專(zhuān)利名稱(chēng)：聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物和其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物具有提高體內(nèi)血紅蛋白含量和網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)目的生物學(xué)活性，本發(fā)明的應(yīng)用領(lǐng)域涉及生物化學(xué)、藥物化學(xué)以及人類(lèi)疾病的治療。
背景技術(shù)：
促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EPO)是一種糖蛋白激素，分子量約34kD。血漿中存在的促紅細(xì)胞生成素由165個(gè)氨基酸組成，糖基化程度很高，糖基成分主要是唾液酸。根據(jù)碳水.化合物含量不同，天然存在的促紅細(xì)胞生成素分為兩種類(lèi)型，a型含34^的碳水化合物，p型含26%的碳水化合物。兩種類(lèi)型在生物學(xué)特性、抗原性及臨床應(yīng)用效果上均相同。人類(lèi)促紅細(xì)胞生成素基因位于7號(hào)染色體長(zhǎng)22區(qū)。1985年其cDNA被成功克隆，并利用基因重組技術(shù)開(kāi)始大批量生產(chǎn)重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant hum肌erythropoietin, rHuEPO)，廣泛用于臨床。應(yīng)用重組DNA技術(shù)已經(jīng)生物合成出促紅細(xì)胞生成素(Egrie，JC,Strickland， TW， Lane， J等(986)免疫生物學(xué)(lmmunobiol)72:213-224)，其是插入到中國(guó)倉(cāng)鼠的卵巢組織細(xì)胞(CHO細(xì)胞)中并且表達(dá)的克隆的人促紅細(xì)胞生成素基因的產(chǎn)物。天然存在的人促紅細(xì)胞生成素首先翻譯成含有166個(gè)氨基酸并且166位是精氨酸的多肽鏈。在翻譯后修飾中用羥肽酶裂解掉166位精氨酸。沒(méi)有糖基的人EPO的多膚鏈的分子量是18236Da.在完整的促紅細(xì)胞生成素分子中，糖基占整個(gè)分子量的大約40%( J.Biol.Chem.262: 12059)。
促紅細(xì)胞生成素是最早應(yīng)用于臨床的細(xì)胞因子，是迄今所知作用最單一、且安全可靠的升血紅蛋白制劑。對(duì)于腎貧血、再生障礙性貧血、多發(fā)性骨髓瘤及陣發(fā)性夜間血尿等均有一定療效；此外，應(yīng)用EPO還可減少手術(shù)中的輸血量，并能在一定程度上糾正由惡性腫瘤、化療及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的貧血。由于促紅細(xì)胞生成素主要由腎小管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，腎性疾患引起的貧血是促紅細(xì)胞生成素的首選適應(yīng)證；EPO糾正腎性貧血的療效幾乎100%,但并不能改善腎功能。促紅細(xì)胞生成素的治療安全、有效，適合長(zhǎng)期治療，也能避免血源緊張。在2006年的全球生物技術(shù)藥市場(chǎng)上，促紅細(xì)胞生成素類(lèi)的重組藥物占了119億美元，有巨大的市場(chǎng)容量。
早在1989年，美國(guó)FDA就正式批準(zhǔn)重組人促紅素(EPOGEN)用于腎性貧血的治療，但直到1992年才在我國(guó)上市。我國(guó)慢性腎炎的年發(fā)病率約為0.25%，其中相當(dāng)一部分患者最終會(huì)轉(zhuǎn)為腎衰，每年的腎性貧血患者約50-60萬(wàn)。根據(jù)保守的用藥量估算，如果按當(dāng)前的價(jià)格30-40元/支，加上癌癥相關(guān)性貧血等其他病人的用藥，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)容量約12-16億元甚至更大(病人平均體重按50Kg計(jì)算)。自20世紀(jì)90年代后期，EPO己進(jìn)入我國(guó)重點(diǎn)城市醫(yī)院暢銷(xiāo)藥品行列，2003年在全國(guó)重點(diǎn)城市樣本醫(yī)院用藥金額6213萬(wàn)元，排名第56位。2004年，全國(guó)重點(diǎn)城市樣本醫(yī)院購(gòu)藥金額增長(zhǎng)到8049萬(wàn)元，同比增長(zhǎng)了 30%。
促紅細(xì)胞生成素作為一種作用于骨髓造血細(xì)胞，促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增生、分化，最終成熟的內(nèi)分泌激素。對(duì)機(jī)體供氧狀況發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在胚胎早期，EPO由肝生成，然后逐漸向腎轉(zhuǎn)移，出生后主要由腎小管間質(zhì)細(xì)胞分泌。
在促紅細(xì)胞生成素誘導(dǎo)紅組細(xì)胞分化過(guò)程中，球蛋白被誘導(dǎo)，這能使細(xì)胞吸收更多的鐵合成功能性的血紅蛋白，這種功能性的血紅蛋白可以和成熟的紅血球中的氧結(jié)合，因此，紅血球和血紅蛋白在提供機(jī)體氧方面扮演了極其重要的角色。這一過(guò)程是由促紅細(xì)胞生成素與紅組細(xì)胞的表面受體之間的相互作用引起的。
當(dāng)人體處于健康狀態(tài)時(shí)，組織可以從已經(jīng)存在的紅血球中吸收足夠多的氧，此時(shí)體內(nèi)的促紅細(xì)胞生成素濃度很低，這種正常的較低的促紅細(xì)胞生成素濃度完全可以刺激促進(jìn)由于年齡的問(wèn)題而正常損失的紅細(xì)胞。
