專利名稱：：用于治療il-5介導(dǎo)的疾病的重組il-5拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般地涉及抗體和改變的抗體(alteredantibodies)領(lǐng)域，用于治療和診斷IL-5介導(dǎo)的病癥和與嗜曙紅細(xì)胞過量產(chǎn)生有關(guān)的病癥，更具體地^說，涉及mAb、Fab、嵌合的和人源化的抗體。
背景技術(shù)：
：嗜曙紅細(xì)胞被認(rèn)為與許多炎癥疾病狀態(tài)的病因有關(guān)，這些疾病包括與月市組織的過每文反應(yīng)有關(guān)的變態(tài)疾病(Butterfield等，ImmunopharmacologyofEosinophils,H.SmithandR.Cook,Eds,,p.151-192，AcademicPress,London(1993))。一個(gè)著名的實(shí)例是氣喘，該疾病的特征是空氣通路的可逆性阻塞，導(dǎo)致非特異性的支氣管過敏。而這又依賴于支氣管粘液水平的慢性炎癥反應(yīng)的生成，以及巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞的特征性侵入?？磥硎仁锛t細(xì)胞在起始疾病的典型粘液損傷中起到關(guān)鍵作用(Corrigan等，Immunol.Today,13:501-507(1992))。據(jù)報(bào)道，在患有慢性氣喘的病人的循環(huán)系統(tǒng)、支氣管分泌物和肺實(shí)質(zhì)中，活化的嗜曙紅細(xì)胞的數(shù)量增加，并且通過對不同肺功能的測試測量出，疾病的嚴(yán)重程度與血液嗜曙紅細(xì)胞數(shù)相關(guān)(Griffen等，J.Aller.Clin.Immunol.,67:548-557(1991))。嗜曙紅細(xì)胞數(shù)量增加，通常在去粒過程中，也在進(jìn)行晚期氣喘反應(yīng)的患者的支氣管肺泡洗出液(bronchoalveolarlavage,BAL)中收集到；嗜曙紅細(xì)胞減少，通常是類固醇治療的結(jié)果，與臨床癥狀的改善有關(guān)(Bousquet等，N.Eng.J.Med.,323:1033-1039(1990))。白介素5(IL-5)是主要由活化的CD4+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的同二聚體糖蛋白。在人體中，IL-5主要負(fù)責(zé)控制嗜曙紅細(xì)胞的生長和分化。在氣喘患者的支氣管泡洗出液中檢測到IL-5水平升高(Motojima等，Allergy,48:98(1993))。在沒有抗原的刺激下，IL-5轉(zhuǎn)基因小鼠的外周血和組織顯示出顯著的嗜曙紅細(xì)胞水平(Dent等，J.Exp.Med.,172:1425(1990))，而且抗鼠IL-5單克隆抗體具有在小鼠的血液和組織中減少嗜曙紅細(xì)胞(Hitoshi等，Int.Immunol.,3:135(1991)),以及在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中減少與寄生物感染和過敏原攻擊有關(guān)的嗜曙紅細(xì)胞的作用(Coffman等，Science,245:308-310(1989),Sher等,Proc.Natl.Acad.Sci.,83:61-65(1990),Chand等，Eur.J.Pharmacol.,211:121-123(1992))。雖然皮質(zhì)類固醇對抑制嗜曙紅細(xì)月包數(shù)量和氣喘的其他炎癥成分有顯著的作用，但它們對嚴(yán)重氣喘，以及近來發(fā)現(xiàn)的對溫和至中等氣喘有副作用。僅有的另一種主要抗炎藥物治療-色甘酸(色甘酸鈉和nedocromil)-被認(rèn)為具有比皮質(zhì)類固醇少的副作用。它們的精確作用機(jī)制仍然未知。近來的開發(fā)工作集中于新的吸入的類固醇、長作用支氣管舒張劑和作用于新的生化或藥理學(xué)耙的藥劑(例如鉀通道激活劑、白三烯拮抗劑、5-脂加氧酶(5-LO)抑制劑等)。一種理想的藥物應(yīng)當(dāng)將類固醇的有效性和色甘酸鈉的安全性結(jié)合起來，并具有4交高的選擇性和快速作用的能力。中和IL-5抗體可能對治療人的與嗜曙紅細(xì)胞有關(guān)的疾病有用。因此，本領(lǐng)域中需要一種高親和4生的IL-5拮抗劑，如人IL-5的中和單克隆抗體，它能減少嗜曙紅細(xì)月包的分化和增殖(即嗜曙紅細(xì)胞的積累)，由此減少嗜曙紅細(xì)胞炎癥。發(fā)明概述在第一方面，本發(fā)明提供嚙齒動(dòng)物(例如大鼠和鼠)中和單克隆抗體，該抗體對人IL-5有特異性，并具有一定的結(jié)合親和性，該親和性的特征在于，解離常數(shù)等于或小于大約3.5x10—nM,如發(fā)明詳述中所述。這些單克隆抗體的實(shí)例是鼠單克隆抗體2B6、2E6和2F2，以及大鼠單克隆抗體，如4A6。本發(fā)明的另一方面是一些雜交瘤，例如SK119-2B6.206.75(1)、SKI19-2E3.39.40.2、SKI19-2F2.37.80.2、4A6(1)G1F7和5D3(1)F5D6。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供中和Fab片段或通過去除本發(fā)明的嚙齒動(dòng)物中和單克隆抗體的Fc區(qū)得到的，對人IL-5有特異性的F(ab')2片段。在另一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明提供中和Fab片段或通過鏈改組(shuffling)技術(shù)得到的，對人IL-5有特異性的F(ab')2片段，由此，分離自本發(fā)明嚙齒動(dòng)物中和單克隆抗體的重(或輕)鏈免疫球蛋白，被輕《連(或相應(yīng)的重鏈)免疫球蛋白文庫表達(dá)，該文庫用IL-5免疫的嚙齒動(dòng)物，存在與纖毛噬菌體Fab顯示文庫中。在另一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明提供對人IL-5有特異性的改變的抗體，它包括來源于非人類中和單克隆抗體(mAb)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR),非人類中和單克隆抗體的特征在于，人類IL-5和編碼它的核酸分子的解離常數(shù)等于或小于大約3.5x10—"M。當(dāng)改變的抗體是人源化的抗體時(shí)，來源于非人類免疫球蛋白的，編碼互補(bǔ)決定區(qū)的序列被插入第一免疫球蛋白配對物(partner),在該配對物中，第一免疫球蛋白配對物的至少一個(gè)，優(yōu)選全部的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)被來源于非人類單克隆抗體的CDR置換。優(yōu)選地，第一免疫球蛋白配對物也與第二免疫王泉蛋白配對物可搡作地連接(operativelylinked),第二免疫球蛋白配對物包括免疫球蛋白恒定區(qū)的全部或部分。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供來源于非人類中和單克隆抗體(mAb)的CDR,其特征在于，人類IL-5和編碼所述CDR的核酸分子的解離常數(shù)等于或小于大約3.5xio—"M。在另一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種嵌合抗體，該抗體含有來源于非人類中和單克隆抗體的人類重鏈和輕鏈恒定區(qū)以及重鏈和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，對人類IL-5的解離常數(shù)等于或小于大約3.5x10—nM。在另一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，它含有一種(或多種)上面描述的改變的抗體和藥用載體。在另一方面，本發(fā)明提供一種治療與嗜曙紅細(xì)胞過量產(chǎn)生有關(guān)的人類疾病的方法，該方法是提供對人施用有效量的本發(fā)明藥物組合物來完成的。在另一方面，本發(fā)明提供改變的抗體(例如工程化的抗體、CDR、Fab或F(ab)2片段，或其類似物)的重組制備方法和有用的成分，該抗體來源于非人類中和單克隆抗體(mAb),其特征在于，對人類IL-5的解離常數(shù)等于或小于大約3.5x10_11M。這些成分包括編碼它們的分離的核酸序列，含有在特定調(diào)節(jié)序列控制下的核酸序列的重組質(zhì)粒，所述調(diào)節(jié)序列能夠指導(dǎo)核酸序列在被重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞(優(yōu)選哺乳動(dòng)物)中表達(dá)。該制備方法包括在改變的抗體(優(yōu)選人源化抗體)可以在所述細(xì)胞中表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的被轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞系，并從中分離表達(dá)產(chǎn)物。在另一方面，本發(fā)明提供診斷與嗜曙紅細(xì)胞在人體中過量產(chǎn)生有關(guān)的疾病的方法，其包括從患者體內(nèi)獲得生物液樣本，使本發(fā)明的抗體和改變的抗體與該樣本接觸，所用條件使得IL-5/(單克隆或改變的)抗體復(fù)合物得以形成，檢測IL-5/抗體復(fù)合物存在與否。本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)在發(fā)明詳述和優(yōu)選實(shí)施方案中進(jìn)一步描述。附圖簡述圖l[SEQIDNO:1和15]表明鼠抗體2B6和鼠/人抗體2B6嵌合抗體的重鏈可變區(qū)。方框區(qū)指示CDR。圖2[SEQIDNO:2和16]表明氣和鼠/人抗體2B6嵌合抗體的輕鏈可變區(qū)。方框區(qū)指示CDR。3]表明鼠抗體2F2的重鏈可變區(qū)。方框區(qū)指示CDR。4]表明鼠抗體2F2的輕鏈可變區(qū)。方框區(qū)指示CDR。5]表明鼠抗體2E3的重鏈可變區(qū)。方框區(qū)指示CDR。6]表明鼠抗體2E3的輕鏈可變區(qū)。方框區(qū)指示CDR。7-14]表明鼠抗體2B6、2F2和2E3的重鏈和輕鏈可圖3[SEQIDNO圖4[SEQIDNO圖5[SEQIDNO圖6[SEQIDNO圖7[SEQIDNO變區(qū)。圖8[SEQIDNO:18,19]表明人源化的抗體2B6的重鏈可變區(qū)。方框區(qū)指示CDR。圖9[SEQIDNO:20,21]表明人源化的抗體2B6的輕鏈可變區(qū)。方框區(qū)指示CDR。圖10是質(zhì)粒pCDIL5HZHC1.0的示意圖，該質(zhì)粒用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)人源化的重鏈基因。該質(zhì)粒含有(3乳糖酶基因(BETALAC)、SV-40復(fù)制起始區(qū)(SV40)、巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子序列(CMV)、一段信號序列、人源化的重鏈、來自牛生長激素(BGH)的polyA信號、卩珠蛋白啟動(dòng)子(betaglopro)、二氬葉酸還原酶基因(DHFR)和另一種BGH序列polyA信號，它們位于pUC19背景中。圖11是質(zhì)粒pCNIL5HZHC1.0的示意圖，該質(zhì)粒用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)人源化的輕鏈基因。圖12[SEQIDNO:61,62]表明人源化的抗體2B6的NewM重鏈可變區(qū)。方框區(qū)指示CDR。圖13[SEQIDNO:69,70]表明人源化的抗體2B6的REI輕鏈可變區(qū)。方框區(qū)指示CDR。發(fā)明詳述本發(fā)明提供多種抗體、改變的抗體及其片段，其特征在于人類IL-5結(jié)合的特異性、中和活性和對人類IL-5的高親和性，這些特征由鼠單克隆抗體2B6例示。本發(fā)明的抗體可通過常規(guī)雜交瘤技術(shù)、噬菌體顯示組合文庫、免疫球蛋白鏈改組以及人源化技術(shù)制備，以得到新的中和抗體。這些產(chǎn)物可用于治療IL-5介導(dǎo)的疾病(如氣喘)的治療和藥物組合物。這些產(chǎn)物也可用于通過測量(例如通迚酶聯(lián)免疫檢測(ELISA))人體內(nèi)源IL-5水平或由激活的細(xì)胞間接體內(nèi)(exvivo)釋放的IL-5，來i會(huì)斷IL-5介導(dǎo)的病癥。1.定義"改變的抗體"指由改變的免疫^扎蛋白編碼區(qū)編碼的蛋白，它可以通過在特定宿主細(xì)胞中表達(dá)得到。這些改變的抗體是工程化的抗體(例如嵌合抗體或人源化的抗體)或抗體片段，該抗體片段缺少免疫球蛋白恒定區(qū)(例如Fv、Fab或F(ab)2等)的全部或部分。"改變的免疫球蛋白編碼區(qū)"指編碼本發(fā)明的改變的抗體的核酸序列。當(dāng)改變的抗體是移植的CDR或人源化的抗體時(shí)，來源于非人類免疫球蛋白的互補(bǔ)編碼決定區(qū)(CDR)的序列-波插入第一免疫球蛋白配對物中，該配對物含有人類可變框架序列。任選地，第一免疫球蛋白配對物與第二免疫球蛋白配對物可^喿作地連接。"第一免疫球蛋白配對物"指編碼人類框架或人類免疫球蛋白可變區(qū)的核酸序列，其中天然(或天然存在的)CDR編碼區(qū)被供體抗體的CDR編碼區(qū)置換。人類可變區(qū)可以是免疫球蛋白重鏈、輕鏈(或兩種鏈同時(shí)存在)、其類似物或功能性片段。這些CDR區(qū)位于抗體(免疫球蛋白)的可變區(qū)內(nèi)，可以用本領(lǐng)域已知的方法確定。例如，Kabat等(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,4thEd.,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NationalInstitutesofHealth(1987))公開了CDR的定位方法。此外，可用于鑒定CDR區(qū)/結(jié)構(gòu)的計(jì)算才幾程序也是已知的。"中和"指一種抗體通過阻止人類IL_5與其特異性受體結(jié)合，或抑制IL_5通過其受體的信號來抑制IL-5活性，應(yīng)使結(jié)合發(fā)生。如果在B13細(xì)胞生物檢測中(IL-5中和檢測，見實(shí)施例2C)，一種mAb對抑制IL-5活性是90%有效的，優(yōu)選95%有效的，最有效100%有效的，則該mAb是中和性的。術(shù)語"高親和性"指抗體具有一種結(jié)合親和性，其特征在于，在光學(xué)生物傳感器分析中(見實(shí)施例2D),對人類IL-5的Kd等于或小于3.5x10—nM。"對人類IL-5結(jié)合的特異性，，指對人而不是鼠的IL-5的高親和性。"第二免疫球蛋白配對物"指另一編碼蛋白或肽的核酸序列，第一免疫球蛋白配對物在框架內(nèi)或以任意合逸的連接序列(即可操作連接)與之融合。優(yōu)選地，它是免疫球蛋白基因。第二免疫球蛋白配對物可包括一段核酸序列，該序列編碼同樣(即同源的-第一和第二改變的可以來自同一來源)或另一(即異源的)感興趣的抗體的全部恒定區(qū)。它可以是免疫球蛋白的重鏈或輕鏈(或同時(shí)具有兩種鏈，它們作為單一多肽的一部分)。第二免疫球蛋白配對物不限于具體的免疫球蛋白類型或同種型。此外，第二免疫球蛋白配對物可包含免疫球蛋白的恒定區(qū)的一部分，例如Fab或F(ab)2的一部分(即合適的人類恒定區(qū)或框架區(qū)的離散部分)。這樣的第二免疫球蛋白配對物可包含編碼整合膜蛋白的序列，該蛋白暴露于宿主細(xì)胞的外表面，例如噬菌體顯示文庫的一部分，或編碼用于分析性或i貪斷性檢測的蛋白(例如辣根過氧化物酶、(3半乳糖苷酶等)。術(shù)語Fv、Fc、Fd、Fab或F(ab)2以它們的標(biāo)準(zhǔn)含義使用(見例如，Harlow等，AntibodiesALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory(1988))。