專利名稱：尼曼-皮克病的基于陪伴分子的治療的制作方法
尼曼-皮克病的基于陪伴分子的治療本申請是申請日為2004年11月24日，申請?zhí)枮?00480039029.5 的發(fā)明名稱是"尼曼-皮克病的基于陪伴分子的治療，，發(fā)明專利申請 的分案申請。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供一種治療患酸性鞘磷脂酶缺陷型尼曼-皮克病(即A型 或B型尼曼-皮克病)個體的方法，是通過施用小分子作為與該病相關(guān) 的缺陷酸性鞘磷脂酶(ASM)的特異性分子"陪伴分子"。發(fā)明背景A型和B型尼曼-皮克病(NPD)是由于酸性鞘磷脂酶(ASM)活性缺 乏，因此鞘磷脂、膽固醇和其他脂類在患病個體的細(xì)胞和組織內(nèi)積累 而引起的溶酶體貯積癥(LSD) (Schuchman和Desnick, Niemann-Pick disease types A and B: acid sphingomyelinase deficiencies. In: The metabolic and molecular bases of inherited disease. Schriver CR， Beaudet AL， Valle D, Sly WS編著；New York. McGraw Hill Inc 3589-3610 2001)。 A型NPD患者通常在嬰兒期早期被診斷為器官巨大癥，接著 發(fā)生快速的神經(jīng)變性過程，到大約3歲時導(dǎo)致死亡。相反，B型NPD 患者極少或者沒有中樞神經(jīng)系統(tǒng)累及，通常存活至成年期。但是，B 型NPD在臨床上是不均一的，可能出現(xiàn)多種檢查結(jié)果，包括肝脾大、 生長遲緩、頻發(fā)呼吸道感染、疲勞和血液學(xué)異常，如高LDL膽固醇 和甘油三酯、低HDL膽固醇和低血小板。另外，已經(jīng)報道幾名B型 NPD患者具有與神經(jīng)變性相關(guān)的中間表型(Elleder和Cihula， Eur J Pediatr 1983; 140:323-328; Elleder等人，J Inherit Metab Dis 1986; 9:357-366)。兩種類型的NPD都是在全部人種中發(fā)生的，但是報道的大多數(shù)A型NPD病例發(fā)生在德裔猶太人個體中。相反，B型NPD似乎在北 非、阿拉伯和土耳其人群中更加普遍。迄今為止，已經(jīng)報道在ASM 基因中有超過70個突變能夠引起A型或B型NPD (Simonaro等人，Am J Hum Gen. 2002,71:1413-1419)。其中有少量共同突變預(yù)測有特定表 型。例如，在北美和西歐的全部NPD患者的約10-15。/。中發(fā)現(xiàn)AR608 突變，其中殘基608處的精氨酸缺失(AR608),并且該突變總是與該 疾病的非神經(jīng)形式(即B型NPD)相關(guān)(L evran等人，J Clin Invest. 1991; 88:806-810)。該突變也在北非的約90%的B型NPD患者中發(fā)現(xiàn)(Vanier 等人，Hum Genet. 1993;92:325-330)。與AR608突變不同，另外三個突 變，即L302P,其中脯氨酸替換了氨基酸殘基302處的亮氨酸，R496L, 其中亮氨酸替換了氨基酸殘基496處的精氨酸，和fsP330,其中未成 熟終止密碼子被引入氨基酸殘基330處的脯氨酸下游，存在于德裔猶 太人群體中90%以上的A型NPD患者中(Levran等人，Proc Natl Acad Sci USA. 1991; 88:3748-3752; Levran等人，Blood. 1992; 80:2081-2087; Levran等人，Hum Mut. 1993;2:317-319)。德裔猶太人群體中這三種突 變的攜帶頻率為約1:80至1:100 (Li等人Am J Hum Genet. 1997; 61 (suppl):A24)。