當(dāng)循環(huán)系統(tǒng)中的依靠紅細(xì)胞進(jìn)行氧輸送的水平被降低進(jìn)而出現(xiàn)缺氧情況時(shí)，促紅細(xì)胞生成素在體內(nèi)的數(shù)量將會(huì)增加，機(jī)體缺氧狀態(tài)可以由以下原因引起的過(guò)量的輻射、因高緯度或長(zhǎng)期昏迷造成的氧攝入量減少、各種類(lèi)型的貧血等等。作為對(duì)組織處于缺氧壓力的應(yīng)答，促紅細(xì)胞生成素水平的提高可以刺激紅組細(xì)胞的分化達(dá)到提高紅細(xì)胞生成的能力。當(dāng)體內(nèi)的紅細(xì)胞的數(shù)量大于正常組織的需求時(shí)，循環(huán)系統(tǒng)中促紅細(xì)胞生成素的水平被降低。正是由于促紅細(xì)胞生成素對(duì)于紅細(xì)胞的生成有著至關(guān)重要的作用，因此這類(lèi)激素對(duì)于治療和診斷以紅細(xì)胞生成低下和缺陷為特征的血液病方面有著很廣泛的前景。最近的研究為推測(cè)促紅細(xì)胞生成素療法在多種疾病、紊亂和血液學(xué)異常情況中
的效用提供了基礎(chǔ)，這些疾病包括慢性腎衰竭(CRF)患者貧血癥的治
療中使用促紅細(xì)胞生成素和在艾滋病和接受化療的癌癥患者貧血癥的
治療中使用EPO(Danna， RP， Rudnick, SA， Abels， RI，于:MB， Garnick編著，臨床應(yīng)用中的促紅細(xì)胞生成素一國(guó)際展望(Erythropoietin inClinical Applications-An International Perspective. Marcel Dekker;1990:p301-324)。
但是當(dāng)前可獲得未被修飾的促紅細(xì)胞生成素的血漿半衰期短，容易遭受蛋白酶降解，利用率不高，這些缺陷阻止它們?nèi)〉米畲蟮呐R床療效。因此獲得長(zhǎng)效的促紅細(xì)胞生成素已,經(jīng)成了各大研究機(jī)構(gòu)及制藥企業(yè)競(jìng)相研發(fā)的熱點(diǎn)，如己經(jīng)上市的amgen公司的長(zhǎng)效促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品(aransp)是通過(guò)基因工程的手段增加糖基化的位點(diǎn)數(shù)目，進(jìn)而提高糖基化的程度，達(dá)到每?jī)芍茏⑸湟淮危纳屏舜偌t細(xì)胞生成素在體內(nèi)的半衰期，但是這種產(chǎn)品由于仍然無(wú)法避免體內(nèi)蛋白酶的酶解影響，因此延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期的程度有限，并且生產(chǎn)成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生物學(xué)活性更好，生物利用度更高的的聚乙二醇修飾的促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物以及該偶聯(lián)物的制備方法。
本發(fā)明目的還在于提供一種含有該被修飾的促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物的藥物組合物，用于治療以缺乏紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病。
本發(fā)明所公開(kāi)的一種新的聚乙二醇修飾的促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)通式為
P-NH-CH2-X-S-Y- (OCH2CH2) ml-OCH3
所述偶聯(lián)物是由甲氧基聚乙二醇基團(tuán)通過(guò)式-(:112《-3-￥"中的-(:112-
9基團(tuán)與促紅細(xì)胞生成素的氨基形成-NH-CH2-鍵連接而得到，其中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素，X是-(CH2)k-或-CH2(OCH2CH2)k-， k的數(shù)目選自2 10, ml選自100 2000之間的整數(shù)，Y選自
<formula>formula see original document page 10</formula>
其中m、 n的數(shù)目各自獨(dú)立地選自2 10。
其中重組人促紅細(xì)胞生成素優(yōu)選重組人促紅細(xì)胞生成素a或p，特別是a。促紅細(xì)胞生成素的制備是通過(guò)本領(lǐng)域公開(kāi)的技術(shù)而得到。在本方案中，其中m，n優(yōu)選的整數(shù)為2。在本方案中，其中X是-(CH2)k-， k選自2 10。在本方案中，k的數(shù)目?jī)?yōu)選2 4，進(jìn)一步優(yōu)選為2。在本方案中，甲氧基聚乙二醇基團(tuán)的平均分子量?jī)?yōu)選為5， 000 40， OOO道爾頓，進(jìn)一步優(yōu)選為為20， OOO道爾頓。
在本方案中， 一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案所對(duì)應(yīng)的偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)式為
<formula>formula see original document page 10</formula>
其中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素，X是-(CH2)k-或
<formula>formula see original document page 10</formula>-CH2(OCH2CH2)k-， k的數(shù)目選自2 10， m、 n的數(shù)目選自2 10， rm選自100 2000之間的整數(shù)。
其中X優(yōu)選為-(CH2)k-， k的數(shù)目可進(jìn)一步優(yōu)選自2 4，最優(yōu)選的是2。 .
