專利名稱：：傷寒、副傷寒特異性轉(zhuǎn)移因子口服制劑的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及傷寒、副傷寒特異性轉(zhuǎn)移因子口服制劑的制備工藝。
背景技術(shù)：
：傷寒(typhiodfever)是由傷寒沙門菌引起的，人是其唯一的天然宿主及儲存者，主要發(fā)病于學(xué)齡兒童、青壯年及旅游者，大多是通過該菌攜帶者的分泌物而污染食物和水來傳播，發(fā)病季節(jié)高峰在79月。到目前為止，傷寒仍然是全球的公共衛(wèi)生問題，全球均有傷寒的報道，以熱帶、亞熱帶地區(qū)多見。隨著社會發(fā)展和公共衛(wèi)生狀況的改善傷寒發(fā)病率有所下降，但在發(fā)展中國家仍有地方性流行或局部暴發(fā)流行的趨勢。在我國貴州、廣西、云南、新疆、江蘇等省市傷寒仍是高發(fā)區(qū)。在遵義，近20年的流行病學(xué)調(diào)査表明，傷寒的最高發(fā)病率為10.22/10萬，且發(fā)病總體趨勢呈上升態(tài)勢，約隔5年就有一次流行高峰。副傷寒(paratyphoidfever)是由副傷寒沙門菌所致的急性傳染病，副傷寒的病原體有3型甲型副傷寒沙門菌、乙型副傷寒沙門菌和丙型副傷寒沙門菌。甲型副傷寒是一種由甲型副傷寒沙門菌引起的急性腸道傳染病，近年來在貴州省的發(fā)病明顯增高。據(jù)貴州省疾控中心通報，僅2004年上半年遵義市開發(fā)區(qū)發(fā)生的副傷寒累計發(fā)病達(dá)1750例。其主要的致病因素是革蘭氏陰性細(xì)胞壁的脂多糖(LPS)引起發(fā)熱、白細(xì)胞反應(yīng)及內(nèi)毒素血癥等。甲型副傷寒沙門菌侵入機(jī)體后，主要在細(xì)胞內(nèi)生長繁殖，因而要徹底殺滅這類胞內(nèi)寄生菌，特異性細(xì)胞免疫是主要的防御機(jī)制。轉(zhuǎn)移因子(transferfactor)是白細(xì)胞中有免疫活性的淋巴細(xì)胞所釋放的一種低分子核苷酸和和多肽，其本質(zhì)是少量核酸和小分子多肽的混合物。它可以將被某種抗原(病原)免疫的特異性免疫反應(yīng)從某一個體轉(zhuǎn)移到另一個體，非特異性的提高受者的免疫功能，促進(jìn)免疫細(xì)胞因子釋放。轉(zhuǎn)移因子包括非特異性轉(zhuǎn)移因子和特異性轉(zhuǎn)移因子。非特異性轉(zhuǎn)移因子主要用于提高人體的免疫功能和抗病能力，而特異性轉(zhuǎn)移因子除了具備非特異性轉(zhuǎn)移因子的功能外，還可以激發(fā)針對某種抗原的免疫反應(yīng)。轉(zhuǎn)移因子具有可透析性，不含蛋白，粗制轉(zhuǎn)移因子中含多肽、核酸，在一2(TC條件下可長期保存，分子量小于5000，使用很小的劑量就可以使受體產(chǎn)生局部或全身反應(yīng)，作用時間快，3-4小時就可激活宿主的淋巴細(xì)胞，使受體致敏。傷寒、副傷寒特異性轉(zhuǎn)移因子能傳遞傷寒抗原特異性物質(zhì)，激活T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，介導(dǎo)免疫反應(yīng)的發(fā)生，同時提高IL-2、IFN和集落刺激因子等多種細(xì)胞因子在體內(nèi)的生成，作用于免疫系統(tǒng)的多個環(huán)節(jié)，調(diào)整多項免疫反應(yīng)，以增強(qiáng)受體的免疫功能。傷寒、副傷寒目前主要是采用化學(xué)藥物治療，化學(xué)藥物治療導(dǎo)致出現(xiàn)了越來越多的耐藥菌株，并且缺乏效果理想的疫苗；目前還沒有緊急預(yù)防和治療傷寒、副傷寒的生物制品。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于公開一種傷寒、副傷寒特異性轉(zhuǎn)移因子口服制劑的制備工藝，為傷寒、副傷寒的緊急預(yù)防和生物治療提供一種即安全又有效的生物制劑。