本文所用的術(shù)語"工程化的抗體"描述一種改變的抗體，即全長合成的抗體(例如針對一個(gè)抗體片段的嵌合的或人源化的抗體)，其中特定受體抗體的輕鏈和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域的一部分被來自一個(gè)或多個(gè)供體抗體的類似部分替換，所述供體抗體對特定表位具有特異性。例如，這類分子可包括這樣一些抗體，其特征在于，人源化的重鏈與未修飾的輕鏈(或嵌合的輕鏈)相連，反之亦然。工程化的抗體的特征也可以是編碼受體抗體輕鏈和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域框架區(qū)(frameworkregions)的核酸序列發(fā)生改變，使之保留供體抗體結(jié)合特異性。這些抗體可包含用來自本文描述的供體抗體的CDR替換來自受體抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR。"嵌合抗體"指一類工程化的抗體，其包含來源于供體抗體的天然存在的可變區(qū)(輕鏈和重鏈)，以及來源于受體抗體的輕鏈和重ii恒定區(qū)。"人源化抗體"指一類工程化的抗體，其CDR來源于非人類供體免疫球蛋白，分子中殘余的來源于免疫球蛋白的部分來源于一種(或多種)人類免疫球蛋白。此外，框架支持殘基可被改變以維持結(jié)合親和性(見例如，Queen等，Proc.NatlAcadSciUSA,86:10029-10032(1989),Hodgson等,Bio/Technology,9:421(1991))。術(shù)語"供體抗體"指這樣一種(單克隆或多克隆)抗體，它將其可變區(qū)、CDR或其他功能片段或其類似物提供給第一免疫球蛋白，以提供改變的免疫球蛋白編碼區(qū)和所得的表達(dá)的抗^本，該抗體具有供體抗體的抗原特異性或中和活性特征。一種適用于本發(fā)明的供體抗體是命名為2B6的非人類(即鼠的)中和單克隆抗體?？贵w2B6被限定為高親和性的、人類IL-5特異性的(即不識別鼠IL-5)同種型IgG!的中和抗體，它在合適的鼠IgG恒定區(qū)內(nèi)，分別具有SEQIDNO:2和16的可變輕鏈DNA和氨基酸序列，以及SEQIDNO:l和15的可變重鏈DNA和氨基酸序列。術(shù)語"受體抗體"指與供體抗體異源的(單克隆或多克隆)抗體，它將編碼其重鏈和/或輕鏈框架區(qū)和/或其重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)全部(或任意部分，但優(yōu)選全部)的核酸序列貢獻(xiàn)給第一免疫球蛋白配對物。優(yōu)選地，人類抗體是該受體抗體。"CDR"被限定為一種抗體的互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸序列，它是免疫球蛋白重鏈和輕鏈的超可變區(qū)。見例如，Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,4thEd.,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NationalInstitutesofHealth(1987)。免疫球蛋白的可變部分中有三種重鏈CDR和三種輕鏈CDR(或CDR區(qū))。因此，本文所用"CDR"指全部三種重鏈CDR,或全部三種4至鏈CDR(或全部重鏈和輕鏈CDR,若合適的話)。在抗體與抗原或表位結(jié)合時(shí)，CDR提供主要的接觸殘基。本發(fā)明感興趣的CDR來源于供體抗體可變重鏈和輕鏈序列，包括天然存在的CDR的類似物，該類似物分享或維持與和它來源相同的供體抗體同樣的抗原結(jié)合特異性和/或中和能力。"分享抗原結(jié)合特異性或中和能力"指，例如，雖然mAb可能具有某種程度的抗原親和性，但被2B6核酸序列編碼的CDR在適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)環(huán)境中可能具有較低的或較高的親和性。人們希望2B6的CDR在這樣的環(huán)境中與2B6識別相同的表位。2B6重鏈CDR的實(shí)例包括SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9，2B6輕鏈CDR的實(shí)例包括SEQIDNO:10、SEQIDNO:ll和SEQIDNO:12。"功能性片段"是重鏈或輕鏈可變序列的一部分(例如免疫球蛋白可變區(qū)的氨基或羧基末端的小的缺失)，它保留了與產(chǎn)生該片段的抗體相同的抗原結(jié)合特異性和/或中和能力。"類似物"是至少一個(gè)氨基酸被修飾的氨基酸序列，其中所述修飾可以是化學(xué)性的，或是少量氨基酸(即不超過10個(gè))的替換或重排，該修飾使得氨基酸序列保留未修飾的序列的生物學(xué)特性，例如抗原特異性和高親和性。例如，當(dāng)在CDR編碼區(qū)內(nèi)或周圍產(chǎn)生了某些內(nèi)切核酸酶限制性位點(diǎn)時(shí)，可以通過替換構(gòu)建(不活動(dòng))突變。類似物也可由等位變異產(chǎn)生。"等位變異或修飾"是編碼本發(fā)明的氨基酸或肽序列的核酸序列中的改變。逸種變異或修飾可來自于遺傳密碼的簡并性，或被精心地工程化，以提供所需的特性。這些變異或修飾可以或不可以導(dǎo)致任何所編碼的氨基酸序列發(fā)生改變。術(shù)語"效應(yīng)子試劑"指非蛋白載體分子，改變的抗體和/或供體抗體的天然或合成的輕鏈或重鏈，或供體抗體的其他片段可通過常規(guī)方式與之相連。這樣的非蛋白載體可包括診斷領(lǐng)域所用的常規(guī)載體，例如聚笨乙烯或其他塑料珠，多糖，如BIAcore[Pharmacia]系統(tǒng)中所用的，或其4也可用于醫(yī)藥領(lǐng)域的非蛋白物質(zhì)，它們對人和動(dòng)物施用時(shí)是安全的。其他效應(yīng)子試劑可包括用于螯合重金屬原子或放射性同位素的大環(huán)。這些效應(yīng)子試劑也可用于提高改變的抗體的半衰期，例如聚乙二醇。II.高親和性IL-5單克隆抗體為了用于構(gòu)建本發(fā)明的抗體、改變的抗體和片段，可用非人類的物種(例如牛、羊、猴、雞、嚙齒動(dòng)物(例如鼠和大鼠)等)來產(chǎn)生所需的免疫球蛋白，該免疫球蛋白呈遞天然的人類IL-5或其它肽表位。常規(guī)的雜交瘤技術(shù)可用于提供分泌非人類抗IL-5單克隆抗體釣雜交瘤細(xì)胞系。然后用IL-5包被的96孔板篩選結(jié)合的雜交瘤，如實(shí)施例部分所述，或可選地用與鏈親和素包被的平板結(jié)合的生物素化的IL-5。本發(fā)明的一個(gè)示例性的，高親和'f生的，中和mAb是mAb2B6，它是一種鼠類抗體，可用于開發(fā)嵌合的、人源化的抗體，在下面的實(shí)施例l中有進(jìn)一步的描述。2B6單克隆抗體的特征在于特異性結(jié)合人類IL-5的抗原，對IL-5的Kd值小于3.5xio-nM(大約2.2x10—"M)。通過光學(xué)生物傳感器確定的2B6的Fab片段對IL-5的Kd值是大約9xio—nM。mAb2B6看來阻遏人類IL-5和人類IL-5受體a鏈之間的結(jié)合反應(yīng)0另一種所需的供體抗體是鼠類mAb-2E3。這種mAb是同種型IgG2a,對hIL-5的解離常數(shù)小于3.5x10_"M(大約2.0x10_"M)。另一種所需的供體抗體是大鼠mAb-4A6。這種mAb對hIL-5的解離常數(shù)小于3.5xio—nM(大約1.8x10—"M)。此外，mAb4A6看來阻遏人類IL_5和人類IL-5t體P鏈之間的結(jié)合反應(yīng)。本發(fā)明不限于應(yīng)用2B6mAb、2E3mAb或其超可變(即CDR)序列。任何其他對人類IL-5的解離常數(shù)小于或等于3.5x10—"M的高親和性IL-5抗體和相應(yīng)的抗IL-5CDR可替換它們。下面說明書中的供體抗體被限定為2B6或2E3，這個(gè)名稱僅是用于說明并使說明書簡化。IIL抗體片段本發(fā)明也包括Fab片段或F(ab')2片段，這些片段來源于抗人類IL-5的mAb。這些片^殳可用作體內(nèi)抗IL-5和嗜曙紅細(xì)胞介導(dǎo)的病癥的藥劑，或作為IL-5體外診斷的一部分。Fab片段包含輕鏈的全部和重鏈的氨基末端部分；F(ab')2片段是由兩個(gè)Fab片段通過二硫鍵結(jié)合形成的片段。單克隆抗體2B6、2E3和其他類似的高親和性的IL-5結(jié)合抗體，提供了Fab片段和F(ab')2片段來源，這些片段可以通過常規(guī)方式得到，例如用合適的蛋白水解酶(木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)切割mAb,或用重組方法得到。這些Fab和F(ab')2片段本身可用作治療、預(yù)防或診斷藥劑，以及用作序列供體，所述序列包括可變區(qū)和CDR序列，它們可用于形成本文描述的重組或人源化的抗體。Fab和F(ab')2片^殳可通過重組噬菌體文庫構(gòu)建(見例如Winter等，Arm.Rev.Immunol.,12:433-455(1994))或免疫球蛋白鏈改組技術(shù)(見例如Marks等，Bio/Technology,10.779-783(1992),兩篇文獻(xiàn)均完整地在此引入作為參考)構(gòu)建，其中來自選定抗體的Fd或vh免疫球蛋白(例如2B6)被允許與輕鏈球蛋白vl(或vk)的所有組成部分結(jié)合，以形成新的Fab。相反，來自選定抗體的輕鏈可被允許與重鏈免疫球蛋白vH(或Fd)的所有組成部分結(jié)合，以形成新的Fab。當(dāng)mAb2B6的Fd被允許與輕鏈免疫球蛋白的所有組成部分結(jié)合時(shí)，得到中和IL-5Fab,如實(shí)施例部分所詳述的。因此，人們可由鏈改組技術(shù)用單一序列(核苷酸或氨基酸)回收中和Fab。IV.感興趣的抗IL-5氨基酸和^亥苷酸序列上述mAb2B6或其他抗體可提供序列，如可變重鏈和/或輕鏈肽序列、框架序列、CDR序列、功能片段及其類似物，以及編碼它們的核酸序列，可用于設(shè)計(jì)和待到不同的改變的抗體，這些抗體對供體抗體具有抗原特異性。作為一個(gè)實(shí)例，本發(fā)明提供可變輕鏈和可變重鏈序列，這些序列來自IL-5鼠抗體2B6及其衍生的序列。2B6的重鏈可變區(qū)由圖1給出。CDR編碼區(qū)用方框區(qū)域標(biāo)出，并由SEQIDN0:7;SEQIDNO:8和SEQIDNO:9給出。2B6的輕鏈克隆可變區(qū)由圖2給出。CDR編碼區(qū)由SEQIDNO:10;SEQIDNO:II和SEQIDNO:12給出。人源化的重鏈可變區(qū)由圖8給出[SEQIDNO:18和19]。信號序列也由SEQIDNO:17給出。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他合適的信號序列，可以替換本實(shí)例中的信號序列。此構(gòu)建體的CDR氨基酸序列與天然鼠和嵌合重鏈CDR的相同，由SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9給出。人源化的輕鏈可變序列的一個(gè)實(shí)例(合成的)由圖9給出[SEQIDNO:20和21]。本發(fā)明的編碼可變輕鏈和重鏈肽序列的核酸序列或其片段，也可用于在編碼CDR或框架區(qū)的核酸序列內(nèi)誘變產(chǎn)生特定的變化，并將所得的被修飾的或融合的核酸序列摻入表達(dá)質(zhì)粒中。例如，框架和核酸序列和CDR編碼區(qū)內(nèi)的不活動(dòng)替換被用于形成限制酶位點(diǎn)，這些位點(diǎn)有助于請變的CDR(和/或框架)區(qū)的插入。這些CDR編碼區(qū)被用于構(gòu)建本發(fā)明的人源化的抗體。考慮到遺傳密碼的簡并性，可以構(gòu)建不同的編碼序列，這些序列編碼可變重鏈和輕鏈氨基酸序列，本發(fā)明的CDR序列及其功能性片段或類似物，它們也具有供體抗體的抗原特異性。本發(fā)明的編碼可變輕鏈肽序列或CDR的分離的核酸序列或其片段，當(dāng)與第二免疫球蛋白配對物可搡作地結(jié)合時(shí)，可用于產(chǎn)生改變的抗體，例如嵌合的或人源化的抗體，或其他工程化的抗體。應(yīng)當(dāng)注意到，除了本文描述的編碼改變的抗體部分的分離的核酸序列外，本發(fā)明也包括其他這些的核酸序列，例如與天然CDR編碼序列互補(bǔ)的，或與位于CDR編碼區(qū)周圍的被〗奮飾的人類框架區(qū)互補(bǔ)的序列。有用的DNA序列包括這樣一些序列，它們在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與DNA序列雜交(見T.Maniatis等，分子克隆(實(shí)驗(yàn)指南)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1982),387-389頁)。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的一個(gè)實(shí)例是用4xSSC在65。C下雜交，然后用0.1xSSC在65。C下清洗一個(gè)小時(shí)。另一嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是50%甲酰胺，4xSSC,42°C。優(yōu)選地，這些雜交的DNA序列的長度至少是大約18個(gè)核苷酸，即大約CDR的大小。V.改變的免疫球蛋白分子和改變的抗體改變的免疫球蛋白分子可編碼改變的抗體，該抗體包括工程化的抗體，如嵌合抗體和人源化的抗體。所需的改變的免疫球蛋白編碼區(qū)包含CDR編碼區(qū)，CDR編碼區(qū)編碼對IL-54元體有抗原特異性的肽，優(yōu)選的是本發(fā)明提供的高親和性抗體，它被插入第一免疫球蛋白配對物(人類框架或人類免疫球蛋白可變區(qū))中。優(yōu)選地，第一免疫球蛋白配對物與第二免疫球蛋白配對物可搡作地相連。第二免疫球蛋白配對物由上文限定，可包括編碼感興趣的第二抗體區(qū)域(例如Fc區(qū))的序列。第二免疫;泉蛋白配對物也可包括編碼另一免疫球蛋白的序列，所述另一免疫球蛋白與輕鏈或重鏈恒定區(qū)在框架內(nèi)或以連接物序列的方式融合。針對IL-5的功能片段或類似物的工程化抗體可被設(shè)計(jì)得與同一抗體有更強(qiáng)的結(jié)合能力。第二免疫球蛋白配對物也可與上文限定的效應(yīng)物試劑(包括非蛋白載體分子)結(jié)合，第二免疫球蛋白配對物可以以常規(guī)方式與之可搡作地連接。在第二免疫球蛋白配對物(例如纟亢體序列)和效應(yīng)物試劑之間的融合和連接可通過任何合適的方式進(jìn)行，例如通過常規(guī)的共價(jià)或離子鍵，蛋白融合，或異雙功能交聯(lián)，如碳化二亞胺，戊二醛等。這些技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，在常規(guī)的化學(xué)和生物化學(xué)課本中已有描述。此外，常規(guī)的連接序列也可被構(gòu)建到改變的免疫球蛋白編碼區(qū)內(nèi)，這些連接序列僅在第二免疫球蛋白配對物和效應(yīng)物試劑之間才是供所需數(shù)量的空間。這樣的連接物的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域^t術(shù)人員充分了解的。此夕卜，本發(fā)明的分子的信號序列可被修飾，以增強(qiáng)表達(dá)。作為一個(gè)實(shí)例，具有信號序列和來源于鼠重鏈序列的CDR的2B6人源化抗體，其初始的信號肽被另一信號序列[SEQIDNO:l71替換。一種示例性的改變的抗體含有可變重鏈和/或輕鏈肽，或含有對mAb2B6具有抗原特異性的蛋白序列，例如VH和Vi鏈。本發(fā)明另一種所需的改變的抗體的特征在于這樣的氨基酸序列或其功能片段或類似物，它包含鼠抗體分子2B6的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的至少一個(gè)，優(yōu)選全部的CDR,殘余序列來源于人。見例如人源化的Vh和A^區(qū)(圖8和9)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程化的抗體可與另一試劑相連。例如，重組DNA技術(shù)的方法可用于產(chǎn)生本發(fā)明的工程化抗體，其中完整抗體分子的Fc片段或CH2CH3結(jié)構(gòu)域被一種酶或其他可檢測分子(即多肽效應(yīng)物或報(bào)道分子)替換。