專利名稱：：預(yù)防和治療癌癥轉(zhuǎn)移和癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)性骨丟失的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過將M-CSF拮抗劑和另一種治療劑聯(lián)合給予對象來預(yù)防和治療溶骨性疾病，包括癌癥轉(zhuǎn)移和癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)性骨丟失的方法。
背景技術(shù)：
：介導(dǎo)骨吸收的破骨細胞參與正常和異常的骨再塑過程，包括溶骨性疾病。破骨細胞是從造血細胞分化來的多核細胞。通常接受破骨細胞是由骨髓中的造血干細胞衍生的單核前體融合形成，而不是不完全的細胞分裂(Chambers，BoneandMineralResearch,6:1-25，1989;G她ling等，ClinOrthopRelatR.120:201-228，1976;Kahn等，Nature258:325-327，1975;Suda等，EndocrRev]3:66-80，1-992;Walker,Science180:875，1973;Walker,Sciencel卯:785-787,1975;Walker,Sciencel卯784-785，1975)。它們共有相同的-T.細胞和單核細胞-h:噬細胞譜系細胞(Ash等，Nature283:669-670，1980;Kerby等，J.BoneMinerRes7:353-62，1992)。破骨細胞前體分化成成熟的多核破竹細胞需要不問的岡素，包括激素和局部刺激(Athanasou等，BoneMiner3:317-333，1988;Feldman等，Endocrinology107:1137-1143，1980;Walker,Science190:784-785，1975;Zheng等，HistochemJ23:180-188，1991)，現(xiàn)已證實活的卄頭和骨細胞在破骨細胞發(fā)rr中起著至關(guān)承::盟的作用(IIagenaars等，BoneMiner6:179-189，1989)。成骨細胞成竹髓某質(zhì)細胞也足破骨細胞分化所蓋:。這些細胞產(chǎn)生的支持破骨細胞形成的因素之-是巨噬細胞集落刺激丙子，M-CSF(Wiktor-Jedrzejczak節(jié)，ProcNatlAcadSciUSA87:4828-4832，19卯；Yoshida等，Nature345:442-444，1990)。NF-kB受休激活蛋[T配休(RANKL，也稱為TRANCE、ODF和OPGL)是另--種估^(Suda等，EndocrRev3:66-80，1992),W成竹細胞/基質(zhì)細胞通過該信3，經(jīng)山位于破'ft細胞和破竹細胞前體1-:的受體RANK(TRANCER)刺激破骨細胞形成和吸收(Lacey等，Cell93:165-176，1998;Tsuda等，BiochemBiophysResCo234:137-142，1997;Wong鄰'JExpMed186:2075-2080,1997;Wong等，JBiol.Chem272:25190-25194，1997;Yasuda等，Endocrinology139:1329-1337，1998;Yasuda等，ProcNatlAcadSciUS95:3597-3602，1998)。成'n'細胞還分泌強烈抑制破骨細胞形成的蛋白質(zhì)，稱為骨保護紫(OPG，也稱為OCIF)，其用作RANKL的誘餌受體，因而抑制了破骨細胞和成1t細胞之間經(jīng)山RN八K和RANKL的it信號。破骨細胞負(fù)責(zé)礦物質(zhì)和有機骨基質(zhì)的溶解(Blair等，JCellBiol102:1164-1172，1986)。破骨細胞代表了表達獨特極化形態(tài)的最終分化細胞，其具有專門膜區(qū)域與幾個膜和胞質(zhì)標(biāo)記，例如酒石酸耐受性酸性磷酸酶(TRAP)(Anderson等，1979)、碳酸酐酶II(Vaananen等，Histochemistry78:481-485，1983)、降鐘'素受體(Warshafsky等，Bone6:179-185，1985)和玻璃粘附蛋l(fā)l受體(Davies等，JCellBiol109:1817-1826，1989)。多核破骨細胞通常含W不到10個核，但它們最多可含^100個;i!l徑在10-100|um之問的核(G6thling等，ClinOrthopRelatR120:201-228，1976)。這使得可以較為7/便地使川光學(xué)顯微鏡鑒別它們。它們處于活性狀態(tài)時:H有大量寧:泡，還含有許多線粒休，》明其代謝速率"(Mundy，刊丁《代謝性骨病和礦物質(zhì)代謝障石導(dǎo)入門》(Primeronthemetabolicbonediseasesanddisordersofmineralmetabolism),第18-22頁，1990)。由于破骨細胞在溶卄性轉(zhuǎn)移巾的t要作用，本領(lǐng)域需要新的藥物和方法來預(yù)防破骨細胞刺激I功能。癌癥轉(zhuǎn)移是手術(shù)后或治療后癌癥患者復(fù)發(fā)的主要原因。盡管人們致力于開發(fā)治療方法，但癌癥轉(zhuǎn)移仍然基本上是難以治療的。骨頭是各種類型的人癌癥(例如，乳腺癌、肺癌、前列腺癌和甲狀腺癌)轉(zhuǎn)移的最常見部位。溶骨性骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生因難治的疼痛、極易骨折、神經(jīng)壓迫和高鈣血癥而造成嚴(yán)重的發(fā)病率。雖然這些臨床問題至關(guān)重要，但癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨丟失的治療方法卻很少。目前正使用或開發(fā)幾張以溶骨性疾病為目的的治療方案，這些方案主要致力于開發(fā)藥物，以圖通過抑制破骨細胞的形成或活性來阻斷骨吸收。目前，集中于骨中的二膦酸鹽(BP)、焦磷酸鹽類似物是骨吸收的最有效抑制劑。BP被破骨細胞吸收，抑制了它們的活性，進而導(dǎo)致這些細胞凋亡，從而抑制了骨吸收。阿倫膦酸鹽(alendronate)是第一種骨吸收的BP抑制劑，其顯示明顯降低了脊柱/髖部骨折，并批準(zhǔn)用于治療骨質(zhì)疏松。最新一代BP，佐美塔(Zometa)批準(zhǔn)用于治療實體瘤和多發(fā)性骨髓瘤中的高鈣血癥和骨疾病，正在研究其是否能用于治療佩吉特病和實體瘤及多發(fā)性骨髓瘤導(dǎo)致的骨轉(zhuǎn)移。佐美塔可在極低劑量起作用，可以每月一次的15分鐘靜脈內(nèi)輸注給予，但仍能影響成骨細胞并可導(dǎo)致副作用，例如腎臟毒性和顎骨壞死(Fromigue和Brody，.1,Endocrinol.Invest.25:39-46，2002;Ibrahim,A等,Clin.Cane.Res.9:2394-99，2003;Body,JJ.，TheBreast.S2-S37-44,2003;Yaccoby，S.笮，Brit.J,Hemat.，116:278-80，2002;Corey，E.等，Clin.Cane.Res.9:295-306，2003;Coleman,R.E.，Sem.Oncol.，29(6):43-49，2002;Coleman,R.E.，Eur.Soc.Med.Oncol.16:687-95，2005;Bamias等，JClinOncol13:8580-8587，2005)。閑此，本領(lǐng)域仍需要鑒定新的藥物和方法來預(yù)防或治療溶骨件疾病和/或癌癥轉(zhuǎn)移，包括溶骨性骨轉(zhuǎn)移。發(fā)明概述本發(fā)明的組合物和方法實現(xiàn)了上述和本領(lǐng)域的其它相關(guān)需要。本發(fā)明的一個實施方式提供了治療患有溶骨性疾病或具有該疾病危險的對象的方法，所述方法包括在約1天到1年的過渡期給予對象單一治療量的M-CSF拮抗劑和單一治療有效量的第二抗-破骨細胞劑，在此期間M-CSF拮抗劑將活性破骨細胞數(shù)量降低至治療上可接受的水平。示范性M-CSF拮抗劑包括M-CSF抗體，而示范性第二抗-破骨細胞劑包括二膦酸鹽和RANKL抑制劑，包括抗-RANKL抗體。涉及本文的抗-M-CSF抗體和破骨細胞抑制劑的方法和/或應(yīng)用任選排除國際公布號WO2005/068503披露的RX1、5H4、MCI和MC3-衍生抗體的應(yīng)用。過渡期的持續(xù)時間可以是，例如至少一天到最多一年，并且可通過，例如破骨細胞生長或活性的相關(guān)標(biāo)記物進行監(jiān)測?；蛘?，可以同時給予它們。舉例來說，骨形成的標(biāo)記物包括但不限于鈣、總的和骨特異性的堿性磷酸酶(BAP)、骨鈣蛋白(OC，P-gla-蛋白)、I型前膠原C前肽(PICP)、I型前膠原N前肽(PINP)和骨吸收的標(biāo)記物，包括但不限于NTX(骨膠原的N-末端交聯(lián)端肽)和CTX(骨膠原的C-末端交聯(lián)端肽)、吡啶交聯(lián)(吡啶諾啉(pyridinoline)和脫氧吡啶諾啉[DPD])和締合肽、I型骨膠原降解產(chǎn)物羥基脯氨酸和羥基賴氨酸糖苷、酒石酸耐受性酸性磷酸酶(TRACP)和骨涎蛋白(BSP)。參見Fohr等，J.Clin.Endocrinol.Metab.，2003年11月，88(11):5059-5075。在相關(guān)的實施方式中，提供的上述方法在過渡期后停止給予所述第二抗-破骨細胞劑。在其它相關(guān)的實施方式中，提供的上述方法在過渡期后降低所述第二抗-破骨細胞劑的用量。在進一步相關(guān)的實施方式中，提供的所述方法在過渡期后降低M-CSF拮抗劑的用量。本發(fā)明方法包括通過抑制M-CSF及其受體(M-CSFR)之間的相互作用實現(xiàn)其治療潛力。還包括抑制M-CSF/M-CSFR相互作用來抑制破骨細胞增殖和/或分化。在本發(fā)明的任何方法和組合物中，M-CSF拮抗劑可以是包含抗-M-CDF抗體的多肽；包含抗-M-CSFR抗體的多肽；包含M-CSF突變蛋白或其變體的可溶性多肽；包含M-CSFR突變蛋白或其變體的可溶性多肽；或抑制M-CSF或M-CSFR表達的核酸分子。通過引用全文納入本文的國際公布號WO2005/068503描述了各種M-CSF拮抗劑的鑒定、產(chǎn)生和修飾。M-CSF抗體可以是多克隆抗體；單克隆抗體；人源化抗體；人抗體；人工程改造抗體；嵌合抗體；Fab、F(ab，)2或Fv抗體片段；或上述任一的突變蛋白。國際公布號WO2005/068503描述了抑制骨質(zhì)溶解的本發(fā)明M-CSF抗體，該份文獻關(guān)于M-CSF抗體的指導(dǎo)通過引用全文納入本文。在一個實施方式中，提供了能與分別具有圖l、3和4所示氨基酸序列的鼠科單克隆抗體RXl、MCI或MC3中任一種的相同M-CSF表位特異性結(jié)合的非鼠科單克隆抗體，包括功能片段。在一相關(guān)實施方式中，提供的上述抗體選自多克隆抗體；單克隆抗體，包括HumanEngineeredTM抗體；人源化抗體；人抗體；嵌合抗體；Fab、F(ab')2;Fv;ScFv或SCA抗體片段；雙特異抗體(diabody);線性抗體；或優(yōu)選保留至少10—7、10—8或10—9或更高結(jié)合親和力的這些抗體中任-種的突變蛋白。還包括與具有圖l所示氨基酸序列的單克隆抗體RX1、MCI和/或MC3競爭結(jié)合超過75%的M-CSF的非鼠科單克隆抗體，包括功能片段。在另一實施方式中，提供了非鼠科單克隆抗體，包括功能片段，其中所述非鼠科單克隆抗體或其功能片段結(jié)合包含圖7所示氨基酸98-105的至少4、5、6、7或8個毗連殘基的M-CSF表位。在另一實施方式中，本發(fā)明提供非鼠科單克隆抗體，包括功能片段，其中所述非鼠科單克隆抗體或其功能片段結(jié)合包含圖7所示氨基酸65-73或138-144的至少4、5、6、7或8個毗連殘基的M-CSF表位(對應(yīng)于5H4或MC3識別的M-CSF表位)。在還有另一實施方式中，提供了結(jié)合包含圖7所示氨基酸98-105的M-CSF表位的上述抗體或片段。在一相關(guān)實施方式中，提供的上述抗體包含圖1A所示CDR3。在另一實施方式中，提供的抗體包含圖1A所示鼠科連同RX1的至少1、2、3、4、5或6個CDR。包含鼠科抗體RX1的至少1、2、3、4或5個CDR的這種抗體還可包含圖8A-B所示抗體5H4的任何6個CDR中至少1、2、3、4或5個CDR?；蛘?，包含鼠科抗體RX1的至少1、2、3、4或5個CDR的這種抗體還可包含圖8A-B所示抗體MC1的任何6個CDR中至少1、2、3、4或5個CDR。在還有另一實施方式中，上述抗體還可包含圖8A-B所示抗體MC3的任何6個CDR中至少1、2、3、4或5個CDR。在一相關(guān)實施方式中，提供的包含鼠科抗體RX1的至少l、2、3、4或5個CDR的抗體可包含圖8A-B所示的共同CDR中至少1、2、3、4或5個CDR。在還有另一相關(guān)實施方式中，在上述抗體中，共有CDR的一個或多個殘基被鼠科抗體RX1、5H4、MC1或MC3的任何CDR的相應(yīng)殘基取代?？梢员Ａ羲杞Y(jié)合親和力，即使抗體中一個或多個氨基酸突變，例如CDR中的保守取代和/或低風(fēng)險或中等風(fēng)險殘基中的保守性或非保守性改變。在本發(fā)明的另一實施方式中，提供的上述抗體的變體包含與圖1A、2、3或4所示氨基酸序列有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同源性的可變重鏈氨基酸序列。在另一實施方式中，所述抗體包含與圖1A、2、3或4所示氨基酸序列有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同源性的可變輕鏈氨基酸序列。在還有另一實施方式中，所述抗體包含人抗體序列的恒定區(qū)與一個或多個重鏈和輕鏈可變框架區(qū)。在一相關(guān)實施方式中，所述抗體包含人IgGl、lgG2、IgG3或IgG4的修飾或未修飾恒定區(qū)。在一優(yōu)選實施方式中，所述恒定區(qū)是人IgGl或IgG4，可任選進行修飾以增強或降低某些特性。以IgGl為例，對恒定區(qū)，特別是絞鏈區(qū)或CH2區(qū)的修飾可增強或降低效應(yīng)物功能，包括ADCC和/或CDC活性。在其它實施方式中，可修飾IgG2恒定區(qū)以減少抗體-抗原凝聚物形成。以IgG4為例，對恒定區(qū)，特別是絞鏈區(qū)的修飾可減少半抗體(haU:antibody)的形成。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供的非鼠科單克隆抗體特異性結(jié)合與國際公布號WO2005/068503所述鼠科抗體RX1、5H4、MC1或MC3中任一種相同的M-CSF表位，或與上述任一種鼠科抗體競爭結(jié)合超過10%、優(yōu)選超過25%、還要更優(yōu)選超過50%、甚至更優(yōu)選超過75%、最優(yōu)選超過90n/。的M-CSF。WO2005/068503描述了衍生自這些鼠科抗體序列的抗體，包括嵌合抗體、人抗體、人源化抗體、人工程改造抗體或它們的片段或突變蛋白或化學(xué)衍生形式。術(shù)語"RXl-衍生抗體"包括保留結(jié)合M-CSF能力的以下任一種1)具有圖1所示氨基酸序列的鼠科抗體RX1的氨基酸變體，包括含有與圖1所示氨基酸序列有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同源性的可變重鏈氨基酸序列，和/或含有與圖1所示氨基酸序列有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同源性的可變輕鏈氨基酸序列的變體，考慮了用于同源性測定的相似氨基酸；2)包含具有圖1所示氨基酸序列的鼠科抗體RX1的一個或多個互補決定區(qū)(CDR)的M-CSF-結(jié)合多肽(排除鼠科抗體RX1)，優(yōu)選包含RX1的CDR3，優(yōu)選包含2個或更多個，或3個或更多個，或4個或更多個，或5個或更多個，或所有6個CDR;3)具有圖9B-12B所示氨基酸序列的HumanEngineeredTM抗體或它們的變體，所述變體包含與圖9B-12B所示原始HumanEngineeredTM重鏈或輕鏈有至少60%氨基酸序列相同性的重鏈或輕鏈，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，包括例如65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%相同;4)包含圖9B-12B所示HumanEngineeredTM抗體的一個或多個CDR的高風(fēng)險殘基的M-CSF結(jié)合多肽(排除鼠科抗體RX1)，優(yōu)選包含2個或更多個，或3個或更多個，或4個或更多個，或5個或更多個，或所有6個CDR的高風(fēng)險殘基；5)保留圖1B所示高風(fēng)險氨基酸殘基，并且在圖1B所示低風(fēng)險或中等風(fēng)險殘基處包含一個或多個改變的HumanEngineeredTM抗體或變體；例如，包含圖1B所示低風(fēng)險殘基處的一個或多個改變和中等風(fēng)險殘基處的保守性取代，或例如，保留圖1B所示中等和高風(fēng)險氨基酸殘基并包含低風(fēng)險殘基處的一個或多個改變，其中的改變包括插入、刪除或取代，并且可以是保守性取代或者可以產(chǎn)生序列更接近人輕鏈或重鏈序列、人種系輕鏈或重鏈序列、共有人輕鏈或重鏈序列、或共有人種系輕鏈或重鏈序列的工程改造抗體。這些抗體優(yōu)選以至少l(T7、1(TS或10力或更高的親和力結(jié)合M-CSF，優(yōu)選能中和M-CSF的破骨細胞產(chǎn)生(osteoclastogenesis)誘導(dǎo)活性。.