進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)k方案對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)式為
m,選自450 600的整數(shù)，其中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素，可進(jìn)一步優(yōu)選重組人促紅細(xì)胞生成素a或P,最優(yōu)選a。本發(fā)明還提供一種如下結(jié)構(gòu)通式的偶聯(lián)物
o
其中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素糖蛋白，X是-(CH2)k-或-012(0(:112(^2)1[-，1^的數(shù)目選自2 10， m的數(shù)目選自2 10， mt選自100 2000之間的整數(shù)。
進(jìn)一步優(yōu)選地，該結(jié)構(gòu)式中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素a; X是-(CH2)k-，其中k是2; m的數(shù)目選自2; rm選自450 600的整數(shù)。
本發(fā)明還il供一種如下結(jié)構(gòu)通式的偶聯(lián)物
o
其中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素，X是-(CH2)k-或-CH2(OCH2CH2)k-，k的數(shù)目選自2 10， m的數(shù)目選自2 10， nn選自100 2000之間的整數(shù)。
進(jìn)一步優(yōu)選，該結(jié)構(gòu)式中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素a; X是-(CH2)k-，其中k是2; m的數(shù)目選自2; m,選自450 600的整數(shù)。
本發(fā)明還提供一種如下結(jié)構(gòu)通式的偶聯(lián)物<formula>formula see original document page 12</formula>
其中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素，X是-(CH2V或-CH2(OCH2CH2)k-， k的數(shù)目選自2 10, m,選自100 2000之間的整
似—-數(shù)。
進(jìn)一步優(yōu)選地，該結(jié)構(gòu)式中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素a; X是-(CH2)k-，其中k是2; m,選自450 600的整數(shù)。
本發(fā)明還提供一種如下結(jié)構(gòu)通式的偶聯(lián)物
<formula>formula see original document page 12</formula>其中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素，X是-(CH2)k-或
-CH2(OCH2CH2)k-， k的數(shù)目選自2 10, r^選自100 2000之間的整數(shù)。
進(jìn)一步優(yōu)選地，該結(jié)構(gòu)通式中P是指重組人促紅細(xì),胞生成素a; X是-(CH。k-，其中k是2; rm選自450 600的整數(shù)。本發(fā)明還提供一種如下結(jié)構(gòu)通式的偶聯(lián)物
H2
P一NH一C —X-S一S
OCH2CH2j~OCH3
其中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素，X是-(CH2)k-或
-CH2(OCH2CH2)k-， k的數(shù)目選自2 10， m、 n的數(shù)目選自2 10， m！選自100 2000之間的整數(shù)。
進(jìn)一步優(yōu)選地，該結(jié)構(gòu)式中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素a; X是-(CH2)k-，其中k是2; m、 n的數(shù)目選自2; 選自450 600的整數(shù)。
本發(fā)明所公開(kāi)的偶聯(lián)物是促紅細(xì)胞生成素通過(guò)連接體(-CH2-X-S-Y-)與甲氧基聚乙二醇基團(tuán)共價(jià)連接進(jìn)而被修飾，關(guān)鍵在于促紅細(xì)胞生成素與連接體以形成-NH2-CH2-鍵形式而連接，與未被修飾的促紅細(xì)胞生成素相比，本發(fā)明提供的偶聯(lián)物能夠提高血漿的停留時(shí)間和循環(huán)半衰期，降低清除率，在體內(nèi)的生物活性更高，并且具有和促紅細(xì)胞生成素一樣的用途。與以形成-NH-CO-鍵形式的聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物相比具有反應(yīng)位點(diǎn)更單一 ，質(zhì)量更可控的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明提供的聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物可以被用來(lái)治療以缺乏
紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病。
本發(fā)明還公開(kāi)了上述偶聯(lián)物的一種制備方法，包括以下步驟首先是促紅細(xì)胞生成素和含有己保護(hù)巰基的醛類(lèi)物質(zhì)發(fā)生還原胺化反
應(yīng)，形成通過(guò)-NH-CH2-鍵連接的活化促紅細(xì)胞生成素，然后，將所述活化促紅細(xì)胞生成素脫保護(hù)，與活性甲氧基聚乙二醇衍生物偶聯(lián)，通過(guò)進(jìn)一步的分離純化而得到。
本發(fā)明還公開(kāi)了一種藥物組合物，包含(1)治療量的上述聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物；(2)藥學(xué)可接受的藥物載體。
本發(fā)明含有任意的上述治療量的聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物用于治療以缺乏紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病。特別是治療下述疾病末期腎功能衰竭或透析；AIDS相關(guān)性貧血，自身免疫性疾病，或,惡性腫瘤；囊性纖維變性；早期早熟性貧血；與慢性炎性疾病相關(guān)的貧血；脊髓損傷；急性失血；衰老和伴有異常紅細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤疾病。
促紅細(xì)胞生成素的制備
促紅細(xì)胞生成素的制備方法是通過(guò)內(nèi)源基因激活表達(dá)蛋白質(zhì)的方法，都是本領(lǐng)域公知的技術(shù)。其制備及治療應(yīng)用詳細(xì)描述于美國(guó)專(zhuān)利US5547933、 US5621080和US5955422, EP-B0209539和EP-B0148605和EP-B0209539 ,以及Huang，S丄.，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA) (1984)2708-2712等。
