與根據(jù)本發(fā)明的實施方案的官能化的博來霉素的金屬結合區(qū)域的反應。
圖5顯示根據(jù)本發(fā)明的特定實施方案，根據(jù)本發(fā)明的實施方案的官能 化的甲氨蝶呤的組分的反應。
圖6顯示可以與多種抗癌藥聯(lián)合使用的耙向部件。 圖7顯示根據(jù)本發(fā)明的特定實施方案，根據(jù)本發(fā)明的實施方案的官能 化的吡羅昔康的組分的反應。 圖8圖示蝶啶膦的形成。
優(yōu)選實施方案的詳述
根據(jù)特定的實施方案并參考某些附圖描述本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些 描述限制，而僅受權利要求的限制。權利要求中的任何參考標記不應被解 釋為限定范圍。所述的附圖僅是示意性的，而非限制性的。在附圖中，為 說明的目的，某些成分的尺寸可能被夸大，而不是按照比例繪制。其中本 說明書和權利要求書所用的術語"包含"不排除其它的成分或步驟。在指 代單數(shù)名詞時所用的不定冠詞或定冠詞，例如"a"或"an"、 "the"，也包括該
名詞的復數(shù)，除非另外具體說明。
而且，說明書和權利要求書中的術語第一、第二、第三和類似用語是 用于區(qū)分類似成分而不必然用于描述先后順序或時間順序。應該理解為， 所用的術語在適當?shù)那樾蜗率强梢曰Q的，并且本文描述的本發(fā)明的實施 方案能夠以非本文所描述或圖示的順序操作。
本文所用的術語或定義僅用于幫助理解本發(fā)明。
本發(fā)明提供施陶丁格連接的新用途，更具體而言提供施陶丁格連接在 藥物遞送領域內(nèi)的新用途。本申請所指的"施陶丁格連接"指施陶丁格反 應的改良，其導致兩個分子連接。在"施陶丁格反應"中，膦和疊氮化物 之間發(fā)生反應，產(chǎn)生氮葉立德(圖1A)。在存在水的情況下，這種中間產(chǎn) 物自發(fā)地水解成伯胺和對應的氧化膦。在室溫下，膦和疊氮化物在水中容 易彼此發(fā)生反應。
在施陶丁格連接中，將施陶丁格反應改良以防止氮葉立德中間產(chǎn)物的 水解。這可以通過使用兩種常規(guī)方法實現(xiàn)。在第一種方法中，將含有例如 甲酯的親電子阱的膦設計成能使不穩(wěn)定的親核的氮葉立德中間產(chǎn)物在有機會水解之前發(fā)生分子內(nèi)重排以形成穩(wěn)定的加合物。因此，在這種方法中， 通過這種改良的和生物綴合的三芳基膦與疊氮化物綴合物反應進行施陶丁 格連接，之后進行分子內(nèi)環(huán)化得到酰胺鍵和氧化膦。這種連接稱為"非無
痕"施陶丁格連接(圖1B)，因為連接產(chǎn)物包含附加的三苯基氧化膦殘基。 已開發(fā)出"無痕"施陶丁格連接以由疊氮化物和膦試劑產(chǎn)生簡單的酰 胺鍵(圖1C)。該反應利用含可轉(zhuǎn)移的?；撵?。與疊氮化物的反應，在 中間產(chǎn)物氮葉立德重排和水解之后，產(chǎn)生酰胺連接的的產(chǎn)物和釋放的氧化 膦。
"非無痕"和"無痕"施陶丁格連接的使用都被認為在本發(fā)明的范圍 之內(nèi)。
本文所用的術語"生物活性化合物"通常指在給藥于患者時具有潛在 生物活性的分子。因此，它包括所有的藥物、藥用化合物、治療性酶和蛋 白，等等。本身具有活性的化合物，和在與體內(nèi)的特定分子接觸時被活化，
例如通過內(nèi)源性酶活化的化合物，都包括在此術語的范圍內(nèi)。
本發(fā)明中所用的術語"生物活性化合物的組分"或"BAC組分"涉及 生物活性化合物的一部分，其對化合物的活性非常重要，但其本身不具有 生物活性。因此，生物活性化合物的組分根據(jù)定義僅指完整的生物活性化 合物的部分，不包括完全或完整的生物活性化合物。根據(jù)本發(fā)明的生物活 性化合物的組分的(再)組裝可以產(chǎn)生與所述完整的生物活性化合物相同 的化合物，或者具有與所述完整的生物活性化合物基本上相同的活性的化 合物。
在提及生物活性化合物時本文所用的術語"完整的"用于指代原始開 發(fā)的和在適用時商品化的生物活性化合物。
本文所用的術語"官能化"和"官能化的"指加入或存在官能團，它 在本發(fā)明的范圍內(nèi)指在非無痕或無痕施陶丁格連接中相互作用的官能團。 當本文描述特定實施方案的時候，通常含有膦或疊氮化物官能團的所述生 物活性化合物的組分分別稱為"含膦組分"和"含疊氮化物組分"。由于連 接總是需要至少一對組分，在這一對中，這些組分通常也分別稱為"第一" 和"第二"組分，盡管可能考慮使用多于一種的含膦組分和多于一種的含 疊氮化物組分。本文所用的術語"降低的藥學活性"或"基本上無生物活性"指生物 活性化合物的組分，指示經(jīng)過標準測定法確定的，與完整的生物活性化合
物的活性或治療效果相比，活性或治療效果降低或可忽略不計。BAC組分 的降低的活性可以是低于所述完整的生物活性化合物的活性的5%、 1%、 0.1%或0.01%的活性。