第二免疫球蛋白配對物也可與非免疫球蛋白肽、蛋白或其片段可操作地連接>這些非免疫球蛋白肽、蛋白或其片段是與對鼠2B6有抗原特異性的含CDR的序列異源的。表達(dá)后所得的蛋白同時(shí)具有抗IL-5抗原特異性和非免疫球蛋白的特性。融合配對物特性可以是例如功能特性，如其他結(jié)合或受體結(jié)構(gòu)域；或治療特性，如果融合配對物本身是治療性蛋白；或其他抗原特性。本發(fā)明另一種所需的蛋白可包括具有全長重鏈和輕鏈的完整抗體分子，或其任何離散的片段，如Fab或F(ab')2片段，重鏈二聚體，或其任何最小重組片段，例如Fv或單鏈抗體(SCA)或任何其他具有與選定供體單克隆抗體(例如mAb2B6或2E3)相同的特異性的分子。這樣的蛋白可以以改變的抗體形式應(yīng)用，或以其非融合形式應(yīng)用。疫球蛋白;jl架"k恒定區(qū)的任何同種型'或類型、)5,都可得到工程化抗體。:程化抗體可包含來自例如受體抗體的免疫球蛋白(Ig)恒定區(qū)和可變框架區(qū)，和來自供體抗體(如本文描述的抗IL-5抗體)的一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選所有)CDR。此外，可對受體mAb輕鏈和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域框架區(qū)在核酸或氨基酸水平上進(jìn)行改變，例如缺失、替換或添加，或改變供體CDR區(qū)，以便保留供體抗體的抗原結(jié)合特異性。這些工程化的抗體;^皮設(shè)計(jì)為具有IL-5mAb(如上述任意地l務(wù)飾)可變重鏈和/或輕鏈中的一個(gè)(或兩個(gè))，或下面確定的重鏈或輕鏈CDR(見圖7)中的一個(gè)或多個(gè)。本發(fā)明的工程化抗體被中和,'即它們按需要阻遏與IL_5蛋白受體的結(jié)合，它們也阻遏或防止IL-5依賴型細(xì)胞的增殖。這些工程化抗體可包括人源化抗體，該人源化抗體含有選定的人類免疫球蛋白或亞型的框架區(qū)，或是包含與IL-5抗體功能片段融合的人類重鏈和輕鏈恒定區(qū)的嵌合抗體。合適的人類(或其他動(dòng)物)受體抗體可根據(jù)與供體抗體的核苷酸和氨基酸序列的同源性選自常規(guī)的數(shù)據(jù)庫，例如KABAT⑧數(shù)據(jù)庫、LosAlamos數(shù)據(jù)庫和Swiss蛋白數(shù)據(jù)庫。與供體抗體的框架區(qū)同源的(基于氨基酸)的人類抗體可能適于提供用于插入供體CDR的重鏈恒定區(qū)和/或重鏈可變框架區(qū)。可以用類似方式選擇能提供輕鏈恒定區(qū)或可變框架區(qū)的合適的受體抗體。應(yīng)注意到受體抗體的重鏈和輕鏈對由同一受體抗體起始而言是不需要的。異源框架和恒定區(qū)最好選自人類免疫球蛋白及其同種型，如IgG(亞型1至4),IgM,IgA和IgE。但是，受體抗體不必僅包含人類免疫球蛋白序列。例如可以這樣構(gòu)建基因，使得其中編碼部分人類免疫球蛋白鏈的DNA序列與編碼非免疫球蛋白氨基酸序列(例如多肽效應(yīng)子或受體分子)的DNA分子融合。特定的所需人源化抗體的一個(gè)實(shí)例包含2B6的CDR,它被插入選定的人類抗體序列的框架區(qū)。對于中和人類抗體，一個(gè)，兩個(gè)或優(yōu)選三個(gè)來自IL-5抗體重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的CDR被插入選定的人類抗體序列的框架區(qū)，替換了人類抗體的天然CDR。優(yōu)選地，在人源化的抗體中，'人類重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域通過一個(gè)或多個(gè)CDR替換而被工程化?？梢允褂萌苛鶄€(gè)CDR，或使用少于六個(gè)的CDR的不同組合。優(yōu)選全部六個(gè)CDR被替換?？梢詢H在人類重鏈中替換CDR,用輕鏈作為來自人類受體抗體的未修飾的輕鏈。可選地，可相容的輕鏈可通過常規(guī)抗體數(shù)據(jù)庫選自另一人類抗體。工程化抗體的剩余物可來源于任何合適的受體人類免疫球蛋白。工程化的人源化抗體優(yōu)選地具有天然人類抗體或其片段的結(jié)構(gòu)，并具有-I介導(dǎo)的人^炎癥。；Z、'、'''''作為另一實(shí)例，工程化抗體可包含三個(gè)2E3可變輕鏈區(qū)的CDR[SEQIDNO:IO、11和13]和三個(gè)2B6可變重鏈區(qū)的CDR[SEQIDNO:7、8和9]。所得人源化抗體應(yīng)具有與mAb2B6相同的抗原結(jié)合特異性和高親和小生。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，工程化抗體可通過改變可變結(jié)構(gòu)域氨基酸而被進(jìn)一步修飾，同時(shí)不會(huì)顯著影響供體抗體(即類似物)的特異性和高親和性。預(yù)期重鏈和輕鏈氨基酸可被其他氨基酸取代，取代位于可變結(jié)構(gòu)域框架和/或CDR中。此外，可改變恒定區(qū)以提高或降低本發(fā)明分子的選擇特性。例如二聚化，與Fc受體結(jié)合或結(jié)合并激活補(bǔ)體的能力(見例如Angal等，分子免疫學(xué)，30:105-108(1993),Xu等，生物化學(xué)雜志，269:3469-3474(1994),Winter等，EP307,434-B)。作為嵌合抗體的改變的抗體與上面描述的人源化抗體不同，它提供完整的非人類供體抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)(包括框架區(qū))，它們均與兩條鏈的人類免疫球蛋白恒定區(qū)相連。預(yù)期相對人源化抗體而言保留了附加的非人類序列的嵌合抗體可在人體中引發(fā)顯著的免疫應(yīng)答。這樣的抗體在本發(fā)明和IL-5個(gè)導(dǎo)的疾病的治療中是有用的，如下所述。VI.改變的抗體和工程化抗體的制備優(yōu)選地，mAb2B6或其他合適的供體單克隆抗體(例如2E3、2F2、4A6等)的可變輕鏈和/或重鏈序列以及CDR,和它們的編碼核酸序列，被用于通過如下方法構(gòu)建本發(fā)明的改變的抗體，優(yōu)選人源化抗體。相同或用常規(guī)方法克隆產(chǎn)生選定供體mAb(例如鼠抗體2B6)的雜交瘤，該抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA可通過本領(lǐng)域才支術(shù)人員已知的技術(shù)得到，例如Sambrook等(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1989))描述的技術(shù)。用多核普酸引物和逆轉(zhuǎn)錄酶得到2B6的可變重鏈和輕鏈，它們至少包含CDR編碼區(qū)和受體mAb輕鏈和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域框架區(qū)的某些部分(這些部分是為保留供體mAb結(jié)合特異性所需的)，以及殘余的免疫球蛋白來源的部分，所述免疫球蛋白來源于人類免疫球蛋白的抗體鏈?？芍苽涫?人嵌合抗體并檢測結(jié)合活性。這種嵌合抗體包含完整的非人類供體抗體VH和VL區(qū)，它們在兩條鏈中均與人類Ig恒定區(qū)相連。用計(jì)算機(jī)化的數(shù)據(jù)庫(例如KABAT)來確定來自人類抗體的重鏈可變區(qū)的同源框架區(qū)，并且選擇與2B6有同源性的人類抗體作為受體抗體。設(shè)計(jì)在人類抗體框架內(nèi)含有2B6CDR編碼區(qū)的合成的重鏈可變區(qū)的序列，它在框架區(qū)內(nèi)具有任選的核香酸替換，以引入限制性位點(diǎn)。隨后用長的合成寡聚物合成出所設(shè)計(jì)的序列?？蛇x地，所設(shè)計(jì)的序列是通過重疊寡核香酸，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增和修正錯(cuò)i吳而被合成的。用類似的方式可以設(shè)計(jì)出合適的幸至鏈可變框架區(qū)。人源化的抗體可來源于嵌合抗體，或優(yōu)選地通過合成制備，合成是通過在選定的重鏈和輕鏈框架內(nèi)適當(dāng)?shù)夭迦雭碜灾劓満洼p鏈的供體mAbCDR編碼區(qū)而完成的?？蛇x地，本發(fā)明的人源化的抗體可用標(biāo)準(zhǔn)i秀變技術(shù)制備。因此，所得的人源化抗體包含人類框架區(qū)和供體mAbCDR編碼區(qū)。隨后可對框架殘基進(jìn)行進(jìn)一步操作。所得人源化抗體可在重組宿主細(xì)胞(例如COS、CHO或骨髓瘤細(xì)胞)中表達(dá)。其他人源化抗體可用這一技術(shù)在其他合適的IL-5特異性的、中和的、高親和性的非人類抗體上制備。常規(guī)的表達(dá)載體或重組質(zhì)?？蛇@4f制備將改變的抗體的這些編碼序列與常規(guī)的調(diào)節(jié)控制序列可搡作地連4妄，所述調(diào)節(jié)控制序列能控制在宿主細(xì)胞中的復(fù)制和表達(dá)，和/或從宿主細(xì)胞中分泌。調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子序列，例如CMV啟動(dòng)子，和信號序列，它可來源于其他已知抗體。類似地可制備第二表達(dá)載體，該載體具有編碼互補(bǔ)抗體輕鏈或重鏈的DNA序列。優(yōu)選地，第二表達(dá)載體與第一表達(dá)載體相同，只是涉及編碼序列和可選擇的標(biāo)記物，以確保各多肽鏈被功能性地表達(dá)?？蛇x地，改變的抗體的重鏈和輕鏈編碼序列可存在于單一載體上。通過常規(guī)技術(shù)將第一和第二載體共轉(zhuǎn)染選定的宿主細(xì)胞(或只用單一載體轉(zhuǎn)染)，以產(chǎn)生本發(fā)明的被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，該細(xì)胞同時(shí)包含重組的或合成的輕鏈和重鏈。隨后用常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以制備本發(fā)明的工程化的抗體。通過適當(dāng)?shù)臋z測技術(shù)，如ELISA或RIA,從培養(yǎng)物中篩選出與重組重鏈和/或輕鏈相連的人源化抗體。類似的常規(guī)技術(shù)可用于構(gòu)建本發(fā)明其他改變的抗體和分子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可篩選出克隆和亞克隆步驟所用的合適的載體，所述的克隆和亞克隆步驟被用于本發(fā)明的方法和組合物的構(gòu)建中。例如可使用常規(guī)的pUC系列克隆載體。所用的一種載體是pUC9，它可以從例如Amersham(Buckinghamshire,英國)或Pharmacia(Uppsala,瑞典)購得。^匕外，任何容易復(fù)制，具有大量克隆位點(diǎn)和可選擇的基因(例如抗生素抗性)，容易操作的載體可用于克隆。因此，對克隆載體的選擇在本發(fā)明中不是限制性因素。類似地，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可從任意常規(guī)載體中選擇出表達(dá)本發(fā)明的工程化抗體所需的載體。這些載體也包含選定的調(diào)節(jié)序列(如CMV啟動(dòng)子)，它指導(dǎo)異源DNA序列在選定的宿主細(xì)胞中的復(fù)制和表達(dá)。這些載體含有上面描述的DNA序列，所述序列編碼工程化抗體或改變的免疫球蛋白編碼區(qū)。此外，載體中可摻入選定的免疫球蛋白序列，該序列通過所需的限制性位點(diǎn)的插入而被修飾，以利于纟喿作。表達(dá)載體的特征也可在于這樣一些基因，它們適于擴(kuò)大異源DNA序列(例如哺乳動(dòng)物二氫葉酸還原酶基因(DHFR))的表達(dá)。其他優(yōu)選的載體序列包含一段polyA信號序列，該序列來自例如牛生長激素(BGH)和P珠蛋白啟動(dòng)子序列(betaglopro)。本文所用的表達(dá)載體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員充分了解的技術(shù)合成。這些載體的組分，例如復(fù)制子、選擇基因、增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、信號序列等，可從商業(yè)或天然來源得到，或用已知的方法合成，它們被用來在宿主細(xì)胞中指導(dǎo)重組DNA的產(chǎn)物的表達(dá)和/或分泌?？蔀榇四康倪x擇其他合適的表達(dá)載體，它們之中用于哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、昆蟲、酵母和真菌表達(dá)的多種類型是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明也包括用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，所述重組質(zhì)粒包含工程化抗體或其改變的免疫球蛋白分子的編碼序列。適于這些克隆載體克隆和其他操作的宿主細(xì)胞也是常規(guī)的。但是，最優(yōu)選地，來自大腸桿菌的不同菌抹被用于克隆載體的復(fù)制和本發(fā)明的改變的抗體的構(gòu)建中的其他步驟。系優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO、COS、成纖維細(xì)胞(例如3T3)和骨髓細(xì)胞，更優(yōu)選的是CHO或骨髓細(xì)胞?？捎萌祟惣?xì)胞，這使得分子可以以人類糖基化模式被修飾?？蛇x地，可以使用其他真核細(xì)胞系。合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的逸擇，轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、擴(kuò)增、篩選和產(chǎn)物制備和純化的方法是本領(lǐng)域已知的。見例如Sambrook等，引文同上。細(xì)菌細(xì)胞可用作適于表達(dá)本發(fā)明的重組Fab的宿主細(xì)胞(見例如Pluckthum，A.,免疫學(xué)綜述，130:151-188(1992))。但是，由于細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)的蛋白有處于非折疊或不正確折疊形式或處于非糖基化形式的傾向，應(yīng)對任何細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生的重組Fab篩選其抗原結(jié)合能力的保留。如果細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)的分子以正確折疊的形式產(chǎn)生，該細(xì)菌細(xì)胞將是所需的宿主。例如，用于表達(dá)的不同大腸桿菌菌抹是生物
技術(shù)領(lǐng)域：