最近，克隆了人ASM基因的三個同種型，并且鑒定了能夠可靠 應(yīng)用于診斷評價德裔猶太人群體中A型和B型NPD雜合體的幾個突 變(參見Schuchman等人的美國專利5，773，278和5,686,240)。支持治療是用于大多數(shù)LSD患者的唯一療法。對于幾種LSD, 包括戈謝病、法布里病和I型粘多糖貯積病(MPSI)，已經(jīng)開發(fā)了或者 當(dāng)前正在開發(fā)酶替代療法(ERT) (Desnick和Schuchman, Nat Rev Genet, 2002; 3:954-966),但是由于這些酶在靜脈輸注后不能通過血腦屏障， 因此不是用于重度神經(jīng)累及(例如A型NPD)患者的有效策略。使用小 分子抑制劑來阻止病原性底物合成的底物剝奪療法(Substrate deprivation therapy)也已經(jīng)開發(fā)或者正在評價用于幾種LSD,在歐洲 和美國已經(jīng)有條件地批準(zhǔn)銷售用于戈謝病(Butters等人，Philos TransRSocLondB Biol Sci. 2003; 358:927-945)。與ERT相比，這一方法的 一個優(yōu)點是小分子抑制劑可以通過血腦屏障，從而防止底物在腦中積累。最近開發(fā)的另外一種小分子方法稱作化學(xué)陪伴分子，或活性部位 特異性陪伴分子(ASSC)療法(Fan等人Nat Med. 1999;5:112-115; Fan, Trends Pharmacol Sci. 2003; 24:355-360)。 ASSC使用低濃度的有效酶 抑制劑來增加特定LSD中突變蛋白的折疊和活性。該方法首先在法 布里病中評價，其中應(yīng)用oc-半乳糖苷酶A的小分子抑制劑l-脫氧-半 乳糖野尻霉素(DGJ)提高來自法布里病患者的細(xì)胞系中的殘余oc-半乳 糖苷酶活性(參見Fan等人的美國專利6，274，597)。 Fan等人的美國專 利6，583，158進(jìn)一步舉例說明了用于大量其他溶酶體貯積癥，包括戈 謝病和GMl神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥的ASSC策略，并且證明了使用有效 竟?fàn)幮砸种苿┳鳛榛瘜W(xué)陪伴分子來提高患者細(xì)胞中殘余酶活'性的這種治療策略不僅限于法布里病患者，而可以用于多種酶缺陷疾病，特 別是LSD?，F(xiàn)在正在開發(fā)用于包括戈謝病在內(nèi)的幾種LSD的ASSC療法， 它與ERT或底物剝奪療法相比具有幾個優(yōu)點。最重要的是，由于在 ASSC中使用的活性部位抑制劑是引起疾病的酶特異性的，因此這種 療法針對單一蛋白質(zhì)和代謝途徑，這不同于抑制整個合成途徑的底物 剝奪療法。同底物剝奪療法一樣，用于ASSC的小分子抑制劑具有通 過血腦屏障的能力，因而能夠用于治療神經(jīng)LSD形式。除了提高與LSD相關(guān)的缺陷酶的活性以外，還證明了 ASSC能 夠提高相應(yīng)野生型酶的活性(參見，F(xiàn)an等人的美國專利6,589,964), 因此能夠作為酶替代療法的共同治療用于LSD患者。A型NPD是ASSC的一個重要的候選者。首先，所有A型NPD 患者都發(fā)展到大約3歲時導(dǎo)致死亡的嚴(yán)重的神經(jīng)學(xué)表型。對于這種疾 病的神經(jīng)學(xué)特征現(xiàn)在還沒有治療方法。但是，使用ASM敲除小鼠模 型的研究已經(jīng)表明，將殘余ASM活性提高最多正?；钚缘募s5%能夠 完全防止腦病的發(fā)生，并且導(dǎo)致壽命正常，提示低水平的功能性ASM防止了 A型NPD患者的神經(jīng)變性(Marthe等人，Hum Mol Genet. 2000; 9:1967-1976)。另外，造成大多數(shù)德裔猶太人A型NPD患者的這三個 突變中的兩個(L302P和R496L)是可能適合ASSC的點突變。另外， 世界上大約15%的B型NPD患者帶有至少一個拷貝的AR608突變。 