重組促紅細(xì)胞生成素的純化一般使用羥基磷灰石凝膠，離子交換層析，凝膠層析等本領(lǐng)域公知的純化方法進(jìn)行純化，并在美國(guó)專(zhuān)利No.5547933、 5621080和5955422等專(zhuān)利中均有詳細(xì)描述；Nobuo，I.等，生物化學(xué)雜質(zhì)(J.Biochem) 107(19卯)352-359也描述了重組EPO的純化方法。
聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物的制備本發(fā)明提供一種制備聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物的制備方法，其步驟包括
(1 )通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的技術(shù)制備結(jié)構(gòu)通式I的小分子醛化合物，如將硫代乙酸與烯醛類(lèi)化合物進(jìn)行邁克爾加成反應(yīng)
其中k的數(shù)目選自2 10，優(yōu)選2;(2)將結(jié)構(gòu)通式I的小分子醛化合物與促紅細(xì)胞生成素在緩沖液里反應(yīng)，并加入還原劑得到結(jié)構(gòu)通式為II的活化促紅細(xì)胞生成素；
其中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素a或P，優(yōu)選重組人促紅細(xì)胞生成素a，緩沖液的pH選自4.0 6.0，優(yōu)選6.0，還原劑可以是硼氰化鈉、氰基硼氰化鈉，優(yōu)選氰基硼氰化鈉；
(3)利用本領(lǐng)域公知的技術(shù)在含有活化促紅細(xì)胞生成素的緩沖液里加入脫保護(hù)劑，脫去結(jié)構(gòu)通式為(II)的活化促紅細(xì)胞生成素的乙?；Ｗo(hù)基，隨后加入結(jié)構(gòu)通式為III的活化甲氧基聚乙二醇進(jìn)行聚乙二醇化反應(yīng)。
其中加入的脫保護(hù)劑優(yōu)選羥胺；緩沖體系的pH選自5.0 7.0，優(yōu)選pH6,2; AG選自
14s一s一c —
ff^ , H2 、 S H H2 H2 [f^L ,H2、 8 H fH2、H 8
N m N m n
其中m、 n的數(shù)目選自2 10，優(yōu)選2;(4)聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物的純化方法采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)，如離子交換層析、凝膠層析。
生物學(xué)活性的測(cè)試
通過(guò)本領(lǐng)域公知的各種測(cè)試可以測(cè)定促紅細(xì)胞生成素或本發(fā)明提.供的聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物的生物學(xué)活性。體內(nèi)活性的測(cè)試通過(guò)小鼠皮下注射促紅細(xì)胞生成素及本發(fā)明提供的聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物，連續(xù)三天，然后處死小鼠，取全血進(jìn)行外周血細(xì)胞及網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)采用全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。對(duì)獼猴靜脈注射進(jìn)行藥效學(xué)研究，單次給藥劑量1.35mg/kg，作為對(duì)比藥物使用的促紅細(xì)胞生成素給藥劑量為240M/kg，每周三次，連續(xù)給藥六周，采集血樣進(jìn)行相關(guān)血液學(xué)指標(biāo)分析。
通過(guò)對(duì)本發(fā)明提供的聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物的測(cè)試數(shù)據(jù)表明:本發(fā)明提供的聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物能夠明顯刺激小鼠外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的升高，說(shuō)明它們刺激紅細(xì)胞生成，同時(shí)還能夠大大延長(zhǎng)偶聯(lián)物在體內(nèi)的半衰期。聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物對(duì)成熟的紅細(xì)胞、血細(xì)胞壓積、血紅蛋白含量沒(méi)有明顯的影響，對(duì)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)液沒(méi)有明顯影響。
藥物組合物的制備
可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法用藥學(xué)可接受載體或賦形劑制成適合
o
、,H2、 jH H2 H2N卄C ) 11 N—C 一C ■
O
0
0
m注射的藥物組合物。用于配制本發(fā)明的產(chǎn)物的優(yōu)選的藥學(xué)可接受載體
是人血清白蛋白，人血漿蛋白質(zhì)等。本發(fā)明的化合物可以在含有132mm氯化鈉的10mM磷酸鈉/鉀緩沖液pH7中配制。任選地，藥物組合物
可以含有防腐劑。藥物組合物可以含有不同量的促紅細(xì)胞生成素，優(yōu)選10-1000微克/毫升。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:乙?；鶐€基丙醛的制備
o
將11.2 g(20mmo1)丙烯醛與干燥的100 ml THF加入到反應(yīng)瓶中，冷卻至0。C，然后緩慢滴加1.52g (0.2 mol)硫代乙酸/20ml THF的混合溶液。滴加完畢保溫反應(yīng)2小時(shí)后。35"C減壓濃縮除去過(guò)量的丙烯醛。然后快速上柱(洗脫液純正己烷—正己垸/乙酸乙酯=50/1)，合并收集產(chǎn)物點(diǎn)，減壓濃縮至干得油狀液體0.6g。
實(shí)施例2: mPEG-MAL-01(20kD)的制備
16<formula>formula see original document page 17</formula>
將20g(lmmol)mPEG-OH(20kD)投入到200ml的單口瓶中，加入100ml甲苯，回流分水反應(yīng)2.5hr;然后蒸出甲苯，冷卻至室溫，再加入100mlDCM，隨后加入1.18g(4mmil)的三光氣(triphosgene)，室溫密閉攪拌反應(yīng)過(guò)夜；次日處理將反應(yīng)液于通風(fēng)廚中沖析入200ml的無(wú)水乙醚中，過(guò)濾后真空干燥得白色固體15g。將15g上步白色固體投入到200ml的單口瓶中，加入100ml Toluene/DCM(2:l)的溶液，再加入0.25g的HOSu，隨后加入0,3g三乙胺，室溫密閉攪拌反應(yīng)4hr (或過(guò)夜)；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液過(guò)濾，濾液直接沖析入100ml的無(wú)水乙醚中，過(guò)濾，真空干燥得白色固體14g，即為SC-mPEG(20kD);
