專利名稱：包含氣芯和殼體的顆粒的制備方法及這樣獲得的顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含氣芯(gas core)和殼體的顆粒的制備方法，所述顆粒適 合于用作造影劑和用作治療組合物的一部分，尤其用于藥物遞送。
背景技術(shù)：
用于診斷目的的超聲造影劑是可以獲得的。其中第一代造影劑由自由 氣泡組成，目前的試劑通常由氣芯(gaseous core)和殼體組成；所述殼體可 以由脂質(zhì)單層、諸如人血清白蛋白的蛋白質(zhì)或者可生物降解聚合物組成。 具有聚合物殼體的試劑常常被稱為硬殼試劑，并且它們的行為與例如脂質(zhì) 殼試劑不同。它們通過從它們的內(nèi)部釋放氣體而給出超聲造影，這僅僅在 超聲照射(例如機械指數(shù)和域脈沖長度)值的某個閾值以上發(fā)生。其它試劑 在它們變得有聲學(xué)活性之前并不表現(xiàn)出這樣的閾值。認(rèn)為具有這樣的閾值 對于其中首先產(chǎn)生無造影劑活性的圖像的某些成像技術(shù)來說是有利的。它 對于藥物遞送目的也是高度期望的，其中每個觀察到的聲猝發(fā)對應(yīng)于單一 藥物遞送事件。這使得能夠?qū)λf送的藥物的量進行定量。
常常觀察到在聚合物殼氣泡的樣品中并非所有充氣聚合物囊都在超聲 輻照時變得有聲學(xué)活性。文獻參見Bloch等人，Applied Physics Letters, 84， 631， 2004，圖1。 Bouakaz等人(Bouakaz， Versluis， DeJong， Ultrasound in Medicine and Biology, 31， 391， 2005)未能在診斷頻率和壓力下檢測特別 小C2 jxm)的囊的活化。
從造影劑中的不完全氣體釋放可能導(dǎo)致成像靈敏度和治療效能的損 失。結(jié)果可能是不必要的高劑量。對于藥物遞送來說，不完全釋放可能意 味著只有一部分藥物會被釋放，而極有可能過量藥物會在肝或脾中而不是 在感興趣的區(qū)域處積聚。
USA-6,896，659涉及使用超聲引發(fā)試劑從具有一組指定機械性能的中 空微泡中釋放，將治療劑遞送到個體內(nèi)局部區(qū)域的方法。在US-A-6，896，659 中公開的試劑具有受控的脆性，其特征為具有一致的壁厚與直徑比率，所
述比率限定離散閾值功率強度。US-A-6，896,659具體公開了微泡的制備方
法，其中在微泡生成中將環(huán)辛烷用作溶劑。該環(huán)辛烷在隨后的步驟中通過
凍干法被去除。Bouakaz等人，Ultrasound in Medicine and Biology， 31 ， 391 ，
2005發(fā)現(xiàn)，這樣的氣泡實際上難以用超聲力擊破。他們發(fā)現(xiàn)大囊與小囊相
比在較低的聲壓下破裂并且推斷大小對這些氣泡的脆性的影響仍然存在。
在一般診斷條件下，由該方法制備的顆粒的至少一部分不破裂。
WO-A-98/48783公開了可以用作超聲造影劑和用于將藥物遞送到血流
中的微粒。微粒具有包含內(nèi)層和外層的殼體。在包括以下步驟的方法中制
備所述顆粒形成生物相容材料的第一水分散體并將其與可生物降解聚合
物的第二溶液混合，其中所述第二溶液包含對于所述聚合物而言相對揮發(fā) 性的不與水混溶的溶劑和相對非揮發(fā)性的不與水混溶的非溶劑。所述相對
非揮發(fā)性的不與水混溶的非溶劑典型地為C6-C20烴。在實施例中使用環(huán)辛 烷。與US-A-6，896,659中所述的顆粒一樣，這些顆?？赡茉谝话愠晽l件 下僅部分破裂。
期望合成這樣的試劑，其能夠在診斷成像中可接受的壓力和頻率下被 聲學(xué)活化，并且這種活化優(yōu)選是完全的，釋放最優(yōu)選從所有受聲波作用的 囊中發(fā)生。本發(fā)明的另一目的是使活化百分比與囊的粒度無關(guān)，從而使試 劑釋放與囊的粒度無關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
我們已驚奇地發(fā)現(xiàn)，包含氣芯的有殼顆粒的穩(wěn)定性至少部分由殼體厚 度和水不能穿透所述殼體進入所述芯來決定。我們已發(fā)現(xiàn)，在這些顆粒的 制備方法中使用溶劑的特定組合是非常期望的。
因此，本發(fā)明在第一方面涉及包含氣芯和殼體的顆粒的制備方法，所
述方法包括以下步驟
a) 提供包含殼體成分、第一溶劑(1)和第二非溶劑(2)的混合物；