因此，實質(zhì)上需要這種形式的小分子療法。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種治療A型或B型NPD患者的方法，是通過施用 小分子神經(jīng)酰胺類似物或含磷鞘磷脂或核苷酸類似物作為活性部位 特異性陪伴分子(ASSC)。在一個實施方案中，向在人酸性鞘磷脂酶(ASM)基因中具有 L302P突變的個體施用ASSC。在另一個實施方案中，向在人酸性鞘磷脂酶(ASM)基因中具有 R496L突變的個體施用ASSC。在另一個實施方案中，向具有AR608突變的個體施用ASSC。在另一個實施方案中，該小分子是具有下式的鞘磷脂類似物胸<formula>formula see original document page 17</formula>其中每一個R如果存在則獨(dú)立任選地是取代的Cwo烷基、鹵素、 N02、 CN、 OH、 Cw烷氧基；Ri、 R2和R3獨(dú)立地是H、 Cw。烷基、 芳基或芳烷基；n是0-5， m是l-3，優(yōu)選2。在另 一個實施方案中，該小分子是具有下式的鞘磷脂類似物<formula>formula see original document page 17</formula>獨(dú)立地是H、 Cw。烷基、芳基或芳烷基。在 一 個優(yōu)選實施方案中，該鞘磷脂類似物具有以下結(jié)構(gòu)<formula>formula see original document page 18</formula>在另外一個實施方案中，該小分子是具有下式的神經(jīng)酰胺類似物<formula>formula see original document page 18</formula>其中Rn如上所述定義，R7是H或OH, Rs是H、 Cw。烷基、芳基或芳烷基，R9是do-20烷基。在一個特定實施方案中，該ASSC是D-MAPP(見

圖1)。 在另外一個實施方案中，該小分子類似物是磷核苷酸類似物，如下風(fēng)<formula>formula see original document page 18</formula>但是，也包括其他磷核苷酸，例如但不限于腺苷一磷酸、胞苷一 磷酸和腺苷二磷酸。在一個實施方案中，該小分子類似物可以施用作為單一治療。在另外一個實施方案中，該小分子類似物可以與野生型重組ASM 一起施用作為酶替代治療。隨著施用的替代功能性ASM蛋白的穩(wěn)定 性提高，內(nèi)源ASM蛋白的穩(wěn)定性，因而活性，將同時提高。在另外一個實施方案中，該小分子類似物與編碼功能性ASM的 重組載體，即基因治療一起施用。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種提高非哺乳動物宿主細(xì)胞產(chǎn)生重組ASM 蛋白的方法，是通過將該宿主細(xì)胞在含有本發(fā)明的小分子類似物的培 養(yǎng)基中接觸。本發(fā)明還提供含有該小分子類似物和藥物可接受的載體的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供在藥物可接受的載體中含有純化的ASM蛋白 和如此處所述的小分子類似物陪伴分子的組合物。本發(fā)明還提供一種預(yù)防或治療已經(jīng)診斷為或者在遺傳學(xué)上易發(fā) 展為NPD的受試者的方法，是通過單獨(dú)施用或與酶替代或基因治療 聯(lián)合施用小分子類似物。附圖簡述圖1顯示本發(fā)明的一個優(yōu)選ASSC，即D-MAPP的結(jié)構(gòu)。 圖2A-D。圖2A顯示可以在本發(fā)明中應(yīng)用的神經(jīng)酰胺類似物的結(jié) 構(gòu)，而圖2B和2C顯示能夠用于實施本發(fā)明的鞘磷脂類似物的結(jié)構(gòu)。 圖2D顯示作為NPDASCC候選物的鞘磷脂類似物的一個優(yōu)選實施方 案的結(jié)構(gòu)。