將1.4g無(wú)水乙二胺用50ml DCM于200ml反應(yīng)瓶中溶解,再取14gSC-mPEG(20kD)溶解于100ml的DCM溶解后加入到上述乙二胺溶液中，反應(yīng)過(guò)夜；次日停止反應(yīng)過(guò)濾，濾液加入500ml的飽和食鹽水洗滌，分出有機(jī)層，水層用DCM提取三次(200mlx3)，合并有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至100ml，于500ml無(wú)水乙醚中沉降析出固體，過(guò)濾，真空干燥得白色固體13g，即為mPEG-NHCH2CH2NH2(20kD);將1.9g的MAL-ONP用50mL DCM溶解，加入0.04g的三乙胺，
然后加入上述MAL-ONP的DCM溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜;、次日減壓濃縮出DCM，殘余物加入200ml的無(wú)水乙醚中，沉降析出固體，真空干燥得白色固體12.5g，即為mPEG-MAL-01(20kD)。
實(shí)施例3: mPEG-MAL"02(20kD)的制備
,0-
mPEG-NH2(20KD>
NH，
(MAL-ONP)
0、
O，n
mPEG-MAL-02(20KD)
將2.0g的MAL-ONP用50mL DCM溶解，加入0.05g的三乙胺，再將15g的mPEG-NH2(20kD)用100ml的新開(kāi)的DCM溶解，然后加入上述MAL-ONP的DCM溶液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜；次日減壓濃縮出DCM，殘余物加入200ml的無(wú)水乙醚中，沉降析出固體，真空干燥得白色固體13g，即為mPEG-MAL-02(20kD)。
實(shí)施例4: mPEG-OPPS-01(20kD)的制備
、0
。^^0"。Y^s、s》0 (MPPS)
mPEG-OPPS-01(20KD)
18將0.5g MPPS用50mlDCM溶解，隨后加入0.05g三乙胺和20gmPEG-NH2(20kD)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過(guò)夜，次日減壓濃縮出DCM，殘余物加入200ml的無(wú)水乙醚，析出固體，過(guò)濾，真空干燥得白色固體19g，即為mPEG-OPPS-01(20kD)。
實(shí)施例5: mPEG-OPPS-02(20kD)的制備
將0.5g MPPS用50mlDCM溶解，隨后加入0.05g三乙胺和20gmPEG-NHCH2CH2NH2(20kD)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過(guò)夜，次日減壓濃縮出DCM，殘余物加入200ml的無(wú)水乙醚，析出固體，過(guò)濾，真空干燥得白色固體18.5g，即為mPEG-OPPS-02(20kD)。
實(shí)施例6:活化促紅細(xì)胞生成素的制備
取促紅細(xì)胞生成素原液60毫克，蛋白濃度為1.5毫克/毫升，共40毫升，體系為0.1M磷酸鈉鹽緩沖液，pH6.0;取2.5毫克乙酰基巰基丙醛溶于80微升乙腈后加入以上蛋白溶液；再稱(chēng)取50毫克氰基硼氫化鈉加入上述反應(yīng)液，并慢速攪拌反應(yīng)，冰浴控制反應(yīng)溫度在10。C,反應(yīng)24小時(shí)；然后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入透析袋(截留分子量3500),對(duì)0.1M磷酸鈉鹽緩沖液，含2,￡01八"116.25進(jìn)行透析，以除掉過(guò)量的小分子醛，然后再加入羥胺脫去乙?；?，得活化促紅細(xì)胞生成素。
實(shí)施例7: HH-EPO-014A的制備
通過(guò)實(shí)施例6得到的10mg活化促紅細(xì)胞生成素(1.4毫克/毫升，
化
mPEG-NHCH2CH2NH2(20KD)
mPEG-OPPS-02(20KD)0.1M磷酸鈉鹽緩沖液，含2mM EDTA,pH6.25)，加入100毫克mPEG-MAL-01(20kD)。攪拌反應(yīng)60分鐘；再加入N-甲基馬來(lái)酰亞胺至濃度為5mM，室溫反應(yīng)30分鐘，以反應(yīng)掉蛋白上剩余的巰基；然后將反應(yīng)液透析至20mM乙酸一乙酸鹽緩沖液體系。
反應(yīng)液的純化依次使用離子交換層析(SPSepharoseH.P)和凝膠層析(Superdex 200 )，即可得到聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素(HH-EPO-014A)，約5mg。
實(shí)施例8: HH-EPO-014B的制備
通過(guò)實(shí)施例6得到的含有游離巰基的10mg活化促紅細(xì)胞生成素(1.4毫克/毫升，O.IM磷酸鈉鹽緩沖液，含2mMEDTA，pH6.25)，加入100毫克mPEG-MAL-02(20kD)。攪拌反應(yīng)60分鐘(25。C);再加入N-甲基馬來(lái)酰亞胺至濃度為5mM,室溫反應(yīng)30分鐘，以反應(yīng)掉蛋白上剩余的巰基；然后將反應(yīng)液透析至20mM乙酸一乙酸鹽緩沖液體系。
反應(yīng)液的純化依次使用離子交換層析(SPSepharoseH.P)和凝膠層析(Superdex 200 )，即可得到聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素(HH-EPO-014B)，約5.5mg。
實(shí)施例9: HH-EPO-014C的制備
向?qū)嵤├?得到的10mg活化促紅細(xì)胞生成素(1.4毫克/毫升，0.1M磷酸鈉鹽緩沖液，含2mM EDTA，pH6.25)溶液中加入100毫克mPEG-MAL(20KD),攪拌反應(yīng)60分鐘(25°C)，再加入N-甲基馬來(lái)酰亞胺至濃度為5mM，室溫反應(yīng)30分鐘，以反應(yīng)掉蛋白上剩余的巰基；然后將反應(yīng)液透析至20mM乙酸一乙酸鹽緩沖液體系。
反應(yīng)液的純化依次使用離子交換層析(SPSepharoseH.P)和凝膠層析(Superdex 200 )，即可得到聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素(HH-EPO-014C),約6.2mg。
實(shí)施例10: HH-EPO-014D的制備
向?qū)嵤├?得到的10mg活化促紅細(xì)胞生成素(1.4毫克慮升，0.1M磷酸鈉鹽緩沖液，含2mM EDTA，pH6.25)溶液中加入100毫克
20mPEG-OPPS(20KD)，攪拌反應(yīng)60分鐘(25°C)，再加入N-甲基馬來(lái)酰亞胺至濃度為5mM，室溫反應(yīng)30分鐘，以反應(yīng)掉蛋白上剩余的巰基；然后將反應(yīng)液透析至20mM乙酸一乙酸鹽緩沖液體系。
反應(yīng)液的純化依次使用離子交換層析(SPSepharoseH.P)和凝膠層析(Superdex 200 ),即可得到聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素(HH國(guó)EPO-014D)，約6.0mg。