b) 將步驟(a)的混合物與含水成分混合，由此在水相中形成步驟(a)的混 合物的乳狀液；
c) 施加揮發(fā)溶劑(l)的條件；
d) 施加去除水的條件；e)施加去除非溶劑(2)的條件；
其中非溶劑(2)選自在步驟(d)的條件下蒸氣壓顯著比水低的有機成分。
在另一方面，本發(fā)明涉及由該方法獲得的顆粒，它們在造影劑和治療 劑中的包裹體，并且涉及造影劑或治療組合物，其中大部分顆粒能夠由強 度在對于超聲診斷成像而言通常的范圍內(nèi)的超聲力活化。


圖l:用于事件計數(shù)和回波強度測量的裝置的示意圖2:如實施例1中所述制備和測量的pla-pfo囊的事件計數(shù)； 圖3:如實施例1中所述制備和測量的囊的平均回波強度； 圖4:如實施例2中所述測量的混合有pla-peo的pla-pfo的事件計數(shù)； 圖5:實施例5測定的腫瘤大小。
具體實施例方式
在本發(fā)明的語境中使用以下定義。
將參考具體實施方案并參照某些附圖描述本發(fā)明，但是本發(fā)明并不局 限于此，而是僅僅由權(quán)利要求書限定。權(quán)利要求書中的附圖標(biāo)記不應(yīng)理解 成限制該范圍。所描述的附圖僅僅是示意性的而非限制性的。在附圖中， 為了說明目的， 一些元件的尺寸可能被放大而不是按比例繪制的。在本說 明書和權(quán)利要求書中使用術(shù)語"包括"或"包含"時，其并不排除其它元 件或步驟。當(dāng)提及單數(shù)名詞時使用不定冠詞或定冠詞例如"a"或"an"、"the"
時，除非另有明確規(guī)定，否則這包括該名詞的復(fù)數(shù)。
本發(fā)明涉及顆粒的制備方法，所述顆粒適合于用作造影劑或者用作藥 物組合物中的藥物遞送載體。
在本發(fā)明的方法中，步驟(a)包括提供包含殼體成分、第一溶劑(l)和第 二非溶劑(2)的混合物。
該混合物優(yōu)選大約在室溫，更優(yōu)選在4至30'C的溫度下制得。
在本發(fā)明的語境中，溶劑(l)優(yōu)選是殼體成分的良好溶劑。優(yōu)選溶劑1 是形成殼體的聚合物的良好溶劑，而非溶劑2是形成殼體的聚合物的不良 溶劑。溶劑(l)優(yōu)選至少在一定程度上溶解在水中。溶劑(l)優(yōu)選是相對揮發(fā)性的成分。
溶劑(1)優(yōu)選是在步驟(C)的條件下蒸氣壓比水高的溶劑，更優(yōu)選選自二 氯甲烷、二氯乙烷、乙酸異丙酯或它們的組合。
據(jù)信非溶劑(2)的存在是為了制備包含氣芯和殼體的顆粒(囊)而不是固 體顆粒。因此，溶劑(2)的適當(dāng)成分期望地是相對非揮發(fā)性的成分，其中所 選則的殼體成分不溶解或者僅僅很小程度地溶解。與溶劑1相反，對于非 溶劑(2)而言，高度優(yōu)選在水中的溶解度很低，接近于零。
非溶劑(2)選自在步驟(d)的條件下蒸氣壓顯著比水低的有機成分。更優(yōu) 選在歩驟(d)的條件下非溶劑(2)的蒸氣壓比水的蒸氣壓低至少5倍。應(yīng)當(dāng)理 解，選擇非溶劑(5)以使其蒸氣壓仍然足夠高以使得能夠在冷凍干燥條件下 (任選地與優(yōu)選使用公知標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備容易達到的合適減壓組合)去除。
這一低蒸氣壓會確保溶劑(2)確實保留在形成的囊內(nèi)，最后導(dǎo)致形成具 有含氣空腔的囊。優(yōu)選所述包含至少一個空腔。最優(yōu)選所述囊包含一個主 空腔和任選的其它小空腔。在步驟(c)中，如果在完全去除溶劑1之前非溶 劑(2)從囊中消失，則囊會表現(xiàn)出過大的收縮，由此增加它們的壁厚。
在優(yōu)選實施方案中，非溶劑(2)選自碳鏈長度為10至20個碳原子的烴。 發(fā)現(xiàn)有利的是從環(huán)癸烷、癸烷或它們的組合中選擇非溶劑(2)。在最優(yōu)選的 實施方案中，非溶劑(2)包括環(huán)癸垸，更加優(yōu)選非溶劑(2)基本上由環(huán)癸烷組 成。在本發(fā)明的語境中，基本上由……組成意為非溶劑(2)的至少80重量％， 優(yōu)選90-100重量％是環(huán)癸烷。
在步驟(a)中任選地使用溶劑(l)和(2)的預(yù)混物以及殼體成分和溶劑(1) 的預(yù)混物。
下一步驟(b)包括將步驟(a)的混合物與含水成分混合，由此在水相中形 成步驟(a)的混合物的乳狀液。
優(yōu)選將含有步驟(a)的混合物的殼體成分加入含水成分中。為了生成乳 狀液，優(yōu)選施加攪拌或另一種形式的攪動/剪切力。