本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案傷寒、副傷寒特異性轉(zhuǎn)移因子口服制劑的制備工藝，該工藝包括如下步驟(1)制備傷寒、副傷寒沙門菌免疫原取傷寒沙門菌H9(n株、0901株和副傷寒沙門菌株三種菌株的腦心浸液固體培養(yǎng)基20小時培養(yǎng)物，&01株20小時培養(yǎng)物用0.4%甲醛生理鹽水溶解后，菌液置4。C冰箱殺菌3-5天，0901株和副傷寒沙門菌株20小時培養(yǎng)物分別用0.5%石炭酸生理鹽水溶解后，菌液置于37'C孵箱過夜殺菌；500r/m離心洗滌菌液2次，根據(jù)計算公式細(xì)菌數(shù)OD5oo/1.25X2X109，殺滅后的Hg(u菌株、0901菌株、副傷寒沙門菌株分別用無菌生理鹽水配制成5億個菌/ml后，按照l:1:l的比例混合三種菌液，無菌實驗檢測為陰性后分裝10ml/瓶，得免疫原，置于4。C冰箱保存；(2)動物體內(nèi)免疫免疫過程為第l、3、5、7天背部皮下多點注射0.5ml傷寒、副傷寒沙門菌免疫原；第14和21天背部皮下多點注射1.0ml傷寒、副傷寒沙門菌免疫原；第28天靜脈注射1.0ml傷寒、副傷寒沙門菌免疫原；免疫結(jié)束7天后檢測傷寒、副傷寒抗體效價達(dá)到1/2000，表示免疫成功；(3)體外免疫動物淋巴細(xì)胞無菌分離出動物脾臟淋巴細(xì)胞，用10。/。小牛血清RPMI1640液制成5Xl(/個/ml的淋巴細(xì)胞懸液，淋巴細(xì)胞懸液、濃度為50yg/ml的PHA溶液和5X106個/1111傷寒、副傷寒免疫原按5:1:l的比例加入培養(yǎng)瓶內(nèi)，置5%(]02、37°C、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6天，待用；(4)制備傷寒、副傷寒特異性轉(zhuǎn)移因子取體內(nèi)免疫成功動物的脾臟、淋巴結(jié)等淋巴組織加入4倍量的三蒸水絞碎勻漿后，超聲破碎細(xì)胞，采用凍結(jié)溫度為-255(TC、融化溫度為203(TC的凍融條件凍融6次，最后將勻漿透析；(5)體外免疫動物淋巴細(xì)胞后，收集淋巴細(xì)胞超聲破碎細(xì)胞，采用凍結(jié)溫度為-255CTC、融化溫度為2030。C的凍融條件凍融6次，然后置低溫離心機(jī)以500r/min離心20min，取上清液透析；(6)收集步驟(4)和(5)中所得透析液過濾除菌，以Lorry法測定特異性轉(zhuǎn)移因子的多肽含量，以多肽含量為lmg/ml為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相應(yīng)的稀釋或濃縮以多肽含量lmg/ml作為lU，按生物制品規(guī)程分裝，每支2ml含有2單位。其中步驟(4)和(5)中所述透析條件為溫度為4'C、勻漿液和透析液比例為l:4、IOKD透析袋、中間震蕩6次、換液一次、總透析時間不超過40小時。采用如上技術(shù)方案制得的特異性轉(zhuǎn)移因子口服制劑的主要成分是由低聚核苷酸和多肽組成的不含蛋白的一種可溶解、可透析、可超濾的小分子物質(zhì)，分子量一般在30005000道爾頓。本發(fā)明產(chǎn)品具有轉(zhuǎn)移細(xì)胞信息，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，特異性地抑制和殺傷傷寒、副傷寒沙門菌的功能，并且能增強(qiáng)非特異性免疫功能，且服用無過敏反應(yīng)，是輔助緊急預(yù)防和生物治療傷寒、副傷寒的一種安全有效的生物制劑。