類似地，術(shù)語"MC3-衍生抗體"包括保留結(jié)合M-CSF能力的以下任一種1)具有圖4所示氨基酸序列的鼠科抗體MC3的氨基酸變體，包括含有與圖4所示氨基酸序列有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同源性的可變重鏈氨基酸序列，和/或含有與圖4所示氨基酸序列有至少60、65、70、75、80、85、卯、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同源性的可變輕鏈氨基酸序列的變體，考慮了用于同源性測定的相似氨基酸；2)包含具有圖4所示氨基酸序列的鼠科抗體MC3的一個或多個互補決定區(qū)(CDR)的M-CSF-結(jié)合多肽(任選包括或排除鼠科抗體MC3)，優(yōu)選包含MC3重鏈的至少(l個)CDR3，優(yōu)選包含2個或更多個，或3個或更多個，或4個或更多個，或5個或更多個，或所有6個CDR;3)按照Studnicka等，美國專利號5,766,886和本文實施例4A所述方法改變鼠科序列產(chǎn)生的HumanEngineeredTM抗體，采用圖13C-13E所示Kabat編號鑒定了低、中等和高風(fēng)險殘基；這些抗體包含至少一個以下重鏈和至少一個以下輕鏈:(a)其中所有低風(fēng)險殘基(如果需要的話)修飾成人參比免疫球蛋白序列的相同殘基的重鏈或(b)其中所有低風(fēng)險和中等風(fēng)險殘基(如果需要的話)修飾成人參比免疫球蛋白序列的相同殘基的重鏈，(c)其中所有低風(fēng)險殘基(如果需要的話)修飾成人參比免疫球蛋白序列的相同殘基的輕鏈或(b)其中所有低風(fēng)險和中等風(fēng)險殘基(如果需要的話)修飾成人參比免疫球蛋白序列的相同殘基的輕鏈；(4)上段(3)中所述抗體的變體，所述變體包含與原始HumanEngi.neeredTM重鏈或輕鏈有至少60%氨基酸序列相同性的璽鏈或輕鏈，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，包括例如65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%相同；5)包含圖4所示鼠科MC3抗體的一個或多個CDR的高風(fēng)險殘基的M-CSF結(jié)合多肽(任選包括或排除鼠科抗體MC3)，優(yōu)選包含2個或更多個，或3個或更多個，或4個或更多個，或5個或更多個，或所有6個CDR的高風(fēng)險殘基；6)保留鼠科MC3抗體的高風(fēng)險氨基酸殘基，并且在低風(fēng)險或中等風(fēng)險殘基處包含一個或多個改變的HumanEngineeredTM抗體或變體；例如，包含低風(fēng)險殘基處的一個或多個改變和中等風(fēng)險殘基處的保守性取代，或例如，保留中等和高風(fēng)險氨基酸殘基并包含低風(fēng)險殘基處的一個或多個改變，其中的改變包括插入、刪除或取代，并且可以是保守性取代或者可以產(chǎn)生序列更接近人輕鏈或重鏈序列、人種系輕鏈或重鏈序列、共有人輕鏈或重鏈序列、或共有人種系輕鏈或重鏈序列的工程改造抗體。這些抗體優(yōu)選以至少10—7、10-s或10力或更高的親和力結(jié)合M-CSF，優(yōu)選能中和M-CSF的破骨細胞產(chǎn)生誘導(dǎo)活性。術(shù)語"5H4-衍生抗體"或"MCl-衍生抗體"根據(jù)上述類似限定。如本文所詳述的，RX1、5H4、MC1或MC3-衍生抗體，包括HumanEngineeredTM抗體或其變體，可以是不同的同種型，例如IgG、IgA、IgM或IgE。IgG類抗體可包含不同的恒定區(qū)，例如可修飾IgG2抗體以展示IgGl或IgG4恒定區(qū)。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供含有修飾或未修飾的IgGl或IgG4恒定區(qū)的HumanEngineeredTM或其變體。以IgGl為例，對恒定區(qū)，特別是絞鏈區(qū)或CH2區(qū)的修飾了增強或降低效應(yīng)物功能，包括ADCC和/或CDC活性。在其它實施方式中，修飾IgG2恒定區(qū)以減少抗體-抗原凝聚物形成。以lgG4為例，對恒定區(qū)，特別是絞鏈區(qū)的修飾可降低半抗體形成。在具體的示范性實施方式中，使IgG4絞鏈序列Cys-Pro-Ser-Cys突變成Cys-Pro-Pro-Cys?？砂凑毡景l(fā)明給予包含任何上述M-CSF拮抗劑或M-CSF抗體和藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的藥物組合物。還優(yōu)選將兩種或更多種M-CSF拮抗劑混合在一起，或共同給予M-CSF拮抗劑和第二抗-破骨細胞劑以增強抗本發(fā)明溶骨性疾病，包括癌癥轉(zhuǎn)移和/或癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)性骨丟失的效力。在本發(fā)明的示范性實施方式中，提供的上述方法中第二抗-破骨細胞劑是二膦酸鹽。在進一步的實施方式中，所述二膦酸鹽是唑來膦酸鹽、帕米膦酸鹽、ft屈膦酸鹽、羥乙磷酸鹽、替魯膦酸鹽、阿倫膦酸鹽、伊班膦酸鹽或利塞膦酸鹽。示范性的其它抗-破骨細胞劑包括::::::::::膦酸鹽、PTHrP中和劑(例如，抗體、反義、siRNA)、組織蛋白酶K抑制劑、MIP-1-a拮抗劑、RANK/RANKL中和劑(例如，抗-RANK抗體、抗-RANKL抗體或反義、可溶性RANKL受體或其突變蛋白)、RANKL疫苗、骨保護素(OPG)、血小板衍生生長因子(PDGF)、src激酶抑制劑、麥芽糖鎵(galliummaltolate)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)抑制劑。本發(fā)明治療方法可與第三治療劑，例如癌癥化療劑或與放療或外科手術(shù)聯(lián)用。癌癥化療劑包括但不限于垸化劑，例如碳鉑或順鉑；氮芥烷化劑；亞硝基脲烷化劑，例如卡莫司汀(BCNU);抗代謝物，例如氨甲蝶呤；嘌呤類似物抗代謝物、巰基嘌呤；嘧啶類似物抗代謝物，例如氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他濱；激素抗瘤劑，例如戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林和他莫昔芬；天然抗瘤劑，例如阿地白介素、白介素-2、多西他賽、依托泊苷(VP-16)、干擾素oc、紫杉醇和維甲酸(ATRA);抗生素性天然抗瘤劑，例如博萊霉素、放線菌素、柔紅霉素、阿霧素和絲裂霉素；和長春花生物堿天然抗瘤劑，例如長春花堿、長春新堿、長春地辛；羥基脲；乙酰葡醛酸內(nèi)酯、阿霉素、異磷酰胺、依諾他濱、表硫雄醇、阿柔比星、安西他濱、尼莫司汀、鹽酸丙卡巴肼、卡波醌、碳鉑、卡莫氟、色霉素A3、抗腫瘤多糖、抗腫瘤血小板因子、環(huán)磷酰胺、裂殖菌多糖、阿糖胞苷、達卡巴嗪、硫代肌苷、塞替派、替加氟、新制癌菌素、OK-432、博萊霉素、氟鐵龍、溴尿苷、白消安、二磷酸己烯雌酚四鈉(honvan)、培洛霉素、貝他定(Bestatin)(烏苯美司)、干-擾素-|3、美雄垸、二溴甘露醇、美法蘭、層粘連蛋白肽、磨茹多糖、雜色革蓋菌(Coriolusversicolor)提取物、替加氟/尿嘧啶、雌莫司汀(雌激素/氮芥)。此外，用于癌癥患者輔助治療的其它藥物包括EPO、G-CSF、更昔洛韋；抗生素、醋酸亮丙瑞林；哌替啶；齊多夫定(AZT);白介素1-18，包括突變體和類似物；千擾素或細胞因子，例如千擾素0t、P和Y;激素，例如促黃體激素釋放激素(LHRH)和類似物及促性腺激素釋放激素(GnRH);生長因子，例如轉(zhuǎn)化生長因子-P(TGF-l3)、成纖維細胞生長因子(FGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、生長激素釋放因子(GHRF)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子同源因子(FGFHF)、肝細胞生長因子(HGF)和胰島素生長因子(IGF);腫瘤壞死因子-a和卩(TNF-a禾卩卩)；侵襲抑制因亍-2(invasioninhibitingfactor-2)(IIF-2);骨形成蛋白l-7(BMP1-7);生長激素抑制素；胸腺素-a-l;Y-球蛋白；超氧化物歧化酶(:SOD);補體因子；抗血管生成因子；抗原性物質(zhì)；前藥；生長因子受體激酶抑制劑；抗-Her2抗體；和VEGF中和抗體。過渡期后，可以降低達到療效所需的M-CSF拮抗劑用量或第二抗-破骨細胞劑用量。因此，在該時期后，M-CSF拮抗劑可提高第二抗-破骨細胞劑的效力，或降低給予第二抗-破骨細胞劑相關(guān)的副作用，或者提高第二抗-破骨細胞劑的安全性。M-CSF拮抗劑還能提高第三治療形態(tài)，例如癌癥化療、其它輔助治療、外科手術(shù)或放療的效力、降低其副作用或提高其安全性。在本發(fā)明的另一實施方式中，提供了裝有藥品和使用說明書的包裝、小瓶或容器，所述藥品包含M-CSF拮抗劑，而所述使用說明書說明了該藥品應(yīng)與第二和/或第三治療劑和/或外科手術(shù)或放療聯(lián)用。預(yù)計許多溶骨性病癥適合于按照本發(fā)明治療。本文所用的"溶骨性病癥"是破骨細胞活性升高導(dǎo)致的任何狀況。具有溶骨性病癥危險的對象可以是易患溶骨性病癥的對象，或患有會導(dǎo)致或促進破骨細胞活性升高的疾病的對象。在本發(fā)明的示范性實施方式中，溶骨性病癥可以是破骨細胞活性相對升高相關(guān)的代謝性骨病，包括內(nèi)分泌病(皮質(zhì)醇增多癥、性腺機能減退、原發(fā)性或繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進、甲狀腺功能亢進)、高鈣血癥、缺乏狀態(tài)(佝僂病/骨軟化癥、壞血病、營養(yǎng)不良)、慢性病(吸收不良綜合征、慢性腎衰竭(腎病性骨營養(yǎng)不良)、慢性肝病(肝性骨營養(yǎng)障礙))、藥物(糖皮質(zhì)激素類(糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥)、肝素、酒精)，以及遺傳性疾病(成骨不全、高胱氨酸尿癥)，癌癥，骨質(zhì)疏松癥、骨硬化癥、與關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的骨炎癥、牙周病、纖維性結(jié)構(gòu)不良和/或佩吉特病。在其它示范性實施方式中，溶骨性病癥可以是骨的轉(zhuǎn)移癌癥，其中所述轉(zhuǎn)移癌癥是乳腺癌、肺癌、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、甲狀腺癌、前列腺癌、腺癌、包括白血病和淋巴瘤在內(nèi)的血細胞惡性腫瘤；頭頸癌；胃腸癌，包括食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、腸癌、結(jié)腸直腸癌、直腸癌、胰腺癌、肝癌、膽管或膽囊的癌癥；雌性生殖道的惡性腫瘤，包括卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、陰道癌或?qū)m頸癌；膀胱癌；腦癌，包括成神經(jīng)細胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；或皮膚癌，包括惡性黑色素瘤或鱗狀上皮細胞癌。在本發(fā)明的示范性實施方式中，任何上述方法可防止或降低骨丟失，或防止或降低骨轉(zhuǎn)移或疾病相關(guān)骨丟失的嚴(yán)重程度。按照本發(fā)明給予的M-CSF抗體可以約2ng/kg-30mg/kg、0.1mg/kg-30mg/kg或0.1mg/kg-10mg/kg體重之間的劑量給予。附圖簡述圖1A顯示了M-CSF特異性鼠科抗體RX1的氨基酸序列(SEQIDNO:2禾口4)(由美國弗吉尼亞州馬納薩斯市美國模式培養(yǎng)物保藏所保藏的質(zhì)粒的cDNA插入物編碼，ATCC保藏號為PTA-6133)以及相應(yīng)的核酸序歹i」(SEQIDNO:l和3)。CDR區(qū)編號以黑體字顯示。圖1B和1C分別顯示了M-CSF特異性鼠科抗體RX1輕鏈(SEQIDNO:5)和重鏈(SEQIDNO:6)的氨基酸序列，其中按照Studnicka等，W093/I1794鑒定了高風(fēng)險(黑體字)、中等風(fēng)險(下劃線)和低風(fēng)險殘基。圖2、3和4分別顯示了M-CSF-特異性鼠科抗體5H4(SEQIDNO:10和11)、MC1(SEQIDNO:12和13)(以ATCC保藏號PTA-6263保藏的雜交瘤產(chǎn)生)和MC3(SEQIDNO:14和15)(以ATCC保藏號PTA-6264保藏的雜交瘤產(chǎn)生)的氨基酸序列。圖5是M-CSFa的氨基酸序列(SEQIDNO:7)。圖6是M-CSF卩的氨基酸序列(SEQIDNO:8)。圖7是M-CSFy的氨基酸序列(SEQIDNO:9)。DNA序列中的許多多態(tài)性可導(dǎo)致氨基酸差異。例如，某種常見的多態(tài)性在104位提供Ala而非Pro。圖8A和B是人M-CSF-特異性鼠科抗體RX1;5H4;MCI;和MC3的重鏈和輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO:16-38)的CDR區(qū)的比對。圖9顯示了(a)鼠科RX1重鏈的風(fēng)險線(riskline)(H=高風(fēng)險、M=中等風(fēng)險、L=低風(fēng)險)，(b)RX1重鏈氨基酸序列(SEQIDNO:6)，(c)與RX1作比對的最接近人共有序列(KabatVh2共有序歹U)的氨基酸序列(SEQIDNO:39)和(d)為產(chǎn)生兩條示范性HumanEngineeredTM序列(SEQIDNO:41和43)而作的改變。圖9B顯示了指定為"低風(fēng)險"和"低+中等風(fēng)險"的兩條示范性重鏈HumanEngineeredTM序列的氨基酸序列(SEQIDNO:41和43)，以及相應(yīng)的核酸序列(SEQIDNO:40和42)。圖10A顯示了(a)鼠科RX1輕鏈的風(fēng)險線(11=高風(fēng)險、M^中等風(fēng)險、L=低風(fēng)險)，(b)RXl輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO:5)，(c)與RXl作比對的最接近人共有序列(KabatVk3共有序列)的氨基酸序列(SEQIDNO:49)和(d)為產(chǎn)生兩條示范性HumanEngineeredTM序列(SEQIDNO:45和47)而作的改變。圖io:B顯示了指定為"低風(fēng)險"和"低+中等風(fēng)險"的兩條示范性輕鏈HumanEngineerecFM序列的氨基酸序列(SEQIDNO:45和47)，以及相應(yīng)的核酸序列(SEQIDNO:44和46)。圖llA顯示了(a)鼠科RX1輕鏈的風(fēng)險線(H^高風(fēng)險，M-中等風(fēng)險、L=低風(fēng)險)，(b)RXl輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO:5)，(c)與RXl作比對的最接近人共有序列(KabatVk3共有序歹(J)的氨基酸序列(SEQIDNO:49)和(d)54-56位未改變的擇一(alternate)示范性氨基酸序列(g卩，保留了鼠科序列)(SEQIDNO:48)。圖11B顯示了兩條示范性擇一輕鏈HumanEngineeredTM序列的氨基酸序列(SEQIDNO:48、87)，以及相應(yīng)的核酸序列(SEQIDNO:88禾l]86)。圖12A顯示了(a)鼠科RX1輕鏈的風(fēng)險線(H,高風(fēng)險、M)中等風(fēng)險、L=低風(fēng)險)，(b)RXl輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO:5)，(c)與R.Xl作比對的最接近人共有種系序列(Vk6亞群2-l-(l)-A14)的氨基酸序列(SEQIDNO:5O)和(d)為產(chǎn)生兩條示范性HumanEngineeredTM序列(SEQIDNO:51和53)而作的改變。圖12B顯示了指定為"低風(fēng)險"和"低+中等風(fēng)險"的兩條示范性輕鏈HumanEngin,eerecFM序列的氨基酸序列(SEQIDNO:51和53)，以及相應(yīng)的核酸序列(SEQIDNO:52)。圖13A和24B顯示了采用Kabat編號系統(tǒng)(成一直線顯示的氨基酸編號指定為"POS")比對鼠科RX1重鏈氨基酸序列(SEQIDNO:54)與各種人共有和人種系共有序列(SEQIDNO:55-83)。圖13C-13E顯示了抗體5H4、MCI禾口MC3的氨基酸殘基如何與Kabat編號系統(tǒng)相對應(yīng)(分別是SEQIDNO:10禾口11;SEQIDNO:12和13;SEQIDNO:14禾口15)。圖14顯示了佐美塔在動物模型中的抗吸收作用。圖15顯示了各組中具有可檢測骨質(zhì)溶解的動物百分比。圖16顯示了在該項研究的最后一天依據(jù)x-射線圖像分析的平均骨質(zhì)溶解評分。圖17顯示了該項研究最后一天的代表性脛骨Faxitronx-射線圖像(腫瘤接種部位)。箭頭表示骨質(zhì)溶解部位。圖18顯示了RX1對破骨細胞活性的作用。圖19顯示了佐美塔對破骨細胞活性的抑制作用。圖20顯示了RX1在靈長類動物中的藥代動力學(xué)研究結(jié)果。圖21顯示了RX1在靈長類動物中的藥代動力學(xué)研究結(jié)果。詳述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)也稱為巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)的集落刺激因子(CSF-l)對于破骨細胞形成至關(guān)重要。此外，M-CSF顯示能與其它可溶性因子協(xié)作調(diào)節(jié)成熟破骨細胞的破骨功能、它們的遷移和存活，以及成骨細胞和成纖維細胞提供的細胞-細胞相互作用(Fixe禾[lPraloran，Cytokine10:3-7，1998;Martin等，CriticalRev.inEukaryoticGeneExpression8:107-23(1998))。全長人M-CSPmRNA編碼554個氨基酸的前體蛋白。