眾所周知的宿主細(xì)胞?？莶菅挎邨U菌、鏈霉菌和其他桿菌等的不同菌抹也可用于本方法。如果需要，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的酵母菌抹也可作為宿主細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞(例如果蠅和鱗翅目昆蟲)和病毒表達(dá)系統(tǒng)也是如此。見例如Miller等，遺傳工程，8:277-298,PlenumPress(1986)以及其中所引用的文獻(xiàn)。構(gòu)建本發(fā)明的載體的一般方法，產(chǎn)生本發(fā)明的宿主細(xì)胞所需的轉(zhuǎn)染方法，和從該宿主細(xì)胞產(chǎn)生本發(fā)明的改變的抗體所必需的培養(yǎng)方法都是常規(guī)的技術(shù)。同樣，本發(fā)明的改變的抗體一旦生成，即可根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法從細(xì)胞培養(yǎng)物中將其純化，所述方法包括辟L酸銨沉淀、親和柱、柱層析、凝膠電泳等。這些技術(shù)屬于本領(lǐng)域之內(nèi)，并且沒有對本發(fā)明進(jìn)行限制。人源化抗體的另一種表達(dá)方法可利用在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的表達(dá)，如美國專利4,873，316號中描述的。這涉及利用動(dòng)物酪蛋白啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)，當(dāng)其被轉(zhuǎn)基因性地?fù)饺氩溉閯?dòng)物中時(shí)，能使雌性動(dòng)物在其奶中產(chǎn)生所需的重組蛋白。一旦用所需的方法表達(dá)，即通過合適的檢測手段檢查工程化抗體的體外活性。用目前常規(guī)的ELISA檢測方案來定量和定性地評估工程化抗體與IL-5的結(jié)合。此外，可用其他體外檢測手段確認(rèn)中和效果，然后進(jìn)行人類臨床研究以評價(jià)工程化抗體除通常的清除機(jī)制外的機(jī)體內(nèi)持續(xù)能力。在由2B6制備人源化抗體的方法之后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可從本文描述的其他供體IL-5抗體、可變區(qū)序列和CDR肽構(gòu)建人源化的抗體。工程化抗體可用可變區(qū)框架制備，該框架可能通過^妄受工程化抗體而識別"自身"?？勺儏^(qū)框架的小的改變可使抗原結(jié)合產(chǎn)生大的增加，但對接受者的免疫原性沒有可覺察的增加。這種工程化的抗體可有效地治療IL-5介導(dǎo)的人類疾病。這類抗體也用于診斷這些疾病。VII.治療/預(yù)防應(yīng)用本發(fā)明也涉及治療人類嗜曙紅細(xì)月包相關(guān)癥狀(如氣喘)的方法，包括施用有效劑量的抗體，所述抗體包括本文描述的工程化抗體或改變的抗體或其片段中的一種或多種。利用本發(fā)明的分子誘導(dǎo)的治療反應(yīng)可通過結(jié)合人類IL-5然后阻遏嗜曙紅細(xì)胞刺激作用而產(chǎn)生。因此，當(dāng)處于適于治療應(yīng)用的制備物和制劑中時(shí)，本發(fā)明的分子對這樣一些人是非常有用的，他們患有變態(tài)和/或特應(yīng)性反應(yīng)，或與嗜曙紅細(xì)胞有關(guān)的反應(yīng)，例如但不限于，過敏性鼻炎、氣喘、慢性嗜曙紅性肺炎、過敏性支氣管曲霉病、腹腔病、嗜曙紅性胃腸炎、Churg-Strauss綜合癥(結(jié)節(jié)性動(dòng)脈外膜炎和特應(yīng)性病)、嗜曙紅肌痛綜合癥、嗜曙紅細(xì)胞過多綜合癥、水腫反應(yīng)(包括發(fā)作性angiodema)、蠕蟲感染(其中嗜曙紅細(xì)胞起保護(hù)性作用)、盤尾絲蟲皮炎和特應(yīng)性皮炎。本發(fā)明的改變的抗體、抗體及其片段也可與其他抗體結(jié)合應(yīng)用，特別是可與其他標(biāo)記物(表位)反應(yīng)的人類mAb,所述標(biāo)記物與疾病相關(guān)，本發(fā)明的工程化抗體是針對這些標(biāo)記物的。據(jù)信，本發(fā)明的治療性藥劑可在大約2天至3周內(nèi)或根據(jù)需要治療過敏性疾病。例如，當(dāng)治療季節(jié)性鼻炎等時(shí)，可能需要較長的治療時(shí)間。這比目前在治療IL-5介導(dǎo)的疾病時(shí)所用的輸注方案要好。治療的劑量和持續(xù)時(shí)間與本發(fā)明分子在人類循環(huán)系統(tǒng)中的相對持續(xù)時(shí)間有關(guān)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)患者的病情和一般健康狀況對其進(jìn)行調(diào)整。本發(fā)明藥劑的施用方式可以是^f壬何將藥劑輸送到宿主中的合適的途徑。本發(fā)明的改變的抗體、抗體、工程化的抗體及其片^殳以及藥物組合物特別適于胃腸外施用，即皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或鼻腔內(nèi)。本發(fā)明的治療藥劑可被制成藥物組合物，該組合物中含有有效量的處于藥用載體中的本發(fā)明的工程化(例力口人源化)抗體作為活性成分。在本發(fā)明的預(yù)防性藥劑中，以適于注射的形式存在的含有工程化抗體的水懸液或溶液(優(yōu)選在生理pH下緩沖的)是優(yōu)選的。用于胃腸外施用的組合物通常含有本發(fā)明工程化抗體的溶液或其溶于藥用載體形成的混合液，所述載體優(yōu)選地是水基載體?？捎貌煌?^基載體，例如0.4%鹽水，0.3%甘氨酸等。這些溶液是滅菌的，通常沒有顆粒狀物種。這些溶液可用常規(guī)的、眾所周知的滅菌技術(shù)(例如過濾)滅菌。組合物中可含有接近生理?xiàng)l件所需的藥用輔助性物質(zhì)，例如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑等。本發(fā)明抗體在藥物組合物中的濃度可在較寬的范圍內(nèi)變化，即重量比從小于0.5%,通常等于或小于1%,到15%或20%，根據(jù)所選4奪的具體施用方式，基于液體的體積、粘度等來選擇抗體的濃度。因此，用于肌肉內(nèi)注射的本發(fā)明的藥物組合物可包含1毫升無菌緩沖液，和大約1納克至100毫克，例々口大約50納克至30毫克，或更優(yōu)選大約5毫克至25毫克的本發(fā)明的工程^f匕抗體。類似地，用于靜脈輸注的本發(fā)明的藥物組合物可包含250毫升無菌的Ringer's溶液，和大約1至30,優(yōu)選5毫克至大約25毫克的本發(fā)明的工程化抗體。制備可胃腸外施用的組合物的精確方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的或是顯而易見的，更詳細(xì)的描述見例^口Remington'sPharmaceuticalScience,15thed.,MackPublishingCompany,Easton,Pennsylvania。優(yōu)選地，當(dāng)處于藥物制備物中時(shí)，本發(fā)明的治療藥劑以單位劑量形式存在。適當(dāng)?shù)闹委熡行┝靠捎杀绢I(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。為了有效地治療人或其他動(dòng)物的炎癥，應(yīng)當(dāng)對每70公斤體重通過胃腸外(優(yōu)選靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi))施用大約0.1毫克至20毫克劑量的本發(fā)明的蛋白或抗體。如果必要的話，在炎癥反應(yīng)期間，醫(yī)生可選擇合適的時(shí)間間隔重復(fù)這一劑量。本發(fā)明的改變的抗體和工程化抗體也可用于"^斷，例如確定IL-5介導(dǎo)的疾病或跟蹤這類疾病的治療進(jìn)程。作為診斷藥劑，這些改變的抗體可被常規(guī)地標(biāo)記以用于ELISA和其他常弄見的測量血清、血漿或其他適當(dāng)?shù)慕M織中的，或由培養(yǎng)物中的人類細(xì)胞釋放的IL-5水平的檢測方案。其中利用了改變的抗體的檢測的性質(zhì)是常規(guī)的，并且不限制本發(fā)明公開。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及幫助診斷過敏或其他與嗜曙紅細(xì)胞過量產(chǎn)生有關(guān)的病癥的方法，它包括以下步驟確定得自所述患者的樣本(血漿或組織)中人類IL-5的量，將該量與普通群體中的人類IL-5平均量進(jìn)行比較，由此，如果患者樣本中IL-5的量顯著升高，則表明有與嗜曙紅細(xì)胞過量產(chǎn)生有關(guān)的過敏或其他病癥。本文描述的抗體、改變的抗體或其片段可被冷凍干燥以便貯存，并在使用前在合適的載體中重建。這一技術(shù)已被證明對常規(guī)的免疫球蛋白有效。本領(lǐng)域已知的冷凍干燥和重建技術(shù)可被采用。下述實(shí)施例闡明了本發(fā)明的不同實(shí)施方案，，包括示例性工程化抗體的構(gòu)建及其在合適的載體和宿主細(xì)胞中的表達(dá)，并且不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明的范圍。所有的氨基酸都以常規(guī)的三字母或單字母編碼表示。除非另外說明，所有必要的限制性酶、質(zhì)粒和其他藥劑和材料都是從商業(yè)途徑得到的。所有的一般克隆連接和其他重組DNA方法都按下面文獻(xiàn)中描述的進(jìn)行T.Mamatis等，引文同上，或其第二版(1989)，Sambrook等編輯，出版者相同("Sambrook等")。實(shí)施例1-hIL-5的MAb的制備在果蠅Schneider2(S2)細(xì)胞中表達(dá)人類IL-5,^1夸其純化至均一。用草地貪夜蛾21(Sf21)在Baculovirus中表達(dá)鼠IL-5，將其純化至均一。單克隆抗體TRFK-5(—種中和大鼠抗小鼠IL-5抗體)得自Genzyme公司(Cambridge,MA)。A.免疫方法重組人類IL-5(IL-5)被用作一組七只CAF1雌性小鼠(CharlesRiver,Wilmington,MA)的免疫原。動(dòng)物接受三次皮下注射，注射的是磷酸緩沖液(PBS)中的IL-5,用1:1的TiterMAXTM(CytoRxCorp.,Nocross,GA)將其乳化四個(gè)月。激發(fā)抗原的劑量是50微克，加強(qiáng)劑量是25和10微克。加強(qiáng)之后收集血清樣本，檢測與IL-5的結(jié)合，并通過受體結(jié)合抑制試驗(yàn)和B13增殖試驗(yàn)(或IL-5中和試驗(yàn)(實(shí)施例2C))檢測中和活性。所有小鼠產(chǎn)生的血清樣本都結(jié)合IL-5。在無痛苦致死之前3天，用10微克重組人類IL-5對被選作脾供體的動(dòng)物進(jìn)行靜脈內(nèi)加強(qiáng)注射。B:雜交瘤發(fā)育所用的是Kohler等(Nature,256:495(1975))首先報(bào)道的融合方法，對其進(jìn)行了修改以便用細(xì)胞單層來完成這一技術(shù)(Kennet等編，"雜交瘤生物分析的新方向"，pp.368-377,PlenumPress,NewYork)。合并來自兩只供體小鼠的脾細(xì)胞，用5千萬脾細(xì)胞對1千萬SP2/0/Agl4骨髓瘤細(xì)胞的比例進(jìn)行融合。通過ELISA檢測融合陽性孔的上清液對IL-5的結(jié)合。含有產(chǎn)生IL-5的抗體的細(xì)胞的孔被展開，用IL-5受體結(jié)合抑制試驗(yàn)和B13(中和)增殖試驗(yàn)(下面將要描述)篩選上清。分離出16個(gè)雜交瘤，它們分泌可與IL-5反應(yīng)的單克隆抗體。將雜交瘤上清與碘化的IL-5混合，加入到由表達(dá)IL-5受體(IL-5R)a鏈的果蠅細(xì)胞制備的膜提取物中，檢測受體結(jié)合的抑制。11個(gè)雜交瘤上清液對碘化IL-5與IL-5受體a鏈結(jié)合的抑制大于60%。三種單克隆抗體(2B6、2E3和2F2)也對由人而不是鼠IL-5引發(fā)的鼠B13細(xì)胞的增殖的抑制大于70%。雜交瘤中的5個(gè)，其中4個(gè)阻遏結(jié)合和/或增殖(1C6、2B6、2E3和2F2),l個(gè)是非中和的(24G9),在軟瓊脂中被反復(fù)地亞克隆，以產(chǎn)生穩(wěn)定的克隆細(xì)胞系。用ELISA篩選來自克隆細(xì)胞系上清的交叉反應(yīng)，這些上清不與人類IL-loc、IL-ip、IL-4、IL-8、M-CSF或TGFa結(jié)合。這些單克隆抗體被純化，其結(jié)合親和性用光學(xué)生物傳感器(BIAcore)測定為范圍是10-lOOpM。用同種型試劑(PharMingen,SanDiego,CA)將來自這些細(xì)胞系的上清同種型化。通過類似的方法，如對小鼠進(jìn)行的描述，用相近的免疫方案和用于融合的大鼠雜交瘤，從免疫的大鼠中得到大鼠雜交瘤。兩個(gè)大鼠雜交瘤(4A6和5D3)被鑒定為產(chǎn)生可與IL-5結(jié)合的單克隆抗體。象mAb2B6、2E3和2F2—樣，發(fā)現(xiàn)mAb4A6和5D3在下文描述的B13試驗(yàn)中被中和。C.雜交瘤保藏，產(chǎn)生單克隆抗體2B6的雜交瘤細(xì)胞系SK119-2B6.206.75(1)被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),Rockville,MD,USA,保藏號HB11783，并且依照1977年的布達(dá)佩斯協(xié)議被專利保藏處接受，該協(xié)議管理為專利程序目的的微生物保藏。產(chǎn)生單克隆抗體2E3的雜交瘤細(xì)胞系SKI19-2E3.39..40.2被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),Rockville,MD,USA,保藏號HB11782,并且依照1977年的布達(dá)佩斯協(xié)議被專利保藏處接受，該協(xié)議管理為專利程序目的的微生物保藏。產(chǎn)生單克隆抗體2F2的雜交瘤細(xì)胞系SK119-2F2.37.80.12(1)被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD,USA,保藏號HB11781,并且依照1977年的布達(dá)佩斯協(xié)議被專利保藏處接受，該協(xié)議管理為專利程序目的的微生物保藏，產(chǎn)生單克隆抗體24G9的雜交瘤細(xì)胞系.SKn9-24G9.8.20.5(l)被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),Rockville,MD,USA,保藏號HB11780,并且依照1977年的布達(dá)佩斯協(xié)議被專利保藏處接受，該協(xié)議管理為專利程序目的的微生物保藏。產(chǎn)生單克隆抗體4A6的雜交瘤細(xì)胞系4A6(1)G1F7于1995年6月8日被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),Rockville,MD,USA,保藏號HB11943,并且依照1977年的布達(dá)佩斯協(xié)議被專利保藏處接受，該協(xié)議管理為專利程序目的的微生物保藏。產(chǎn)生單克隆抗體5D3的雜交瘤細(xì)胞系5D3(1)F5D6于1995年6月8曰被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),Rockville,MD,USA，保藏號HB11942,并且依照1977年的布達(dá)佩斯協(xié)議被專利保藏處接受，該協(xié)議管理為專利程序目的的微生物保藏。實(shí)施例2-檢測A.ELISA:用溶于0.05M,pH9.6碳酸緩沖液的0.2微克IL-5包被MaxiSorfc)TM免疫平板的單獨(dú)的孔，4。C保溫過夜后，用含0.025%吐溫@20的PBS清洗平板，用溶于含0.025%吐溫@20的PBS的1%BSA在室溫下封閉2小時(shí)。未稀釋的雜交上清被加到IL-5包#_的孔中，在室溫下保溫2小時(shí)，清洗平板之后，加入用PBS稀釋成1/7500的過氣化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG&IgM(BoehringerMannheim,Indianapolis,IN),所述PBS中含有1%BSA和0.025%吐溫20。2小時(shí)之后清洗平板，加入0.2毫升pH4.75的0.1M檸檬酸緩沖液，該緩沖液中含有0.1%的尿素過氧化物和lmg/ml的鄰苯二胺，15分鐘后，將平板在VMaxTMMicroplateReader(MolecularDevices,MenloPark,CA)上以450nm讀數(shù)，B.受體結(jié)合抑制試驗(yàn)表達(dá)人類IL-5受體(IL-5R)ot鏈的果蠅S2細(xì)胞的膜提取物被用于測量抗體對IL-5與受體結(jié)合的影響，為制備膜，在4。C下用1000xg離心10分鐘沉淀109個(gè)細(xì)胞。用干冰/乙醇浴冷凍細(xì)胞沉淀15分鐘，融化沉淀，用10毫升PBS在4。C下重懸，用1000xg離心10分鐘，用2xPBS清洗細(xì)胞沉淀，重懸于13.5毫升高滲緩沖液(10mMTnspH7.5,3mMMgCl2,ImM二石充蘇糖醇，ImM苯曱碌酰氟，luMleupeptm,luMpepstatmA),在冰上保溫5分鐘。