圖3顯示為ASM的抑制劑和ASSC的一種核苦酸類似物的結(jié)構(gòu)。 圖4證明D-MAPP抑制野生型ASM活性的Ki 。具體來說，即D-MAPP對純ASM的活性的影響圖5顯示D-MAPP對來自A型NPD個體的細(xì)胞中ASM活性的影響。具體來說，即D - MAPP對來自R496L突變純合的A型NPD患者的皮膚成纖維細(xì)胞中殘余ASM活性的影響。發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于神經(jīng)酰胺、鞘磷脂或磷核苷酸類似物作為NPDASSC的應(yīng)用。當(dāng)在D-MAPP (5-50微摩爾)存在下將來自含有兩個拷 貝R496L突變的A型NPD患者的培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞溫育3天時， 殘余ASM活性提高最高達(dá)3倍，或者提高至正常值的約3%(從不到 正常值1%的起始活性起，見圖5)。類似地，當(dāng)鞘磷脂類似物與正常 成纖維細(xì)胞(20微摩爾)一起培養(yǎng)5天時，正常ASM活性抑制90%, 提示它是ASM的有效的陪伴分子。以前Fan等人(美國專利6,274,597; 6,583,158; 6,589,964;和 6,599,919)所描述的ASSC是葡萄糖和半乳糖的亞胺基糖類似物，它 們是公知的糖普酶抑制劑，與之不同，本發(fā)明描述的小分子類似物不 是亞胺基糖。本發(fā)明的化合物在約50-100 pM的濃度時抑制ASM。 這也不同于Hannun等人在美國專利5,830,916中所述，該專利公開了 此處所述的一種神經(jīng)酰胺類似物，即D-MAPP,作為石烕性神經(jīng)酰胺酶 抑制劑通過抑制神經(jīng)酰胺酶來提高神經(jīng)酰胺積累的應(yīng)用。神經(jīng)酰胺酶 是一種催化神經(jīng)酰胺水解為鞘氨醇和脂肪酸的酶。Hannun也披露了 D-MAPP對內(nèi)源鞘磷脂水平?jīng)]有作用，反對在全細(xì)胞中對鞘磷脂酶(降 解鞘磷脂的酶)的作用。(3-葡糖苷酶， 一種催化芳基和烷基(3-D-葡糖苷 在體外(使用全細(xì)胞)水解的糖苷酶，也發(fā)現(xiàn)類似的作用缺乏。公開的Dagan等人的美國專利申請2003/0133004也描述了作為 各種脂質(zhì)相關(guān)酶的抑制劑的化合物。該申請描述了幾種修飾鞘脂合成 或代謝的化合物。具體地，描述了抑制鞘磷脂合成，從而提高細(xì)胞中 神經(jīng)酰胺的濃度，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的鞘磷脂類似物。該申請也涉及使用 這些抑制劑通過抑制鞘磷脂治療糖脂貯積病，鞘磷脂是在某些LSD 如NPD中積累的病理性脂質(zhì)。這是底物剝奪或減少的一個例子。該 申請描述的 一種化合物顯示抑制酸性和中性鞘磷脂酶。定義如此處所用的，術(shù)語"活性部位特異性陪伴分子"(ASSC)是指與蛋白質(zhì)的活性部位可逆地特異性相互作用，并且增強(qiáng)穩(wěn)定的分子構(gòu)象形 成的任何分子，包括蛋白質(zhì)、肽、核酸、碳水化合物等。如此處所用 的，"活性部位特異性陪伴分子，，不包括細(xì)胞ER中存在的內(nèi)源性普通陪伴分子，如Bip、《丐聯(lián)接蛋白或4丐網(wǎng)織蛋白，或普通的非特異性化 學(xué)陪伴分子，如重水、DMSO或TMAO。才艮據(jù)本發(fā)明，ASSC是神經(jīng) 酰胺、鞘磷脂或核苷酸類似物和與ASM相互作用的蛋白質(zhì)。酸性鞘磷脂酶，或ASM,具有如美國專利6，541，218所述的核苷 酸和氨基酸序列。ASM的氨基酸序列顯示在下文的SEQIDNO:l中。 該術(shù)語也包括A S M的物種直向同源物和變體。如此處所使用的，術(shù)語"活性部位"是指與底物或結(jié)合配偶體結(jié) 合，并且貢獻(xiàn)直接參與形成和打斷化學(xué)鍵的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)區(qū) 域。