任選地包括進一步的乳化處理以形成具有期望的、優(yōu)選單分散的粒度 分布的乳狀液。
獲得這種乳化處理的合適設(shè)備例如選自膠體磨、均化器、超聲發(fā)生器。 任選在這樣的處理之前或之后將乳狀液擠壓通過玻璃濾器。當(dāng)期望時
可以多次重復(fù)這樣的處理。
產(chǎn)生期望的具有窄分布的粒度的另一實施方案使用制備單分散乳狀液 的方法例如噴墨技術(shù)和使用微通道或微孔的乳化。對于微孔膜，可以施加 橫向流以改善粒度分布。使用噴墨技術(shù)制備顆粒的方法例如公開在共同在
審申請IB2005/052098中。在下一個步驟(c)中，施加條件以去除溶劑(l)。 在本申請的語境中，這也被稱為揮發(fā)溶劑(l)?？梢詰?yīng)用任何合適的技術(shù)以 去除溶劑(l)。
高度優(yōu)選控制條件以使水和尤其是非溶劑(2)尚不被去除。步驟(c)中的 條件優(yōu)選使得大多數(shù)非溶劑(2)尚不被去除，更優(yōu)選基本上沒有非溶劑(2)被 去除。因此，優(yōu)選在該步驟中不采取措施(例如通過施加真空)以降低混合物 周圍的壓力。
去除溶劑(l)的適合方式是將溫度升高至例如25'C至35°C，或者簡單地 通過將混合物攪拌給定量的時間來進行。
不希望受到任何理論的束縛，據(jù)信在溶劑(l)蒸發(fā)時，乳狀液內(nèi)相中的 殼體成分濃度升高到溶解度閾值以上并且在這時殼體成分會開始沉淀。
該沉淀然后導(dǎo)致在乳狀液內(nèi)相(乳狀液液滴)的表面形成聚合物殼體。據(jù) 信一旦大多數(shù)或所有溶劑(l)蒸發(fā)，就產(chǎn)生覆蓋芯的殼體成分，其包含非溶 劑(2)、水和任選的可能已在該方法較早階段加入的其它成份。
在下一步驟(d)中施加條件以從芯中去除水。這之后立即在步驟(e)中去 除非溶劑(2)。
高度優(yōu)選在兩個不同步驟中分別去除水和非溶劑(2)。實際上在這些步 驟之間有一些重疊可能是不可避免的，但是優(yōu)選應(yīng)當(dāng)避免重疊。通常水的 去除是通過例如冷凍干燥技術(shù)獲得的。非溶劑(2)的去除可能還需要減壓。
在步驟(e)之后產(chǎn)生包含經(jīng)干燥顆粒的組合物。在再懸浮之后，給藥適 當(dāng)劑量的試劑如包含這些顆粒的造影劑或治療劑。
任選在步驟(a)或(b)中包括穩(wěn)定組合物。這樣的穩(wěn)定組合物優(yōu)選選自表 面活性劑和聚合物(例如聚乙烯醇)或者至少兩種表面活性劑和/或聚合物的 組合。如果在該方法中包括這樣的穩(wěn)定劑，則該方法優(yōu)選在去除溶劑(l)之 后包括沖洗步驟以去除穩(wěn)定劑。
對于殼體材料而言，可生物降解聚合物及其組合是高度優(yōu)選的。如果
使用一種以上聚合物的組合，則聚合物之一優(yōu)選具有至少一種疏水性基團 如脂族嵌段或者一個或多個側(cè)基，或者更優(yōu)選具有氟化基團。不希望受到 任何理論的束縛，據(jù)信在制備方法中，這些基團會朝著囊的芯側(cè)定向，提 供疏水內(nèi)部。這會把水排斥在囊之外。聚合物的其它部分為囊提供足夠的 機械穩(wěn)定性以允許進行包括再分散在內(nèi)的合成操作并給出足夠的體內(nèi)穩(wěn)定 性?？缮锝到饩酆衔锶缇廴樗岷苓m合于此，其它可生物降解聚合物包括 聚乙醇酸、聚已內(nèi)酯和它們的共聚物。
在優(yōu)選實施方案中，聚合物成分是用至少一種疏水性基團改性的聚合
物，所述疏水性基團優(yōu)選選自氟化物、包含6至24個碳原子的烷基鏈或它 們的組合。
最優(yōu)選的聚合物選自具有全氟化部分的聚乳酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚 物(polylactic-polyglycoladd copolymer)、聚已內(nèi)酯或它們的組合。
低分子量聚合物通常在殼體中較少纏結(jié)，所以當(dāng)施加超聲時會較易導(dǎo) 致殼體破裂。在機械穩(wěn)定性足夠的條件下，小于10000的分子量是優(yōu)選的。 最優(yōu)選分子量為2000至10000。
任選地，包含疏水性基團的聚合物可以與其它聚合物混合以建立期望 的性質(zhì)，例如聚乙二醇化(pegylated)聚合物，或靶向選擇，例如使用生物素 化聚合物以允許靶向。用配基修飾囊的后改性是有吸引力的，原因是它確 保耙向部分位于囊的外表面。