當提及在本發(fā)明的組分在體內(nèi)(再)組裝之后得到的化合物時，術語 "與完整的生物活性化合物基本相同的活性"指所述(再)組裝之后的生 物活性化合物的藥理或生物活性為所述完整的生物活性化合物的至少 70%，更具體地為至少80%，進一步更具體地為至少90%,最具體為 95-100%。
本文所用的與藥物組合物相關的術語"藥學上可接受的載體或賦形劑" 意指可以與本發(fā)明的組分配制，例如通過溶解、分散或擴散所述組分以促
進它們應用或散布至待治療的部位，和域以促進它們的儲存、運輸或裝卸， 且不損及它們再組裝成生物活性化合物的能力的任何材料或物質(zhì)。所述藥 學上可接受的載體可以是固體或液體或已被壓縮成液體的氣體，即本發(fā)明 的組合物可以適于用作濃縮物、乳劑、溶液劑、粒劑、粉劑、噴霧劑、氣 霧劑、丸劑或散劑。用于所述藥物組合物和它們的制劑的適合的藥用載體 對本領域技術人員來說是己知的。
在一方面，本發(fā)明基于這樣的概念以其基本上無活性組分的形式給 藥生物活性化合物可以具有許多優(yōu)點，例如降低副作用、改善吸收、降低
全身毒性等。而且，本發(fā)明提供，通過使用施陶丁格連接以在體內(nèi)重組BAC
組分，所述組分的在體內(nèi)的有效再組裝能夠得到保證。最后，本發(fā)明提供， 通過使用無痕施陶丁格連接，無痕靶向作用也能夠得到保證。
通常，被考慮在本發(fā)明范圍之內(nèi)的生物活性化合物的性質(zhì)不是關鍵。 因此，適于在本發(fā)明范圍內(nèi)使用的生物活性化合物包括但不限于抗增殖/抗 腫瘤藥、抗生素、抗炎藥、抗病毒藥、抗高血壓藥和化學敏化劑。然而， 可以想象，基于結構和結構-活性關系，某些生物活性化合物可能比其它化 合物更容易順應本發(fā)明。這在下文作更為詳細的描述。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供生物活性化合物的基本上無活性且被官 能化的組分，從而能夠(再)組裝成所述完整的生物活性化合物或者具有與所述完整的生物活性化合物基本相同的活性的化合物。
生物活性化合物的基本上無活性的組分通過所述組分的直接合成或?qū)?完整的生物活性化合物分解成組分來獲得。所述組分的性質(zhì)的選擇主要由 以下條件決定所述生物活性化合物的所有組分基本上無活性和/或所述組 分不表現(xiàn)出(或者可以被修飾以避免)所述完整的生物活性化合物的固有 的缺點。此外，所述組分的性質(zhì)的選擇受不同參數(shù)影響，包括但不限于對 根據(jù)本發(fā)明的官能化的順應性、所述組分的大小和穩(wěn)定性、溶解度和附加 例如靶向部分(參見下述)等的其他部分的能力。根據(jù)特定的實施方案， 本發(fā)明提供生物活性化合物的兩種組分的用途，其中在所述兩種組分(再) 組裝時，獲得所述完整的生物活性化合物或具有與所述完整的生物活性化 合物基本上相同的活性的化合物?？晒┻x擇地，可以考慮使用多于兩種的 組分(例如3或4)，只要能夠保證它們適當?shù)?再)組裝成所述完整的生 物活性化合物或具有與所述完整的生物活性化合物基本上相同的活性的化 合物。為了實現(xiàn)這個目的，本發(fā)明規(guī)定所述的組分具有(偶數(shù)個)能夠在 施陶丁格連接中，在所述完整的生物活性化合物中連接各組分的(那些) 位置相互作用的官能團。
如以下詳述，本發(fā)明的一個實施方案提供生物活性化合物的組分，所 述化合物的完整形式包含酰胺鍵?？梢赃@樣產(chǎn)生所述化合物的組分，以致 于在(再)組裝時由連接得到的酰胺鍵對應于所述完整的生物活性化合物 中的酰胺鍵。然后修飾所述組分以分別包括例如三芳基膦基和疊氮基，從 而允許在所述組分間無痕連接。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，生物活性化合物的組分基本上無活性， 即使是在它們被官能化之前。在另一個實施方案中，所述生物活性化合物 的組分由于它們的官能化變得基本上無活性。
本發(fā)明提供生物活性化合物的組分的基于非無痕或無痕施陶丁格連接 的組裝。用于官能化與第二組分的疊氮化物基團相互作用的第一組分的膦 基的性質(zhì)會隨所考慮的連接的類型而變。更具體而言，對于非無痕施陶丁 格連接，第一組分具有被烷氧基羰基鄰位取代的三芳基膦基(參見圖1B)。