實(shí)施例ll: HH-EPO-014E的制備
向?qū)嵤├?得到的10mg活化促紅細(xì)胞生成素(1.4毫克/毫升，0.1M磷酸鈉鹽緩沖液，含2mM EDTA，pH6.25)溶液中加入100毫克mPEG-OPPS-01(20KD)，攪拌反應(yīng)60分鐘(25°C)，再加入N-甲基馬來(lái)酰亞胺至濃度為5mM,室溫反應(yīng)30分鐘，以反應(yīng)掉蛋白上剩余的巰基；然后將反應(yīng)液透析至20mM乙酸一乙酸鹽緩沖液體系。
反應(yīng)液的純化依次使用離子交換層析(SPSepharoseH.P)和凝膠層析(Superdex 200 )，即可得到聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素(HH-EPO-014E)，約5.6mg。
實(shí)施例12:冊(cè)-EPO-014F的制備
向?qū)嵤├?得到的10mg活化促紅細(xì)胞生成素(1.4毫克/毫升，0.1M磷酸鈉鹽緩沖液，含2mM EDTA，pH6.25)溶液中加入100毫克mPEG-OPPS-02(20KD)，攪拌反應(yīng)60分鐘(25°C)，再加入N-甲基馬來(lái)酰亞胺至濃度為5mM，室溫反應(yīng)30分鐘，以反應(yīng)掉蛋白上剩余的巰基；然后將反應(yīng)液透析至20mM乙酸一乙酸鹽緩沖液體系。
反應(yīng)液的純化依次使用離子交換層析(SPSepharoseH.P)和凝膠層析(Siiperdex 200 )，即可得到聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素(HH-EPO國(guó)014F),約5.6mg。
實(shí)驗(yàn)例
實(shí)驗(yàn)例l:聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物對(duì)小鼠的作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br> 評(píng)價(jià)并比較聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物及促紅細(xì)胞生成素蛋
21白對(duì)小鼠紅細(xì)胞生成的影響。 材料及方法
聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物HH-EPO-014A、 HH-EPO-014B、 HH-EPO-014C、 HH-EPO-014D、 HH誦EPO國(guó)014E、 HH-EPO-014F由江蘇
豪森藥業(yè)股份有限公司提供；促紅細(xì)胞生成素(陽(yáng)性對(duì)照)購(gòu)自沈陽(yáng) 三生制藥有限責(zé)任公司；昆明種小鼠，購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 體重25 30g， $，各組動(dòng)物數(shù)10只。
小鼠皮下注射聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物及促紅細(xì)胞生成 素，連續(xù)三天，然后處死小鼠，取全血進(jìn)行外周血細(xì)胞及網(wǎng)織紅細(xì)胞
計(jì)數(shù)，血細(xì)胞i十?dāng)?shù)用全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。
結(jié)果與討論
按照目前的給藥方案，聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物及促紅細(xì) 胞生成素均能明顯刺激小鼠外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的升高，說(shuō)明它們 刺激紅細(xì)胞生成(見(jiàn)表一)。聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物對(duì)成熟的紅 細(xì)胞、血細(xì)胞壓積、血紅蛋白含量沒(méi)有明顯的影響(見(jiàn)表二)，對(duì)外周 血白細(xì)胞計(jì)數(shù)液沒(méi)有明顯影響(見(jiàn)表三)。
表一、聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素'偶聯(lián)物對(duì)小鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞生成的
影響
分組
小鼠 (只)
給藥劑量和方案
網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)
(xiq9/l，x土sd)
control
朋-EPCM)14A HH-EPO-014B HH-EPO-014C HH-EPO墨014D HH-EPO-014E HH-EPO-014F
10 10 10 10 10 10 10
0.1%BSAinNS
5ng/kg，sc,dl-3
5pg/kg，sc，dl-3
5ng/kg，sc，dl-3
5ng/kg，sc，dl-3
5pg/kg，sc，dl-3
5jig/kg，sc，dl-3
177.6 ±55. 2 826.1 ±25.1 810.2±58. 3 765.3±67. 5 652.1 土81. 3 647.5 ±24.1 586.0±32. 4
EPO
10
5ng/kg,sc，dl-3
360.6 ±27.0
表二、聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物對(duì)小鼠紅細(xì)胞生成、血細(xì) 胞壓積、血紅蛋白含量的影響
分組
小鼠 (只)
給藥劑量和方案
紅細(xì)胞計(jì)數(shù) (X 106叫，x ±sd)
血細(xì)胞壓積 (%)
血紅蛋白100.1%BSAinNS9.6 ±0. 548.2 ±3.014.8±0.7
HH-EPCM)14A105ng/kg，sc，dl-39.9 ±0.452.1 ±1.615.7±0.6
HH-EPO-014B105ng/kgjSC,dl-39.3 ±0. 153.0±1.515.7±0.7
朋-EPO-014C105jxg/kg，sc，dl-39.6 ±0. 353.2±1.415.1±0.5
HH-EPCM)14D105ng/kg，sc，dl-39.7 ±0.150.0 ±1.914.7±0.7
HH-EPO-tH4E105ng/kg，sc，dl-39.1 ±0.555.4 ±1.216.5±0.9
HH-EPO-014F105|ig/kg，sc，dl-39.2 ±0. 656.5 ±1.816.3±0. 7
EPO105ng/kg，sc，dl-39.0 ±0.646.2 ±2. 714.3 ±0.7
表三、聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物對(duì)小鼠血小板、白細(xì)胞生
成的影響
￥1 71 給藥劑量和方案""血小板(x 103/mL)"~白細(xì)胞(xio3/ml)
(只)
control100.1%BSAinNS1078.0±151.25.U1.5
HH-EPO-014A HH-EPCM)14B10 105|ag/kg，sc，dl-3 5ng/kg，sc，dl-31372.5±135 1350.8±3274.2±1.5 4.2±1.1