通過另路mRNA剪接和差異翻譯后蛋白酶解加工，M-CSF可以作為糖蛋白或含蛋白多糖的硫酸軟骨素分泌入循環(huán)系統(tǒng)，或者表達成M-CSF產(chǎn)生細胞表面的跨膜糖蛋白。細菌表達的人M-CSF氨基末端150個氨基酸(完全體外生物學(xué)活性所需的最小序列)的三維結(jié)構(gòu)表明該蛋白質(zhì)是二硫鍵連接的二聚體，其中各單體由4個a螺旋束和反平行P片層構(gòu)成(Pandit等，Science258:1358-62(1992))。通過另路mRNA剪接產(chǎn)生了三種不同的M-CSF。三種多肽前體是256個氨基酸的M-CSFa、554個氨基酸的M-CSFP和438個氨基酸的M-CSFpM-CSF(3是不以膜結(jié)合形式產(chǎn)生的分泌蛋白。M-CSFa表達成通過蛋白酶解切割緩慢釋放的膜內(nèi)在蛋白。M-CSFa在圖5所示序列的氨基酸191-197處切割。M-CSF的膜結(jié)合形式能與鄰近細胞上的受體相互作用，因此能介導(dǎo)特異性細胞-細胞相互作用。術(shù)語"M-CSF"還可包括圖7所示氨基酸36-438。各種形式的M-CSF通過與其靶細胞上的受體M-CSFR結(jié)合而起作用。M-CSFR是具有5個胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、1個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個胞內(nèi)間斷Src相關(guān)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的跨膜分子。C->w原癌基因編碼M-CSFR。M-CSF與M-CSFR的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合導(dǎo)致受體二聚化，從而活化了胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域，進而造成其它細胞蛋白的自磷酸化和磷酸化(HamiltonJ.A.，JLeukocBiol.，62(2):145-55，1997;HamiltonJ，A.，ImmunoToday.，18(7):313-7,1997)。磷酸化的細胞蛋白誘導(dǎo)生物化學(xué)事件的級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致以下細胞反應(yīng)有絲分裂、細胞因子分泌、膜褶皺和調(diào)節(jié)其自身受體轉(zhuǎn)錄的(Fixe和Praloran，Cytokine10:32-37，1998)。本文所用的"腫瘤"指所有無論是惡性或良性的贅生細胞生長和增殖以及所有癌前和癌性細胞和組織。術(shù)語"癌癥"和"癌性"是指或描述哺乳動物中通常以細胞生長不受調(diào)節(jié)為特征的生理狀況。癌癥的例子包括但不限于癌；淋巴瘤，母細胞瘤，肉瘤和白血病。這些癌癥的更具體例子包括乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、鱗狀上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝臟癌癥、膀胱癌、肝癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、腎癌、肝臟癌癥、肛門癌、甲狀腺癌、肝癌和各種類型的頭頸癌。"治療"是以防止疾病的發(fā)生或改變疾病病狀為意圖而進行的干預(yù)。因此，"治療"同時指治療性治療和預(yù)防性或防御性措施。需要治療的對象包括已患病的對象以及需要預(yù)防疾病的對象。在腫瘤(例如，癌癥)治療中，治療劑可直接減輕腫瘤細胞的病狀，或使腫瘤細胞對其他治療劑如放療和/或化療的治療更敏感。癌癥的"病狀"包括損害患者健康的所有情況。這包括，但不限于；異常或不可控制的細胞生長、轉(zhuǎn)移、干擾相鄰細胞的正常功能、釋放水平異常的細胞因子或其它分泌產(chǎn)物、抑制或加重炎癥或免疫反應(yīng)，等等。就治療目的而言，"哺乳動物"指歸類為哺乳動物的任何動物，包括人，家養(yǎng)和農(nóng)用動物，以及動物園動物(zooanimal)、運動動物(sportsanimal)和寵物，如狗、馬、貓、母牛等。所述哺乳動物優(yōu)選人。本文所用的短語"轉(zhuǎn)移性癌癥"定義為有可能擴散到身體其他區(qū)域、尤其是骨中的癌癥。許多癌癥都可轉(zhuǎn)移到骨中，但最常見的轉(zhuǎn)移性癌癥是乳腺癌、肺癌、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、甲狀腺癌和前列腺癌。例如，有可能轉(zhuǎn)移到骨中的其它癌癥包括但不限于腺癌，血細胞惡性腫瘤，包括白血病和淋巴瘤；頭頸癌；胃腸癌，包括食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、腸癌、結(jié)腸直腸癌、直腸癌、胰腺癌、肝癌、膽管或膽囊的癌癥；雌性生殖道的惡性腫瘤，包括卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、陰道癌和宮頸癌；膀胱癌；腦癌，包括成神經(jīng)細胞瘤；肉瘤，骨肉瘤；以及皮膚癌，包括惡性黑色素瘤和鱗狀上皮細胞癌。本發(fā)明尤其包括預(yù)防和治療腫瘤誘導(dǎo)的溶骨性骨損傷。本文所用的短語"治療有效量"指當(dāng)按照所需治療方案給藥時將引起所需治療性或預(yù)防性效力或反應(yīng)的適合本發(fā)明實施方式的治療性或原發(fā)性M-CSF拮抗劑，例如M-CSF抗體的用量。本文所用的人"M-CSF"指具有與以下文獻所述的成熟人M-CSFa、M-CSFP或M-CSFY多肽基本相同的氨基酸序列的人多肽Kawasaki等，Science230:291(1985)，Cerretti等，MolecularImmunology,25:761(1988)，或Ladner等，EMBOJournal6:2693(1987)，各文獻通過引用納入本文。如上所述，該術(shù)語反映出，這三種成熟的M-CSF具有不同氨基酸序列，且M-CSF的活性形式是二硫鍵連接的二聚體；因此，當(dāng)術(shù)語"M-CSF"指表示生物活性形式時指二聚體形式。"M-CSF二聚體"指已經(jīng)二聚化的兩個M-CSF多肽單體，同時包括同型二聚體(由兩個相同類型的M-CSF單體構(gòu)成)和雜二聚體(由兩個不同單體構(gòu)成)。如通過引用納入本文的美國專利4,929,700所述，可在體外將M-CSF單體轉(zhuǎn)變成M-CSF二聚體。1.拮抗劑本文所用的術(shù)語"拮抗劑"通常指例如，分子、化合物或其它藥物通過空間位阻、構(gòu)型改變或其它生物化學(xué)機制以干擾一種分子與另一種分子的結(jié)合或干擾另一種細胞對一種細胞的刺激的特性。在這點上，術(shù)語"拮抗劑"涉及某藥物防止受體與其配體結(jié)合例如M-CSF與M-CSFR結(jié)合的特性，從而抑制M-CSF觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。術(shù)語"拮抗劑"不局限于任何具體的作用機制，而是泛泛地指本文所述的功能特性。本發(fā)明的拮抗劑包括但不限于M-CSF抗體及其片段和突變蛋白和修飾物，可溶性M-CSF及其片段和突變蛋白和修飾物，M-CSFR抗體及其片段和突變蛋白和修飾物，可溶性M-CSFR及其片段和突變蛋白和修飾物，能結(jié)合M-CSF或M-CSFR的肽和其它化合物及分子，以及能抑制M-CSF和M-CSFR表達的核酸分子，例如反義或RNAi化合物?？梢员绢I(lǐng)域已知的任何方式給予本發(fā)明的任何拮抗劑。例如，可經(jīng)由基因治療給予能結(jié)合M-CSF或M-CSFR的M-CSF突變蛋白、M-CSFR突變蛋白或抗體片段。如果適用，本發(fā)明的M-CSF拮抗劑包括功能等價物。例如，分子的長度、結(jié)構(gòu)、組成等可能不同，但仍保留了一種或多種所述功能。更具體地說，本發(fā)明的抗體、抗體片段或肽的功能等價物可包括模擬化合物，即設(shè)計以模擬抗原結(jié)合的適當(dāng)構(gòu)型和/或取向的構(gòu)建物。可通過加入側(cè)基團等，例如通過氨基末端?；?、羧基末端酰胺化或通過使其它基團與氨基酸側(cè)鏈偶聯(lián)來任選修飾優(yōu)選的M-CSF拮抗劑。拮抗劑還可包含一個或多個保守型氨基酸取代。"保守性氨基酸取代"表示氨基酸序列中保留被取代氨基酸的總體電荷、疏水性/親水性和/或空間體積的那些改變。例如，以下基團之間的取代是保守性的Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Asp/Glu、Lys/Arg、Asn/Gln、Ser/Cys/Thr、禾l]Phe/Trp/Tyr。這些修飾不會實質(zhì)性降低M-CSF拮抗劑的效力，還可賦予所需特性，例如延長體內(nèi)半紫期或降低毒性。本發(fā)明還應(yīng)包括攜帶除插入、刪除或取代以外的氨基酸殘基修飾的多肽。例如，在本質(zhì)上所述修飾可以是共價的，包括，例如與聚合物、脂質(zhì)、其它有機和無機部分的化學(xué)鍵合?？芍苽溥@些衍生物以延長多肽的循環(huán)半衰期，或可設(shè)計這些衍生物以改善多肽對于所需細胞、組織或器官的靶向能力。類似地，本發(fā)明還包括經(jīng)共價修飾從而包含一個或多個水溶性聚合物附加物，例如聚乙二醇、聚氧乙烯甘油或聚丙二醇的M-CSF或M-CSFR多肽。A.M-CSF抗體術(shù)語"抗體"以最廣泛的含義使用，包括完全裝配的抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、能結(jié)合抗原的抗體片段(例如，F(xiàn)ab，、F，(ab)2、Fv、單鏈抗體、雙特異抗體(diabody))、和包括上述抗體的重組肽，只要它們具有所需生物學(xué)活性。本文所用的術(shù)語"單克隆抗體"指從基本上均質(zhì)的抗體群(即除了可能存在少量天然產(chǎn)生的突變外，構(gòu)成該群體的單個抗體相同)中獲得的抗體。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個抗原性位點。此外，與通常包括針對不同決定子(表位)的不同抗體的傳統(tǒng)(多克隆)抗體制品相反，各單克隆抗體針對抗原上的單一決定子。除了它們的特異性，單克隆抗體的優(yōu)點在于可通過均質(zhì)培養(yǎng)(homogeneousculture)合成它們，不會受具有不同特異性和特征的其它免疫球蛋白污染。修飾語"單克隆"表示該抗體的特征為獲自基本均質(zhì)的抗體群，不能解釋為要求通過任何特定方法產(chǎn)生抗體。例如，可通過最先由Kohler等(Nature,256:495[1975])描述的雜交瘤方法，或重組DNA法(參見，例如，美國專利4，816，567)制備本發(fā)明所用的單克隆抗體。還可采用例如Clackson等(Nature，352:624628[1991])和Marks等(J.Mol.Biol.，222:581-597(1991))描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離"單克隆抗體"。免疫球蛋白可根據(jù)它們重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列分成不同類別。主要有五類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中幾類還可分成亞類或同種型，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl禾[]IgA2。對應(yīng)于不同類別免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱為ot、S、s、7和^1。不同類別的免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。不同同種型具有不同的效應(yīng)物功能；例如IgGl和IgG3同種型具有ADCC活性。"抗體片段"包含完整的全長抗體的一部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙特異抗體；線形抗體(Zapata等，ProteinEng.，8(10):1057-1062(1995));單鏈抗體分子;和抗體片段形成的多特異性抗體。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個稱為"Fab"片段的相同的抗原結(jié)合片段和殘留的"Fc"片段，兩個"Fab"片段各具有一個抗原結(jié)合位點，而"Fc"片段的名稱反映出其易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生具有兩個"單鏈Fv"的F(ab')2片段或包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域的"sFv"抗體片段，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈中。Fv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含能使Fv形成抗原結(jié)合所需結(jié)構(gòu)的多肽接頭。sFV的綜述參見Pluckthun，刊于《單克隆抗體藥理學(xué)》(ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies),第113巻，Rosenburg禾UMoore編，S-V公司(Springer-Vedag)，紐約，第269-315頁，(1994)。術(shù)語"超變"區(qū)指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體氨基酸殘基。超變區(qū)包含CDR的互補決定區(qū)的氨基酸殘基[即，如Kabat等，《免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)序列》(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)，第五版，公共衛(wèi)生月艮.務(wù)部(PublicHealthService),國家衛(wèi)生研究院，貝塞斯達(Bethesda)，馬里蘭州，(1991)所述，輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)和重鏈可變區(qū)中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)]和/或重鏈可變區(qū)中超變環(huán)的那些殘基(即，如Choth.ia等，J.Mol.Biol..196:卯1,917(1987)所述，輕鏈可變區(qū)的殘基26-32(Ll)、50-52(L2)和91-96(L3)和1t鏈可變區(qū)的26-32(Hl)、53-55(H2)和96誦101(H3)。"框架"或FR殘基是除超變區(qū)殘基以外的那些可變區(qū)殘基。術(shù)語"雙特異抗體"指含兩個抗原結(jié)合位點的小抗體片段，所述片段將相連的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)包含在同一多肽鏈中(VHVL)。利用因太短而不能使同一鏈的兩個結(jié)構(gòu)域之間配對的接頭，可迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一鏈的合并結(jié)構(gòu)域配對，從而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。例如，EP404,097;WO93/11161;和30Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卯:6444-6448(1993)更詳細地描述了雙特異抗體。在一些實施方式中，優(yōu)選產(chǎn)生多特異性(例如，雙特異性)單克隆抗體，包括對至少兩種不同表位具有結(jié)合特異性的單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、HumanEngineerecFM或抗-M-CSF抗體變體。示范性的雙特異性抗體可以結(jié)合M-CSF的兩種不同表位?；蛘?，可將抗-M-CSF臂與結(jié)合白細胞上觸發(fā)分亍，例如T-細胞受體分亍(如CD2或CD3)、或IgG的Fc受體(Fc"/R)，如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRin(CD16)的臂結(jié)合，從而使細胞防御機制對準(zhǔn)M-CSF-表達細胞。還可利用雙特異性抗體將細胞毒性劑固定于表達M-CSF的細胞。這些抗體具有M-CSF-結(jié)合臂和結(jié)合細胞毒性劑(例如，皂:草素(sapodn)、抗-千擾素-60、長春花生物堿、蓖麻毒蛋白A鏈、氨曱蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂?？蓪㈦p特異性抗體制備成全長抗體或抗體片段(例如，F(xiàn)(ab')2雙特異性抗體)。按照制備雙特異性抗體的另一種方法，可工程改造一對抗體分子之間的界面以盡可能提高從重組細胞培養(yǎng)液中回收的雜二聚體百分比。優(yōu)選的界面包括抗體恒定區(qū)的Ch3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在該方法中，第一抗體分子的界面的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈被較大側(cè)鏈(例如，酪氨酸或色氨酸)取代。