根據(jù)本發(fā)明，活性部位包括ASM酶的催化結(jié)構(gòu)域。D-MAPP是指D-赤式-2-(N-肉豆蔻酰氨基)-l-苯基-l-丙醇。 D-MAPP在美國專利5，369，030中描述，并在本文的圖1中示出。術(shù)語"穩(wěn)定正確構(gòu)象"指本發(fā)明的化合物誘導(dǎo)突變ASM蛋白的構(gòu) 象使之與野生型ASM蛋白的構(gòu)象功能上相同的能力。術(shù)語"功能上相 同"意思是構(gòu)象可能有少量變化(實際上幾乎所有蛋白質(zhì)在其生理學(xué) 狀態(tài)下都顯示一定的構(gòu)象柔性)，但是這種構(gòu)象柔性不會導(dǎo)致(l)蛋白 質(zhì)聚集，(2)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的降解途徑清除，(3)ASM功能的損害， 和/或(4)不當(dāng)?shù)募?xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。該術(shù)語也指野生型或功能性ASM如為 ERT產(chǎn)生的ASM的穩(wěn)定。術(shù)語"野生型活性，，是指ASM在細(xì)胞內(nèi)的正常生理功能。此種功 能性可通過已知的用于確定蛋白質(zhì)功能性的任何方法測試。某些測試 可以評價ASM的性質(zhì)，該性質(zhì)可能對應(yīng)于或者可能不對應(yīng)于它的實 際體內(nèi)功能，但卻是蛋白質(zhì)功能性的聚集替代物，并且野生型在這樣 的試驗中的行為是本發(fā)明的蛋白質(zhì)折疊拯救技術(shù)的可接受的結(jié)果。根 據(jù)本發(fā)明的 一種這樣的活性是ASM從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向溶酶體的適當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)。術(shù)語"功能性ASM蛋白，，是指具有以正確構(gòu)象折疊的能力，到達(dá) 其在細(xì)胞中的天然位置，并且具有對鞘磷脂和其他脂質(zhì)底物的催化活性的ASM蛋白。功能性ASM蛋白包括野生型ASM蛋白(見下文的 定義)，例如SEQIDNO:l所示，和具有野生型活性的ASM蛋白。術(shù)語"提高ASM的活性，，意思是穩(wěn)定突變ASM蛋白的正確構(gòu)象， 使其成為功能性ASM蛋白(即以正確構(gòu)象折疊，到達(dá)其在細(xì)胞中的天 然位置，并且具有對鞘磷脂和其他脂質(zhì)底物的催化活性)。該術(shù)語也 指提高外源施用的ASM蛋白的野生型活性，即通過提高野生型ASM 的穩(wěn)定性及延長其半壽期，從而延長其活性。術(shù)語"ASM的抑制劑，，是指在低于藥理學(xué)劑量的濃度時，相比其他 酶，包括參與鞘磷脂合成的酶，在抑制ASM上表現(xiàn)出更高選擇性的 化合物。抑制劑必須特異性抑制ASM。如此處所用的，抑制劑不包 括可在活性部位結(jié)合，但是除了在不利于對個體施用的極高濃度下之 外本身不具有抑制活性的化合物。術(shù)語"低于抑制ASM所需的濃度，，是指提高ASM活性而不抑制其 活性的本發(fā)明化合物的濃度。根據(jù)本發(fā)明，該濃度的范圍為約5-50如此處所用的，術(shù)語"突變ASM蛋白"是指由含有基因突變的基 因翻譯而來的ASM,該基因突變導(dǎo)致在ER中正常存在的條件下不會 實現(xiàn)天然構(gòu)象的改變的蛋白質(zhì)序列。不能實現(xiàn)這種構(gòu)象導(dǎo)致ASM降 解，而不是通過蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的正常途徑轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體。