HH-EPO014C101207±2375.0±2.2
HH-EPO014D105ng/kg，sc，dl-31325±2235.5±1.2
HH-EPO-014E HH-EPCMH4F10 105ng/kg，sc，dl-3 5ng/kg，sc，dl-31457.6±247.6 1186.8±218.64.2±1.2 4.1±1.2
EPO105jxg/kg，sc，d卜31306.肚170.4.0±0.9
實(shí)驗(yàn)例2:聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物對(duì)獼猴的作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br> 評(píng)價(jià)聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物對(duì)獼猴紅細(xì)胞生成的影響材料及方法
聚乙二醇促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物HH-EPO-014A，由江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司提供；促紅細(xì)胞生成素(陽(yáng)性對(duì)照)購(gòu)自沈陽(yáng)三生制藥有限責(zé)任公司。使用前以含0.1XBSA的生理鹽水稀釋。
獼猴，體重5.5 8,5kg，雌雄不限，購(gòu)自蘇州西山中科實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。獼猴根據(jù)基礎(chǔ)血紅蛋白分組，每組三只。HH-EPO-014A，L35mg/kg，靜脈注射一次；EPO 240p/kg,三次/周，連續(xù)給藥6周，每周測(cè)1 2次血液學(xué)指標(biāo)
結(jié)果及討論
HH-EPO-014A單次靜脈注射導(dǎo)致獼猴外周血血紅蛋白含量上升，血細(xì)胞壓積升高，說(shuō)明HH-EPO-014A刺激血紅蛋白生成，該剌激作用在給藥35天后達(dá)到頂峰，隨后緩慢T降，對(duì)血紅蛋白的刺激作用大約
23為33%。陽(yáng)性對(duì)照促紅細(xì)胞生成素同樣升高獼猴外周血血紅蛋白含量， 升高血細(xì)胞壓積，其作用在停藥后緩慢減弱。按照目前的給藥方案，
單次靜脈注射HH-EPO-0i4A和多次連續(xù)靜脈注射促紅細(xì)胞生成素對(duì) 獼猴血紅蛋白生成的刺激作用相當(dāng)。
權(quán)利要求
1. 一種聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)通式為P-NH-CH2-X-S-Y-(OCH2CH2)m1-OCH3所述偶聯(lián)物是由甲氧基聚乙二醇基團(tuán)通過(guò)式-CH2-X-S-Y-中的-CH2-基團(tuán)與促紅細(xì)胞生成素的氨基形成-NH-CH2-鍵連接而得到，其中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素，X是-(CH2)k-或-CH2(OCH2CH2)k-，k的數(shù)目選自2～10，m1選自100～2000之間的整數(shù)，Y選自其中m、n的數(shù)目各自獨(dú)立地選自2～10。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于所述重組人促紅細(xì) 胞生成素是重組人促紅細(xì)胞生成素a或p。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的偶聯(lián)物，其特征在于所述重組人促紅細(xì) 胞生成素是重組人促紅細(xì)胞生成素a。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于111=2， n=2<NH-CH^CH:-S-CH2CH:
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于X是-(CH2)k-， k選 自2 10。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的偶聯(lián)物，其特征在于k選自2 4。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的偶聯(lián)物，其特征在于k為2。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于所述甲氧基聚乙二 醇基團(tuán)的平均分子量為5， 000 40， 000道爾頓。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的偶聯(lián)物，其特征在于甲氧基聚乙二醇基 團(tuán)的平均分子量為20, OOO道爾頓。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)式為<formula>formula see original document page 3</formula>其中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素，X是-(CH2)k-或 -CH2(OCH2CH2)k-，k的數(shù)目選自2 10， m、 n選自2 10， m,選 自100 2000之間的整數(shù)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的偶聯(lián)物，其特征在于X是-(CH。k-。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的偶聯(lián)物，其特征在于k選自2 4。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的偶聯(lián)物，其特征在于k為2。
14. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的偶聯(lián)物，其特征在于偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)式<formula>formula see original document page 3</formula>其中m,選自450 600的整數(shù)。
15. 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的偶聯(lián)物，其特征在于所述重組人促紅細(xì) 胞生成素是重組人促紅細(xì)胞生成素a或p。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的偶聯(lián)物，其特征在于所述重組人促紅細(xì) 胞生成素是重組人促紅細(xì)胞生成素a。