本發(fā)明的制備工藝具有如下的特點1、免疫原采用弱毒性的傷寒沙門菌H9(n株和09(n株、副傷寒沙門菌制備，免疫動物體內(nèi)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答；2、免疫的次數(shù)、部位及劑量既可保證傷寒、副傷寒有效應(yīng)答又不引起免疫耐受；3、特定透析的條件能提高傷寒、副傷寒特異性轉(zhuǎn)移因子有效成分的含量；4、體外免疫淋巴細(xì)胞，可節(jié)約成本，有利于控制和規(guī)范制備過程。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的產(chǎn)品是取材于經(jīng)過傷寒、副傷寒沙門菌免疫原免疫動物后的淋巴組織或者體外免疫淋巴細(xì)胞，采用勻漿透析法制得，具有以下優(yōu)點(1)該口服制劑具有轉(zhuǎn)移細(xì)胞信息、介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)、特異性地抑制和殺傷傷寒、副傷寒沙門菌的功能，并且能增強(qiáng)非特異性免疫功能；(2)因特異性轉(zhuǎn)移因子本身沒有免疫原性，所以服用無過敏反應(yīng)，使用安全，效果明顯，患者服用不會產(chǎn)生抗藥性；(3)本產(chǎn)品采用口服給藥途徑，服用不受條件的限制，既方便，又不影響有效成分本身的生物學(xué)活性，是一種安全有效的制劑，具有很好的社會價值和市場應(yīng)用前景。具體實施例方式本發(fā)明實施例按照如下步驟制備傷寒、副傷寒特異性轉(zhuǎn)移因子口服制劑(1)制備傷寒、副傷寒沙門菌免疫原取傷寒沙門菌H9(n株、0901株和副傷寒沙門菌株三種菌株的腦心浸液固體培養(yǎng)基20小時培養(yǎng)物，&01株20小時培養(yǎng)物用0.4%甲醛生理鹽水溶解后，菌液置4。C冰箱殺菌3-5天，0901株和副傷寒沙門菌株20小時培養(yǎng)物分別用0.5%石炭酸生理鹽水溶解后，菌液置于37'C孵箱過夜殺菌；500r/m離心洗滌菌液2次，根據(jù)計算公式細(xì)菌數(shù)OD5oo/1.25X2X109，殺滅后的Hg(u菌株、0901菌株、副傷寒沙門菌株分別用無菌生理鹽水配制成5億個菌/ml后，按照l:1:l的比例混合三種菌液，無菌實驗檢測為陰性后分裝10ml/瓶，得免疫原，置于4。C冰箱保存；(2)動物體內(nèi)免疫免疫過程為第l、3、5、7天背部皮下多點注射0.5ml傷寒、副傷寒沙門菌免疫原；第14和21天背部皮下多點注射1.0ml傷寒、副傷寒沙門菌免疫原；第28天靜脈注射1.0ml傷寒、副傷寒沙門菌免疫原；免疫結(jié)束7天后檢測傷寒、副傷寒抗體效價均達(dá)到1/2000，表示免疫成功；(3)體外免疫動物淋巴細(xì)胞無菌分離出動物脾臟淋巴細(xì)胞，用10。/。小牛血清RPMI1640液制成5Xl(/個/ml的淋巴細(xì)胞懸液，淋巴細(xì)胞懸液、濃度為50yg/ml的PHA溶液和5X106個/!111傷寒沙門菌免疫原按5:1:l的比例加入培養(yǎng)瓶內(nèi)，置5%(]02、37°C、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6天，待用；(4)制備傷寒特異性轉(zhuǎn)移因子(typhoidfeverspecifictransferfactor，簡稱T-STF):取體內(nèi)免疫成功動物的脾臟、淋巴結(jié)等淋巴組織加入4倍量的三蒸水絞碎勻漿后，超聲破碎細(xì)胞，采用凍結(jié)溫度為-255(TC、融化溫度為203(TC的凍融條件凍融6次，最后將勻漿在4'C溫度下、勻漿液和透析液比例為1:4、使用10KD透析袋透析，中間振蕩6次、換液一次、總透析時間不超過40小時；(5)體外免疫動物淋巴細(xì)胞后，收集淋巴細(xì)胞超聲破碎細(xì)胞，采用凍結(jié)溫度為-255CTC、融化溫度為2030。