在一個實施方案中，用本發(fā)明的方法拯救的ASM突變是R496L (SEQIDNO:2),即在密碼子核苷酸1487處的G向T的顛換突變。還 不清楚堿性精氨酸替換為疏水性更強(qiáng)的亮氨酸殘基是否改變了酶的 催化活性、酶的穩(wěn)定性，或這兩者。在另外一個特定實施方案中，用本發(fā)明的方法拯救的ASM突變 是核苷酸905處T向C的轉(zhuǎn)換，這導(dǎo)致脯氨酸替換了亮氨酸(L302P -SEQ ID NO:3)。在另外一個特定實施方案中，用本方法的ASSC拯救的ASM突 變是R608的缺失突變(AR608 - SEQ ID NO:4)。分子生物學(xué)定義根據(jù)本發(fā)明，可以應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)中的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA才支術(shù)。這些技術(shù)在以下文獻(xiàn)中充分描述。參見，例如 Sambrook， Fritsch和Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (在此寫為"Sambrook等人，1989") ; DNA Cloning: A Practical Approach,第I巻和第II巻(D. N. Glover編，1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編，1984); Nucleic Acid Hybridization; B. D. Hames和S. J, Higgins編(1985) ; Transcription And Translation; [B. D. Hames和S. J. Higgins,編(1984); Animal Cell Culture; R. I. Freshney，編(1986); Immobilized Cells And Enzymes; IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel等人(編)，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)。如此處所用的，術(shù)語"分離的，，意思是從正常發(fā)現(xiàn)的環(huán)境中除去參 考物質(zhì)。因此，分離的生物材料可以沒有細(xì)胞成分，即發(fā)現(xiàn)或產(chǎn)生該 材料的細(xì)胞的成分。對于核酸分子，分離的核酸包括PCR產(chǎn)物、分 離的mRNA、 cDNA或限制性酶切片段。在另外一個實施方案中，分 離的核酸優(yōu)選從可以發(fā)現(xiàn)它的染色體上切下，更優(yōu)選地不再與非調(diào) 節(jié)、非編碼區(qū)連接，或者不再與當(dāng)在染色體中發(fā)現(xiàn)時位于該分離的核 酸分子所含基因的上游或下游的其他基因連接。在另外一個實施方案 中，分離的核酸缺少一個或多個內(nèi)含子。分離的核酸分子包括插入質(zhì) 粒、粘粒、人工染色體等中的序列。因此，在一個特定實施方案中， 重組核酸是分離的核酸。分離的蛋白質(zhì)可以與在細(xì)胞中相結(jié)合的其他 蛋白質(zhì)或核酸或這兩種結(jié)合，或者如果是膜結(jié)合蛋白，則與細(xì)胞膜結(jié) 合。在一個特定實施方案中，分離的ASM蛋白是由表達(dá)載體表達(dá)的 重組ASM蛋白。分離的物質(zhì)可以但不是必須純化。如此處所使用的術(shù)語"純化的"指在減少或消除無關(guān)材料即污染 物的條件下被分離的材料。例如，純化的ASM優(yōu)選地基本上沒有在細(xì)胞內(nèi)通常與ASM結(jié)合的其他蛋白質(zhì)或核酸。