細(xì)胞懸液在15毫升Dounce勻漿器中勻漿，用2.5M蔗糖溶液使蔗糖的終濃度達(dá)到0.25M。1000xg離心15分鐘除去細(xì)胞碎片。4°C下100,000xg離心90分4中沉淀細(xì)胞膜，用50毫升10mMTrispH7.5,3mMMgCl2,250mM蔗糖重懸細(xì)胞膜，-70。C保存。用含有受體的果蠅膜進(jìn)行的檢測在MultiscreenGVTM平板(MilliporeCorp.,Bedford,MA)上用果蠅果蠅組織培養(yǎng)基M3(Lindqmst等，DrosophilaInf.Serv.,58:163(1982))完成，M3中含有25mMHEPES緩沖液，pH7.2和0.1。/。BSA(結(jié)合緩沖液)。用0.1毫升結(jié)合緩沖液將孔預(yù)封閉。50微升的待測樣本，每樣三份，被加入孔中，隨后加入25微升碘化(^I)IL-5。室溫下溫育20分鐘后，25微升表達(dá)人類IL5Ra鏈的果蠅S2細(xì)胞的膜提取物被加入孔中。進(jìn)一步培養(yǎng)l小時(shí)后，通過真空過濾收集膜，用結(jié)合緩沖液洗3次。過濾物;波干燥和計(jì)數(shù)。C.IL-5中和檢測鼠IL-5/IL—3依賴型細(xì)胞系LyH7.B13(B13)得自R.Plalcios,BaselInstituteofImmunology,Switzerland。纟田另包在RPMI1640培養(yǎng)液(GibcoBRL,Renfrewshire,UK)中每周深層培養(yǎng)兩次，培養(yǎng)液中補(bǔ)充了L-谷氨酰胺，非必需氨基酸，丙酮酸鈉，青霉素-鏈霉素(均為GibcoBRL),加2-巰基乙醇(5x1(T5M,Sigma),lC)o/o胎牛血清(Globepharm,Surrey,UK)和1-10單位的鼠IL-5。為進(jìn)行檢測，在存在被適當(dāng)稀釋的待測樣本的條件下，將細(xì)胞在96孔圓底平板中每樣三份地培養(yǎng)48小時(shí)，在最后4個(gè)小時(shí)中快速施加0.5uCi3H-胸苷(A認(rèn)rsham,Bucks,UK)。在1205Betaplate(LKBWa!lac,Beds,UK)中對其進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)。D.光學(xué)生物傳感器用BIAcore光學(xué)傳感器(PharmaciaBiosensor,Uppsala,Sweden)測量固定化的hIL-5和抗體的動(dòng)力學(xué)和平擺于結(jié)合特性。用前面描述的(Karlsson等,J.Immunol.Meth.,145:229-240(1991))相關(guān)內(nèi)容評價(jià)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，該文獻(xiàn)完整地在此引入作為參考。三種中和單克隆抗體，即2B6、2E3和2F2，具有非常類似的抑制l25I-IL-5與膜受體結(jié)合和B細(xì)胞增殖的中和的能力，并對IL-5有非常類似的親和性(見表I)。來自這三種mAb(2種IgG,和一種IgG2a)的Vh和VL的核苦酸序列已被確定。所得的序列非常類似，僅有幾個(gè)殘基的差異。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>a用光學(xué)生物傳感器(BIOcore)分析(25。C)確定b對1251-IL-5與來自果蠅暖的IL-5R(a鏈)結(jié)合的抑制c對8pM人類IL-5引發(fā)的B13細(xì)胞增殖(以pM為單位)的抑制ND=沒有數(shù)據(jù)實(shí)施例3-來自組合文庫的IL-5Fab的分離和定性A.PCR和組合文庫的構(gòu)建用cDNA試劑盒(BoehrmgerMannheim,Indianapolis,IN)將純化自三只小鼠的脾的RNA逆轉(zhuǎn)錄，使用試劑盒中提供的引物(dT)15'或3'Fd(IgGl,IgG2a&IgG3),以及kappa輕鏈引物，如Huse等(Science，246:1275(1989))和Kang,S.A.(Methods:CompanionMethodsEnzymol.,2:U(1991))所述，文獻(xiàn)在此引入作為參考。用所描述的(Huse等，同上)引物和熱循環(huán)條件通過PCR擴(kuò)增免疫球蛋白cDNA。對所有反應(yīng)采用使用了AmpliWaxPCRGem100(PerkinElmerCetus，Norwalk,CT)小珠的"熱起始(HotStart)"技術(shù)和制造商的方案。PCR產(chǎn)物被凝膠純化、消化并連4妄到pMKFabGene3載體(Ames等，J.Immunol.,152:4572(1994))上。與FdcDNA連接后的文庫滴度為5.1x107CFU，與kappacDNA連接后的文庫滴度為1.5x106CFU。用輔助噬菌體VCSM13(Stratagene)感染XL1-Blue細(xì)胞(Stratagene，LaJolla,CA),該細(xì)胞已用噬菌粒文庫進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，所述噬菌體是如Barbas和Le認(rèn)r(Methods:CompanionMethodsEnzymol.,2:.119(1991))所述制備的。B.生物淘選(Bioparmmg):用溶于0.1M碳酸氪鹽，pH8.6的IL_5(lug/孔)在4。C下將四微滴定孔(ImmulonIIRemovawellStrips,DynatechLaboratoriesInc.,Chantilly,VA)包被過夜。用水清洗孔，用含有3。/。BSA的PBS在37。C下將孔封閉1小時(shí)。除去封閉溶液，將文庫加入微滴定孔中(50ug/孔)，在37。C下保溫2小時(shí)。用TBS/吐溫⑧(50mMTns-HCl,pH7.5,150mMNaCl,0.5%吐溫@20)將孔洗IO次，用水洗l次，然后用下述溶液將粘附的噬菌體洗脫0.1MHC1,用甘氨酸調(diào)至pH2.2,-含lmg/mlBSA。C.菌落轉(zhuǎn)移s:按所述方法(Barbas和Lerner，同上)處理菌落轉(zhuǎn)移s,該菌落轉(zhuǎn)移s來自分離自第3和第4輪生物淘選的克隆。用0.5-1.0uCi125I-IL-5在室溫下，在含有1%BSA的PBS中溫育過濾物1小時(shí)，125I-IL-5是按制造商建議的方法用Bolton-Hunter試劑(NEN,Billerica,MA)碘化的。然后用PBS0.25%吐溫清洗，在柯達(dá)XAR膠片上曝光。用放射自顯影檢測表達(dá)IL-5反應(yīng)性Fab的克隆。D.可溶FAB的制備用Nhel和Spel消化噬菌粒DN八以除去基因III并自連4妻。XLl-Blue細(xì)胞被轉(zhuǎn)化，分離的克隆在含有1%葡萄糖和50ug/ml羧節(jié)青霉素的5.0毫升s叩erbroth(SB)培養(yǎng)基(30克胰蛋白胨，20克酵母提取物，10克3-[N-嗎啉代]丙磺酸，MOPS,pH調(diào)至7)中，在37。C下生長過夜。用BeckmanGS_6G離心機(jī)3500rpm離心10分鐘將1毫升培養(yǎng)物中的細(xì)胞沉淀，該細(xì)胞被用于接種5毫升SB,SB中含有50ug/mlcarbenicillin。將培養(yǎng)物在37。C下振搖1小時(shí)，加入異丙基-b-D-硫代半乳糖苦(IPTG;ImM),將培養(yǎng)物移至28。C過夜。通過在4。C下，在懸于30mMTrispH8.0的20%蔗糖中裂解細(xì)胞來從胞外質(zhì)中制備可溶性Fab,然后在Microfuge中離心10分鐘。用western印跡，通過與含有已知量的鼠Fab的樣本進(jìn)行比較來估計(jì)Fab的濃度。不同細(xì)菌的胞外質(zhì)提取物含有相似濃度的Fab,按western印跡分析所估計(jì)的，其濃度范圍是l-20ug/ml。E.FAB的純化用基因工程方法將一段螯合肽加到重鏈的羧基末端，以利于蛋白純化。用Nhel和Spel消化除去M13基因III編碼區(qū)之后，編碼6個(gè)組氨酸殘基的一對重疊寡核苷酸被亞克隆到Fab表達(dá)載體中5'-CTAGCCACCACCACCACCACCACTAA-3'[SEQIDN〇:44]3'-GGTGGTGGTGGTGGTGGTGATTGATC-5'。用上面描述的方法誘導(dǎo)Fab的表達(dá)。在28°C下誘導(dǎo)過夜之后，通過在20%蔗糖，30mMTRISpH8.0中，在4°C下保溫30分鐘制備細(xì)胞沉淀的胞外質(zhì)裂解物。向澄清的上清中加入尿素和Bnj-35試劑至終濃度分別為2M和1%。在室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)后，處理后的澄清上清液以0.5毫升/分鐘的速率直接加到5毫升鎳-NTA金屬螯合柱(1.5x3厘米)上，該柱已用緩沖液A(IOOmM磷酸鈉，10mMTris,0.3MNaCl,2M尿素，pH8.0)平衡。在4個(gè)柱體積(20毫升)的洗柱之后，用6個(gè)柱體積(30毫升)的從pH8到pH4的反向pH梯度，在與上面相同的緩沖液中洗脫下結(jié)合的物質(zhì)。從柱中洗脫下的純化的Fab在pH5.5時(shí)呈現(xiàn)尖銳的對稱i峰。它們的純度大于90%,不含DNA。F.FABELISA:用懸于0.1MpH8.6碳酸氫鹽緩沖液的蛋白(l毫克/毫升，每孔50毫升)包被ImmulonII平板(Dynatech)。稀f奪和清洗在含有0.05%吐溫頂20的PBS中進(jìn)行。將平板在室溫下用含有1%BSA的PBS清洗并封閉1小時(shí)。將含有可溶Fab或純化Fab的，不同稀釋率的細(xì)菌上清加到平板上。溫育1小時(shí)之后清洗平板，力卩入生物素化的山羊抗小鼠kappa(SouthemBiotechnologyAssociates,Inc.,Birmingham,AL)(1:2000稀釋；50微升/孔)1小時(shí)。清洗平板，加入鏈親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(1:2000稀釋；50微升/孔)1小時(shí)。清洗平板，加入ABTS過氧化物酶底物(100微升/孑L;Kirkegaard&PerryLaboratoris,Gaithersburg,MD),在UVmaxTM(MolecularDevices)微平板計(jì)數(shù)器上讀取405nm的光密度。G.來自組合文庫的Fab的分離和定性通過多輪抗包被了IL-5的微滴定孔的生物淘選，從文庫中選出帶有抗IL-5的Fab的噬菌體。篩選4輪之后，用菌落轉(zhuǎn)移試驗(yàn)鑒定IL-5反應(yīng)性Fab,所述試驗(yàn)利用了125I-IL-5。第3輪的34個(gè)克隆和第4輪的4個(gè)克隆被鑒定為結(jié)合標(biāo)記的IL_5。與IL-5的結(jié)合通過直接結(jié)合ELISA而被確認(rèn)，ELISA中應(yīng)用了表達(dá)Fab-基因III融合蛋白的培養(yǎng)物上清。從這些克隆中分離出DNA,在去除M13基因III的編碼區(qū)之后，可溶Fab的表達(dá)被誘導(dǎo)。制備胞外質(zhì)級分，用ELISA檢測其與IL-5的結(jié)合。Fab特異性地結(jié)合IL-5，沒有顯示出結(jié)合另一種蛋白，rC5a。未稀釋的胞外質(zhì)提取物(含有1-20ug/mlFab)在IL_5R結(jié)合抑制試驗(yàn)(實(shí)施例2)中被檢測。Fab中沒有一個(gè)抑制碘化IL-5與IL-5Ra的結(jié)合超過35%。H.中和mAb轉(zhuǎn)變成FAB:用上面描述的條件，通過PCR分離mAb(2B6)的Fd和kcDNA。凝膠純化的片段被亞克隆到pMKFabGene3載體中，該載體已^皮修飾為包含基因IIIcDNA的hexa-His序列3',結(jié)果生成質(zhì)粒pMKFabGene3H。通過菌落轉(zhuǎn)移試驗(yàn)鑒定出含有2B6重鏈和輕鏈的功能性IL-5結(jié)合Fab克隆。用NheI/SpeII消化除去基因III和自連接之后重鏈在框架內(nèi)與hexa-His融合，使得可以用上述方法純化。Fab以劑量依賴方式抑制受體結(jié)合，IC50大約為7.5ug/nU,與親本mAb(鼠2B6)類似。I.鏈改組文庫的構(gòu)建和篩選編碼中和mAb2B6的Fd的cDNA作為Xhol/Spel片4殳被亞克隆到pMKFabGene3H中，pMKFabGene3H含有Sstl/Xbal片,殳以代替輕鏈cDNA。用Sstl和Xbal消化該噬菌泮立，然后與Sstl/Xbal消化的輕鏈PCR產(chǎn)物連接，所述PCR產(chǎn)物來源于IL-5免疫的小鼠(上文描述的)。連4妻后的文庫滴度是4x105CFU。i口上所述對組合文庫進(jìn)行生物淘選和菌落轉(zhuǎn)移試驗(yàn)。通過將編碼中和mAb2B6的Fd與相同輕鏈的所有組成部分匹配而構(gòu)建文庫，所述輕鏈的所有組成部分是/人IL-5免疫的小鼠中回收的，被用于產(chǎn)生組合文庫。對該鏈改組文庫進(jìn)行4輪生物淘選(對固定化的IL-5),用菌落轉(zhuǎn)移試驗(yàn)對所得的克隆進(jìn)行IL-5反應(yīng)性檢測。用EUSA和IL-5Roc結(jié)合試^r對結(jié)合^典化IL-5的陽性克隆進(jìn)一步檢測。/人^i改組文庫中回收的兩個(gè)Fab(2和5)阻遏IL-5與IL-5Roc的結(jié)合，并在B13試驗(yàn)中抑制IL-5依賴性增殖。這兩個(gè)Vk的序列與2B6Vk(2B6Vh的初始輕鏈配對物)的序列類似。Fab2&15的輕鏈序列分別是SEQIDNO:45和46。對于Fab2,CDR1-3分別是SEQIDNO:IO,U和47。對于Fab15，CDRl-3分別是SEQIDNO:0，11和48。下面實(shí)施例4和5中列出的所有抗體氨基酸序列使用KABAT編號系統(tǒng)，它允許CDR和框架長度的變化。即，不論在它們前面的氨基酸的實(shí)際編號是多少，關(guān)鍵氨基酸總是被指定相同的編號。例如，所有輕鏈CDR之前的半胱氨酸總是KABAT位置23,CDR1之后的色氨酸殘基總是KABAT位置35，即使CDR1可含有多達(dá)17個(gè)氨基酸。實(shí)施例4-人源化的抗體一種人源化的抗體被設(shè)計(jì)為在人類抗體框架內(nèi)包含鼠類CDR。通過下述操作來制備人源化的IL-5特異性小鼠抗體2B6。A.基因克隆用《尋自BoehringerMannheim(Indianapolis,IN)i式劑盒分另'U人2B6、2F2和2E3雜交瘤細(xì)胞系(見實(shí)施例1)中分離mRNA,然后用cDNA試劑盒(BoehringerMannheim)提供的引物(dT)15將其逆轉(zhuǎn)錄以制備cDNA。用小鼠免疫球蛋白特異性PCR引物擴(kuò)增DNA,該DNA編碼從重鏈可變區(qū)的氨基酸#9(KABAT編號系統(tǒng))到鉸鏈區(qū)，以及從輕鏈可變區(qū)氨基酸#9(KABAT編號系統(tǒng))到恒定區(qū)末端的結(jié)構(gòu)域。通過獨(dú)立的PCR反應(yīng)得到各抗體鏈的幾個(gè)克隆。所用的小鼠yl鉸鏈區(qū)引物是[SEQIDNO:22]:5'GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC3'所用的小鼠y2a鉸鏈區(qū)引物是[SEQIDNO:23]:5'GGACAGGGCTTACTAGTGGGCCCTCTGGGCTC3'所用的小鼠重鏈可變區(qū)引物是[SEQIDNO:24]:所用的小鼠輕鏈可變區(qū)引物是[SEQIDNO:26]:5'CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA3'PCR片段被克隆到質(zhì)粒pGEM7f+(Promega)中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(BethesdaResearchLabs)。B.DNA測序?qū)ι厦鍭部分的重鏈和輕鏈?zhǔn)骳DNA克隆進(jìn)行測序。這些克隆的可變區(qū)的測序結(jié)果顯示在SEQIDNO:-6(圖1-6)中。各克隆含有這樣一些氨基酸，它們在小鼠重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)中是保守的。CDR氨基酸序列在下面列出。