所述生物活性化合物的第一組分通過非活性連接在其中一個芳基的一個其 余的位置上連接到三芳基膦。對于無痕連接，第一組分具有三芳基膦基，其方式使得產(chǎn)生被所述生物活性分子的第一組分通過羰基氧(-co-o-)或羰基硫(-CO-S-)連接鄰位取代的三芳基膦(參見圖1C)。更為具體而言，在這兩個實施方案中，三芳基膦為任選地被取代的三苯基膦基。因此，根據(jù)所 考慮的連接，所述完整的生物活性化合物在基于這些連接的(再)組裝之 后包含與三芳基氧化膦綴合的的酰胺鍵(非無痕施陶丁格連接)或酰胺鍵(無 痕施陶丁格連接)。本發(fā)明所依賴的連接的選擇，部分地由所述完整的生物活性化合物的 性質(zhì)決定。例如，對于那些已知包括酰胺鍵的藥用化合物，或者已知酰胺 鍵的存在基本上不影響其活性的情況(即產(chǎn)生具有與所述完整的生物活性 化合物基本相同的活性的化合物)，本發(fā)明優(yōu)選依賴無痕施陶丁格連接。因 此，本發(fā)明的特定實施方案涉及提供天然地包含酰胺鍵的生物活性化合物 的基本上無活性的組分，其中所述組分用含有可轉(zhuǎn)移的?；撵⒒童B氮 化物官能化。根據(jù)這個實施方案，所述生物活性化合物的組分的再組裝將 產(chǎn)生藥用化合物或與所述完整的藥用化合物相同或幾乎相同的基本上完整 的藥用化合物。具有酰胺鍵的藥用化合物的非窮舉的名單包括生物活性 (多)肽，例如肽類激素和酶、受體結合物和衍生自氨基酸樣化合物的藥物；寡核苷酸類；碳水化合物；但也包括某些種類的無機化合物，例如縮 聚物如殺微生物劑SAMMA。在實施例部分說明根據(jù)本發(fā)明的官能化的博 來霉素和甲氨蝶呤的組分的用途。圖2表示根據(jù)本發(fā)明的無痕施陶丁格連接在生物活性化合物的組裝中 的用途的一般概念的實施方案。將例如含有酰胺鍵的藥物的生物活性化合 物分成對應于原始藥物的酰胺官能團兩側(cè)的殘基的兩種組分(A和B)。用無 痕施陶丁格膦探針官能化組分A，并用疊氮化物官能化組分B。當兩種組 分在體內(nèi)彼此相遇時，這兩種組分間產(chǎn)生的無痕連接提供所述完整的含酰 胺的藥物。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明提供生物活性化合物的基本上無活性的 組分，所述生物活性化合物天然地包含與氧化膦綴合的酰胺鍵，或者已知 (或已確定)該生物活性化合物中與氧化膦綴合的酰胺鍵的存在不顯著地 影響所述生物活性化合物的生物或治療活性，例如產(chǎn)生具有與所述完整的 生物活性化合物基本相同的生物活性的生物活性化合物。根據(jù)這個實施方案，本發(fā)明提供生物活性化合物的基本上無活性的組分，其中第一組分用 三芳基膦，或通過芳基上磷的鄰位的酯或硫酯連接(無痕)，或通過被烷氧 基羰基或烷基硫羰基鄰位取代的三芳基膦的芳基上的非活性連接(非無痕) 官能化第一組分，并且第二組分用疊氮化物官能化。根據(jù)特定的實施方案， 一種或多種官能化的本發(fā)明的生物活性化合物 的組分可以是靶向組分。更為具體而言，該組分可固有地具有耙向性，所 述靶向性基于其選擇性吸收或分布于一個或多個特定器官，任選與特定的 給藥途徑結合?？晒┻x擇地，所述生物活性化合物的本身不具有特定分布或親合力的 官能化的組分可以通過連接靶向部分而具有靶向作用。本發(fā)明范圍內(nèi)可考 慮不同的耙向部分以保證所述生物活性化合物的一種或多種組分靶向到感 興趣的組織或器官。實例包括但不限于抗體或抗體片段(例如但不限于Fab2、 Fab、 scFV),或其它能夠特異性的結合到特定的細胞、組織或器官 或被其特異性地吸收的化合物，例如但不限于奧曲肽和衍生物、VIP、 MSH、 LHRH、趨化肽、鈴蟾肽、彈性蛋白、肽模擬物、碳水化合物、單糖、多糖、 病毒、藥物、化學治療劑、受體配體、激動劑和拮抗劑、細胞因子、激素、 甾類。適用作為本發(fā)明范圍內(nèi)所考慮的靶向部分的有機化合物的實例為或 衍生自雌激素，例如雌二醇，雄激素，孕酮，皮質(zhì)類固醇，紫杉醇，依 托泊苷，阿霉素(doxorubricin)，甲氨蝶呤，葉酸和膽固醇。根據(jù)本發(fā)明的特定的實施方案，所述靶向部分能夠特異性地結合受體， 例如受體的配體或仍結合到受體的它的一部分，例如在受體結合蛋白配體 的情況下為受體結合肽。蛋白性質(zhì)的靶向部分的其它實例包括干擾素，例如a、 P和Y干擾 素，白細胞介素，和蛋白生長因子，例如腫瘤生長因子(如a、 0腫瘤生 長因子)、血小板源性生長因子(PDGF)、尿激酶型纖溶酶原激活物受體 (uPAR)靶向蛋白、載脂蛋白、低密度脂蛋白(LDL)、膜聯(lián)蛋白V、內(nèi) 皮抑素和血管生成抑素?？晒┻x擇的靶向部分的實例包括DNA、 RNA、 PNA和LNA,這些物 質(zhì)由其序列或其部分的性質(zhì)能夠特異性地與靶核苷酸雜交。根據(jù)本發(fā)明的特定的實施方案，使用能夠結合細胞內(nèi)靶標的小的親脂性主要部分。根據(jù)本發(fā)明，將靶向部分連接到一種或多種所述生物活性化合物的組 分上從而保證其在給藥于身體時的靶向遞送。僅一種組分的耙向作用就是 足夠的，其中含疊氮化物的藥物組分或含膦組分可以是靶向性的。在某些 實施方案中，在所述生物活性化合物的含疊氮化物組分和含膦組分上都提 供耙向部分。根據(jù)第一實施方案，通過所述生物活性化合物的組分自身的官能團連 接靶向部分。使用這種方法，靶向部分在所述組分上的存在不受所述生物 活性化合物的再組裝的影響，因此所述靶向部分在再組裝之后保持連接到 所述生物活性化合物上。盡管如此，所述靶向部分可以通過其它因素，例 如細胞代謝而被部分或全部除去。