在優(yōu)選實施方案中，顆粒具有靶向部分如抗體或抗體片段以使得能夠 靶向于人或動物體的特定部位。
任選將治療組合物引入芯中、殼體中或殼體上。最優(yōu)選將疏水性治療 成分包含在芯中。十六烷或石蠟油可以用于溶解芯中的治療組合物?？梢?包含在顆粒芯中的可能藥物包括抗癌藥如非常疏水的多柔比星 (deoxyrubicin)和紫杉醇。我們已驚奇地發(fā)現(xiàn)，十六垸是疏水性治療成分或 疏水性造影劑的非常合適的載液。我們己發(fā)現(xiàn)，這樣的成分容易保持溶解 或微細(xì)分散在十六烷中，所以這些成分會在剩余油相中進入囊芯內(nèi)部。所 以只有在用超聲活化之后，溶解的成分才從顆粒中被釋放。所以在優(yōu)選實 施方案中，本發(fā)明涉及請求保護的顆粒，其還包含治療成分和/或造影劑的 至少一種載液。最優(yōu)選的載液是十六烷。在另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本
發(fā)明的方法，其中在步驟(C)之前，用包含治療劑和/或造影劑的成分補充所 述成分，所述治療劑和造影劑溶解在優(yōu)選包含十六垸的至少一種載液中。
在另一方面，本發(fā)明的方法優(yōu)選在步驟(a)或(b)中包括治療成分的包裹體。
更加優(yōu)選將治療成分與油相，優(yōu)選十六烷或石蠟組合加入。
顆粒的芯可以包含任何氣體。優(yōu)選所述氣體是生物相容的氣體如空氣 或氮氣?；蛘呖梢允褂玫腿芙舛鹊臍怏w，例如全氟化碳。如果較高溶解度 的氣體是期望的，則包含二氧化碳可能是合適的。
為了確保通過超聲力容易地破壞顆粒，顆粒優(yōu)選具有對1至5微米的 平均半徑而言平均厚度為1至50 nm的殼體。最優(yōu)選最薄的殼體厚度至多 是顆粒平均直徑的3%。
在另一方面，本發(fā)明涉及包含氣芯和殼體的顆粒，其由本發(fā)明和如上 面更詳細(xì)描述的方法獲得。
在另一方面，本發(fā)明涉及超聲造影劑，其包含至少一種本發(fā)明的顆粒。 通常這樣的造影劑會包含許多這樣的顆粒。高度優(yōu)選大多數(shù)所述顆粒，更 加優(yōu)選80-100%的所述顆粒是由上述方法獲得的顆粒。
在優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及包含氣芯和聚合物殼體的顆粒組合物，其 中所述顆粒具有0.1至5微米的直徑和1至80 nm的殼體厚度。可以通過 以至多3，更優(yōu)選至多1.6，更優(yōu)選至多1.2，更加優(yōu)選至多l(xiāng).O，更加優(yōu)選 至多0.8的機械指數(shù)施加超聲來聲學(xué)活化這樣的顆粒。
優(yōu)選活化在0.2以上，更優(yōu)選0.2至0.8，更加優(yōu)選下限在0,2至0.6之
間的機械指數(shù)下觸發(fā)。
對于大多數(shù)超聲成像和超聲介導(dǎo)的藥物釋放應(yīng)用，期望(造影)劑包含顆 粒組合物，所述顆粒組合物包含顆粒，所述顆粒包含氣芯和聚合物殼體， 其中所述顆粒具有0.1至5微米的直徑和是顆粒直徑的至多5%，更優(yōu)選至 多4%的平均殼體厚度(優(yōu)選1至80 nm的殼體厚度)，所述顆?？梢酝ㄟ^施 加閾值范圍以上的超聲來聲學(xué)活化，其中所述閾值范圍始于0.2的機械指數(shù) 使得所述顆粒在1.2的機械指數(shù)以下表現(xiàn)出顯著的氣體釋放。
優(yōu)選超聲造影劑包含本發(fā)明的聚合物殼顆粒，其中當(dāng)在至多0.8的機械 指數(shù)下施加超聲時，至少80%，優(yōu)選80-100%的所述顆粒被聲學(xué)活化。
在另一方面，本發(fā)明涉及治療組合物，其包含至少一種本發(fā)明的顆粒。 優(yōu)選這些顆粒包含至少一種藥物成分。最優(yōu)選所述治療成分包含如上所述
的顆粒，其中當(dāng)在至多3，更優(yōu)選至多1.6，更優(yōu)選至多1.2，更加優(yōu)選至多 1.0，更加優(yōu)選至多0.8的機械指數(shù)下施加超聲時，至少80%，優(yōu)選80-100% 的所述顆粒被聲學(xué)活化。
通常這意味著在施加超聲時至少80%的顆粒從芯釋放氣體并任選地釋 放其它成份。高度期望該釋放在短時幀內(nèi)并在小機械指數(shù)范圍內(nèi)發(fā)生。