通過用較小的氨基酸側(cè)鏈(例如，丙氨酸或蘇氨酸)取代大氨基酸側(cè)鏈在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與上述大側(cè)鏈相同或相似大小的補償"空腔"。如此提供的機制能提高雜二聚體的產(chǎn)量，從而超過不良終產(chǎn)物，例如同二聚體。參見1996年9月6日公布的WO96/27011。雙特異性抗體包括交聯(lián)或"雜偶聯(lián)物"抗體。例如，雜偶聯(lián)物中的抗體之一可以與抗生物素蛋白偶聯(lián)，另一個可與生物素偶聯(lián)?？刹捎贸Ｒ?guī)交聯(lián)方法制備雜偶聯(lián)物抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域熟知的，美國專利號4,676,980披露這些交聯(lián)劑以及許多交聯(lián)技術(shù)。參考文獻中還描述了從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可采用化學(xué)連接制備雙特異抗體。Brennan等，Science229:81(1985)描述了將完整的抗體酶解切割以產(chǎn)生F(ab，)2片段的方法。在二巰基化物絡(luò)合劑亞砷酸鈉存在下還原這些片段以穩(wěn)定鄰近的二巰基化物并防止分子內(nèi)二硫鍵形成。然后將形成的Fab，片段轉(zhuǎn)化成硫代硝基苯甲酸(thionitrobenzoate)(TNB)衍生物。然后用巰基乙胺還原將一種Fab，-TNB衍生物再次轉(zhuǎn)化成Fab'-硫醇，與等摩爾量的另一Fab，-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體?？蓪a(chǎn)生的雙特異性抗體用作選擇性固定酶的物質(zhì)。在還要進一步的實施方式中，可體外化學(xué)偶聯(lián)從大腸桿菌中直接回收的Fab，-SH片段，從而形成雙特異性抗體。(Shalaby等，J.Exp.Med.175:217-225(1992》Shalaby等，J.Exp.Med.175:217-225(1992)描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab，)2分子的產(chǎn)生。大腸桿菌分別分泌各Fab，片段，將這些片段在體外直接化學(xué)偶聯(lián)，從而形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能結(jié)合過度表達HER2受體的細胞和正常細胞，以及觸發(fā)人細胞毒性淋巴細胞針對人乳腺腫瘤耙細胞的裂解活性。直接從重組細胞培養(yǎng)液中制備和分離雙特異性抗體片段的技術(shù)現(xiàn)已見諸描述。例如，已利用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體(Kostelny等，J.Immunol.148(5):1547-1553(1992))?？赏ㄟ^基因融合將Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽以連接于兩種不同抗體的Fab，部分。可還原抗體二聚體的絞鏈區(qū)以形成單體，然后重新氧化以形成抗體雜二聚體。還可采用該方法產(chǎn)生抗體同二聚體。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)所述的"雙特異抗體"技術(shù)提供了制備雙特異性抗體片段的另一機制。這些片段包含通過接頭相連的重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(vl)，所述接頭因太短而不能使同一鏈的兩個結(jié)構(gòu)域之間形成配對。因而迫使一個片段的Vh和VL結(jié)構(gòu)域與另一片段的互補V[,和VH結(jié)構(gòu)域配對，從而形成兩個抗原結(jié)合位點。利用單鏈Fv(sFV)二聚體制備雙特異性抗體片段的另一種方法也已見諸報道。參見Gruber等，J.Immunol.152:5368(1994)?；蛘撸p特異性抗體可以是如Zapata等，ProteinEng.8(10):1057-1062(1995)所述產(chǎn)生的"線形抗體"。簡言之，這些抗體包含一對串聯(lián)的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，這些片段形成----對抗原結(jié)合區(qū)。線形抗體可以是雙特異性或單特異性的。還包括兩價以上的抗體。例如，可制備三特異性抗體。(Tutt等，J.Immunol.147:60(1991))。在某些實施方式中，單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、HumanEngineeredTM或抗-M-CSF抗體變體是抗體片段，例如RX1、5H4、MC1或MC3抗體片段?，F(xiàn)已開發(fā)了各種技術(shù)來產(chǎn)生抗體片段。一般通過蛋白酶解消化完整的抗體來衍生這些片段(參見，例如Morimoto等，JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992)禾口Bre廳n等，Science229:81(1985))。然而，目前可利用.璽組宿主細胞直接產(chǎn)生這些片段。Better等，Science240:1041-1043(1988)披露了細菌分泌功能抗體片段(參見，例如Better等，Skerra等，Science240:1038-1041(1988))。例如，可從大腸桿菌中直接回收Fab'-SH片段，將其化學(xué)偶聯(lián)從而形成F(ab')2片段(Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992))。在另一實施方式中，利用亮氨酸拉鏈GCN4形成F(ab')2以促進F(ab')2分子裝配。按照另一種方法，可以從重組細胞培養(yǎng)液中直接分離Fv、Fab或F(ab')2片段。技術(shù)人員知道產(chǎn)生抗體片段的其它技術(shù)。"分離的"抗體是經(jīng)鑒定和分離并從其天然環(huán)境組分中回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性組分是會干擾該抗體的診斷或治療應(yīng)用的物質(zhì)，包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方式中，將抗體純化至(l)以抗體的重量計，羅氏蛋白定量法(Lowrymethod)測定到大于95。/。，最優(yōu)選大于99重量％，(2)利用自旋杯式測序儀(spinningcupsequenator)純化至足以獲得內(nèi)部氨基酸序列或N-末端的至少15個殘基的程度，或(3)利用考馬斯藍，或優(yōu)選銀染色，通過還原或非還原條件下的SDS-PAGE純化至均勻。分離的抗體包括重組細胞內(nèi)原位的抗體，因為該抗體的天然環(huán)境的至少一種成分不存在。然而，一般通過至少一步純化步驟制備分離的抗體?？贵w的結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生的詳述參見通過引用全文納入本文的Roth，D.:B.和Craig，N丄.，Cell,94:411-414(1998)和樊國專利號6，255，458。簡言之，產(chǎn)生編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因的DNA的過程主要發(fā)生在正發(fā)育的B-細胞中。發(fā)現(xiàn)V、D、J和恒定區(qū)(C)基因區(qū)段通常先位于-個染色體上較接近之處，再發(fā)生各種免疫球蛋白基因區(qū)段的重排和連接。在B-細胞分化期間，V、D、J(或在輕鏈基因的情況|:]只有V和J)基因區(qū)段的合適家族成員各自重組以形成功能性重排的重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因。該基因區(qū)段重排過程看來是順次的。首先，進行重鏈D-J連接，然后進行重鏈V-DJ連接和輕鏈V-J連接。側(cè)接重組感受態(tài)V、D和J區(qū)段的重組信號序列(RSS)介導(dǎo)各區(qū)域基因區(qū)段的重組以形成功能性重鏈和輕鏈可變區(qū)。RSS必需且足以指導(dǎo)重組，其包含二重對稱(dyad-symmetric)七聚體、富含AT的九聚體和12或23個堿基對的間插間隔子區(qū)。這些信號在進行D-J(或V-J)重組的不同基因座和物種之間保守并且在功能上可互換。參見Oettinger等，(1990)，Science,248，1517-1523和其中引用的參考文獻。七聚體包含序列CACAGTG或其類似物，其后是不保守序列的間隔子，然后是具有序列ACAAAAACC的九聚體或其類似物。在各V和D基因區(qū)段的J，或F游側(cè)發(fā)現(xiàn)這些序列。緊鄰種系D和J區(qū)段之前仍是兩條重組信號序列，仍舊為不保守序列隔開的第一條九聚體和第二條七聚體。V。Vh或D區(qū)段后七聚體和九聚體序列和與之重組的J。D或Jh區(qū)段之前序列的互樸。七聚體和九聚體序列之間的間隔子的長度可以是12個堿基對或22-24個堿基對。除了V、D和J區(qū)段的重排，借助輕鏈中V和J區(qū)段連接位置和重鏈中D和J區(qū)段連接位置處的可變重組，可在一級免疫球蛋白重鏈和輕鏈庫中產(chǎn)生其它多樣性。輕鏈中的這種變化通常發(fā)生在V基因區(qū)段的最后一個密碼子和J區(qū)段的第一的密碼子中。連接中的類似不精確性發(fā)生在D和jh區(qū)段之間的重鏈染色體上，并可延伸最多10個核苷酸。此外，可在D和Jh之同以及Vh和D基因區(qū)段之間插入幾個不由基因組DNA編碼的核苷酸。加入這些核苷酸稱為N-區(qū)多樣性(N-regiondiversity)?？勺儏^(qū)基因區(qū)段中的這種重排和在這種連接期間可發(fā)生的可變重組的凈效應(yīng)(neteffect)是產(chǎn)生了一級抗體庫。"Fv"是含有完整的抗原識別和結(jié)合位點的最小抗體片段。該區(qū)域由一個重鏈和一個輕鏈可變區(qū)的緊密、非共價結(jié)合二聚體構(gòu)成。各可變區(qū)的三個CDR就是以此構(gòu)型相互作用，從而在VHV1二聚體的表面確定了抗原結(jié)合位點。六個CDR在整體上賦予抗體抗原結(jié)合特異性。然而，即使一個可變區(qū)(或只含有3個抗原特異性CDR的半個Fv)也能識別并結(jié)合抗原，雖然親和力低于完整的結(jié)合位點。Fab片段還含有輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CHl)。Fab片段與Fab'片段的不同之處是在包含一個或多個抗體絞鏈區(qū)半胱氨酸的重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端加入了少許殘基。本文將Fab，-SH指定為其中恒定區(qū)的一個或多個半胱氨酸殘基攜帶游離巰基的Fab，。F(ab')2抗體片段最初制備成之間具有絞鏈半胱氨酸的一對Fab'片段。"中和抗體"表示能消除或明顯降低與之結(jié)合的靶抗原的效應(yīng)物功能的抗體分子。因此，"中和"抗-靶標(biāo)抗體能消除或明顯降低效應(yīng)物功能，例如酶活性、配體結(jié)合或胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本文提供的用于治療癌癥轉(zhuǎn)移和/或癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)性骨丟失的組合物和方法可單用一種或多種抗體或可與其它治療劑聯(lián)用以實現(xiàn)所需作用?？蓮囊蚪佑|環(huán)境抗原或用該抗原免疫接種而產(chǎn)生抗體的動物中分離本發(fā)明抗體?；蛘撸衫帽绢I(lǐng)域熟知的抗體表達系統(tǒng)之一，通過重組DNA方法產(chǎn)生抗體(參見，例如Harlow和Lane，《抗體實驗室手冊》(Antibodies:ALaboratoryManual),冷泉港實驗室(ColdSpringHarborLaboratory)(1988))。這些抗體可包括重組IgG、具有免疫球蛋白衍生序列的嵌合型融合蛋白或"HumanEngineered"抗體，根據(jù)本發(fā)明這些抗體均可用于治療癌癥轉(zhuǎn)移和/或癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)性骨丟失。除了完整的全長分子外，術(shù)語"抗體"還指其片段(例如，scFv、Fv、Fd、Fab、Fab'和F(ab)'2片段)或能結(jié)合M-CSF(或M-CSFR)的完整分子和片段的多聚體或凝聚體。這些抗體片段能結(jié)合抗原，并可經(jīng)衍生，例如通過摻入半乳糖殘基而表現(xiàn)出促進清除和攝取的結(jié)構(gòu)特征。在本發(fā)明的一個實施方式中，可基本上如通過引用納入本文的Halenbeck等，美國專利號5，491，065(997)所述制備M-CSF單克隆抗體。示范性M-CSF單克隆抗體包括與重組或天然二聚M-CSF相關(guān)表觀構(gòu)型表位結(jié)合并伴有中和生物活性的那些抗體。這些抗體基本上不與生物學(xué)無活性形式的M-CSF，包括單體和化學(xué)衍生的二聚體M-CSF反應(yīng)。在本發(fā)明的其它實施方式中，提供了HumanEngineeredTM抗-M-CSF單克隆抗體。短語"HumanEngineeredTM抗體"指衍生自非人抗體，通常是小鼠單克隆抗體的抗體?；蛘?，HumanEngineeredTM抗體可衍生自保留或基本...i::保留了親代非人抗體的抗原結(jié)合特性，但與親代抗體相比，在給予人后顯示免疫原性降低的嵌合抗體。本文所用的短語"嵌合抗體"指含有衍生自兩種不同抗體的序列的抗體(參見，例如樊國專利號4,816,567)，而所述兩種抗體通常源自不同物種。最常見的嵌合抗體含有人和小鼠抗體片段，通常是人恒定區(qū)和小鼠可變區(qū)。短語"互補決定區(qū)"或術(shù)語"CDR"指整體決定天然免疫球蛋白結(jié)合位點的天然Fv區(qū)域的結(jié)合親和力和特異性的氨基酸序列(參見，例如Chothia等，J.Mol.Biol.196:901917(1987);Kabat等，樊國衛(wèi)生與人類服務(wù)部NIH出版號(U.S.Dept.ofHealthandHumanServicesNIHPublicationNo.)913242(1991))。短語"恒定區(qū)"指抗體分子中賦予效應(yīng)物功能的部分。在本發(fā)明中，小鼠恒定區(qū)優(yōu)選被人恒定區(qū)取代。所述抗體的恒定區(qū)衍生自人免疫球蛋白。重鏈恒定區(qū)可選自以下5種同種型中的任一種a、S、s、y或P。如果本發(fā)明抗體與抗原結(jié)合的Ka大于或等于約106M—、優(yōu)選大于或等于約10"M"、更優(yōu)選大于或等于約108M—'、最優(yōu)選大于或等于約109M—'、1010M—'、10"M"或10"M—1，則稱其具有免疫特異性或能特異性結(jié)合。抗-M-CSF抗體可結(jié)合M-CSF的不同天然形式，包括宿主/對象的組織表達以及腫瘤表達的。本文披露的單克隆抗體，例如RX1、5H4、MCI或MC3抗體對M-CSF具有親和力，這些抗體的特征在于解離平衡常數(shù)(Kd)至少是1(T4M、優(yōu)選至少約10-7M至約1(T8M、更優(yōu)選至少約10-8M、1(T1()M、l(T11M或1(T12M。采用常規(guī)技術(shù)不難測定這種親和力，例如通過平衡透析；采用生產(chǎn)商概述的通用方法，利用BIAcore2000儀器；利用125I標(biāo)記的M-CSF進行放射性免疫測定；或采用技術(shù)人員已知的另一種方法?？煞治鲇H和力數(shù)據(jù)，例如通過Scatchard等，AnnN.Y.Acad.Sci.，51:660(1949)所述的方法。因此，優(yōu)選的M-CSF抗體對M-CSF表現(xiàn)出的特異性程度明顯高，而與其它分子結(jié)合的親和力基本上較低。優(yōu)選的抗體與M-CSF結(jié)合的親和力類似于圖4所示鼠科RX1與M-CSF結(jié)合的親和力，表現(xiàn)出低免疫原性并在轉(zhuǎn)移性疾病動物模型中測試時能抑制癌細胞轉(zhuǎn)移。其它示范性抗體與M-CSF結(jié)合的親和力類似于如圖2、3或4分別所示的鼠科5H4、MCI或MC3與M-CSF結(jié)合的親和力。用于產(chǎn)生抗體的抗原可以是，例如保留所需表位的完整M-CSF或M-CSF片段(任選與另一多肽融合)，從而能以其天然構(gòu)型展示該表位。或者，可利用在其表面表達M-CSF的細胞產(chǎn)生抗體?？赊D(zhuǎn)化這些細胞以表達M-CSF，或者這些細胞可以是表達M-CSF的其它天然細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可用于產(chǎn)生抗體的M-CSF的其它形式。i.多克隆抗體優(yōu)選通過多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑而在動物種產(chǎn)生多克隆抗體?？衫秒p功能試劑或衍生化試劑(derivatizingagent),例如馬來酰亞氨基苯甲?；腔牾啺孵?maleimidobenzoylsulfosuccinimideester)(通過半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐或本領(lǐng)域已知的其它試劑，將相關(guān)抗原與在待免疫動物中有免疫原性的蛋白質(zhì)，例如匙孔蜮血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑偶聯(lián)來增強抗體應(yīng)答。