所用的小鼠kappa鏈恒定區(qū)引物是[SEQIDNO:25]:2B6重鏈的CDR區(qū)是SEQIDNO:7、8和9。見圖7。這些序列由SEQIDNO:l編碼。輕鏈的CDR區(qū)是SEQIDNO:IO、11和12。見圖7。這些序列由SEQIDNO:2編碼。2F2重鏈的CDR區(qū)是SEQIDNO:7、8和9。見圖7。這些序列由SEQIDNO:3編碼。輕鏈的CDR區(qū)是SEQIDNO:IO、11和13。見圖7。這些序列由SEQIDNO:4編碼。2E3重鏈的CDR區(qū)是SEQIDNO:7、8和14。見圖7。這些序列由SEQIDNO:5編碼。輕鏈的CDR區(qū)是SEQIDNO:10、11和13。見圖7。這些序列由SEQIDNO:6編碼。C.人類框架的選擇在2B6的克隆之后，將重鏈和輕《連的可變區(qū)的氨基酸序列(圖l和2)(分別是SEQIDNO:15和16)與KABAT和SWISS-PROT(Nuc.AcidsRes.，20:2019-2022(1992))蛋白序列數(shù)據(jù)庫中已知的鼠免疫球蛋白序列進(jìn)行比較，以將氨基酸歸屬至N末端殘基。然后將推斷的2B6重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人類免疫球蛋白序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，以確定重鏈和輕鏈的人類框架，它應(yīng)與鼠類序列最為匹配。此外，用位置數(shù)據(jù)庫(positionaldatabase)評價(jià)重鏈和輕鏈，以估計(jì)由于氨基酸而導(dǎo)致的沖突，該沖突可能影響CDR的呈遞，所述數(shù)據(jù)庫是從Fab結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)模型產(chǎn)生的。通過在沖突位置替換相應(yīng)的小鼠氨基酸，可以在人源化可變區(qū)的合成過程中解決沖突。得自人類骨髓瘤免疫球蛋白(COR)的抗體的重鏈框架區(qū)被利用(E.M.Press和N.M.Hogg,Biochem.丄，117:641-660(1970))。發(fā)現(xiàn)人類重鏈框架氨基酸序列與2B6框架有大約66%的同源性。對于合適的輕鏈可變區(qū)框架，利用了Bence-Jones蛋白(LEN)的輕鏈可變框架序列(Schneider等，Hoppe-Seyler，sZ.Physiol.Chem.，356:507-557(1975))。在氨基酸水平上，人類輕鏈框架區(qū)與鼠類2B6輕鏈框架區(qū)有大約82%的同源性。選定的人類框架被反向翻譯以提供DNA序列。D.人源化Mab基因的構(gòu)建提供2B6重鏈CDR[圖7和SEQIDNO:l-2]和人類抗體的框架序歹'J,制備合成的重鏈可變區(qū)[SEQIDNO:18]。它是用四個(gè)合成的寡核苷酸[SEQIDNO:27和28][SEQIDNO:29和30]制備的，當(dāng)這些寡核苷酸連接到一起時(shí)，編碼氨基酸#21-#106(KABAT編號)。然后將寡核苷酸連^^到基于pUClS的質(zhì)粒的Hpal-Kpnl限制性^主點(diǎn)中，該質(zhì)粒含有基于COR框架(同上)的來源于另一人源化重鏈的序列。這個(gè)質(zhì)粒提供單一序列[SEQIDNO:17]和殘余的可變區(qū)序列。用誘變引物通過PCR或通過將合成的連接物添加到已存在的限制性位點(diǎn)中，對作圖的序列中的任何錯(cuò)誤進(jìn)行改正。信號序列和人源化重鏈可變區(qū)作為EcoRI-ApaI片段被從基于pUC的質(zhì)粒中切下，并被連接到表達(dá)載體pCD中，pCD包含IgG!人類恒定區(qū)。合成的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列在圖8[SEQIDNO:18和19]中給出。人類框架殘基是SEQIDNO:19的氨基酸1-30，36-49，66-97和109-119。CDR的氨基酸序列與鼠2B6CDR相同。所得的表達(dá)載體pCDIL5HZHC1.0在圖10中給出。提供2B6輕鏈CDR[圖7和SEQIDNO:IO、11和12]和人類抗體的框架序列，制備合成的輕鏈可變區(qū)[SEQIDNO:20]。四個(gè)合成的寡核苷酸被插入基于pUC18的質(zhì)粒中；這四個(gè)合成的寡核苷酸編碼人源化VL氨基酸#27-#58(KABAT編號)[SEQIDNO:31和32]和氨基酸弁80畫弁109[SEQIDNO:33和34],它們分別帶有Sad-Kpnl和PstI-HmdIII末端；所述質(zhì)粒含有來源于另一人類輕鏈框架(B17)(Marsh等，Nuc.AcidsRes.,13:6531-6544(1985))的序列，它與LEN框架有高度的同源性。這個(gè)質(zhì)粒提供殘余的可變區(qū)序列。用誘變引物通過PCR或通過將合成的連4婁物添加到已存在的限制性位點(diǎn)中，對作圖的序列中的任何錯(cuò)誤和LEN與B17之間的單氨基酸差異進(jìn)行改正。人源化輕鏈可變區(qū)以EcoRV-Narl片段從pUC質(zhì)粒中分離出來，連接到表達(dá)載體pCN中，該載體含有單一序列[SEQIDNO:17]和kappa人類恒定區(qū)。合成的輕鏈可變區(qū)核普酸和氨基酸序列在圖9[SEQIDNO:20和21]中給出。人類框架殘基是SEQIDNO:21的氨基酸1-23、41-55、63-94和104-113。CDR的氨基酸序列與鼠2B6CDR相同。但是，這些CDR的編碼序列與鼠2B6編碼序列不同，以產(chǎn)生限制性酶位點(diǎn)。所得的一個(gè)表達(dá)載體，pCNIL5HZLC1.0在圖11中給出。這些合成的可變輕鏈和/或質(zhì)粒序列被用于構(gòu)建人源化抗體。E.人源化MAB的表達(dá)來源于IgG,同種型的人源化重鏈利用了SEQIDNO:19提供的合成的重鏈可變區(qū)。按上面描述的方法設(shè)計(jì)并合成含有2B6重鏈CDR的該合成的VH。人源化的輕鏈，一種人類kappa鏈，利用了SEQIDN0:21提供的合成的輕鏈可變區(qū)。按上面描述的方法i殳計(jì)并合成含有2B6輕鏈CDR的該合成的VL。編碼人源化可變區(qū)的DNA片li被插入基于pUC19的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒利用了單一序列，并含有CMV啟動(dòng)子，以及嵌合體的人類重鏈或人類輕鏈恒定區(qū)，用常規(guī)方法(Maniatis等，引文同上)得到質(zhì)粒pCDIL5HZHC〗.0(重鏈)[SEQIDNO:49,也見圖IO]和pCNIL5HZLC1.0(輕鏈)[SEQIDNO:50,也見圖1l]。質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中，分別在3和5天后用實(shí)施例5描述的ELISA進(jìn)行上清試-瞼，以確定人類抗體的存在。上述實(shí)施例描述了示例性工程化抗體的制備。利用其他抗IL-5抗體(例如2F2、2E3、4A6、5D3、24G9等)，可用類似的方法開發(fā)其他工程化的抗體。F.純化CHO表達(dá)的嵌合和人源化2B6的純化可通過常規(guī)的蛋白A(或G)親和層析，離子交換和分子篩層析來完成。類似的方法已被成功地用于其他單克隆抗體(例如呼吸道合胞病毒、白介素4和瘧疾環(huán)子孢子蛋白抗原)的純化，純度>95%。G.其他人源化單克隆抗體和表達(dá)質(zhì)粒提供質(zhì)粒pCDIL5HZHC1.0[SEQIDNO:49],制得表達(dá)質(zhì)粒pCDIL5HZHC1.1,其中在框架位置73的Asp被Thr替換。這是通過將帶有EcoRV和XhoI末端的合成的連4秦物[SEQIDNO:51和SEQIDN〇:52]與同樣消化的pCDIL5HZHC1.0連^妻而完成的。類似地，表達(dá)質(zhì)粒pCDIL5HZHC1.2在框架位置37將lie替換成Val。這是通過將帶有Hpal和Xbal末端的合成的連接物[SEQIDNO:53和SEQIDNO:54]與同樣消化的pCDIL5HZHC.0連接而完成的。表達(dá)質(zhì)粒pCDIL5HZHCl.3也是通過將帶有Hpal和Xbal末端的合成的連接物[SEQIDNO:53和SEQIDNO:54]與同樣消化的pCDIL5HZHC1.1連4妻而完成的。提供前面描述的基于pUC18的質(zhì)粒，制備人源化的輕鏈可變區(qū)，其中框架位置#15從Leu變成Ala,所迷基于pUC18的質(zhì)粒含有四個(gè)合成的寡核苷酸序列[SEQIDN〇:31、32、33和34]。用Nhel和Sacl限制性內(nèi)切酶消化該質(zhì)粒，并插入一個(gè)合成的連接物[SEQIDNO:55和56]。然后分離EcoRV-NarI片段，將其連接到同樣消化的表達(dá)載體pCDIL5HZHC1.0中，得到pCDIL5HZHC1.1。用得自免疫球蛋白(NEW)的重鏈框架區(qū)(Saul等，J.Biol.Chem.253:585-597(1978))和2B6重鏈CDR[圖7和SEQIDNO:l-2]制備合成的可變區(qū)?？赡苡绊慍DR呈遞的框架氨基酸被鑒定并用前面描述的方法替換。產(chǎn)生了四個(gè)重疊的合成寡核苷H[SEQIDNO:57、58、59和60],當(dāng)它們被退火并延伸時(shí)，編碼單一序列[SEQIDNO:17]和重鏈可變區(qū)的氨基酸。用PCR引物[SEQIDNO:63和64]擴(kuò)增該合成的基因，并作為BstXI-HmdIII限制性片段連接到基于pUC18的質(zhì)粒中，該質(zhì)粒含有基于COR框架的來源于另一人源化重鏈的序列。通過將合成的寡核苷酸連接物[SEQIDNO:75和76]插入SacII和Kpnl限制性位點(diǎn)，在氨基酸位置91(Kabat編號系統(tǒng))(等價(jià)于圖12的位置94)進(jìn)行笨丙氨酸到酪氨酸框架替換。所得的重鏈可變區(qū)[圖12和SEQIDN〇:61,62]被稱作NEWM人源化的重鏈。用誘變引物通過PCR或通過將合成的連接物添加到已存在的限制性位點(diǎn)中，對mapped序列中的任何錯(cuò)i吳進(jìn)行改正。信號序列和人源化重鏈可變區(qū)作為EcoRI-ApaI片段被從基于pUC的質(zhì)粒中切下，并被連接到表達(dá)載體pCD中，得到質(zhì)粒pCDIL5NEWM,其中pCD包含IgG人類恒定區(qū)。CDR的氨基酸序列與鼠2B6重鏈CDR的相同。用得自免疫球蛋白(REI)的輕今連框架區(qū)(Palm等，Hoppe-Seyler'sZ.Physiol.Chem.356:167-191(1975))和2B6輕鏈CDR[圖7和SEQIDNO:10、11和12]制備合成的可變區(qū)?？赡苡绊慍DR呈遞的框架氨基酸被鑒定并用前面描述的方法替換。產(chǎn)生了四個(gè)重疊的合成寡核苷酸[SEQIDNO:65、66、67和68],當(dāng)它們被退火并延伸時(shí)，編碼代表的氨基酸[圖13和SEQIDNO:69，70]，該輕鏈可變區(qū)被稱為REI人源化輕鏈。用PCR引物[SEQIDNO:71和72]擴(kuò)增該合成的基因，并作為EcoRI-HmdIII限制性片段連接到pGEM-7Zf(+)(Promega公司，Madison,WI)中。用誘變引物通過PCR或通過將合成的連接物添加到已存在的限制性位點(diǎn)中，對mapped序列中的任何錯(cuò)i吳進(jìn)行改正。人源化輕鏈可變區(qū)作為EcoRV-Narl片段被從基于pGEM-7Zf(+)的質(zhì)粒中切下，并被連接到表達(dá)載體pCN中，得到質(zhì)粒pCNIL5REI，其中pGEM-7Zf(+)包含單一序列[SEQIDNO:17]以及人類Kappa恒定區(qū)。CDR的氨基酸序列與鼠2B6輕鏈CDR的相同。但是，這些CDR的編碼序列與鼠2B6的編碼序列不同，以產(chǎn)生限制性酶位點(diǎn)。這些合成的可變輕鏈和/或重鏈序列被用于構(gòu)建人源化抗體。提供上述基于pGEM-7Zf(+)的質(zhì)粒，可制備人源化的輕鏈可變區(qū)，其中框架位置#15從纈氨酸變?yōu)楸彼帷？捎孟拗菩詢?nèi)切酶Nhel和Sacl消化該質(zhì)粒并插入合成的引物[SEQIDNO:73和74]。然后分離出EcoRR-NarI片段，將其連接到同樣消化的表達(dá)載體pCNIL5HZREI中，得到質(zhì)粒pC亂5REIV15A。實(shí)施例5-嵌合抗體的構(gòu)建編碼鼠單克隆抗體2B6重鏈可變區(qū)的氨基酸弁9-#104(KABAT編號)的DNA被作為AvaII-StyI限制性片段從cDNA的基于pGEM7Zf+的PCR克隆中分離，所述cDNA由2B6雜交瘤細(xì)胞系(見實(shí)施例4)產(chǎn)生。通過將該片段與四個(gè)小的合成寡連接物[SEQIDNO:35、和36][SEQIDNO:37和38]結(jié)合到用BstXl-HmdIII消化的基于pUC18的質(zhì)粒中，可以提供側(cè)面(flankmg)重鏈可變區(qū)序列和一段信號序列[SEQIDNO:17]。從緊密相關(guān)的鼠重鏈推斷的N末端氨基酸的共有序列被指認(rèn)為前8個(gè)Vh殘基，并且在SEQIDNO:35和36中被編碼。通過對2B6重鏈的前15個(gè)N末端氨基酸進(jìn)行測序，確認(rèn)了重鏈的推斷氨基酸序列。含有信號和Vh區(qū)序列的EcoRI-ApaI片段被分離，并被連接到質(zhì)粒pCD中，該質(zhì)粒已編碼人類IgG,恒定區(qū)。編碼鼠單克隆抗體286輕鏈可變區(qū)的氨基酸#12-#99(KABAT編號)的DNA被作為Ddel-Aval限制性片段從cDNA的基于pGEM7Zf+的PCR克隆中分離，所述cDNA由2B6雜交瘤細(xì)胞系(見實(shí)施例4)產(chǎn)生。通過將該片4殳與四個(gè)小的合成寡連接物[SEQIDNO:39、和40][SEQIDNO:41和42]結(jié)合到用EcoRV-HindIII消化的基于pUC18的質(zhì)粒中，可以提供側(cè)面(flankmg)輕鏈可變區(qū)序列。從緊密相關(guān)的鼠輕鏈推斷的N末端氨基酸的共有序列被指認(rèn)為前8個(gè)Vl殘基，并且在SEQIDNO:39和40中被編碼。通過對2B6輕鏈的前15個(gè)N末端氨基酸進(jìn)行測序，確認(rèn)了輕鏈的推斷氨基酸序列。該可變區(qū)隨后作為EcoRV-Narf片段被分離出來，并連接到表達(dá)載體pCN中，該載體已含有人類kappa區(qū)和信號序列。通過pCD和基于pCN的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞來完成嵌合抗體的表達(dá)。3和5天后收集培養(yǎng)物上清，通過下面描述的ELISA檢測免疫球蛋白的表達(dá)除最后一步外，各步驟之后用PBS清洗。用100納克/5(U敞升/孔的山羊抗體將微滴定平板包被過夜，所迷抗體對人類抗體的Fc區(qū)有特異性。加入培養(yǎng)物上清，溫育1小時(shí)。然后加入辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗人IgG抗體，溫育1小時(shí)。然后加入ABTS過氧化物酶底物(Kirkegaard&PerryLaboratoriesInc.,Gaithersburg,MD)。溫育1小時(shí)后，用微滴定平板計(jì)數(shù)器(MolecularDevices公司，MenloPark,CA)在405nm處讀取吸收值。嵌合抗體的表達(dá)被檢測。在類似的ELISA中，含有嵌合抗體的COS細(xì)胞上清與包被了人類IL-5蛋白的微滴定孔特異性地結(jié)合。這個(gè)結(jié)果證實(shí)編碼抗IL-5抗體的基因已被合成并表達(dá)。上述實(shí)施例描述了示例性工程化抗體的制備。利用通過常規(guī)方式開發(fā)的其他抗IL-5供體抗體(例如2F2、2E3、4A6、5D3、24G9等)，可以用類似的方法開發(fā)其他工程化的4元體。序列表(l)一般資料(i)申請人:Ames,RobertS.Appelbaum,EdwardR.Chaiken,IrwinMCook,RichardM.Gross,MitchellS.Holmes,StephenD.McMillan,Lynette丄Theisen，TimothyW.