該聲學(xué)活化可以由實施例中描述的事件計數(shù)裝置監(jiān)測。在該裝置中， 當(dāng)接收的散射信號(來自活化的微粒)的振幅大于檢測系統(tǒng)的噪聲水平的兩 倍時，活化事件被檢定并計數(shù)。
在示例性實施方案中，本發(fā)明涉及包含顆粒的造影劑或治療組合物， 所述顆粒包含氣芯和聚合物殼體，其中在0.01至3，更優(yōu)選0.1至2，更優(yōu) 選0.4至1.6的機械指數(shù)范圍內(nèi)，在0.5個單位，優(yōu)選0.4個單位，更優(yōu)選 0.3個單位的機械指數(shù)窗中，至少80%的所述顆粒被超聲能量活化。
優(yōu)選該活化由在實施例所述的條件下事件計數(shù)增加到至少50來證明。
該事件計數(shù)的增加優(yōu)選對應(yīng)于在如上所述的機械指數(shù)窗和范圍內(nèi)回波 強度增加到初始值的至少1000倍。
可以進行光學(xué)觀察以查看顆粒的活化和從它們的芯釋放氣體。可以使 用由Bouakaz等人描述的和在本申請實施例中描述的光學(xué)裝置。當(dāng)例如在 大約0.9的MI下顆粒被活化時氣體的顯著釋放由于氣泡的形成而清楚可 見。因此可以通過首先在0至1.2的MI下施加超聲獲得所有顆粒的完全活 化的證據(jù)。在所述活化之后，然后在例如大約1.6的更高MI下給予進一步 的脈沖系列。如果所有顆粒先前已經(jīng)被活化，則該第二脈沖系列不引起可 見的氣體形成。
在步驟(e)之后產(chǎn)生的顆粒通常在使用前被再懸浮在合適的液體中。如 果該試劑要被用作動物或人的造影劑或治療劑，則優(yōu)選顆粒被再懸浮在生 理鹽水溶液中。
標(biāo)準(zhǔn)超聲換能器可以用于提供超聲能量。該聲能可以是脈沖式的，但 是為了藥物釋放的最大引發(fā)，優(yōu)選以連續(xù)波提供超聲能量。使用對于患者 安全性而言臨床可接受的診斷功率水平下的幾個聲脈沖，可以成像含氣體
的顆粒。
現(xiàn)在通過以下非限制性實施例舉例說明本發(fā)明。
實施例 聲學(xué)活性
如圖1中所示，用于聲學(xué)測量的裝置由三個部分組成發(fā)射部件、接 收部件和時間調(diào)制部件。所有三個部件均由個人電腦通過LabView (Texas Instrument)控制。使用在32個周期的脈沖長度下使用的l.OMHz氣穴換能 器(Panametrices V392)建立聚焦聲場。使用被動聲學(xué)檢測器檢查活化微囊的 行為。所述被動檢測器由中心頻率為5 MHz的寬頻帶聚焦換能器(直徑為 3.8 cm且焦距為5.1 cm) (Panametrics V307)和寬頻帶低噪聲信號放大器 (20dB)組成。3.0 MHz的高通濾波器(TTE-HB5-3M-65B)和10.7 MHz的低通 濾波器(MiniCircuits BLP-10.7)用于從氣穴換能器去除直接發(fā)射的、衍射引 起的1.0MHz聲信號。數(shù)字示波器(ModelLT374L， LeCroy， ChestnutRidge， NY)用于以20 MHz的采樣頻率將放大的散射信號數(shù)字化。
時間調(diào)制器(Four Channel Digital Delay/Pulse Generator; Stanford Research Systems DG535)用于在2.0 Hz的PRF (脈沖重復(fù)頻率)下同步聲學(xué) 檢測器與活化超聲脈沖?；罨瘬Q能器水平地安裝在矩形試驗箱(20.2 x 20.2 x 9.6 cm"的側(cè)壁上，而聲學(xué)檢測器垂直地放置并且與氣穴換能器成直角共焦 地對準(zhǔn)。由于發(fā)射和接收換能器都是聚焦換能器，因此檢測器僅僅對兩個 換能器的小共焦區(qū)域中的微囊非常敏感。使用被動技術(shù)，可以通過表征接 收的聲信號的波形，和通過由信號的波譜分析諧波和噪聲發(fā)生來研究微囊 的活化閾值和活化后振蕩(或活化引起的破壞)。對于1.0 MHz猝發(fā)音的每 100次聲波作用，通過使用LabWew自動計數(shù)接收的散射信號測量微囊的 活化事件計數(shù)(或相對活化率)。
來自LeCroy數(shù)字示波器的數(shù)字化散射信號被傳遞到PC供進一步處 理。使用路徑頻帶為2.5至6.5 MHz的10階數(shù)字Butterworth帶通濾波器進 一步增加實驗系統(tǒng)的檢測靈敏度(信噪比)。所以，第一諧波(在l.O MHz的 發(fā)射頻率下)和第二諧波在散射信號中被完全去除。長度為50微秒(g卩1000 個數(shù)據(jù)平特(pints))的每個濾過信號(含有3階、4階、5階和6階諧波)被求