如此處所使用的術(shù)語"基本上沒有"在材料的分析測試內(nèi)容中可以操作性地使用。優(yōu)選地，基本上不含污染物的純化的ASM為至少50%的純度；更優(yōu)選至少90% 的純度，更優(yōu)選至少99%的純度。純度可以通過層析、凝膠電泳、免 疫測定、組成分析、生物學(xué)試驗和本領(lǐng)域已知的其他方法估計出來。術(shù)語"大約"和"近似，，通常指根據(jù)測量的性質(zhì)和精度而定的測量數(shù) 量的可接受的誤差程度。 一般，誤差程度的例子為在給定數(shù)值或數(shù)值 范圍的20%以內(nèi)，優(yōu)選在10%以內(nèi)，更優(yōu)選在5%以內(nèi)?；蛘撸⑶?尤其是在生物學(xué)系統(tǒng)中，術(shù)語"大約"和"近似"可指給定數(shù)值的一個數(shù) 量級內(nèi)的數(shù)值，優(yōu)選在10倍或5倍以內(nèi)，更優(yōu)選在2倍以內(nèi)。除非 另外聲明，此處給出的數(shù)字的量是近似的，意思是當(dāng)未清楚說明時， 術(shù)語"大約"或"近似"能夠是推斷的。術(shù)語"宿主細(xì)胞，，意思是以任何方式選擇、修飾、轉(zhuǎn)化、生長或使 用或操作的任何生物體的任何細(xì)胞，用于由該細(xì)胞產(chǎn)生物質(zhì)，例如由 細(xì)胞表達(dá)人ASM基因，包括DNA或RNA序列，或ASM酶。宿主 細(xì)胞可以進(jìn)一步用于ASSC概念的其他試驗的初步評價。"重組DNA 分子"是進(jìn)行分子生物學(xué)操作或改造的DNA分子。在本發(fā)明的一個實 施方案中，宿主細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。"基因，，是編碼"基因產(chǎn)物"的核苷酸序列。通常，基因產(chǎn)物是蛋白 質(zhì)。然而，基因產(chǎn)物還可以是細(xì)胞內(nèi)其他類型的分子，例如RNA(例 如tRNA或者rRNA)。為了本發(fā)明的目的，基因產(chǎn)物還指在細(xì)胞內(nèi)可 以發(fā)現(xiàn)的mRNA序列。如此處所用的，基因是指編碼野生型或突變 ASM的核苷酸序列。"野生型ASM基因，，是指編碼在體內(nèi)具有功能性生物活性的ASM 蛋白的核酸序列。野生型ASM核酸序列可含有與已知^^布的序列如 美國專利6,541,218公開的序列不同的核苷酸改變，只要這種改變導(dǎo) 致對生物活性影響很小或沒有影響的氨基酸置換。如此處所使用的， 術(shù)語"野生型，，也可包括經(jīng)改造而編碼相對于內(nèi)源或天然蛋白質(zhì)能夠 提高或增強(qiáng)活性的ASM蛋白的ASM核酸序列。"野生型ASM蛋白"是指由野生型基因編碼的任何蛋白質(zhì)，當(dāng)在 體內(nèi)表達(dá)或?qū)霑r該蛋白質(zhì)具有功能性生物活性。這種功能性可通過 已知的用于確定蛋白質(zhì)功能性的任何方法測試。術(shù)語"表達(dá)，，意思是指通過活化與相應(yīng)ASM基因或DNA序列(即 編碼ASM的序列)的轉(zhuǎn)錄和翻譯有關(guān)的細(xì)胞功能而允許或?qū)е翧SM 基因或DNA序列中的信息變成表現(xiàn)形式，例如產(chǎn)生RNA (例如rRNA 或mRNA)或ASM蛋白。ASM DNA序列由纟田胞表達(dá)，形成諸如ASM RNA (例如mRNA或rRNA)或ASM蛋白的"表達(dá)產(chǎn)物"。表達(dá)產(chǎn)物本 身，例如所得的ASMRNA或蛋白質(zhì)，也可以稱作被細(xì)胞"表達(dá)的"。術(shù)語"轉(zhuǎn)染"或"轉(zhuǎn)化，，意思是指將"外來的"，即外部的或細(xì)胞外的 基因、DNA或RNA序列，導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，以致宿主細(xì)胞表達(dá)導(dǎo)入 的基因或序列以產(chǎn)生目的物質(zhì)。