(ii)泉明名稱用于治療IL-5介導(dǎo)的疾病的重組IL5拮抗劑(iii)序列數(shù)76(iv)相關(guān)地址(A)收信人SmithKlineBeechamCorp./Corporate(B)街道P.O.Box1539-UW2220(C)城市KingofPrussia(D)州:Pennsylvania(E)國家:USA(F)郵編:19406-0936(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentlnRelease弁l.O,Version#1.30(vi)當(dāng)前申請資料(A)申請?zhí)?B)提交曰期(C)分類(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/470110(B)才是交曰期1995年6月6曰(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/467420(B)提交日期1995年6月6曰(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/363131(B)提交日期1994年12月23日(viii)律師/代理人資料(A)姓名Sutton,JeffreyA.(B)注冊號34,028(C)參考/登記號P50282-2(ix)遠(yuǎn)程通訊資料(A)電話610-270-5024(B)電傳610-270-5090(2)SEQIDNO:l的資料(i)序列特征(A)長度334個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iv)特性:(A)名稱/關(guān)鍵詞misc—feature(B)位置1..334(D)其他資料/注="第一個(gè)堿基相應(yīng)于Kabat位置24"(xi)序列描述SEQIDNO:l:ACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACTTGCACTGTCTCTGGGTTTTC60ATTAACCAGCTATAGTGTACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCT120GGGAGTAATATGGGCTAGTGGAGGCACAGATTATAATTCGGCTCTCATGTCCAGACTGAG180CATCAGCAAAGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAACTGAACAGTCTGCAAACTGA240TGACACAGCCATGTACTACTGTGCCAGAGATCCCCCTTCTTCCTTACTACGGCTTGACTA300CTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA334(2)SEQIDNO:2的資料(i)序列特征(A)長度315個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iv)特性:(A)名稱/關(guān)鍵詞misc一feature(B)位置1..315(D)其他資料/注="第一個(gè)石威基相應(yīng)于Kabat位置25"(xi)序列描述SEQIDNO:2:TCCTCCCTGAGTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGT60CTGTTAAACAGTGGAAATCAAA^GAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAG120CCTCCTAAACTTTTGATCTACGGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTC180ACAGGCAGTGGATCTGGAACCGATTTCACTCTTTCCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGAC240CTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGTTOVTAGTTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACA300GAGTTGGAAATAAAA315(2)SEQIDNO:3的資料(i)序列特征(A)長度334個(gè)堿基對(B)類型核酸.'(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iv)特性(A)名稱/關(guān)4建詞misc—feature(B)位置1..334(D)其他資料/注-"第-(xi)序列描述SEQIDNO:3ACCTGGCCTGGTGGCGCCCTC厶C^GAGCCTATTAACCAGTTATAGTGTACACTGGGTTCGGGGAGTAATATGGGCTAGTGGAGGCACAGACATCAGCAAAGACAACTCCAAGAGCCAAGTTGACACAGCCATGTACTACTGTGCCAGAGACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTC(2)SEQIDNO:4的資料(i)序列特征:(A)長度315個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iv)特性:(A)名稱/關(guān)4建詞misc_feature(B)位置I..315(D)其他資料/注="第一個(gè)堿基相應(yīng)于Kabat位置25"(xi)序列描述:SEQIDNO:4:TCCTCCCTGAGTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGT60CTATTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAACAGAAACCAGGGCAG120CCTCCTAAACTTTTGATCTACGGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTC180ACAGGCAGTGGATCTGGAACCGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGAC240CTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATCATAGTTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACA300GAGTTGGAAATAAAA315(2)SEQIDNO:5的資料(i)序列特征:39-個(gè)石威基相應(yīng)于Kabat位置24"GTCCATCACTTGCACTGTCTCTGGGTTTTC60CCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCT120TTATAATTCGGCTCTCATGTCCAGACTGAG180TTTCTTAAAACTGAACAGTCTGCGAACTGA240TCCCCCTTCTTCCTTACTACGGCTTGACTA300CTCA334(A)長度334個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iv)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞misc一feature(B)位置1..334(D)其他資料/注="第一個(gè)石成基相應(yīng)于Kabat位置24"(xO序列描述SEQIDNO:5:ACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACTTGCACTGTCTCTGGGTTTTC60ATTAACCAGCTATAGTGTACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCT120GGGAGTAATCTGGGCTAGTGGAGGCACAGATTATAATTCGGCTCTCATGTCCAGACTGAG180CATCAGCAAAGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAACTGAACAGTCTGCAAACTGA240TGACGCAGCCATGTACTACTGTGCCAGAGATCCCCCTTTTTCCTTACTACGGCTTGACTT300CTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA334(2)SEQIDNO:6的資料(i)序列特征(A)長度315個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iv)特性(A)名稱/關(guān)4建詞misc—feature(B)位置1..315(D)其他貴料/注="第一個(gè)堿基相應(yīng)于Kabat位置25"(xi)序列描述SEQIDNO:6:TCCTCTCTGAGTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGT60CTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAAAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAG12GCCTCCTAAACTTTTGATCTACGGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTC—18CJ-ACAGGCAGTGGATCTGGAACCGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGAC240CTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATCATAGTTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACA300GAGTTGGAAATAAAA315(2)SEQIDNO:7的資料(1)序列特征(A)長度5個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈CD)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQIDNO:l:SerTyrSerValHis15(2)SEQIDNO:8的資料(i)序列特征(A)長度16個(gè)氨基酸■(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(li)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQIDNO:8:VallieTrpAlaSerGlyGlyThrAspTyxAsnSerAlaLeuMetSer151015(2)SEQIDN0:9的資料(1)序列特征(A)長度ll個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQIDNO:9:AspProProSerSerLeuLeuArgLeuAspTyr1510(2)SEQIDNO:10的資料(1)序列特征:(A)長度17個(gè)氨基酸'(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQIDNO:IO:LysSerSerGinSerLeuLeuAsnSerGlyAsnGinLysAsnTyrLeu151015Ala(2)SEQIDNO:11的資料(i)序列特征:(A)長度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈CD)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQIDNO:11:GlyAlaSerThrArgGluSer15(2)SEQIDNO:12的資料(1)序列特征:(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQIDNO:12:GinAsnValHisSerPheProPheThr(2)SEQIDNO:13的資料(1)序列特征:(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述:SEQIDNO:13:GinAsnAspHisSer'PheProPheThr(2)SEQIDNO:14的資料(i)序列特征:(A)長度ll個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQIDNO:14:AspProProPheSerLeuLeuArgLeuAspPhe'1510(xi)序列描述SEQIDNO:15:C-lnValGinLeuLysGluSerGlyProGlyLeuValAlaProSerGin151015SerLeuSer工leThrCysThrValSerGlyPheSerLeuThrSerTyr202530SerValHisTrpValArgGinProProGlyLysGlyLeuGluTrpLeu354045GlyVallieTrpAlaSerGlyGlyThrAspTyrAsnSerAla!LeuMec505560SerArgLeuSer工leSerLysAspAsnSerLysSerGinValPheLeu65707580LysLeuAsnSerLeuGinThrAspAspThrAlaMetTyrTyrCysAla859095AjrgAspProProSerSerLeuLeuArgLeuAspTyrTrpGlyGinGly100105110ThrThrLeuThrValSerSer115(2)SEQIDNO:16的資料(i)序列特征:(A)長度U3個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述:SEQIDNO:16:Asp工leValMetThrGinSerProSerSerLeuSerValSerAlaGly151015GluLysValThrMetSerCysLysSerSerGinSerLeuLeuAsnSer202530GlyAsnGinLysAsnTyr35ProProLysLeuLeu工le50ProAspArgPheThrGly6570LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGin4045TyrGlyAlaSerThrArgGluSerGlyVal5560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuSer7580lieSerSerValGinAlaGlu.AspLeuAlaValTyrTyrCysGinAsn859095ValHisSerPhePro100PheThrPheGlySerGlyThrGluLeuGlu工le105HOLys(2)SEQIDNO:17的資料(1)序列特征(A)長度60個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:17:ATGGTGTTGCAGACCCAGGTCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGG60(2)SEQIDNO:18的資料(i)序列特征(A)長度357個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:18:CAGGTTACCCTGCGTGAATCCGGTCCGGCACTAGTTAAACCGACCCAGACCCTGACGTTA60ACCTGCACCGTCTCCGGTTTCTCCCTGACGAGCTATAGTGTACACTGGGTCCGTCAGCCG120CCGGGTAAAGGTCTAGAATGGCTGGGTGTAATATGGGCTAGTGGAGGCACAGATTATAAT180TCGGCTCTCATGTCCCGTCTGTCGATATCCAAAGACACCTCCCGTAACCAGGTTGTTCTG240ACCATGACTAACATGGACCCGGTTGACACCGCTACCTACTACTGCGCTCGAGATCCCCCT300TCTTCCTTACTACGGCTTGACTACTGGGGTCGTGGTACCCCAGTTACCGTGAGCTCA(2)SEQIDNO:19的資料(0序列特征119個(gè)氨基酸(A;i長度(B)類型(C)鏈