根據(jù)另一個實施方案，在無痕施陶丁格連接中在所述生物活性化合物的含膦組分的三芳基膦基上提供該靶向部分(圖2中的"T")。更具體而言，所述靶向部分可連接到三苯基膦的一個苯基上。利用這種方法，所述靶向 部分在所述兩種組分之間發(fā)生施陶丁格連接時會從再組裝的生物活性化合 物上釋放。在非無痕施陶丁格連接中，可選擇地在參與施陶丁格連接的烷氧基羰 基的烷基上提供所述靶向部分。在此實施方案中，所述靶向部分在所述組分再組裝時也不再存在于生物活性化合物中(圖3)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，生物活性化合物的官能化的組分各自分別地 和單獨地提供，各自任選地與藥學上可接受的載體或賦形劑混合。所述官 能化的組分可以作為組件試劑盒提供，用于聯(lián)合的、序貫的或連續(xù)的給藥 于人或動物體。典型地，本發(fā)明的組分作為一種生物活性化合物的兩種或 更多種組分的組合提供。可以考慮不同類型的包裝或制劑，條件是所述包 裝或制劑防止各組分在給藥前彼此接觸。可以通過相同或不同的途徑給藥一種生物活性化合物的不同組分。本 發(fā)明范圍內(nèi)考慮的用于所述生物活性化合物的組分的不同給藥途徑包括但 不限于口服給藥、局部給藥(粘膜、皮膚)、注射(例如靜脈內(nèi)、皮下、肌 內(nèi)、腹膜內(nèi)、乳房內(nèi)注射)、呼吸(吸入、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)給藥)或直腸給藥。因此，本發(fā)明的另一方面涉及治療方法，所述方法包括向個體給藥生物活性化合物的兩種或更多種組分，其中所述生物活性化合物的組分被官 能化以保證基于施陶丁格連接的所述生物活性化合物的再組裝。
考慮不同的給藥系統(tǒng)以使給藥各組分之后所述生物活性化合物再組裝 的效率最佳化。最具體而言，如果一種官能化的組分(固有地或通過耙向 部分)靶向于期望的器官或組織，可以在給藥對所述期望的器官或組織沒 有或有較小靶向性的官能化的組分之前給藥這部分。
因此，根據(jù)一個實施方案，所述給藥方法一般包括兩步
-第一步，其中給藥所述生物活性化合物的具有最大靶向特異性的官能 化的組分于身體。
-第二步，其中給藥所述生物活性化合物的另外的官能化的組分。
任選地，在步驟1和步驟2之間考慮有一段時間以允許所述生物活性 化合物的第一組分到達其靶標和/或允許其余組分的清除。
根據(jù)本發(fā)明，所述生物活性化合物的再組裝會僅在兩種互補的官能化 的組分彼此相遇的那些地方發(fā)生。
可以考慮上述組分和給藥方法的不同變體和改變。例如，可以用可探 測標記物進一步修飾所述生物活性化合物的一種或兩種(或更多種)組分 以允許追蹤一種或兩種(或更多種)組分的分布。這使基于追蹤第一組分 的結果來調(diào)整給藥第二官能化組分的時間或者調(diào)整待給藥的第二組分的用 量成為可能。
成像探針的可探測標記物的特定實例為用于傳統(tǒng)成像系統(tǒng)的造影劑，
例如MRI可成像試劑、自旋標記物、光學標記物、超聲反應試劑、X射線 反應試劑、放射性核素、(生物)發(fā)光的和FRET型染料。本發(fā)明范圍內(nèi)考 慮的例舉性的可探測標記物包括但不一定限于熒光分子，例如自體熒光分 子、與試劑接觸時發(fā)熒光的分子等；放射性標記物；生物素，例如它通過 生物素和抗生物素蛋白的反應而被檢測出來；熒光標記物；包含順磁性金 屬的用于MRI的顯像劑；成像試劑，例如在美國專利4,741,900和5,326,856 中所述的那些，等等。
所述MRI可成像試劑可以是順磁性離子或超順磁性粒子。 所述超聲反應試劑可以包含微泡，其外殼由磷脂，和/或(可生物降解 的)聚合物，和/或蛋白樣人血清白蛋白組成。微泡可以填充氟化氣體或液體。
所述X射線反應試劑包括但不限于碘、鋇、硫酸鋇、泛影葡胺，或者 可包含填充碘化合物和/或硫酸鋇的小囊、脂質(zhì)體或聚合物膠囊。
此外，本發(fā)明的范圍內(nèi)考慮的可探測標記物還包括肽或多肽，所述肽 或多肽可以通過抗體結合來探測，例如通過可探測的標記抗體的結合或者 通過利用夾層式測定探測結合抗體來探測。
在一個實施方案中，所述可探測標記物為小尺寸的有機PET和SPECT 標記物，例如18F、 "C或1231。
上述的常規(guī)兩步法可能要求給藥高數(shù)量的所述非靶向性第二官能化組 分，以保證兩種組分在體內(nèi)彼此相遇和足量的活性再組裝生物活性化合物 形成。為了處理這種潛在的不便，考慮特定的給藥方法。
在一個實施方案中，兩種互補的官能化組分被包埋在具有靶向部分的 可降解基質(zhì)中。該基質(zhì)將所述組分彼此物理隔離。在靶向作用和隨后的所 述基質(zhì)降解之后，官能化的組分處于彼此接近之處，并且可以有效地發(fā)生 反應。
在另一個實施方案中，兩種官能化組分作為在靶向小囊中的固體粒子 存在。在小囊的靶向作用和破裂或分解之后，兩種組分可以彼此發(fā)生反應。