17.根據(jù)權(quán)利要求i所述的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)式為<formula>formula see original document page 4</formula>其中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素，X是-(CH2)r或 誦CH2(OCH2CH2)k-,k的數(shù)目選自2 10， m選自2 10, m,選自 100 2000之間的整數(shù)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的偶聯(lián)物，其特征在于P是指重組人促紅 細(xì)胞生成素a其中k是2; m為2; mi為選自450 600的整數(shù)。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)式為:其中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素，X是-(CH。k-或 -CH2(OCH2CH2)k-，k選啟2 10， m選自2 10， nit選自100 2000之間的整數(shù)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的偶聯(lián)物，其特征在于P是指重組人促紅 細(xì)胞生成素a; X是-(CH2)2-; m為2; iin選自450 600的整數(shù)。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)式為:<formula>formula see original document page 5</formula>其中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素，X是-(CH2)k-或 -CH2(OCH2CH2)k-， k選自2 10， m,選自100 2000之間的整 數(shù)。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的偶聯(lián)物，其特征在于P是指重組人促紅 細(xì)胞生成素a; X是-(012)2-; m,選自450 600的整數(shù)。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)式為<formula>formula see original document page 5</formula>其中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素，X是-(CH2)k-或 -CH2(OCH2CH2)k-,k的數(shù)目選自2 10; m選自2 10; r^選自 100 2000之間的整數(shù)。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的偶聯(lián)物，其特征在于P是指重組人促紅 細(xì)胞生成素a; X是-(CH。2-; m為2， m,選自450 600的整數(shù)。
25. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)式為<formula>formula see original document page 5</formula>其中P是指重組人促紅細(xì)胞生成素，X是-(CH2V或 -CH2(OCH2CH2)k-， k的數(shù)目選自2 10， m、 n選自2 10， m！ 選自100 2000之間的整數(shù)。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的偶聯(lián)物，其特征在于P是指重組人促紅 細(xì)胞生成素a; X是-(CH2)2-; m、 n選自2; m!選自450 600 的整數(shù)。
27. —種制備權(quán)利要求1 26任一項(xiàng)所述偶聯(lián)物的方法，包括以下(;)促紅細(xì)胞生成素和含有已保護(hù)巰基的醛類(lèi)物質(zhì)發(fā)生還原胺化反應(yīng)，形成通過(guò)-NH-CH2-鍵連接的活化促紅細(xì)胞生成素； (2)所述活化促紅細(xì)胞生成素脫保護(hù)，與活性甲氧基聚乙二醇衍 生物偶聯(lián)。
28. —種藥物組合物，包含(O治療量的如權(quán)利要求1一26任意一項(xiàng)所述的聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物，和 (2)藥學(xué)可接受的藥物載體。
29. 根據(jù)權(quán)利要求1-26任一項(xiàng)所述的聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素偶 聯(lián)物在制備用于治療以缺乏紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞群缺少或缺 陷為特征的疾病的藥,中的用途。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的用途，其特征在于缺乏紅細(xì)胞生成素或 紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病是末期腎功能衰竭或透析； AIDS相關(guān)性貧血，自身免疫性疾病，或惡性腫瘤；囊性纖維變 性；早期早熟性貧血；與慢性炎性疾病相關(guān)的貧血；脊髓損傷； 急性失血；衰老和伴有異常紅細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤疾病。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物是由甲氧基聚乙二醇基團(tuán)通過(guò)式-CH₂-X-S-Y-中的-CH₂-基團(tuán)與促紅細(xì)胞生成素的氨基形成-NH-CH₂-鍵連接而得到。本發(fā)明還公開(kāi)了上述偶聯(lián)物的制備方法，即偶聯(lián)物是由促紅細(xì)胞生成素和含有已保護(hù)巰基的醛類(lèi)物質(zhì)發(fā)生還原胺化反應(yīng)，形成通過(guò)-NH-CH₂-鍵連接的活化促紅細(xì)胞生成素；進(jìn)一步與甲氧基聚乙二醇衍生物偶聯(lián)而得到，該方法具有反應(yīng)位點(diǎn)更單一，質(zhì)量更可控的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明提供的聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物或含有聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素偶聯(lián)物的藥物組合物可在治療以缺乏紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病中廣泛應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K47/48GK101455844SQ20071019531
公開(kāi)日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2007年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月10日
發(fā)明者呂愛(ài)鋒, 孫長(zhǎng)安, 李蘊(yùn)波, 王亞里, 王瑞軍, 陳克然 申請(qǐng)人:江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司