型氨基齒單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQIDNO:19:GinValThrLeuArgGluSerGlyProAlaLeuValLysProThrGin151015Thr丄euThrLeuThrCysThrValSerGlyPheSerLeuThrSerTyr202530SerValHisTrpValArgGinProProGlyLysGlyLeuGluTrpLeu354045GlyVal工leTrpAlaSerGlyGlyThrAspTyrAsnSerAlaLeuMet505560SerArgLeuSer工leSerLysAspThrSerArgAsnGinValValLeu65707580ThrMetThrAsnMetAspProValAspThrAlaThrTyrTyrCysAla859095ArgAspProProSerSerLeuLeuArgLeuAspTyrTrpGlyArgGly100.105110ThrProValThrValSerSer115357(2)SEQIDNO:20的資料(1)序列特征(A)長度339個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈'(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:20:GATATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCGCTAGCTCTGTCTCTCGGCGAGAGGGCCACC60ATCAACTGCAAGAGCTCTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGGCC120TGGTATCAGCAGAAACCCGGGCAGCCTCCTAAGTTGCTCATTTACGGGGCGTCGACTAGG180GAATCTGGGGTACCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACC240ATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTATACTACTGTCAGAATGTTCATAGTTTT300CCATT;ACGTTCGGCGGAGGGACCAAGTTGGAGATCAAA339(2)SEQIDNO:21的資料(i)序列特征(A)長度113個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQIDNO:21:Asp工leValMetThrGinSerProAspSerLeu^laValSerLeuGly1—51015GluArgAlaThr工leAsnCysLysSe:rSerGinSerLeuLeuAsnSer202530GlyAsnGinLysAsnTyrLeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGin354045ProProLysLeuLeu工leTyrGlyAlaSerThrArgGluSerGlyVal505560ProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThr65707580工leSerSerLeuGinAlaGluAspValAlaValTyrTyrCysGinAsn8590S5ValHisSerPheProTheThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGlu工le100105110Lys(2)SEQIDNO:22的資料(1)序列特征(A)長度29個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(li)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:22:GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC29(2)SEQIDNO:23的資料(i)序列特征(A)長度32個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:23:GGACAGGGCTTACTAGTGGGCCCTCTGGGCTC"(2)SEQIDNO:24的資料(1)序列特征(A)長度23個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:24:AGGTSMARCTKTCTCGAGTCWGG23(2)SEQIDNO:25的資料(1)序列特征(A)長度36個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:25:CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG35(2)SEQIDNO:26的資料(i)序列特征(A)長度32個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:26:CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA32(2)SEQIDNO:27的資料(1)序列特征(A)長度140個(gè);成基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:27:AACCTGCACCGTC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AGTAATATGGGCTAGTGGAGGCACAGATTATAAT180TCGGCTCTCATGTCCAGACTGAGTATACTGAAAGACAACAGCAAGAACCAGGTCAGCCTG240AGACTCAGCAGCGTGACAGCCGCCGACACCGCGGTCTATTACTGTGCTCGGGATCCCCCT300TCTTCCTTACTACGGCTTGACTACTGGGGACAAGGTACCACGGTCACCGTCTCGAGC357(2)SEQIDNO:62的資料(i)序列特征(A)長度119個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性..-(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQIDNO:62:GinValGinLeuGinGluSerGlyProGlyLeuValArgPro.SerGin1—51015ThrLeuSerLeuThrCysThrValSerGlyPheSerLeuThrSerTyr202530SerValHisTrpValArgGinProProGlyArgGlyLeuGluTrpLeu354045GlyVsllieTrpAlaSerGlyGlyThrAspTyrAsnSerAlaLeuMet5070Thr5560LysAspAsnSerLysAsnGinValSerLeu7580AlaAspThrAlaValTyrTyrCysAlaSO95LeuArgLeuAspTyrTrpGlyGinGly105110AlaSerArgLeuSerlie65ArgLieuSerSerVal85ArgAspProProSer'SerLeu100ThrThrValThrValSerSer115(2)SEQIDNO:63的資料(l)序列特征(A)長度28個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:63:AGGACGCCAGCAACATGGTGTTGCAGAC28(2)SEQIDNO:64的資料(i)序列特征:(A)長度36個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型:'單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)7(xi)序列描述SEQIDNO:64:TGCCAAGCTTGGGCCCTTCGTGGAGGCGCTCGAGAC36(2)SEQIDNO:65的資料(1)序列特征(A)長度121個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:65:GACCATGATTACGAATTCGTAGTCGGATATCGTGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAG50CGCTAGCGTGGGTGACAGAGTGACCATCACCTGTAAGAGCTCTCAGAGTCTGTTAAACAG120T.-121(2)SEQIDNO:66的資料(1)序列特征(A)長度U6個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:66:AGATTCCCTAGTCGATGCCCCGTAGATCAGCAGCTTTGGAGCCTTACCGGGTTTCTGCTG60ATACCAGGCCAAGTAGTTCTTT—GATTTCCACTGTTTAACAGACTCTGAGAGCTCT116(2)SEQIDNO:67的資料(i)序列特征(A)長度116個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:67:TCTACGGGGCATCGACTAGGGAATCTGGGGTACCAGATAGATTCAGCGGTAGCGGTAGCG60GAACCGACTTCACCTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCAGAGGACATCGCCACCTAC116(2)SEQIDNO:68的資料(1)序列特征(A)長度U7個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(n)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:68:TCGATGCCAAGCTTGGCGCCGCCACAGTACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCTTGTCCGA60ACGTGAATGGAAAACTATGAACATTCTGGCAGTAGTAGGTGGCGATGTCCTCTGGCT117(2)SEQIDNO:69的資料(i)序列特征(A)長度339個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:69:GATATCGTGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCTAGCGTGGGTGACAGAGTGACC60ATCACCTGTAAGAGCTCTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGGCC120TGGTATCAGC--AGAAACCCGGTAAGGCTCCAAAGCTGCTGATCTACGGGGC—ATCGACTAGG180GAATCTGGGGTACCAGATAGA1TCAGCGGTAGCGGTAGCGGAACCGACTTCACCTTCACC240ATCAGCAGCCTGCAGCCAGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGAATGTTCATAGTTTT300CCATTCACGTTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA(2)SEQIDNO:70的資料(i)序列特征(A)長度(B)類型(C)鏈型113個(gè)氨基酸氨基酸單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述Asp工leVal1SEGIDNO:70:MetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly51015AspArgValThrlieThrCysLysSerSerGinSerLeuLeuAsnSer20'2530GlyAsnGinLysAsnTyrLeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLys354045AlaProLysLeuLeulieTyrGlyAlaSerThrArgGluSerGlyVal505560ProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrPheThr65707580lieSer—SerLeuGinProGluAsp工leAla—ThrTyrTyrCys-GinAsn859095ValHisSerPheProPheThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulie100105110Lys339(2)SEQIDNO:71的資料(1)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:71:GATTACGAATTCGTAGTCGGATAT24(2)SEQIDNO:72的資料(1)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDN〇:72:TGCCAAGCTTGGCGCCGCCACAGT24(2)SEQIDNO:73的資料(1)序列特征(A)長度39個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:73:CTAGTGCGGGTGACCGAGTGAC(fATCACCTGTAAGAGCT3((2)SEQIDNO:74的資料(i)序列特征(A)長度31個(gè);成基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:74:CTTACAGGTGATGGTCACTCGGTCACCCGCA(2)SEQIDNO:75的資料(1)序列特征(A)長度66個(gè)^咸基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:75:GGTCTATTACTGTGCTCGGGATCCCCCTTCTTCCTTACTACGGCTTGACTACTGGGGACAAGGTAC(2)SEQIDNO:76的資料(i)序列特征(A)長度64個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO:76:CTTGTCCCCAGTAGTCAAGCCGTAGTAAGGAAGAAGGGGGATCCCGAGCACAGTAATAGACCGC權(quán)利要求1.一種人源化中和單克隆抗體，它對人類白介素5有特異性，并包含以下互補(bǔ)決定區(qū)SEQIDNO7的CDRH1SEQIDNO8的CDRH2SEQIDNO9的CDRH3SEQIDNO10的CDRL1SEQIDNO11的CDRL2SEQIDNO12的CDRL3。2.權(quán)利要求1的人源化中和單克隆抗體，它對人類白介素5有特異性，包含SEQIDNO:19的重鏈可變區(qū)和SEQIDNO:21的輕鏈可變區(qū)。3.—種藥物組合物，它包含權(quán)利要求1或2的人源化抗體和藥用載體。4.權(quán)利要求1或2的人源化抗體在制備用于治療與嗜曙紅細(xì)胞過量產(chǎn)生有關(guān)的人類病癥的藥物中的用途，所述病癥選自氣喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、慢性嗜曙紅性肺炎、過敏性支氣管曲霉病、腹腔病、嗜曙紅性胃腸炎、Churg-Strauss綜合癥、嗜曙紅肌痛綜合癥、嗜曙紅細(xì)胞過多綜合癥和水胂反應(yīng)。全文摘要本發(fā)明涉及用于治療IL-5介導(dǎo)的疾病的重組IL-5拮抗劑。本發(fā)明提供得自高親和性中和單克隆抗體的，嵌合的、人源化的和其他的IL-5單克隆抗體，含有這些單克隆抗體的藥物組合物，治療和診斷方法。文檔編號A61K38/00GK101353381SQ20071018667公開日2009年1月28日申請日期1995年12月22日優(yōu)先權(quán)日1994年12月23日發(fā)明者E·R·阿佩爾鮑姆,I·M·柴肯,L·J·麥克米蘭,M·S·格羅斯,R·M·庫克,R·S·阿米斯,S·D·霍爾米斯,T·W·泰森申請人:史密絲克萊恩比徹姆公司;史密絲克萊恩比徹姆有限公司