在再一個實施方案中，兩種官能化組分在不能發(fā)生施陶丁格連接的條 件下(例如掩蔽一個或兩個官能團)存在于小囊中的溶液中。在破裂或分 解之后，所述化合物釋放，并進一步釋放所述官能團，可以發(fā)生反應。可 供選擇地，考慮這樣的一個實施方案，其中所述小囊是可滲透的，小囊內(nèi) 的條件逐漸改變，而所述生物活性化合物在此微環(huán)境中形成。當小囊破裂 或分解時，再組裝的生物活性化合物形成。
在再一個實施方案中，所述互補的官能化生物活性化合物的組分(如 果必要的話， 一種或兩種為靶向性的)通過可降解的連接基(例如肽、脂 質(zhì)或寡糖)連接。在靶向作用和通過體內(nèi)酶降解連接基之后，兩種組分可 以反應并且形成所述生物活性化合物。
本發(fā)明使保證給藥以完整形式給藥時表現(xiàn)出某些缺點的生物活性化合 物成為可能。更具體而言，認為對于作為完整化合物由于對非靶組織具有 活性而通常具有毒性或具有副作用的生物活性化合物而言，作為非活性組分給藥是顯著的優(yōu)勢。根據(jù)本發(fā)明的生物活性化合物的體內(nèi)組裝提供生物 活性化合物的優(yōu)良的疾病選擇性作用并減小了副作用。這種技術使增大一 系列已知藥物的治療窗并保證增加基于這些藥物的治療成功率，因此增加 其應用/處方范圍成為可能。因此，本發(fā)明提供生物活性化合物的組分，所 述組分對非靶細胞的毒性與所述完整的生物活性化合物的毒性相比是降低
的。更具體而言，根據(jù)體外毒性研究，所述毒性降低20%,更特別地降低 30%，最特別地降低至少50%。附加地或可供選擇地，本發(fā)明使克服所述 生物活性化合物的物理和/或化學缺點成為可能。例如，生物活性化合物在 體內(nèi)的有效分布通常受所述化合物在水中的有限的溶解度阻礙。現(xiàn)有的增 加水溶性的藥物最優(yōu)化方法通常降低細胞吸收或膜擴散，因為親水/親脂平 衡或效力發(fā)生變化。因此，使用提供高藥物吸收的疏水隔室的例如脂質(zhì)體 或乳劑的藥物遞送系統(tǒng)來給藥弱水溶性生物活性化合物。這些遞送載體可 以攜帶高有效載荷的疏水生物活性化合物并提供延長的血液半衰期。脂質(zhì) 體或乳劑藥物遞送的缺點是它們高的肝吸收，其導致肝毒性增加。使用本 發(fā)明的概念可能增加生物活性化合物的水溶性。本發(fā)明的生物活性化合物 的一種或多種官能化的組分的溶解度可以是固有的較高，或者可以通過加 入官能團而得到改良。因此，本發(fā)明提供生物活性化合物的組分，所述組 分的溶解度與完整的生物活性化合物的溶解度相比得到改善。更具體而言， 所述溶解度改善至少20%，更特別地至少30%，最特別地至少50%或更多。
根據(jù)特定的實施方案，最疏水的組分作為第一組分用磷基官能化，所述膦 基上提供有影響所述組分的溶解度的官能團，例如(多)醇基和糖類(本 文也稱為"水溶性標記物")。在施陶丁格連接中與第二組分反應時，除去 所述膦基，所附加的基團不會影響再組裝的生物活性化合物的活性。
實施例
實施例l.博來霉素的體內(nèi)組裝
博來霉素(抗腫瘤抗生素家族)的混合物用于癌癥化學治療(主要是 八2和82，圖4)。當與金屬離子輔因子結合時，博來霉素可以切割DNA。 所述藥物包括不同的基本區(qū)域，其中的兩種為金屬結合區(qū)域和DNA結合區(qū) 域。在這個實施例中，博來霉素1作為分別包含所述金屬結合區(qū)域或所述DNA結合區(qū)域的兩種單獨組分提供，產(chǎn)生兩種DNA非活性組分(2和3)。 用與癌選擇性靶向部件綴合的無痕施陶丁格膦探針(方框，實線)官能化 DNA切割化合物2。用疊氮化物(方框，虛線)官能化DNA結合化合物3。 在全身給藥2且其在癌部位蓄積之后，注射組分3。 2和3之間在耙部位的 選擇性反應會導致組裝的藥物的同時釋放和活化。
實施例2.甲氨蝶呤的體外和體內(nèi)組裝
將甲氨蝶呤(化合物4，圖5)分成兩種組分(化合物5， 6)，各自對 應于在酰胺鍵一側(cè)的完整分子的一部分。這些組分以使這兩種組分之間的 反應導致甲氨蝶呤的再組裝的方式用無痕施陶丁格連接反應配偶子官能 化。
如下根據(jù)人肉瘤細胞系中的增殖減少來評價體外甲氨蝶呤化合物的再 組裝
將人肉瘤細胞(HT-1080)接種于96-多孔平底微孔滴定平板中。在藥物試 驗之前，在37。C， 5%(202下將平板孵育24-48小時以使細胞粘附。新鮮 制備兩種甲氨蝶呤組分5和6的原液，并在完全培養(yǎng)基中制備稀釋液。所 用的濃度范圍為O.lnM-lOuM。用加到100 pl含細胞的完全培養(yǎng)基中的50 pl/孔的組分5和50 pl/孔的組分6以一式四份的方式測定各濃度。在對照 組中，僅加入100 )Lil完全培養(yǎng)基，或者50 pl完全培養(yǎng)基與50 nl組分5或 6的混合物。將此平板孵育72小時，并通過MTT比色測定完成細胞增殖 評價。