C的凍融條件凍融6次，然后置低溫離心機(jī)以500r/min離心20min，取上清液在4'C溫度下、勻漿液和透析液比例為1:4、使用10KD透析袋透析，中間振蕩6次、換液一次、總透析時間不超過40小時；(6)收集步驟(4)和(5)中所得透析液過濾除菌，以Lorry法測定T-STF的多肽含量，以多肽含量為lmg/ml為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相應(yīng)的稀釋或濃縮以多肽含量lmg/ml作為lU，按生物制品規(guī)程分裝，每支2ml含有2單位。本發(fā)明產(chǎn)品的檢定1、外觀無色或者淡黃色，略帶腥味的透明澄清液體。2、PH值P朋.07.5，符合規(guī)定。3、蛋白質(zhì)20%磺基水楊酸法，無沉淀。4、核糖含量3.5-二羥基甲苯比色法，〉0.3mg/ml。5、多肽含量Lorry法測定，1.0mg/ml。6、紫外分光光度計均在258.0263.Onm處有一處高吸收峰，在230.0243.0nm處有一低吸收峰，至300.Onm開始隨波的增加接近于0。E260/280=l.82。7、無菌試驗按2005年版《中國藥典》附錄XIH檢査，符合規(guī)定。8、熱原質(zhì)按2005年版《中國藥典》附錄XIE檢査，符合規(guī)定。9、安全試驗取體重250300g的健康豚鼠2只，腹腔注射本品5ml，觀察3天和7天，豚鼠健康存活，活動自如，體重未減輕，注射點無硬結(jié)和化膿。10、活性測定10.1、白細(xì)胞粘附抑制試驗(LAIT):T-STF口服制劑lml給6只昆明種小鼠灌胃，生理鹽水作為對照組，連續(xù)7天后，無菌取脾，制備脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞終濃度為5Xl(^個/ml。以青霉素瓶進(jìn)行LAIT，每瓶加入淋巴細(xì)胞懸液O.lml，傷寒沙門菌H謝和O謝免疫原(5X106CFU/ml)0.lml和20。/。小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液0.lml，每只動物做兩個復(fù)瓶，孵育前各瓶取20yl計數(shù)每瓶細(xì)胞數(shù)，將瓶移入C02培養(yǎng)箱內(nèi)，在37'C、5%(]02及飽和濕度條件下，培養(yǎng)2.5h。計數(shù)孵育后細(xì)胞數(shù)，以粘附抑制率表示結(jié)果。結(jié)果T-STF口服制劑組白細(xì)胞粘附抑制率為50.04士7.7W，顯著高于生理鹽水對照組的粘附抑制率15.08±3.40%，表明T-STF口服制劑含有介導(dǎo)對傷寒沙門菌抗原特異性LAI效應(yīng)的免疫活性物質(zhì)。10.2、毒株攻擊實驗T-STF口服制劑lml給48只昆明種小鼠灌胃(T-STF組)，生理鹽水作為對照組(NS組)，連續(xù)7天，第10天用傷寒沙門菌(ATCC編號58T779)毒株LD50(含于0.5ml中)腹腔接種，進(jìn)行攻擊實驗，觀察一般情況、3d和7d的存活率。毒株攻擊后各實驗組小鼠的一般情況、3d和7d的存活率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結(jié)果經(jīng)卡方檢驗統(tǒng)計分析T-STF組相對NS組有較高的存活率，說明T-STF可以有效降低傷寒的感染率和死亡率，產(chǎn)生有效的保護(hù)力；轉(zhuǎn)移給正常小鼠的細(xì)胞免疫能力是針對傷寒沙門菌的，且傳遞特異性活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)，具有抗傷寒的效應(yīng)。權(quán)利要求1.