通過混合，例如IOO)ig或5iig蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別對于家兔或小鼠)與3體積的完全弗氏佐劑并將該溶液經(jīng)真皮內(nèi)注射至多個部位，從而用抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫動物。一個月后，通過將1/5到1/10初始量的完全弗氏佐劑配制肽或偶聯(lián)物皮下注射至多個部位來加強免疫動物。在加強注射后7-14天，采集動物血液，檢驗血清的抗體滴度。加強免疫動物直至滴度達到峰值。優(yōu)選用抗原相同，但與不同蛋白質(zhì)和/或經(jīng)不同的交聯(lián)劑偶聯(lián)的偶聯(lián)物加強免疫動物。還可在重組細胞培養(yǎng)液中將偶聯(lián)物制備成融合蛋白。還可適當(dāng)?shù)赜媚埤Rl」(aggregatingagent)，例如明礬增強免疫應(yīng)答。ii.單克隆抗體可采用最先由Kohler等(Nature，256:495(1975))描述的雜交瘤方法，或重組DNA法制備單克隆抗體。在雜交瘤方法中，如本文所述免疫小鼠或其他合適宿主動物，如倉鼠或獼猴以引發(fā)淋巴細胞產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生特異性結(jié)合免疫接種所用蛋白質(zhì)的抗體?；蛘?，可在體外免疫淋巴細胞。然后用合適的融合劑如聚乙二醇使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成雜交瘤細胞(Goding，《單克隆抗體原則和實踐》(MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice)，第59-103頁(學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress),1986))。將如此制備的雜交瘤細胞接種到合適的培養(yǎng)基上并使其生長，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有一種或多種能抑制未融合的親代骨髓瘤細胞生長或存活的物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則雜交瘤的培養(yǎng)基通常將包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)能阻止HGPRT-缺陷型細胞生長。優(yōu)選的骨髓瘤細胞是那些有效融合的、支持選出的抗體產(chǎn)生細胞以高水平穩(wěn)定產(chǎn)生抗體的、并對培養(yǎng)基敏感的細胞。用人骨髓瘤和小鼠-人雜骨髓瘤細胞系來產(chǎn)生人單克隆抗體也己見諸描述(Kozbor，J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等，《單克隆抗體的制造技術(shù)和應(yīng)用》(MonoclonalAntibodiesProductionTechniquesandApplications),第51-63頁(紐約MD有限公司(MarcelDekker，Inc.,NewYork),1987))。示范性鼠科骨髓瘤系包括那些可獲自美國加利福尼亞州圣迭戈市索爾克研究所細胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego，Calif.USA)的衍生自MOP-21和M.C.-ll小鼠腫瘤的細胞系以及可獲自美國馬里蘭州羅克維爾美國模式培養(yǎng)物保藏所(AmericanTypeCultureCollection,Rockville，Md.USA)的SP-2或X63-Ag8-653細胞。檢驗生長雜交瘤細胞的培養(yǎng)基產(chǎn)生針對抗原的單克隆抗體的情況。優(yōu)選通過免疫沉淀反應(yīng)或通過體外結(jié)合試驗，如放射免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)來測定雜交瘤細胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性。例如，可通過Scatchard分析(Munson等，Anal.Biochem.，107:220(1980))來測定單克隆抗體的結(jié)合親和力。鑒定出能產(chǎn)生具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，可通過有限稀釋法對克隆進行亞克隆并在通過標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)(Goding，《單克隆抗體原則和實踐》，第59-103頁(學(xué)術(shù)出版社，1986))。用于該目的的合適培養(yǎng)基包括*例如，D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，可將雜交瘤細胞作為腹水腫瘤在動物體內(nèi)培養(yǎng)。亞克隆分泌的單克隆抗體適合通過諸如A蛋白-瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析等常規(guī)免疫球蛋白純化方法從培養(yǎng)基、腹水液或血清中分離。如果本發(fā)明抗體與抗原結(jié)合的Ka大于或等于約106M"、優(yōu)選大于或等于約1(^M"、更優(yōu)選大于或等于約1()SM"、最優(yōu)選大于或等于約109M-'、1010M-'、10"JVT或1012M"，則稱其具有免疫特異性或能特異性結(jié)合?？?M-CSF抗體可結(jié)合M-CSF的不同天然形式，包括宿主/對象的組織表達的以及腫瘤表達的。本文披露的單克隆抗體，例如RX1、5H4、MC1或MC3抗體對M-CSF具有親和力，這些抗體的特征在于解離平衡常數(shù)(Kd)至少是104M、優(yōu)選至少約10—7M至約1(T8M、更優(yōu)選至少約l(r8M、1(T1QM、l(T11M或l(T12M。采用常規(guī)技術(shù)不難測定這種親和力，例如通過平衡透析；采用生產(chǎn)商概述的通用方法，利用BIAcore2000儀器；利用'251標(biāo)記的M-CSF進行放射性免疫測定；或采用技術(shù)人員已知的另一種方法。可分析親和力數(shù)據(jù)，例如通過Scatchard等，AnnN.Y.Acad.Sci.，51:660(1949)所述的方法。因此，優(yōu)選的M-CSF抗體對M-CSF表現(xiàn)出的特異性程度明顯高，而與其它分子結(jié)合的親和力基本......匕較低。優(yōu)選的抗體與M-CSF結(jié)合的親和力類似于圖1所示鼠科RX1與M-CSF結(jié)合的親和力，表現(xiàn)出低免疫原性并在轉(zhuǎn)移性疾病動物模型中測試時能抑制癌細胞轉(zhuǎn)移。其它示范性抗體與M-CSF結(jié)合的親和力類似于如圖2、3或4分別所示的鼠科5H4、MC或MC3與M-CSF結(jié)合的親和力。標(biāo)題為"優(yōu)選取代"的表1顯示了保守性取代。如果這些取代導(dǎo)致生物學(xué)活性改變，則可將多個實質(zhì)性改變(表1中稱為"示范性取代"或以下參考文獻中進一步描述的氨基酸類別)引入篩選的產(chǎn)物。表l初級示范性優(yōu)選殘基取代Ala(A)val;leu;ilevalArg(R)lys;gln;asnysAsn(N)gin;his;asp，lys;glnargAsp(D)glu;asngluCys(C)ser;alaserGln(Q)asn;gluasnGlu(E)asp;ginaspG1y(G)alaHis(H)asn;gin;lys;argUe(l)leu;val;met;ala;leuphe;正亮氨酸Leu(L)正亮氨酸；ile;val;ilemet;ala;pheLys(K)arg;gin;asnargMet(M)leu;phe;ileleuPhe(F)leu;val;He;ala;tyrPro(P)alaSer(S)thrThr(T)serserTrp(W)tyr;phetyrTyr(Y)trp;phe;thr;serpheVal(V)ile;leu;met;phe;leuala;正亮氨酸可通過選擇在維持以下方面中的作用明顯不同的取代來實現(xiàn)對抗體生物學(xué)特性的實質(zhì)性修飾(a)取代區(qū)域中多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如片層或螺旋結(jié)構(gòu)，(b)耙位分子的電荷或疏水性，或(C)側(cè)鏈的體積。根據(jù)共有側(cè)鏈特性將天然殘基分成幾組(1)疏水性正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile;(2)中性親水性cys、ser、thr;(3)酸性asp、gill;(4)堿性asn、gln、his、lys、arg;(5)影響鏈取向的殘基-gly、pro;禾口(6)芳族trp、tyr、.phe。非保守性取代包括用另一類的成員替換這些類別中某一類的成員。通常還可用絲氨酸取代不涉及維持人源化抗體或抗體變體的適當(dāng)構(gòu)型的任何半胱氨酸殘基，從而改善分子的氧化穩(wěn)定性并防止異常交聯(lián)。相反，可向抗體中加入半胱氨酸鍵以改善其穩(wěn)定性(特別是當(dāng)抗體是例如Fv片段等抗體片段時)。B.M-CSF突變蛋白本發(fā)明還提供可用作本發(fā)明方法的MCSF拮抗劑的M-CSF突變蛋白。本文所用的"片段"表示完整的天然分子的一部分，例如片段多肽是其中N-末端或C-末端的一個或多個氨基酸被刪除的天然多肽的片段。就多肽而言，本文所用的"突變蛋白"表示完整的天然分子的變體或天然分子片段的變體，其中一個或多個氨基酸被取代、插入或刪除。這種取代、插入或刪除可以在分子的N-末端、C-末端或內(nèi)部。因此，術(shù)語"突變蛋白"的范圍包括天然分子的片段。插入型突變蛋白包括在N-或C-末端進行融合，例如與免疫球蛋白的Fc部分融合，從而能延長半衰期。采用檢索參數(shù)如下所示的仿射空位檢索(gapsearch),用MSPRCH程序(牛津分子公司(OxfordMolecular))執(zhí)行史密斯-獲特滿(Smith-Wateraian)同源性檢索算法(Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997))，測定到本發(fā)明的優(yōu)選突變蛋白顯示與天然多肽有至少約65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或更高的序列相同性(同源性)空位開放罰分12，空位延伸罰分l。其它熟知和常規(guī)使用的同源性/相同性掃描算法程序包括Pearson禾ULipman，PNASUSA,85:2444-2448(19138);Lipman和Pearson,Science,222:1435(1985);Devereaux等，Nuc.AcidsRes.，12:387-395(1984);或Altschul等，Mol.Biol.，215:403-410(1990)的BLASTP、BLASTN或BLASTX算法。還可使用利用這些算法的計算機化程序，所述程序包括但不限于GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，這些程序可購自美國威斯康星州麥迪遜市遺傳學(xué)計算組(GCG)軟件包，第八版(GeneticsComputingG謂p(GCG)package,Version8，MadisonWis.，USA)和加利福尼亞州芒廷維尤市智力遺傳公司的PC/Gene程序中的CLUSTAL(CLUSTALPC/Geneprogrambyl.ntellegenetics，MountainViewCalif)。最好通過這些程序利用默認(rèn)參數(shù)測定序列相同性百分比。本文所用的"修飾"表示天然多肽、片段或突變蛋白的任何修飾，例如糖基化、磷酸化、聚合物偶聯(lián)(例如與聚乙二醇偶聯(lián))或加入其它外來部分，只要能保留所需活性(激動劑或拮抗劑)。通過引用全文納入本文的美國專利號6,025,16和Koths，Mol.Reprod.Dev.1997年1月；46(l):31-38描述了M-CSF單獨的結(jié)i晶情況和M-CSF與M-CSFR形成復(fù)合物的結(jié)晶情況，并表征了M-CSF的三維結(jié)構(gòu)以及參與受體結(jié)合的殘基。美國專利號6,025,146還描述了根據(jù)結(jié)構(gòu)信息，在M-CSF中選擇候選氨基酸取代的方法。該形式的M-CSF的總拓?fù)鋵W(xué)是反平行的四a-螺旋束，其中與大多數(shù)四螺旋束中更常見的一—...t>F連接關(guān)系不同，這些螺旋是上-上-下-下。長的跨越連接將螺旋A與螺旋B相連，螺旋C與D之間也見到相似的連接。在二硫鍵連接的二聚體形式卩1，這些螺旋束尾對尾相連，形成極平的延伸結(jié)構(gòu)(維數(shù)約85X35X25)。各單體中有三個分子內(nèi)二硫鍵(Cys7-Cys90，Cys48-Cys139，Cysl02隱Cys146)，所有這些二硫鍵均在該分子的遠端。一個鏈間::::::::::硫鍵(Cys31—Cys31)位于非結(jié)晶雙面對稱車由(noncrystallogmphictwo-foldsymmetryaxis)穿過其中的二聚體界面，如圖2所示。突變實驗表明該形式M-CSF中所有半胱氨酸殘基可能是完整的生物學(xué)活性所必需。本文所述的結(jié)構(gòu)提示它們的作用主耍是結(jié)構(gòu)性的，而非與受體識別有關(guān)。美國專利號6,025，146提供了通過序列中氨基酸殘基的a碳位置測定的截斷重組M-CSFa二聚體的三維結(jié)構(gòu)。螺旋A、C和D中的特定殘基看來涉及受體結(jié)合相互作用的特異性。由于M-CSF卩具有涉及半胱氨酸157和/或159的鏈內(nèi)二硫鍵，M-CSF的C-末端區(qū)域可能從該結(jié)構(gòu)的"尾部"延伸，從而提供膜連接形式M-CSF的長度可變的"系帶"。因此，M-CSF的"前端"或受體結(jié)合區(qū)域位于這些分子的相對側(cè)，由天然M-CSF的螺旋A、C和D中或附近的溶劑可接近殘基(分別包括約6-27、71-卯和110-130個殘基)構(gòu)成。通過定點誘變改變這些區(qū)域中的溶劑可接近殘基以增強或降低側(cè)鏈與受體的相互作用，從而可產(chǎn)生M-CSF激動劑或拮抗劑。根據(jù)三肽(trypeptide)gly-x-gly中可接近氨基酸的表面區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)化(Kabsch，W.等，Biopolymers22:2577(1983))，優(yōu)選溶劑可接近表面區(qū)域大于約0.25，更優(yōu)選大于約0.4的殘基。優(yōu)選不與蛋白質(zhì)的其它部分，例如二聚體界面相互作用的殘基，從而能維持單體的相對取向并避免千擾蛋白質(zhì)折疊過程。其它任選的考慮是選擇在人和不識別人M-CSF受體的小鼠M-CSF之間不保守的殘基。優(yōu)選用不保守的氨基酸取代候選氨基酸，從而能千擾氫鍵和/或與MCSF-R殘基的疏水相互作用。例如，將一個或多個組氨酸改變成大小類似的非氫供體氨基酸可產(chǎn)生受體結(jié)合能力改變的M-CSF。用于取代的優(yōu)選氨基酸包括但不限于H15;Q79;R86;E115;E41;K93;D99;L55;S18;Q20;175;V78;L85;D69;N70;H9;N63;和T34。據(jù)信，在受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中至關(guān)重要的M-CSF殘基由M-CSF的不連續(xù)區(qū)域構(gòu)成。為盡量降低給予M:-CSF蛋白藥物潛在的形成抗體可能性，優(yōu)選盡可能維持溶劑可接近的親代M-CSF殘基(從而類似亍天然分亍)。誘變N-末端/A螺旋區(qū)域中的氨基酸H15和H9獲得生物學(xué)活性明顯較低和MCSF-R結(jié)合能力明顯較低的突變蛋白。這些結(jié)果表明受體結(jié)合親和力降低導(dǎo)致生物學(xué)活性降低；因此，這些組氨酸氨基酸代表了對于M-CSF受體結(jié)合親和力至關(guān)重要的接觸，如果需要完整的受體結(jié)合能力則不應(yīng)改動這些氨基酸。附近的殘基，例如Y6和S13以及其它殘基也代表了M-CSF受體接觸殘基。構(gòu)建了M-CSF的雙重突變體(Q20A、V78K)來檢驗溶劑可接近殘基在螺旋A和C的中心部分中溶劑可接近殘基的重要性。該雙重突變蛋白的生物學(xué)活性略低(8-10倍)和相應(yīng)的受體結(jié)合活性較低。殘基Q17、R21、E15和E119的突變改變了感興趣區(qū)域中溶劑可接近氨基酸的側(cè)鏈特性，但未影響特定的生物學(xué)活性，提示無需改變這些殘基來設(shè)計具有拮抗劑活性的突變蛋白。在一個實施方式中，本發(fā)明包括其中參與受體結(jié)合的螺旋A和/或C和/或D的殘基(例如，氨基酸6-26、71-90和/或110-130)發(fā)生非保守性突變的M-CSF突變蛋白的應(yīng)用。這些突變蛋白優(yōu)選與螺旋A、C或D中的天然序列維持至少65%、70%、75%、80%、85%或90%的相似性(即，相同或具有相似特性的氨基酸)，但與該多肽其余部分中天然序列的相似性更高，例如至少95%、98%或99%相似性。此外，支持受體結(jié)合位點的三維構(gòu)型的殘基可發(fā)生非保守性突變。在另一實施方式中，M-CSF突變蛋白是單體形式的M-CSF。二聚體形式的M-CSF是生物學(xué)活性形式，單體形式的M-CSF通常無活性。單體的二硫鍵看來經(jīng)Cys31-Cys31鏈間連接鍵產(chǎn)生。因此，估計單體形式的M-CSF適合用作拮抗劑。