將甲氨蝶呤(化合物4，圖5)用作抗癌化學治療劑，并用于治療關節(jié) 炎和其它風濕性病癥。它通過阻斷酶二氫葉酸還原酶，從而干擾產(chǎn)生一種 形式的對活躍生長的細胞重要的葉酸來起作用。與實施例1類似，通過應 用靶向原位組裝方法增加甲氨蝶呤治療的治療窗。為此，將甲氨蝶呤化合 物分成如上述的兩種組分。用靶向部分迸一步官能化含三芳基膦的組分， 保證該組分靶向至癌細胞。含三芳基膦組分(5)與含疊氮化物組分(6)的連接 在靶細胞處發(fā)生，借此釋放靶向部件。
實施例3.用代謝產(chǎn)物作為靶向部分的生物活性化合物的體內(nèi)組裝許多抗癌藥物可以使用葡萄糖途徑的代謝產(chǎn)物而具有耙向性。細胞的
葡萄糖代謝途徑可以識別膦-葡萄糖綴合物7 (圖6)。在細胞吸收之后，這 些被修飾的糖被捕獲，并由于第一代謝磷酸化步驟而在細胞內(nèi)蓄積。在全 身給藥之后，葡萄糖最佳地蓄積在具有高葡萄糖吸收的組織(例如腫瘤組 織)，并會最佳地從其它非靶組織和血液中清除。然后給藥第二組分('8'， 圖6)。組分8綴合到組分7上，通過無痕施陶丁格連接被捕獲在細胞內(nèi)。 在發(fā)生連接時，活性含酰胺藥物被再組裝，同時從分子中清除膦-葡萄糖基 團。
作為這種方法的延伸，所述含疊氮化物藥物組分(8)還可以用葡萄糖部 分官能化。通過這種方式，兩種非活性藥物組分特異性地靶向至腫瘤組織。 但是，在此實施方案中的再組裝的藥物是葡萄糖-藥物綴合物，它保持被捕 獲在細胞內(nèi)。
實施例4.施陶丁格連接用于改善生物活性化合物水溶性的用途
根據(jù)本發(fā)明，以兩種組分的形式提供弱水溶性生物活性化合物，所述 組分的水溶性大于或者被修飾至大于完整的生物活性化合物。這對于攜帶 酰胺官能團的生物活性化合物特別有意義。
吡羅昔康(化合物12，圖7)是一種含酰胺官能團的化合物，它以兩 種組分(圖7中的組分13和14)的形式提供，所述組分分別用疊氮化物和 三苯基膦衍生物修飾。將后者連接到更具疏水性的藥物部分，并攜帶附加 的側(cè)基以使得整個構成物具有水溶性。任選地，含疊氮化物的組分的性質(zhì) 也被調(diào)節(jié)以獲得比完整的藥物增加的水溶性。
在治療疼痛患者時，共同給藥所述兩種吡羅昔康組分。所述生物活性 化合物在體內(nèi)通過施陶丁格連接再組裝。
實施例5蝶啶膦
此實施例表示在圖8中。 疊氮基-L-谷氨酸(6)，
將疊氮化鈉(8.83g; 136mmo1)溶于水(25mL)，加入二氯甲烷(37.5 mL)，并將混合物于0。C下劇烈攪拌。在數(shù)分鐘內(nèi)加入三氟甲磺酸酐(Triflicanhydride; 7.89 g; 27.9 mmol)，將反應混合物于0°C下攪拌30分鐘，并在 20°C下攪拌1小時。然后分離有機層，并用二氯甲烷萃取水層(2次15 mL)。 用飽和Na2CO3(10mL)洗滌含三氟甲磺?；B氮化物(triflyl azide)的合并
的有機層。
將L-谷氨酸(2.06 g; 14.0謹ol)、 K2C03 (5.80g; 42.0 mmol)和 Cu(II)S04.5H2O (35mg;0.14mmo1)溶于水(50mL)，加入甲醇(90mL) 和所述三氟甲磺酰疊氮化物溶液。將反應混合物于20°C下攪拌20小時。 真空蒸發(fā)揮發(fā)性溶劑，加入水(250 mL)，用6M鹽酸(大約80mL)中和溶 液，并加入PH=6.2的磷酸鹽緩沖液(250 mL)。用乙酸乙酯洗滌混合物(4 次200mL)，并通過加入6M鹽酸(大約6mL)調(diào)節(jié)pH至2。用乙酸乙酯 萃取此混合物(3次200 mL)，并用MgS04干燥合并的有機層，過濾，并 蒸發(fā)至干燥得到產(chǎn)物，為無色液體(1.98g; 82%)。
'H-雨R (CDC13): 5 4.13 (t， 1H, J-6.5 Hz)， 2.4-2.7 (br. m， 2H)， 2.22 (m, 2H) ppm. 13C-NMR (CDC13): 5 178,8， 175.8， 60.5， 29.6, 26.0 ppm. FT-IR (ATR): v 2927, 2107， 1704, 1413, 1208， 1056, 913， 857, 792 cm-1。
4-[N-(2，4-二氨基-6-蝶啶基)甲萄-N-甲基氨基苯甲酸(15)
將2，4-二氨基-6-(羥基甲基)蝶啶鹽酸鹽(4.40 g; 19.19 mmol)溶于熱 水(150 mL)，通過加入1 M NaOH (大約20 mL)中和溶液。將沉淀物 過濾，用水洗滌，并用P20s真空干燥。隨后將此沉淀物懸浮在DMAc (25 mL)中，并加入二溴化三苯基膦(triphenylphosphine dibromide; 18.12 g; 42.92 mmol)。將混濁的反應混合物于20。C下攪拌20小時。加入4-(甲基氨 基)苯甲酸(2,95g; 19.50 mmol)和DIPEA (5.04 g; 39.00 mmol)，并將混 濁的反應混合物于20。C下攪拌3天。然后，將其倒入0.33 M NaOH溶液 (250 mL)，并濾出沉淀物，并通過加入10%在水中的乙酸(大約2mL) 中和濾液。將沉淀物過濾，用水洗滌，用甲醇(30 mL)研磨，并用P205 真空干燥，得到產(chǎn)物，為米黃色/橙色粉末(3.48 g; 56%)。