和并平均以用于進一步增強檢測靈敏度(信噪比)。當(dāng)接收的散射信號(來自
活化的微粒)的振幅高于檢測系統(tǒng)的噪聲水平(即0.0015 mV或1.5微伏)的兩 倍時，活化事件被檢定并計數(shù)。
用一定量的去離子水將各樣品瓶復(fù)原并稀釋，這取決于瓶內(nèi)部顆粒的 總數(shù)。然后使用精密移液管(Eppendorf200)將預(yù)先確定的少量再懸浮微囊樣 品注射到矩形試驗箱中。4升去離子水用作矩形試驗箱中的運載和傳播介質(zhì) 并且在室溫下用磁力攪拌器保持循環(huán)。
以此方式，試驗箱中顆粒的數(shù)目得到測定。
體內(nèi)成像
將試劑在4 ml磷酸鹽緩沖鹽水中復(fù)原并注射到大鼠尾靜脈中。在30 秒的時間給予0.2 ml。在諧波模式下在0.15的機械指數(shù)下使用帶寬為7MHz 的15 MHz換能器成像試劑。觀察到左心室的清楚造影增強并檢測到心肌 的灌注。試劑循環(huán)至少5分鐘。
實施例l
聚合物合成
根據(jù)受讓人為紐約州立大學(xué)的文獻US-A-6329470中給出的操作，使用 lH,lH-全氟辛垸-l-醇作為引發(fā)劑，合成在末端具有全氟化部分的聚乳酸 (pla)。我們將使用縮寫pla-pfo表示該聚合物。使用已知的聚苯乙烯尺寸標(biāo) 準(zhǔn)作為比較通過凝膠滲透色譜法獲得大約6000的分子量。
pla-pfo囊
將pla-pfo溶解在二氯甲烷中以獲得5% (w/w)的溶液(溶液A)。將環(huán)癸 烷與二氯甲垸混合以獲得10% (w/w)的混合物(溶液B)。將0.25 g溶液A與 1 g溶液B混合(步驟a)。將該混合物加入10 g 0.3%的pva溶液中并且通過 將混合物擠壓通過玻璃濾器迸行乳化。將其重復(fù)10次(步驟b)，之后將乳 狀液攪拌一小時以蒸發(fā)二氯甲烷并完成囊形成(步驟c)。將乳狀液沖洗4次 以去除過量的pva。使用離心以分離囊和液體。在所有沖洗步驟中，囊均形 成泡沬層，表明囊的密度低于水。加入3%的聚乙二醇并且在1 mbar的壓 力下(步驟d)和隨后在0.03 mbar的壓力下(步驟e)凍干樣品以去除環(huán)癸烷并
且在使用前再分散。
基于初始濃度，估計殼體厚度為半徑的5%，對于直徑為2pm的囊， 所述殼體厚度為50nm。
將含有約20000個囊(使用庫爾特粒度儀，在1至30微米之間定量測 量而確定)的試劑的樣品在4升水中稀釋。聲學(xué)事件的數(shù)目用上面所述的圖 1中的裝置計數(shù)，并且在圖2中作為機械指數(shù)的函數(shù)被繪制。在聲學(xué)事件發(fā) 生之前觀察到清楚的閾值。該閾值對應(yīng)于約0.7的機械指數(shù)，并且在1.1的 機械指數(shù)之前事件的數(shù)目已上升到50。參見圖3，也觀察到聲強度的陡增。
使用Bouakaz等人所述的裝置(UMB2005)進行光學(xué)觀察。將薄壁樣品 再分散并且注射到200微米的纖維中。將該纖維定位在于2.25 MHz下工作 的單元件換能器的焦點。對于從0至1.4的一系列機械指數(shù)，在每個設(shè)置使 用10次循環(huán)進行高速照相機觀察。約10個顆粒在視場中。在0.9的MI下 所有顆粒均表現(xiàn)出顯著的氣體釋放，在隨后的超聲猝發(fā)中，在1.2的MI下 未檢測到活性，表明所有顆粒均已完全失去了包封的氣體。
實施例2
具有pla-pfo和pla-peo的囊
將pla-pfo溶解在二氯甲烷中以獲得5% (w/w)的溶液(溶液A)。將 pla-peo溶解在二氯甲烷中以獲得5%的溶液(溶液B)。將環(huán)癸烷與二氯甲烷 混合以獲得10% (w/w)的混合物(溶液B)。將0.25 g溶液A和0.25 g溶液B 與1 g溶液B混合(步驟a)。將該混合物加入10 g 0.3%的pva溶液中并且通 過將混合物擠壓通過玻璃濾器進行乳化。將其重復(fù)10次(步驟b)，之后將 乳狀液攪拌一小時以蒸發(fā)二氯甲烷并完成囊形成(步驟c)。將乳狀液沖洗4 次以去除過量的pva。使用離心以分離囊和液體。在所有沖洗步驟中，囊均 形成泡沫層，表明囊的密度低于水。加入3%的聚乙二醇并且在1 mbar的 壓力下(步驟d)和隨后在0.03 mbar的壓力下(步驟e)凍干樣品以去除環(huán)癸垸 并且在使用前再分散。