這些形式包括Cys31和/或其它半胱氨酸的半胱氨酸缺失和/或半胱氨酸取代(例如，半胱氨酸至丙氨酸取代)的突變蛋白，或一個或多個半胱氨酸，特別是Cys31經(jīng)化學(xué)修飾而不能形成二硫鍵的突變蛋白。在還有另一實施方式中，M-CSF突變蛋白單獨包含螺旋A、C或D中的一個或多個，或其參與受體結(jié)合的各部分，或與其它多肽融合，從而能以合適的三維構(gòu)型展示這些片段。采用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)不難制備含有任何所需保守性和/或非保守性突變蛋白的突變蛋白，包括重組產(chǎn)生或化學(xué)合成。預(yù)計保守性取代，特別是直接參與配體-受體結(jié)合的區(qū)域外的取代不會顯著改變M-CSF突變蛋白(或M-CSFR突變蛋白)的結(jié)合特性。可根據(jù)物理特性以及對二級和三級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的貢獻分類氨基酸。本領(lǐng)域?qū)⒂锰匦灶愃频牧硪环N氨基酸取代某種氨基酸視作保守性取代。示范性保守性取代見下表2(W097/09433，第10頁，1997年3月13日公布(PCT/GB96/02197，1996年9月6日提交)。表2保守性取代I特征脂族非極性極性-不帶電荷極性-帶電荷芳族其它GAPILVCSTMNQDEKRHFWYNQDE或者，可如Lehninger(《生物化學(xué)》(Biochemistry),第二版；沃斯出版公司(WorthPublishers,Inc.),紐約:紐約州(1975)，第71-77頁)所述分組保守性氨基酸，如下表3所示。表3保守性取代II特征非極性(疏水性)A.脂族B.芳族C.含硫D.臨界(Borderline):不帶電荷-極性A.羥基B.酰胺C.巰基D.臨界ALIVPFWMGSTYNQCG帶正電荷(堿性)KRH帶負(fù)電荷(酸性)DE再或者，示范性的保守性取代如下表4所示。表4保守性取代III原始殘基示范性取代Ala(A)Val、Leu、lieArg(R)Lys、Gln、AsnAsn(N)Gln、His、Lys、Asp(D)GluCys(C)SerGln(Q)AsnGlu(E)AspHis冊Asn、Gln、Lys、Ile(I)Leu、Val、Met、Leu(L)Ile、Val、Met、Lys(K)Arg、Gln、AsnMet(M)Leu、Phe、liePhe(F)Leu、Val、Ile、Pro(P)GlySer(S)ThrThr(T)SerTrp(W)TyrTyr(Y)Trp、Phe、Thr、Val(V)1:1e、'Leu、Met、編碼M-CSF的DNA序列可用于各種表達系統(tǒng)以產(chǎn)生所需多肽?？赏ㄟ^本領(lǐng)域熟知的方法構(gòu)建表達載體并從合適的DNA序列產(chǎn)生重組體。通常按照通過引用納入本文的以下文獻實施這些技術(shù)和各種其它技術(shù)Sambrook等，《分子克隆實驗室手冊》(MolecularCloning-ALaboratoryManual),冷泉港實驗室(ColdSpringHarborLaboratory),冷泉港，紐約(1989);和Kdegier，M.，《基岡轉(zhuǎn)移和表達，實驗室手冊》(GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual),斯托克頓出版社(StocktonPress),紐約(19卯)。可按照熟知的重組DNA技術(shù)刪除、添加或改變DNA序列編碼的氨基酸而不破壞所需結(jié)構(gòu)(例如，M-CSF的受體結(jié)合能力)，來對M-CSF—級序列作出某些修飾。此外，技術(shù)人員可知道可通過氧化、還原或其它修飾方法取代或修飾單個氨基酸，可切割多肽以獲得保留活性結(jié)合位點和結(jié)構(gòu)信息的片段。這種取代和改變獲得的多肽所具有的氨基酸序列屬于"具有與成熟M-CSFa(SEQIDND:7)、M-CSFp(SEQIDNO:8)和M-CSFy(SEQIDNO:9)多肽基本上相同氨基酸序列"的多肽的定義?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的化學(xué)合成或重組技術(shù)成熟多肽。還可通過蛋白質(zhì)的編碼核酸的關(guān)聯(lián)性表征蛋白質(zhì)的關(guān)聯(lián)性。測定多核苷酸序列的相同性和/或相似性的方法如上所述。此外，可如下所示實施通過檢驗多核苷酸序列在中等或高嚴(yán)格性條件下雜交的能力來測定它們相似性的方法。示范性中等嚴(yán)格性雜交條件如下所示42c，在含有50%甲酰胺、1%SDS、1MNaCl、10%硫酸葡聚糖的溶液中雜交，在60。C用含有0.1XSSX和1%SDS的洗滌溶液洗滌30分鐘。高度嚴(yán)格性條件包括在68'C用含有0.1XSSX和1%SDS的溶液洗滌。本領(lǐng)域知道可通過改變溫度和緩沖液護鹽濃度獲得等效嚴(yán)格性的條件，如本領(lǐng)域所述(Ausubel等(編)，《分r牛物學(xué)方案》(ProtocolsinMolecularBiology),約翰威利父子公司(JohnWiley&Sons)(1994)，第6.0.3-6.4.10頁)?？赏ㄟ^探針的鳥卄/胞嘧啶(GC)堿某配對的長度和fl"分比而精確計黨或憑經(jīng)驗確定雜交條件中的變化。可如Sambrook等(編)(《分子克隆實驗室手冊》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)，冷泉港實驗審出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress),冷泉港，紐約(1989)，第9.47-9.51頁)所述訃算雜交條件。C.可溶性M-CSFR本發(fā)明的示范性M-CSFR片段可包含一個或多個，或兩個或更多個參與M-CSF/受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域(據(jù)信是結(jié)構(gòu)域1、2和3)。優(yōu)選的M-CSFR片段包含M-CSFR的結(jié)構(gòu)域1、2和3中的所有三個。還考慮了對M-CSFR的這些片段或整個胞外結(jié)構(gòu)域的其它突變和/或修飾，可如上文M-CSF突變蛋白章節(jié)所述產(chǎn)生其它突變和/或修飾。M-CSFR(SEQIDNO:84和85)是具有5個胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(其中據(jù)信結(jié)構(gòu)域1-3參與配體-受體結(jié)合)、1個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個胞內(nèi)間斷Src相關(guān)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的跨膜分子。參考SEQIDNO:85，上述結(jié)構(gòu)域的位置如下所示Ig結(jié)構(gòu)域l:氨基酸27-102;Ig結(jié)構(gòu)域2:氨基酸112-196;lg結(jié)構(gòu)域3:氨基酸215-285;Ig結(jié)構(gòu)域4:氨基酸308-399;Ig結(jié)構(gòu)域5:氨基酸410-492;跨股結(jié)構(gòu)域氨基酸515-537;和激酶結(jié)構(gòu)域氨基酸582-910。"典型的"免疫球蛋l(fā)'l樣結(jié)構(gòu)域含有通常由各環(huán)端部的半胱氨酸之M的-::硫鍵錨定的環(huán)結(jié)構(gòu)。在M-CSFR中，形成Ig樣環(huán)的這些半胱氨酸位丁-以下M基酸位置結(jié)構(gòu)域1:42、84;結(jié)構(gòu)域2:127、177;結(jié)構(gòu)域3:224、278;結(jié)構(gòu)域4:不涉及半胱氨酸；結(jié)構(gòu)域5:419、485。可利用保留了抗原性的M-CSFR的完整胞外部分或其任何片段，例如一個或多個Ig-樣環(huán)來產(chǎn)生能與天然受體結(jié)合的抗體?？扇缟衔腗-CSF的抗體所述制備多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體和它們的抗原結(jié)合片段?？刹捎帽疚闹袠?biāo)題為"篩選方法"的章節(jié)所述試驗或采用本領(lǐng)域已知的合適試驗篩選抗體產(chǎn)物作為MCSF拮抗劑的活性以及是否適合于本發(fā)明治療方法。受體的胞外結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個或多個上述Ig-樣環(huán)可能足以抑制M-CSF和M-CSFR之間的相互作用。因此，采用本領(lǐng)域熟知的重組或化學(xué)合成方法不難制備M-CSFR及其突變蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的片段?？刹捎帽疚闹袠?biāo)題為"篩選方法"的章節(jié)所述試驗或采用本領(lǐng)域已知的合適試驗篩選這些產(chǎn)物作為MCSF拮抗劑的活性以及是否適合于本發(fā)明治療方法。D.基因治療采用本領(lǐng)域已知的合適方法，包括采用物理DNA轉(zhuǎn)移方法(例如，脂質(zhì)體或化學(xué)處理)或利用病毒載體(例如，腺病毒、腺伴隨病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒)，通過離體、原位或體內(nèi)基因治療可實現(xiàn)將治療性蛋白質(zhì)遞送給合適的細胞。本發(fā)明還提供了反義化合物和利用它們的方法。采用熟知的反義、基因"敲除"、核酶、三螺旋或RNAi方法來降低基因表達水平，從而能降低M-CSF或M-CSFR的活性水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知產(chǎn)生和利用這些分子的技術(shù)。本文所用的術(shù)語"肽模擬物(peptidomimetic)"是包含氨基酸側(cè)鏈裝配體、或藥效團或其合適衍生物的非肽化合物，這些部分由支架所支持從而使得藥效團的空間取向基本上能模擬天然肽的生物學(xué)活性構(gòu)型。例如，肽模擬物可缺乏氨基酸或肽鍵，但保留了結(jié)合活性所需親代肽的肽鏈基團的特定三維排列。支架可包含雙環(huán)、三環(huán)或更高級的多環(huán)碳或雜原子骨架，或可依據(jù)一個或多個環(huán)結(jié)構(gòu)(例如，吡啶、B引唑等)或酰胺鍵。該支架可通過間隔臂在一端與酸性基團(例如羧酸官能團灘連，而在核心的另一端與堿性基團(例如含-N部分，例如脒或胍)相連。2003年10月23日公布的美國專利號申請?zhí)?0030199531、2004年7月24日公布的關(guān)同Cj兮申請兮20030139348描述了合成肽模擬物的示范性技術(shù)。除了抗體和其它蛋白質(zhì)外，本發(fā)明還包括其它M-CSF拮抗劑，包括但不限于也能有效抑制M-CSF和M-CSFR之間相互作用或M-CSFR活化的肽或較小的有機分子。II.組合治療共同給予本發(fā)明的兩種治療劑，例如M-CSF拮抗劑和第二抗-破骨細胞劑不需要同時或經(jīng)由相同途徑給予這些藥劑，只要這些藥劑發(fā)揮其治療效果的時期有重疊即可。包括同時或依次給藥，也可在不同天或不同周給藥。發(fā)現(xiàn)在用M-CSF抗體(示范性M-CSF拮抗劑)開始治療后觀察到療效有明顯滯后對于在該過渡期共同給予第二抗-破骨細胞劑的更快起作用是理想的。在過渡期，兩種藥劑必須以單一治療有效量給予。過渡期后，可停止第二抗-破骨細胞劑，或降低其劑量。如果M-CSF拮抗劑和第二抗-破骨細胞劑施加協(xié)同作用，可在過渡期后降低一種或二者的劑量。將用量足以預(yù)防下述疾病發(fā)展或使之部分停滯的本發(fā)明組合物給予早已患有，或易患溶骨性疾病，包括癌癥轉(zhuǎn)移和/或癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)性骨丟失或其它骨丟失相關(guān)疾病，例如骨質(zhì)疏松癥的哺乳動物。單獨給予(不與第二治療劑聯(lián)用)某治療劑時足以實現(xiàn)該目的的治療劑用量稱為"單一治療有效劑量"。在本發(fā)明的組合治療方法中，可依次或在不同時間給予M-CSF拮抗劑，例如M-CSF抗體和第二抗-破骨細胞劑。所述兩種藥劑彼此可以在，例如8小時、l天、14天、30天、3個月、6個月、9個月或1年內(nèi)給予。示范性第二抗-破骨細胞劑包括二膦酸鹽，包括但不限于唑來膦酸鹽、帕米膦酸鹽、氯屈膦酸鹽、羥乙磷酸鹽、替魯膦酸、阿倫膦酸鹽、伊班膦酸鹽或利塞膦酸鹽。示范性的其它抗-破骨細胞劑包括二膦酸鹽、PTHrP中和劑(例如，抗體、反義、siRNA)、組織蛋白酶K抑制劑、MIP-l-a拈抗齊廿、RANK/RANKL中和齊lj(例如，抗-RANK抗體，如Amg-162，或反義、可溶忭RANKL受體或其突變蛋白)、RANKL疫苗、骨保護素(OPG)、血小板衍牛.牛K因子(PDGF)、src激酶抑制劑、麥芽糖鎵和基質(zhì)金屬蛋f1酶(MMP)抑制劑。二膦酸鹽的示范性劑量包括靜脈內(nèi)給予4mg。還可給予較低的劑量，包括3.5mg、3.3mg或3.0mg。其它給藥途徑也是可能的，包括皮下和WO02/087555所述的。M-CSF的有效量可以不同，取決于所治療疾病的嚴(yán)重程度以及患者的體重和總體狀況，但其范圍通常是毎次應(yīng)用約1.0mg/kg至約100mg/kg體.審:，或約10mg/kg辛:約30mg/kg，更常用的劑量為約O.lmg/kg辛約10mg/kg或約1mg/kg，:約10mg/kg。例如，約10ug/kg匿5mg/kg或約30Mg/kg-lmg/kg的抗體是給予忠者的初始候選劑量，而無論，例如通過-次或多次單獨給藥成通過連續(xù)輸注。根據(jù)對疾病的反應(yīng)和忠者對治療的耐受，可視需要以每日一次、隔天一次或每周一次或以更低的頻率給藥?？赡苄鑻朐谳^長的時期，例如4、5、6、7、8、IO或12M1成更K的吋期內(nèi)維持劑g，直節(jié)疾病癥狀得到理想的抑制，可視需要調(diào)整劑量。通過常規(guī)技術(shù)和試驗不難監(jiān)測該治療的進稃。雖然本發(fā)明方法可用于癌癥的所有階段，但特別適用于晚期或轉(zhuǎn)移癌癥。對于未接受過化療治療的患者，優(yōu)選組合采用化療或放療方案的治療方法，而對于接受過一種或多種化療的患者可用本發(fā)明治療方法治療。此外，本發(fā)明治療方法還能利用劑量較低的同期化療(concomitantchemotherapy),特別是對于極不耐受化療劑毒性的患者。本發(fā)明方法包括給予一種抗-M-CSF抗體以及不同抗體的組合或"混合物"。這種抗體混合物具有某些優(yōu)點是因為它們包含利用不同效應(yīng)物機制的抗體或直接組合了細胞毒性抗體與依賴于免疫效應(yīng)物功能的抗體。聯(lián)用這些抗體能表現(xiàn)出協(xié)同療效。本發(fā)明方法可與另一種治療，例如癌癥治療聯(lián)用。示范性的癌癥治療劑和/或方法包括但不限于各種化療劑、雄激素阻斷劑和免疫調(diào)節(jié)劑(例如，IL-2、GM-CSF、SLC)、二膦酸鹽，(例如，阿可達(Aredia)(即，帕米膦酸鹽、帕米膦酸、帕米膦酸一.鈉、帕米膦酸二鈉Ii水合物)；佐美塔(即，骨力強(Aclasta)、唑來膦酸、唑來膦酸鹽)；氯屈膦酸鹽(目卩，骨膦、洛龍(Loron)、氯屈膦酸二鈉、氯屈膦酸鈉)；福善美(Fosamax)(g卩，阿倫膦酸鹽、阿倫膦酸鈉鹽三水合物、阿倫膦酸)；福善文(Fosavance)(g卩，用維生素D配制的福善美)；骨得寧(Bondronat)或邦維爾(Bonviva)或邦維(Boniva)(即，伊班膦酸鹽、伊班膦酸、伊班膦酸鈉)；阿克托耐爾(Actond)(即，利塞膦酸鹽、利塞膦酸鈉、利塞膦酸)；迪多奈爾(Didronel)或迪多卡爾(Didrocal)(即，依替膦酸鹽、依替膦酸、依替膦酸二鈉)；奈里克希爾(Nerixia)(g卩，奈立膦酸鹽、奈立膦酸)；替魯膦酸鈉片(Skelid)(即，替魯膦酸鹽、替魯膦酸)；一甲基-APD(即，奧帕膦酸鹽、奧帕膦酸)；和亞甲磷酸(medronicacid)或亞甲磷酸鹽(medronate))、外科手術(shù)、放療、細胞詢性化療、激索療法(例如，他莫昔芬；抗-雄激累'治療)、抗體治療(例如，KANKL/RANK中和性、PTHrP中和性、抗-IIer2、抗-CD20、抗-CD40、CD22、VEGF、IGFR-1、EphA2、IIAAII、TMEFF2、CalX的抗休)、治療性適t-']質(zhì)治療(例如，可溶性RANKL受休、OPG和PDGF及MMP抑制劑)、小分f藥物治療(例如，Src-激酶抑制劑)、牛K:岡子受體的激酶抑制劑、RANKL抑制劑、寡核昔酸治療(例如，RANKL或RANK或PTHrP反義)、堪因治療(例如，RANKL或RANK抑制劑，如抗RANKL抗體)、肽治療(例如，RANKL的突變蛋&)以及本文所述的那些蛋白、肽、化合物和小分子。癌癥化療劑包括但不限于垸化劑，例如碳鉑或順鉑；氣芥烷化劑；f硝基脲烷化劑，例如卡莫司汀(BCNU);抗代謝物，例如氨甲蝶呤；亞葉酸；喂呤類似物抗代謝物、巰基嘌呤；嘧啶類似物抗代謝物，例如械尿噴從(5-FU)和吉西他濱(Gemzar⑧)；激索抗瘤劑，例如戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林和他莫昔芬；天然抗瘤劑，例如阿地白介素、fl介桌、2、多西它賽(docetaxel)、依托泊苷(VP-16)、丁擾素a、紫杉醉(Taxol⑧)和維甲酸(ATRA);抗牛:素性天然抗瘤劑，例如博萊霉素、放線菌素、柔紅霉素、阿霉素、道諾霉素和絲裂霉素；和長春花生物堿天然抗瘤劑，例如長春花堿、長春新堿、長春地辛；羥基脲；乙酰葡醛酸內(nèi)酯、阿霉素、異磷酰胺、依諾他濱、表硫雄醇、阿柔比星、安西他濱、尼莫司汀、鹽酸丙卡巴肼、卡波醌、碳鉑、卡莫氟、色霉素A3、抗腫瘤多糖、抗腫瘤血小板因子、環(huán)磷酰胺(Cytoxirr⑧)、裂殖菌多糖、阿糖胞苷(阿拉伯糖胞苷)、達卡巴嗪、硫代肌苷、塞替派、替加氟、多拉司他汀、多拉司他汀類似物，例如奧里斯他汀(auristatin)、CPT-11(依立替康)、米托蒽醌、長春瑞濱、替尼泊苷、氨基蝶呤、洋紅霉素、埃斯泊拉米星(esperamicin)(參見，例如美國專利號4,675,187)、新制癌菌素、OK-432、博萊霉素、氟鐵龍、溴尿苷、白消安、二磷酸己烯雌酚四鈉、培洛霉素、貝他定(Ubenimex⑧)、千擾素-p、美雄烷、二溴甘露醇、美法蘭、層粘連蛋白肽、磨茹多糖、雜色革蓋菌提取物、替加氟/尿嘧啶、雌莫司汀(雌激素/氮芥)。