iH-NMR (DMSO): 5 8.59 (s, 1H)， 7.53 (d， 2H, 8.8 Hz), 7.7 (br. s， 1H)， 7.5 (br. s, 1H)， 6.83 (d， 2H， 8.8 Hz)， 4.79 (s， 2H)， 3.23 (s， 3H) ppm. FT-IR (ATR): v 3335,3194， 2964, 1651, 1597， 1292， 1187 cm-1。3-碘-4-羥基苯甲酸(16)
將3-氨基-4-羥基苯甲酸(10.00 g; 65.30 mmol)溶于濃鹽酸(100 mL)， 0。C下滴加在水(30mL)中的亞硝酸鈉(4.73 g; 68.56mmol)溶液。將反 應混合物于0。C下攪拌30分鐘，然后在0。C下滴加在水(100 mL)中的 碘化鉀(54.20 g; 326.5 mmol)溶液。在0°C下攪拌30分鐘后，將反應混 合物加熱到70。C，直至不再有逸出的氣體(大約1小時)。用乙醚萃取混 合物(3次250 mL)，并用1 M NaHS03 (100 mL)洗滌合并的有機層。 用乙醚(150 mL)反萃取水層。用Na2S04干燥合并的有機層，過濾，并蒸 發(fā)至干燥。用甲醇(30mL)和水(70mL)的混合物重結晶剩余固體，得 到產(chǎn)物，為褐色晶體(8,95 g; 52%) . 'H-NMR (MeOD): 5 8.34 (d， 1H, J=2.2 Hz)， 7.85 (dd， 'H， J=2.2, 8.6 Hz)， 6,86 (d， 1H， J-8.6 Hz) ppm. FT-IR (ATR): v 3271, 1679， 1574， 1362, 1288, 1239， 1195， 767 cm-1。
3-二苯基膦-4-羥基苯甲酸三乙銨(17)
將3-碘-4-羥基苯甲酸(4.00 g; 15.15 mmol)懸浮在乙腈(90mL)中， 并加入三乙胺(9.19g;卯.9mmo1)、乙酸鈀(0.17 g; 0.76 mmol)和二苯基 膦(4.23 g; 22.73 mmol)。在氬氣氛下將反應混合物加熱至90°C，持續(xù)20 小時。過濾沉淀物，用乙腈洗滌，并干燥，得到產(chǎn)物，為米黃色固體(5.06 g; 79%)。
tH-NMR (DMSO): 5 7.78 (dd， 1H, J=2,2， 8.6 Hz)， 7.61 (m， 1H), 7.38 (br. m, 6H), 7.20 (br. m， 4H), 6.84 (dd, 1H， J=4, 8.6 Hz), 2.60 (q， 6H， J=7.0 Hz)， 1.00 (t， 9H， J=7.0 Hz) ppm. 31P (DMSO): -17.0 ppm. FT畫IR (ATR): v 2409， 1825， 1584， 1529， 1390， 1354， 1339, 1286， 1123, 791, 743, 700 cm"。
蝶啶膦(5)，
將4-[N-[(2，4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]-N-甲基氨基]苯甲酸(15) (0.650 g; 2.00mmol)懸浮在DMAc(15mL)中。加入DIPEA (0.79 g; 6.14mmo1) 和HBTU(0.92g; 2.43mmo1)，并將反應混合物于20°C下攪拌20小時。 過濾沉淀物，用DMAc和乙醚洗滌，并干燥得到中間產(chǎn)物HOBt-酯(0.668g; 1.51 mmol)。
將3-二苯基膦-4-羥基苯甲酸三乙銨(17) (0.639 g; 1.51 mmol)懸浮在 DMSO (5mL)中，并加入叔丁醇鉀(0.339 g; 3.02 mmol)。往此溶液加 入在DMSO (5mL)中的所述中間產(chǎn)物HOBt-酯的溶液，并將反應混合物 于20。C下攪拌20小時。隨后，將其過濾，倒入水(lOOmL)中，用乙酸 中和并離心。傾析母液，將沉淀在水(100 mL)中攪拌，并再次離心和傾 析。將殘渣溶于丙酮(100mL)，并在-20。C下重結晶得到產(chǎn)物，為黃色粉 末(0.360 g; 29%)。H-麗R (DMSO): 5 8.60 (s, 1H)， 8.01 (dd, 2H, J=2， 8.6 Hz)， 7,65 (br.s, 2H)， 7.50 (d, 2H， J=9.2 Hz)， 7.42 (br. m, 8H), 7.23 (m， 3H), 6.76 (d， 2H， J=9.2 Hz), 6.62 (br. s， 2H)， 4.81 (s， 2H), 3.25 (s， 3H) ppm. 3'P-NMR (DMSO): -16.6 (產(chǎn)物)，+23.4 (小，氧化膦)ppm. FT-IR (ATR): v 3319, 3182, 3053， 1717, 1634， 1600， 1523, 1435， 1367, 1272， 1244, 1172， 1115, 1063， 1045， 742, 691 cm", LC-MS (CH3CN/H20): tr=8.9 min: m/z=630.1 (M+H)+; t產(chǎn)7.5min: m/z=646.0 (氧化膦)。