一種傷寒、副傷寒特異性轉(zhuǎn)移因子口服制劑的制備工藝，該工藝包括如下步驟(1)制備傷寒、副傷寒沙門菌免疫原取傷寒沙門菌H901株、O901株和副傷寒沙門菌株三種菌株的腦心浸液固體培養(yǎng)基20小時培養(yǎng)物，H901株20小時培養(yǎng)物用0.4％甲醛生理鹽水溶解后，菌液置4℃冰箱殺菌3-5天，O901株和副傷寒沙門菌株20小時培養(yǎng)物分別用0.5％石炭酸生理鹽水溶解后，菌液置于37℃孵箱過夜殺菌；500r/m離心洗滌菌液2次，根據(jù)計算公式細(xì)菌數(shù)＝OD500/1.25×2×109，殺滅后的H901菌株、O901菌株、副傷寒沙門菌株分別用無菌生理鹽水配制成5億個菌/ml后，按照1∶1∶1的比例混合三種菌液，無菌實驗檢測為陰性后分裝10ml/瓶，得免疫原，置于4℃冰箱保存；(2)動物體內(nèi)免疫免疫過程為第1、3、5、7天背部皮下多點注射0.5ml傷寒、副傷寒沙門菌免疫原；第14和21天背部皮下多點注射1.0ml傷寒、副傷寒沙門菌免疫原；第28天靜脈注射1.0ml傷寒、副傷寒沙門菌免疫原；免疫結(jié)束7天后檢測傷寒、副傷寒抗體效價均達(dá)到1/2000，表示免疫成功；(3)體外免疫動物淋巴細(xì)胞無菌分離出動物脾臟淋巴細(xì)胞，用10％小牛血清RPMI1640液制成5×107個/ml的淋巴細(xì)胞懸液，淋巴細(xì)胞懸液、濃度為50μg/ml的PHA溶液和5×106個/ml傷寒、副傷寒免疫原按5∶1∶1的比例加入培養(yǎng)瓶內(nèi)，置5％CO2、37℃、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6天，待用；(4)制備傷寒、副傷寒特異性轉(zhuǎn)移因子取體內(nèi)免疫成功動物的脾臟、淋巴結(jié)等淋巴組織加入4倍量的三蒸水絞碎勻漿后，超聲破碎細(xì)胞，采用凍結(jié)溫度為-25～50℃、融化溫度為20～30℃的凍融條件凍融6次，最后將勻漿透析；(5)體外免疫動物淋巴細(xì)胞后，收集淋巴細(xì)胞超聲破碎細(xì)胞，采用凍結(jié)溫度為-25～50℃、融化溫度為20～30℃的凍融條件凍融6次，然后置低溫離心機(jī)以500r/min離心20min，取上清液透析；(6)收集步驟(4)和(5)中所得透析液過濾除菌，以Lorry法測定特異性轉(zhuǎn)移因子的多肽含量，以多肽含量為1mg/ml為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相應(yīng)的稀釋或濃縮以多肽含量1mg/ml作為1單位，按生物制品規(guī)程分裝，每支2ml含有2單位。2.如權(quán)利要求l所述的傷寒、副傷寒特異性轉(zhuǎn)移因子口服制劑的制備工藝，其特征在于步驟(4)和(5)中所述透析條件為溫度為4'C、勻漿液和透析液比例為l:4、IOKD透析袋、中間震蕩6次、換液一次、總透析時間不超過40小時。全文摘要本發(fā)明公開了一種傷寒、副傷寒特異性轉(zhuǎn)移因子口服制劑的制備工藝，該工藝主要包括制備免疫原，動物體內(nèi)免疫，體外免疫動物淋巴細(xì)胞，制備傷寒、副傷寒特異性轉(zhuǎn)移因子等步驟。本發(fā)明口服制劑具有轉(zhuǎn)移細(xì)胞信息、介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)、特異性地抑制和殺傷傷寒、副傷寒沙門菌的功能，并且能增強(qiáng)非特異性免疫功能；該口服制劑服用無過敏反應(yīng)，使用安全，效果明顯，患者服用不會產(chǎn)生抗藥性；本產(chǎn)品采用口服給藥途徑，服用不受條件的限制，既方便，又不影響有效成分本身的生物學(xué)活性，是一種安全有效的制劑，具有很好的社會價值和市場應(yīng)用前景。文檔編號A61P31/00GK101314032SQ200710200719公開日2008年12月3日申請日期2007年5月30日優(yōu)先權(quán)日2007年5月30日發(fā)明者孫萬邦,翔王,羅軍敏申請人:遵義醫(yī)學(xué)院