此外，用作癌癥患者治療劑的其它藥劑包括EPO;G-CSF;更昔洛韋；抗生素；醋酸亮丙瑞林；哌替啶；齊多夫定(AZT);白介素1-18，包括突變體和類似物；千擾素或細胞因亍，例如千擾素a、[3禾By;激素，例如促黃體激素釋放激素(LHRII)和類似物及促性腺激素釋放激素(GnRII);生長因子，例如轉(zhuǎn)化生長因子-(3(TGF-f3)、成纖維細胞生長因子(FGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、生長激素釋放因子(GHRF)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子同源因子(FGFHF)、肝細胞生長因子(HGF)和胰島素生長因子(IGF);腫瘤壞死因子-a和p(TNF-a禾卩卩)；侵襲抑制因子-2(IIF-2);骨形成蛋白1-7(BMP1-7);生長激素抑制素；胸腺素-a-l;Y-球蛋白；超氧化物歧化酶(SOD);補體因子；抗血管生成因子；抗原性物質(zhì)；和前藥。前藥指藥學(xué)活性物質(zhì)的前體或衍生形式，與親代藥物相比，其對腫瘤細胞的細胞毒性較低或無細胞毒性，但能經(jīng)酶活化或轉(zhuǎn)化成活性或更具活性的親代形式。參見，例如Wilman，"癌癥化療中的前藥"(ProdrugsinCancerChemotherapy),《生物化學(xué)協(xié)會論文集》(BiochemicalSocietyTransactions),14，第375-382頁，第615屆貝爾法斯特大會(615thMeetingBelfest)(1986)和Stella鄉(xiāng)，"前藥耙向藥物遞送的化學(xué)方案"(Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery),《定向藥物遞送》(DirectedDrugDelivery),Borchardt等編，第247-267頁，人類出版社(HumanaPress)(1985)。前藥包括但不限于含磷酸鹽的前藥、含硫代磷酸鹽的前藥、含硫酸鹽的前藥、含肽的前藥、D-氨基酸修飾的前藥、糖基化前藥、含J3-內(nèi)酰胺的前藥、任選取代的含苯氧基乙酰胺前藥或任選親代的含苯基乙酰胺前藥、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶，這些前藥可轉(zhuǎn)化成更具活性的細胞毒性游離藥物?？裳苌杀疚乃们八幮问降募毎拘运幬锏膶嵗ǖ幌抻谏鲜瞿切┗焺?。in.給藥和制備M-CSF拮抗劑的有效量可以不同，取決于所治療疾病的嚴(yán)重程度以及患者的體重和總體狀況，但其范圍通常是每次應(yīng)用約1.0ixg/kg至約100mg/kg體重，更常用的劑量為約10嗎/kg至約10mg/kg。可通過本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗方法測定本發(fā)明組合物的有效量。例如，可如Cenci等，JClin.Invest.1055:1279-87，2000所述，采用能體外測定血清阻斷M-CSF誘導(dǎo)鼠科單核細胞(CDllb+細胞，CDl.l細胞的亞組，表達高水平的M-CSF受體)增殖和存活的能力的試驗來評估用給定劑量的M-CSF拮抗劑治療對象的血清體內(nèi)中和活性。根據(jù)對疾病的反應(yīng)和患者對治療的耐受，可視需要以每日一次、每兩天一次、每三天一次、每周兩次、每周一次或以更低的頻率給藥?？赡苄枰谳^長的時期內(nèi)維持劑量，可視需要調(diào)整劑量?？刹捎弥髦吾t(yī)師選擇的劑量水平和模式一次或多次給予這些組合物?？蓪⒂糜趯嵤┍景l(fā)明方法的M-CSF拮抗劑，包括抗-M-CSF抗體配制成含有適合所需遞送方法的載體的藥物組合物。合適的載體包括當(dāng)與M-CSF拮抗劑混合時能維持該拮抗劑的抗腫瘤功能且不與對象的免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)的任何材料。例子包括，但不限于，任何標(biāo)準(zhǔn)藥物載體，如無菌磷酸緩沖鹽溶液、抑菌水，等等。可采用各種水性載體，如水、緩沖的水、0.4%鹽水、0.3%甘氨酸等，并可包含其它蛋白質(zhì)以增強穩(wěn)定性(如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等)、進行溫和化學(xué)修飾，等等。將具有所需純度的拮抗劑與任選的生理學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington'sPharmaceuticalSciences),第16版，Osol，A.編(1980))混合可制備用于儲存的拮抗劑治療制劑，所述制劑的形式可以是凍干制劑或水溶液?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所用劑量和濃度下對受者無毒，包括緩沖劑如磷酸、檸檬酸和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八垸基二甲基芐基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯扎氯銨，苯索氯銨；苯酚，丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸垸基酯類如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA;糖類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，如鈉；金屬絡(luò)合物(例如，Zn-蛋白絡(luò)合物)；和/或非離子表面活性劑如TWEENtm、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。本文的制劑還可包含所治療的特定適應(yīng)癥所需的一種以....I::活性化合物，優(yōu)選具有不會彼此不利地影響的互補活性的那些化合物。例如，優(yōu)選還提供免疫抑制劑。這些分子的合適混合量應(yīng)對所需目的有效。還可將活性成分截留在，例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠囊中，例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，還可截留在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或大乳劑(macroemulsion)中?！独酌黝D藥物科學(xué)》(第16版，Osol，A.編(1980))披露了這些技術(shù)。體內(nèi)給藥的制劑必須無菌。利用除菌濾膜進行過濾不難做到這點。可通過任何合適的方式給予拮抗劑，，包括胃腸外、皮—F、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)和鼻內(nèi)，通過需要還可以是局部治療、傷口內(nèi)給藥。胃腸外輸注包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)或皮下給藥。此外，拮抗劑適合通過脈沖輸注給予，特別是給予劑量遞減的拮抗劑。優(yōu)選通過注射給予給藥劑量，最優(yōu)選靜脈內(nèi)或皮下注射，這部分取決于給藥是簡短的還是延續(xù)性的。還包括其它給藥方法，包括局部，特別是透皮、經(jīng)粘膜、直腸、口服或局部給藥，例如通過放置在接近所需部位的導(dǎo)管。本發(fā)明組合物的形式可以是，例如粒劑、粉末、片劑、膠囊、糖漿、栓劑、注射液、乳劑、酏劑、懸液或溶液?？蔀楦鞣N給藥途徑，例如口服給藥、鼻部給藥、直腸給藥、皮—F"注射、靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射或腹膜內(nèi)注射配制即時組合物?？勺⑸鋭┬屯ǔ０ɡ煤线m的分散劑或潤濕劑和懸浮劑制備的水性懸液或油性懸液?？勺⑸湫问娇梢允怯萌軇┗蛳♂寗┲苽涞娜芤合嗷驊乙盒问健？山邮艿娜軇┗蜉d體包括無菌水、林格液或等滲鹽水溶液。或者，無菌的油可用作溶劑或懸浮劑。油或脂肪酸優(yōu)選無揮發(fā)性，包括天然或合成的油、脂肪酸、甘油一酯、二酯或三酯。對于注射，藥物制劑和/或藥物可以是適合用上述合適溶劑重建的粉末。這些粉末的例子包括但不限于凍干的、旋轉(zhuǎn)千燥的或噴霧千燥的粉末、穩(wěn)定性粉末、粒劑、沉淀物或顆粒。對亍注射，制劑可任選含有穩(wěn)定劑、pH修飾劑、表面活性劑、生物利用度稀釋劑和這些試劑的組合?？梢灾苽渚忈屩苿＞忈屩苿┑暮线m例子包括含有拮抗劑的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，該基質(zhì)采取成形物品的形式，例如薄膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利號3,773,919)、L-谷氨酸和y乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如L叩ronDepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球)、和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然共聚物，如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能在100天期間釋放分子，但某些水凝膠能在較短的時期內(nèi)釋放蛋白質(zhì)。當(dāng)包裹化的拮抗劑在體內(nèi)長期維持時，它們會因在37。C接觸水分而變性或凝聚，從而喪失生物學(xué)活性并可能改變免疫原性?？筛鶕?jù)所涉及的機制來設(shè)計合理的穩(wěn)定方案。例如，如果發(fā)現(xiàn)凝聚機制是通過巰基-二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、用酸性溶液凍千、控制水分含量、利用合適的添加劑和開發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物以實現(xiàn)穩(wěn)定?？蓪⒈景l(fā)明制劑設(shè)計成本文所述的短效、快速釋放、長效或緩釋(制劑)。因此，還可將藥物制劑配制成控釋或緩釋。本組合物還可包含，例如膠束或脂質(zhì)體，或者一些其它包裹形式，或可以延長釋放的形式給予以提供長期保存和/或遞送效果。因此，可將藥物制劑和藥物壓制成丸狀或圓柱形，并通過肌肉內(nèi)或皮下植入作為長效注射劑或植入物，例如支架。這些植入物可利用已知的惰性物質(zhì)，例如硅酮和生物可降解的聚合物。除了......匕述那些代表性劑型，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常知道藥學(xué)....匕可接受的賦形劑和載體，因此本發(fā)明包括這些賦形劑和載體。通過引用納入本文的《雷明頓藥物科學(xué)》(RemingtonsPharmaceuticalSciences),馬克出版社(MackPub.Co.)，新澤西州，(1991)描述了這些賦形劑和載體?？筛鶕?jù)疾病的情況、對象的年齡、體重、總體健康狀況、性別和飲食、劑量間隔、給藥途徑、分泌率和藥物組合調(diào)整具體的劑量。常規(guī)實驗即可確定含有有效量的任何......匕述劑型，因此這些劑型當(dāng)然屬于本發(fā)明的范圍?？捎米鞅景l(fā)明治療劑的M-CSF拮抗劑或抗體常制備成基本.匕不含其它天然產(chǎn)生的免疫球蛋白或其它生物學(xué)分子。給予患或易患溶骨性疾病，包括癌癥轉(zhuǎn)移和/或癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)性骨丟失的哺乳動物后，優(yōu)選的M-CSF拈抗劑還表現(xiàn)出極低的毒性。可通過常規(guī)、熟知的滅菌技術(shù)使本發(fā)明組合物滅菌?？蓪⒌玫降娜芤喊b待用，或在無菌條件下過濾并凍干，凍千制品先與無菌溶液混合再施用。如果需要，這些組合物可含有藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)以接近生理條件，例如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等，如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和穩(wěn)定劑(例如，120%変芽糖，等)。還可經(jīng)由脂質(zhì)體給予本發(fā)明M-CSF拮抗劑，所述脂質(zhì)體是由各類脂質(zhì)和/或磷脂和/或表面活性劑構(gòu)成、用于遞送藥物(例如，本文披露的拮抗劑和任選的化療劑)的小囊泡。脂質(zhì)體包括乳液、泡沫、膠束、不可溶單層、磷脂分散體、層狀片層(lamellarlayer)等，脂質(zhì)體可用作載體以將M-CSF拮抗劑靶向具體組織并延長組合物的半衰期。如美國專利號4,837,028和5,019,369所述，可采用各種方法制備脂質(zhì)體，該兩篇專利通過運用納入本文?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知，例如Epstein等，Natl.Acad.Sci.USA82:3688(1985);Hwang等，Proc.NatlAcad.Sci.USA77:4030(1980);和爽國專利號4,485,045及4,544,545所述的方法制備含拮抗劑的脂質(zhì)體。美國專利號5,013,556披露了循環(huán)時間增加的脂質(zhì)體。通過反相蒸發(fā)方法，用含有磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG—PE)的脂質(zhì)組合物產(chǎn)生特別有用的脂質(zhì)體。利用孔徑確定的濾膜擠出脂質(zhì)體從而產(chǎn)生具有所需直徑的脂質(zhì)體?？扇鏜artin等(J.Biol.Chem.257:286-288(1982))所述，通過二硫鍵互換反應(yīng)將本發(fā)明M-CSF抗體的Fab，片段偶聯(lián)亍脂質(zhì)體。脂質(zhì)體內(nèi)任選含有化療劑(例如阿霉素)[參見，例如Gabizon等，J.NationalCancerInst.81(19):1484(1989)]。這些組合物中M-CSF拮抗劑的濃度變化很大，即以璽量計，從低于約10%,通常是至少約25%到最高75%或90%，并且可按照所選擇的具體給藥方式基本—..h根據(jù)流體體積、粘度等作出選擇。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或明白制備可口服、局部和胃腸外給予的組合物的實際方法，其細節(jié)描述亍，例如《雷明頓藥物科學(xué)》，第19版，馬克出版公司，伊斯頓，賓夕法尼州(1995)，該份文獻通過引用納入本文?？赏ㄟ^本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗方法測定本發(fā)明組合物的有效量。例如，可如Cenci等(JClin.Invest.1055:1279-87，2000)所述，采用體外測定血清阻斷M-CSF誘導(dǎo)鼠科單核細胞(CDllb+細胞，CD11細胞的亞組，其表達高水平的M-CSF受體)增殖和存活的能力的試驗來評估用給定劑量M-CSF拮抗劑治療對象的血清的體內(nèi)中和活性?？蓪⒈景l(fā)明組合物給予早已患有或易患溶骨性疾病，包括癌癥轉(zhuǎn)移和/或癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)性骨丟失的哺乳動物，其用量足以防止這種疾病的發(fā)展或使其至少部分停滯。M-CSF拮抗劑的有效量可以根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度和所治療患者的體重及總體狀況而不同，但其范圍通常是每次施用約1.0mg/kg至約1.00mg/kg體艱，或約10mg/kg至約90mg/kg，劑量約20mg/k名至約80mg/kg或約30mg/kg至約70mg/kg或約40mg/kg至約60mg/kg。例如，約10mg/kg-50mg/kg或約20mg/kg-60mg/kg的抗-MCSF抗體是給予患者的初始候選劑量，而無論，例如通過-次或多次單獨給藥或通過連續(xù)輸注。根據(jù)對疾病的反應(yīng)和患者對治療的耐受，可視需要以每日一次、隔天一次或每周一次或以更低的頻率給藥?？赡苄杷Ｔ谳^長的時期，例如4、5、6、7、8、10或12周或更長的時期內(nèi)維持劑量，直至疾病癥狀得到理想的抑制，可視霈要調(diào)整劑量。通過常規(guī)技術(shù)和試驗不難監(jiān)測該治療的進程?？筛鶕?jù)治療醫(yī)師選擇的劑量水平和模式.次或多次給予組合物。如......匕所述，對于預(yù)防或治療疾病，M-CSF拮抗劑，包括抗-M-CSF抗體的合適劑量取決于待治療疾病的類型，疾病的嚴(yán)重程度和進程，給予拮抗劑是預(yù)防目的還是治療目的，以前的治療，患者的臨床史和對拮抗劑的反應(yīng)以及主治醫(yī)師的判斷?？梢淮位蛟谝幌盗兄委熎陂g將拮抗劑適當(dāng)?shù)亟o予患者。