權利要求
1.完整的生物活性化合物的兩種或更多種組分的組合，所述組分基本上無生物活性，其中所述組分用施陶丁格連接的相容性官能團官能化，從而在彼此接觸時導致具有與所述完整的生物活性化合物基本上相同的活性的生物活性化合物的再組裝。
2. 權利要求1的組合，其特征在于至少一種所述組分是靶向性的。
3. 權利要求2的組合，其中所述靶向性組分包含靶向部分。
4. 根據(jù)權利要求1的組合，其特征在于至少一種所述組分包含可探測 的標記物。
5. 權利要求1的組合，其中所述完整的生物活性化合物具有酰胺基， 且所述組分的再組裝導致所述酰胺基的產(chǎn)生。
6. 權利要求1的組合，其中所述組分作為單獨的藥物組合物提供，所 述組合物各自與藥學上可接受的載體或賦形劑混合。
7. 根據(jù)權利要求1的組合，其中所述官能團在無痕施陶丁格連接中具 有反應性。
8. 根據(jù)權利要求1的組合，其中所述官能團代表相等數(shù)目的選自(a)和 (b)的官能團，其中.-a) 被烷氧基羰基鄰位取代的三芳基膦基，借此所述組分通過非活性連 接在其中一個芳基的一個其余的位置上連接到所述三芳基膦上，或三芳基膦基，其方式使得所述三芳基膦被所述組分通過羰基氧(-co-o-)或羰基硫(-CO-S-)連接鄰位取代，和b) 疊氮基。
9. 根據(jù)權利要求1的組合，其包含2種組分。
10. 根據(jù)權利要求8的組合，其中至少一種所述含膦組分通過耙向部分 具有靶向性。
11. 根據(jù)權利要求10的組合，其中所述靶向部分連接到所述三芳基膦 的芳基上。
12. 根據(jù)權利要求10的組合，其中所述至少一種含膦組分包含被垸氧 基羰基鄰位取代的三芳基膦基，并且其中所述靶向部分連接到所述烷氧基 羰基的烷基上。
13. 根據(jù)權利要求1的組合，其中所述組分的溶解度與所述完整的生物 活性化合物的溶解度相比得到改善。
14. 根據(jù)權利要求13的組合，其中至少一種所述組分為含膦組分，且 其中所述含膦組分的所述膦被修飾以增加所述含膦組分的溶解度。
15. 根據(jù)權利要求1的組合，其中所述組分的穩(wěn)定性和/或毒性與所述 完整的生物活性化合物的穩(wěn)定性相比得到改善。
16. 根據(jù)權利要求1的組合，其包含甲氨蝶呤的兩種組分，其中所述 組分對應于酰胺基的各側(cè)的甲氨蝶呤分子部分。
17. 根據(jù)權利要求1的組合，所述組合包含博來霉素的兩種組分，其中 第一種所述組分對應于博來霉素的金屬結合區(qū)域，且其中第二種所述組分 由博來霉素的DNA結合區(qū)域組成。
18. 包含與完整的生物活性化合物的組分混合的藥用載體或賦形劑的藥物組合物，其中所述組分基本上無生物活性，且其中所述組分被在施陶 丁格連接中具有反應性的基團官能化。
19. 完整的生物活性化合物的第一組分，所述第一組分基本上無生物活 性，其特征在于所述組分被在施陶丁格連接中具有反應性的基團官能化， 使得與第二組分接觸時導致具有與所述完整的生物活性化合物基本上相同 的活性的生物活性化合物的再組裝，且其進一步的特征在于其包含耙向部 分。
20. 制備博來霉素組分的方法，所述組分彼此接觸時能夠再組裝成完整的博來霉素，所述方法包括a) 提供博來霉素的金屬結合區(qū)域，b) 提供博來霉素的DNA結合區(qū)域，c) 在博來霉素的每個所述區(qū)域上，在完整藥物中連接這些區(qū)域的位置， 提供能夠在施陶丁格連接中相互作用的各個官能團。
21. 增加完整的生物活性化合物的吸收的方法，所述方法包括以下步驟a) 提供所述生物活性化合物的兩種組分，所述組分在再組裝時產(chǎn)生所 述生物活性化合物或具有與所述完整的生物活性化合物基本上相同的活性 的化合物，b) 給每一種所述組分提供能夠在施陶丁格連接中一起反應的三芳基膦 或疊氮化物官能團，以允許所述(再)組裝；借此所述兩種組分中更具疏 水性的組分用三芳基膦修飾。
22. 根據(jù)權利要求21的方法，其中所述三芳基膦基進一步用增加所述 組分的水溶性的附加基團修飾。
全文摘要
本發(fā)明提供藥物體內(nèi)自組裝的方法和工具。本發(fā)明使減少與缺乏選擇性、溶解度降低和其它完整藥物的缺點相關的問題成為可能。
文檔編號A61K31/519GK101410139SQ200780010984
公開日2009年4月15日 申請日期2007年3月20日 優(yōu)先權日2006年3月28日
發(fā)明者H·格呂爾, M·S·羅比亞爾 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司