將含有約20000個囊(使用庫爾特粒度儀，在1至30微米之間定量測 量而確定)的試劑的樣品在4升水中稀釋。聲學(xué)事件的數(shù)目用所描述的裝置
計數(shù)，并且在圖4中作為機械指數(shù)的函數(shù)被繪制。在聲學(xué)事件發(fā)生之前觀 察到清楚的閾值。該閾值對應(yīng)于約0.7的機械指數(shù)，并且在1.2的機械指數(shù) 之前事件的數(shù)目已上升到45。
實施例3
靶向造影劑
從聚交酯的混合物制備生物素化的試劑，所述混合物是具有氟化端
基的聚交酯(pla-pfo)、聚乙二醇化的聚交酯(pla-peo)和生物素化的、聚乙二 醇化的聚交酯(pla-peo-生物素)，其中生物素共價鍵合于聚乙二醇化的基團， 所有聚交酯的平均分子量均在7000以下。以pla-pfo : pla-peo : pla-peo-生物 素為5:4:1的比率使用聚合物。將0.25 g在二氯甲烷中5%的聚合物溶液與 1 g在二氯甲垸中的10%環(huán)癸烷混合。將該混合物加入10 g 0.3。/。的pva溶 液中并且通過將混合物擠壓通過1 pm玻璃濾器進行乳化。將其重復(fù)10次， 之后將乳狀液攪拌一小時以蒸發(fā)二氯甲垸并制得環(huán)癸垸填充的囊。將乳狀 液沖洗4次以去除過量的pva。使用離心分離囊和液體。在所有沖洗步驟中， 囊均形成泡沬層，表明囊的密度低于水。加入3%的聚乙二醇并且凍干樣品 以去除環(huán)癸垸并且在使用前再分散。
在流動池中發(fā)現(xiàn)囊附著到經(jīng)抗生蛋白鏈菌素預(yù)處理的聚苯乙烯表面。 使用Panametrix V302換能器輸送超聲脈沖，0個周期猝發(fā)，脈沖重復(fù)頻 率為10kHz(占空因數(shù)為1%)。在典型視場中積累200-400個充氣囊。在暴 露于超聲之后在400mV的峰峰設(shè)置下未看到剩余的囊，表明所有附著的囊 均有聲學(xué)活性。
實施例4
部分油填充的囊
從0.25g在二氯甲烷中的5。/。pla-pfo溶液、0.5g在二氯甲烷中的10°/。 環(huán)癸烷和0.5 g在二氯甲烷中的10%十六烷制備囊。將乳狀液沖洗4次以去 除過量的pva。使用離心以分離囊和液體。在所有沖洗步驟中，囊均形成泡 沬層，表明囊的密度低于水。加入3%的聚乙二醇并且凍干樣品以去除環(huán)癸 烷并且在使用前再分散。
事件計數(shù)測量顯示閾值比不用十六烷制備的囊稍高，但是活化率與不 用十六垸制備的囊不能區(qū)分。
實施例5—載藥造影劑
將pla-pfo溶解在二氯甲烷中以獲得5% (w/w)的溶液(溶液A)。
將紫杉醇溶解在二氯甲垸中以獲得10mg/ml?；旌?.5 g聚合物溶液、 1 g紫杉醇溶液、100mg十六垸和100mg環(huán)癸烷和0.5 g二氯甲烷。將該 混合物加入10 g 0.3%的pva溶液中并且通過將混合物擠壓通過玻璃濾器進 行乳化。將其重復(fù)10次，之后將乳狀液攪拌一小時以蒸發(fā)二氯甲'烷并完成 囊形成。將乳狀液沖洗4次以去除過量的pva。使用離心以分離囊和液體。 在所有沖洗步驟中，囊均形成泡沫層，表明囊的密度低于水。加入3%的聚 乙二醇并且凍干樣品以去除環(huán)癸烷并且在使用前再分散。
將試劑再分散在磷酸鹽緩沖鹽水(0.5 ml)中，提供10 mg紫杉醇/ml的 試劑。對在左和右后腿區(qū)域中對稱地帶有兩個小MC38 (鼠克隆腺癌)腫瘤的 每只小鼠進行兩次25 ^試劑的注射。
使用單元件聚焦換能器輸送治療超聲(l MHz，脈沖長度300 (is和PRF
50Hz)。利用其尖端指向腫瘤的定制膠錐作為換能器和腫瘤之間的聲學(xué)偶聯(lián) 材料。
利用連接到超聲掃描儀(PhilipsHDI5000)的高頻探頭CL15-7上的低MI 諧波模式(opt:具有組織特異性預(yù)置的HGen:脈管手術(shù)/腫瘤)監(jiān)測注射和1 MHz超聲輻照。對于成像，為了最小化氣泡破壞，使用0.15的低MI。成 像深度為1.9 cm并且焦距為 1.5 cm。
在第一次注射之后，可以在低MI諧波成像模式中觀察到試劑到達腫瘤 脈管系統(tǒng)中，然后輸送10秒治療超聲，結(jié)果不再能檢測到破壞的試劑。在 約10秒之后再次觀察到新試劑流入腫瘤內(nèi)部，然后破壞脈沖持續(xù)大概10 秒。這樣間歇地施加治療超聲輻照5分鐘。在第二次注射發(fā)生之后重復(fù)以 上操作。
如圖5中所示，經(jīng)超聲治療的腫瘤的腫瘤生長明顯比未治療的腫瘤延 遲，在圖5中顯示了施加和不施加治療超聲的腫瘤大小變化。