拮抗劑組合物的配制、給藥和施用方式應(yīng)與優(yōu)質(zhì)醫(yī)學(xué)規(guī)范(goodmedicalpractice)-致。在這點應(yīng)考慮的因素包括所治療的具體疾病、所治療的具體哺乳動物、各患者的臨床狀況、疾病的誘因、藥物的遞送部位、給藥方法、給藥時間表和醫(yī)師已知的其它因素。所給予的拮抗劑的治療有效量取決亍這些因素，并且是預(yù)防、改善或治療M-CSF介導(dǎo)疾病、病情或病癥，特別是治療癌細胞，尤其是治療腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的盡可能低的用量。這種用量優(yōu)選低于對宿主有毒或使得宿主對感染明顯更敏感的用量。在本發(fā)明的另一實施方式中，提供了含有用于治療上述疾病、病癥或病情的物質(zhì)的制品。該制品裝有容器和標(biāo)簽。合適的容器包括，例如瓶子、小瓶、注射器和試管?？捎酶鞣N材料，例如玻璃或塑料制成這些容器。這些容器裝有能有效治療所述疾病的組合物，還可裝有無菌存取口(例如，所述容器可以是靜脈內(nèi)乳液袋或具有可用皮—F"注射針頭刺穿的塞子的小瓶:)。組合物中的活性物質(zhì)是本發(fā)明的M-CSF拮抗劑或抗體。容器.....l::或與之相關(guān)的標(biāo)簽表明組合物用于治療選擇的疾病。該制品還可裝有第二容器，該第二容器裝有藥學(xué)—...匕可接受的緩沖劑，例如磷酸緩沖鹽水、林格液和葡萄糖溶液。從商品化和用戶的角度出發(fā)，還可裝有其它物質(zhì)，包括其它緩沖劑、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器和使用說明的包裝插頁。以下實施例描述了本發(fā)明，但這些實施例并非以任何方式限制本發(fā)明。實施例實施例1本實施例在動物模型中建立了佐美塔(唑來膦酸鹽)的劑量依賴性抗-吸收作用(圖14)。用>0.03mg/kg佐美塔治療抑制了骨部位處腫瘤細胞生長所致的溶骨性損傷。此外，當(dāng)用濃度漸增的佐美塔治療小鼠時觀察到劑量應(yīng)答作用?？?小鼠和抗-人M-CSFmAb5A1和5H4組合也能保護免遭骨損傷。在治療嚴(yán)重的溶骨性損傷時單用M-CSF抗體比0.03m/kg佐美塔更有效。研究最后一天基于x-射線圖像的骨質(zhì)溶解評分為(圖14):0=正常；1=可疑或最小病損，皮層結(jié)構(gòu)正常；2=明確的溶解病損，少量皮層/結(jié)構(gòu)破壞；3=大的病損，皮質(zhì)/結(jié)構(gòu)破壞；4=全面破壞，無結(jié)構(gòu)保留由此初步研究，可利用0.03mg/kg亞有效劑量的佐美塔進行組合研究。脛骨內(nèi)接種6X105MDA-MB-231Luc細胞兩周后，用5A1/5H4(10mg/kg，每周一次)、佐美塔(0.03mg/kg，每周兩次)或同時用抗體和二膦酸鹽治療Nu/Nu小鼠。通過Faxitron分析(x-射線技術(shù))每周監(jiān)測骨病損，該項研究結(jié)束時所有小鼠進行最終x-射線(分析)，收集圖像并分配來對病損嚴(yán)重程度進行評分。分析結(jié)果顯示抗-MCSFmAb和佐美塔均能有效治療骨質(zhì)溶解，但與單用任—種相比，佐美塔和M-CSFmAb組合治療對骨溶解發(fā)生率(圖15)和程度(圖16)的抑制程度更大。圖16顯示用0.03mg/kg佐爽塔或10mg/kg抗-MCSF抗體(5A1+5H4)治療抑制骨部位處腫瘤生長所致的溶骨性損傷。佐美塔加抗-MCSF抗體的組合方案還抑制了骨溶解。可從1)三位獨立的志愿者評分的平均分和2)組平均值(最初10只動物/組)計算平均骨質(zhì)溶解評分。研究最后一天基于x-射線圖像的骨質(zhì)溶解評分為0=正常；1=可疑或最小病損，皮層結(jié)構(gòu)正常；2=明確的溶解病損，少量皮層/結(jié)構(gòu)破壞；3=大的病損，皮質(zhì)/結(jié)構(gòu)破壞；4=全面破壞，無結(jié)構(gòu)保留檢査代表性Faxitron圖像進一步證明與佐美塔和抗-MCSF抗體治療動物中病損較少相比，未治療動物中的病損嚴(yán)重(圖17)。組合治療組中未觀察到不利的相互作用。總之，抗-MCSF抗體和佐美塔均能有效抑制骨質(zhì)溶解，與單用每種療法相比，聯(lián)用該兩種療法能增強抗-吸收作用這提示組合療法可能是二膦酸鹽不耐受或早已用二膦酸鹽治療過的骨疾病患者的有效選擇。實施例2本實施例顯示抑制M-CSF活性對分化破骨細胞活性沒有作用(圖18)。用人源化Chir-RXl和佐美塔測試M-CSF-中和抗體和二膦酸鹽對分化破骨細胞活性的作用。在本文所述實驗條件下將人骨髓CD34+細胞(拜爾懷泰克公司(Biowhittaker)，目錄號2M-101A，3X105個細胞/小瓶)誘導(dǎo)分化成破骨細胞。第1天，將1個冷凍小瓶的CD34+細胞融化后加入10ml培養(yǎng)基中(AlphaMEM，含10。/。FCS、lX青霉素鏈霉素(PenStrep)和1X兩性^紫B)。將細胞洗滌一次，重懸于2ml培養(yǎng)基并以100ul/孔接種于OsteoLyse平板(OsteoLyseTM試驗試劑盒(人膠原公司(HumanCollagen))，坎布柬克斯(C:ambrex))。在第2天，在無需除去原始培養(yǎng)基的條件下，向各孔中加入50ul4XCSF-1至終濃度為30ng/ml，和4XRANKL(sRANKL，開米康公司(Chemicon)，目錄號GF091，10ug/包)至終濃度為100ng/ml。在第7天，向各孔中加入50ul5XRANKL至終濃度為100ng/ml。在第15天，加入所示濃度的抗體(Chir-RXl或?qū)φ湛贵w)或佐美塔。在第17天，取樣10ul細胞培養(yǎng)液的....t:清液，在黑色96-孔板(裝在OsteoLyse試驗試劑盒中)的各孔中與200pl熒光團釋放試劑(FluorophoreReleasingReagent)混合。實施例3本實施例顯示佐美塔以劑量依賴性方式抑制分化破骨細胞活性(圖19)。用人源化Chir-RXl和佐美塔測試M-CSF-中和抗體和二膦酸鹽對分化破骨細胞活性的作用。在本文所述實驗條件下將人骨髓CD34+細胞(拜爾懷泰克公司，目錄號23M-101A,3Xl()S個細胞/小瓶)誘導(dǎo)分化成破骨細胞。第1天，將1個冷凍小瓶的CD34+細胞融化后加入lOml培養(yǎng)基中(AlphaMEM，含10%FCS、1X青霉素鏈霉素禾1X兩性霉素B)。將細胞洗滌一次，重懸于2ml培養(yǎng)基中并以100ul/孔接種于OsteoLyse平板(OsteoLyseTM試驗試劑盒(人膠原公司)，坎布萊克斯)上。在第2天，在無需除去原始培養(yǎng)基的條件下，向各孔中加入50ul4XCSF-l至終濃度為30ng/ml，和4XRANKL(sRANKL，開米康公司，目錄號GF091，10ug/包)至終濃度為100ng/ml。在第7天，向各孔中加入50ul5XRANKL至終濃度為100ng/ml。在第15天，加入所示濃度的抗體(Chir-RXl或?qū)φ湛贵w)或佐美塔。在第17天，取樣10ul細胞培養(yǎng)液的上清液，在黑色96-孔板(裝在OsteoLyse試驗試劑盒中)的各孔中與200pl熒光團釋放試劑混合。實施例4本實施例顯示利用RX1在靈長類動物中進行藥代動力學(xué)和藥效學(xué)研究的結(jié)果(圖20和圖21)。本項研究的目的是研究人源化抗-人M-CSF抗體heRXl-10.Gl在給予短尾猴(cynomolgusmonkey)時的藥效學(xué)和藥代動力學(xué)，所述抗體作為單次緩慢推注靜脈內(nèi)注射(第l天，組2和組3)給予，然后是13-周觀察期，或作為多次劑量(第l、43、50和57天，組1)給予，然后是10-周觀察期。經(jīng)臂靜脈或隱靜脈通過緩慢推注靜脈內(nèi)(IV)注射給予人源化抗-M-CSFIgGl單克隆抗體。使用動物是新藥安全性評價全球管理機構(gòu)所要求的?？贵w在嚙齒類動物中沒有交叉反應(yīng)，但在短尾猴中已顯示有活性。因此生物學(xué)家選擇短尾猴作為靜脈內(nèi)注射研究的可接受的非嚙齒類動物。將動物隨機分成以下各組<formula>formulaseeoriginaldocumentpage53</formula>a在第1天，組1.接受0.2mg/kg/劑，在第43、50和57天，同一動物接受10mg/kg/劑。在第1天，組2和3通過靜脈內(nèi)緩慢推注注射在約10分鐘期間給予測試制劑(分別是2和20mg/kg/劑)。利用導(dǎo)管和套管針(abbocath)經(jīng)隱靜脈給予制劑。劑量體積是4ml/kg，實際劑量基于每只動物最近的實際體重。在第1天，組1給予0.2mg/kg的劑量，然后在第43、50和57天給予10mg/kg/劑的劑量。利用導(dǎo)管和套管針經(jīng)隱靜脈通過靜脈內(nèi)緩慢推注注射給予制劑(在約IO分鐘期間)。劑R體積是4mL/kg，實際體積根據(jù)每只動物最近的實際體重。收集所有動物的血液用于血液學(xué)和/或臨床生物化學(xué)(分析)，如下所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>a只需要WBC計數(shù)(總數(shù)和差異數(shù))以與淋巴細胞表型相關(guān)聯(lián)檢測了以下參數(shù):血液學(xué)血細胞形態(tài)；紅細胞指數(shù)(MCV、MCH、MCHC和RDW);紅細胞比容；血紅蛋白；平均血小板體積；血小板計數(shù)；紅細胞計數(shù)；網(wǎng)織紅細胞(絕對數(shù)和百分?jǐn)?shù))；和白細胞計數(shù)(總數(shù)、絕對數(shù)和差異百分?jǐn)?shù))。臨床生物化學(xué)A/G比(計算值)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；白蛋白；堿性磷酸酶；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；血液尿素氮；鈣；氯化物；膽固醇；肌酸酐；球蛋白(計算值)；葡萄糖；無機磷；鉀；鈉；總的、直接和間接膽紅素；總蛋白；甘油三酯；和C反應(yīng)性蛋白。如下所示分析骨更新的生物化學(xué)標(biāo)記(收集所有動物的約2mL血液來測定骨生物標(biāo)記)<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>(NTX:骨膠原的N-末端交聯(lián)端肽)(CTX:骨膠原的C-末端交聯(lián)端肽)藥代動力學(xué)評估和血清M-CSF活性對于組2和3，在第1天(輸注結(jié)束后立即和輸注結(jié)束后4小時)和第3、8、15、22、29、43、57、71和85天在給藥前通過靜脈穿刺將各劑量的血液(各1.5mL)收集在SSR試管中。對于組1動物，在第1天(輸注結(jié)束后立即和輸注結(jié)束4小時后)和第3、8、15、22、29、43天(給藥前和輸注結(jié)束后4小時)、第50天(給藥前和輸注結(jié)束后4小時)、第57天(給藥前和輸注結(jié)束后4小時)、第59、64、71、78、92、106和120天通過靜脈穿刺將各劑量的血液(各1.5mL)收集在SSR試管中。分析樣品的藥代動力學(xué)評估和血清M-CSF活性以及殘余heRXl-10.Gl活性。先使血液樣品在室溫下凝結(jié)約30分鐘，再離心。在約4。C以2700rpm離心10分鐘獲得血清，將得到的血清分成四等份。本說明書述及和/或申請一覽表中所列的所有上述美國專利、美國專利申請公開、美國專利申請、外國專利、外國專利申請和非專利出版物通過引用全文納入本文。從上文應(yīng)該知道，雖然出于說明的目的描述了本發(fā)明的具體實施方式，但可以作出各種改進而不脫離本發(fā)明的構(gòu)思和范圍。權(quán)利要求1.一種治療溶骨性疾病患者的方法，所述方法包括將單一治療有效劑量的抗-M-CSF抗體與單一治療有效劑量的破骨細胞抑制劑給予所述患者的步驟。2.—種治療溶骨性疾病患者的方法，所述方法包括將單一治療有效劑量的抗-M-CSF抗體與單一治療有效劑量的二膦酸鹽給予所述患者的步驟。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述破骨細胞抑制劑是RANKL抑制劑。4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗-MCSF抗體是RX1-衍生抗體、MCl-衍生抗體、MC3衍生抗體或5H4-衍生抗體。5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗-MCSF抗體是heRXl。6.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述溶骨性疾病是骨質(zhì)疏松癥、癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)性骨丟失、佩吉特病或假體周圍骨丟失。7.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述破骨細胞抑制劑和MCSF抗體同時給予。8.如權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述RANKL抑制劑選自下組抗-RA:NKL抗體、可溶性RANKL受體和RANKL疫苗。9.如權(quán)利要求3、4、6和7所述的方法，其特征在于，所述抗-RANKL抗體是AMG-162。10.如權(quán)利要求2、4、6和7所述的方法，其特征在于，所述二膦酸鹽選自下組唑來膦酸鹽、帕米膦酸鹽、氯屈膦酸鹽、羥乙磷酸鹽、替魯膦酸、阿倫膦酸鹽、伊班膦酸鹽和利塞膦酸鹽。11.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述二膦酸鹽是唑來膦酸鹽。12.—種治療溶骨性疾病患者的方法，所述方法包括在過渡期將單一治療有效劑量的抗-M-CSF抗體與單一治療有效劑量的二膦酸鹽給予所述患者的步驟。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述破骨細胞抑制劑是二膦酸鹽或RANKL抑制劑。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述過渡期約為1-7天。15.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述過渡期為l周-l個月。16.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述過渡期是l個月-3個月。17.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述過渡期是3-6個月。18.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述過渡期是6-12個月。19.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在過渡期后停止所述二膦酸鹽治療的步驟。20.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在過渡期后降低所述二膦酸鹽劑量的步驟。21.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在過渡期后立即降低所述二膦酸鹽劑量的步驟。22.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在過渡期后降低所述抗-MCSF抗體劑量的步驟。23.<image>imageseeoriginaldocumentpage0</image>24.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，在過渡期后立即降低所述抗-MCSF抗體的劑量。25.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，在過渡期后給予所述二膦酸鹽至少一次。26.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述抗-MCSF抗體包含SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示鼠科RX1抗體的CDR中的至少兩個。27.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述抗-MCSF抗體包含SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示鼠科RX1抗體的CDR中的至少三個。28.如以上權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述抗-MCSF抗體與SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示鼠科RXl抗體競爭結(jié)合至少75%的M-CSF。29.如權(quán)利要求6、13和20所述的方法，其特征在于，所述破骨細胞抑制劑是唑來膦酸鹽，所述MCSF抗體是RXl-衍生抗體。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述唑來膦酸鹽的給藥劑量在0.5mg-4mg之間。31.如權(quán)利要求4、6、8、10、11或12所述的方法，其特征在于，所述抗-MCSF抗體結(jié)合與RX1、MC1、MC3或5H4抗體相同的表位。全文摘要提供了通過將M-CSF-拮抗劑與治療劑聯(lián)合給予對象來預(yù)防和治療骨質(zhì)溶解、癌癥轉(zhuǎn)移和癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)性骨丟失的方法。文檔編號A61K39/395GK101534858SQ200780006799公開日2009年9月16日申請日期2007年1月4日優(yōu)先權(quán)日2006年1月5日發(fā)明者C·劉,M·卡瓦諾申請人:諾華有限公司;愛克索馬技術(shù)有限公司