權(quán)利要求
1.包含氣芯和殼體的顆粒的制備方法，所述方法包括以下步驟a)提供包含殼體成分、第一溶劑(1)和第二非溶劑(2)的混合物；b)將步驟(a)的混合物與含水成分混合，由此在水相中形成步驟(a)的混合物的乳狀液；c)施加揮發(fā)溶劑(1)的條件；d)施加去除水的條件；e)施加去除非溶劑(2)的條件；其特征在于非溶劑(2)選自在步驟(d)的條件下蒸氣壓顯著比水低的有機成分。
2、 權(quán)利要求l的方法，其中非溶劑(2)的蒸氣壓比水低至少5倍。
3、 權(quán)利要求1的方法，其中非溶劑(2)選自碳鏈長度為10至20個碳原 子的烴。
4、 權(quán)利要求1的方法，其中所述非溶劑(2)選自環(huán)癸烷、癸垸或它們的 組合。
5、 權(quán)利要求4的方法，其中所述非溶劑(2)基本上由環(huán)癸烷組成。
6、 權(quán)利要求l的方法，其中所述殼體成分是聚合物，其優(yōu)選選自疏水 性聚合物。
7、 權(quán)利要求6的方法，其中所述聚合物成分包括用至少一種疏水性基 團改性的聚合物，所述疏水性基團優(yōu)選選自氟化物、包含6至24個碳原子 的垸基鏈或它們的組合。
8、 權(quán)利要求7的方法，其中所述聚合物選自具有全氟化部分的聚乳酸、 聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚已內(nèi)酯、s-己內(nèi)酯或它們的組合。
9、 權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(a)或(b)中包括穩(wěn)定成分。
10、 權(quán)利要求1的方法，其中溶劑(l)是在步驟(c)的條件下蒸氣壓比水 高的溶劑。
11、 權(quán)利要求1-10中任一項的方法，其中在步驟(c)之前，用包含治療 劑和/或造影劑的成分補充所述成分，所述治療劑和造影劑溶解在至少一種 載液中。
12、 權(quán)利要求ll的方法，其中所述載液包含十六烷。
13、 權(quán)利要求1的方法，其包括治療成分的包裹體。
14、 權(quán)利要求1的方法，其中所述顆粒具有對1至5微米的平均半徑 而言平均厚度為1至50 nm的殼體。
15、 包含氣芯和殼體的顆粒，其由權(quán)利要求1-14中任一項的方法獲得。
16、 超聲診斷成像造影劑，其包含至少一種權(quán)利要求15的顆粒。
17、 治療組合物，其包含至少一種權(quán)利要求15的顆粒。
18、 權(quán)利要求16的超聲造影劑或權(quán)利要求17的治療劑，其包含許多 顆粒，其中大多數(shù)所述顆粒，更優(yōu)選80-100%的所述顆粒是由權(quán)利要求1 的方法獲得的顆粒。
19、 包含氣芯和聚合物殼體的顆粒組合物，其中所述顆粒具有O.l至5 微米的直徑和1至80 nm的殼體厚度，所述顆?？梢酝ㄟ^以至多3的機械 指數(shù)施加超聲來聲學(xué)活化。
20、 超聲造影劑，其包含權(quán)利要求19的聚合物殼顆粒，其中在0.01 至3的機械指數(shù)范圍內(nèi)，在0.5個單位的機械指數(shù)窗中，至少80%，優(yōu)選 80-100%的所述顆粒被超聲能量活化。
21、 治療組合物，其包含權(quán)利要求19的顆粒，所述顆粒還包含至少一 種藥物成分。
22、 權(quán)利要求21的治療組合物，其中在0.01至3的機械指數(shù)范圍內(nèi)， 在0.5個單位的機械指數(shù)窗中，至少80%，優(yōu)選80-100%的所述顆粒被超聲 能量活化。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含氣芯和殼體的顆粒的制備方法，所述顆粒適合于用作造影劑和用作治療組合物的一部分，尤其用于藥物遞送。在提供超聲能量時這些顆粒顯示驚人高的活化水平。
文檔編號A61K9/50GK101374506SQ200780003406
公開日2009年2月25日 申請日期2007年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月24日
發(fā)明者C·霍爾, J·E·T·范瓦姆爾, M·R·博默, M·埃默, N·德容, S·H·P·M·德溫特, W·T·師 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司