在本發(fā)明中，該目的物質(zhì)一般是由所 導(dǎo)入基因或序列編碼的RNA,以及由所導(dǎo)入基因或序列編碼的酶蛋 白質(zhì)。所導(dǎo)入的基因或序列還可以稱作"克隆的"或"外來的"基因或序 列，可以包括調(diào)節(jié)或控制序列(例如細(xì)胞的遺傳機(jī)制所使用的起始、 終止、啟動子、信號、分泌或其他序列)?；蚧蛐蛄锌砂ǚ枪δ?性序列或未知功能序列。接受并表達(dá)所導(dǎo)入DNA或RNA的宿主細(xì)胞已經(jīng)被"轉(zhuǎn)化，，或"轉(zhuǎn)染，，了，并且是一個"轉(zhuǎn)化體"或"克隆"。導(dǎo)入宿主 細(xì)胞的DNA或RNA可以來自于4壬何來源，包括與宿主細(xì)胞同一屬或 種的細(xì)胞或不同屬或種的細(xì)胞。如此處所用的，轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化包括編碼 功能性ASM的序列向具有突變內(nèi)源ASM基因的個體中的導(dǎo)入。術(shù)語"載體"、"克隆載體"和"表達(dá)載體，，意思是指運(yùn)載體，通過該 運(yùn)載體可以將ASM DNA或RNA序列(例如外來基因)導(dǎo)入宿主細(xì)胞 從而轉(zhuǎn)化宿主和促進(jìn)所導(dǎo)入序列的表達(dá)(例如轉(zhuǎn)錄和翻譯)。載體包括 任何遺傳元件，如質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、染色體、病毒、病 毒體等，當(dāng)與適當(dāng)?shù)目刂圃嚓P(guān)聯(lián)時其能夠復(fù)制，并且能夠在細(xì)胞 之間轉(zhuǎn)移ASM基因序列。因此，該術(shù)語包括克隆和表達(dá)運(yùn)載體，以 及病毒載體。術(shù)語"表達(dá)系統(tǒng)，，意思是指在適宜條件下的宿主細(xì)胞和相匹配的載體，例如用于表達(dá)由載體攜帶的并已導(dǎo)入宿主細(xì)胞的外來DNA所編碼的ASM蛋白。常用的表達(dá)系統(tǒng)包括大腸桿菌(E. coli)宿主細(xì)胞和 質(zhì)粒載體、昆蟲宿主細(xì)胞例如Sf9、 Hi5或S2細(xì)胞和桿狀病毒載體和 表達(dá)系統(tǒng)、以及哺乳動物宿主細(xì)胞和載體。術(shù)語"基因治療"是指通過外源性施用基因，即ASM基因，改變 內(nèi)源性基因表達(dá)的方法。如此處所使用的，基因治療還指通過將對應(yīng) 于缺陷或丟失ASM基因的功能性基因或基因的一部分導(dǎo)入需要的個 體的體細(xì)胞或干細(xì)胞中而對缺陷ASM基因的替代、或者對丟失的基 因的替代。基因治療可以通過"來自體內(nèi)"的方法實現(xiàn)，其中分化的或 體干細(xì)胞從個體的身體中取出，然后使用病毒載體作為基因遞送工 具，將缺陷基因的正?？截悓?dǎo)入所移出的細(xì)胞內(nèi)。此外，體內(nèi)轉(zhuǎn)移是 為了達(dá)到治療的結(jié)果，使用廣泛的病毒載體、脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)DNA 復(fù)合物或棵DNA,將基因原位直接轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)。術(shù)語"重組蛋白"是指由載體攜帶的治療性ASM基因編碼的ASM 蛋白(基因產(chǎn)物)。通常，接受載體的細(xì)胞會缺乏對應(yīng)于重組蛋白的內(nèi) 源性ASM蛋白的表達(dá)和/或活性，或者即便存在此種內(nèi)源性ASM蛋 白的表達(dá)，它也是突變型的或者水平十分低。在一個實施方案中，重 組蛋白由細(xì)胞在組織培養(yǎng)中產(chǎn)生，用于實驗和治療目的。在另外一個 實施方案中，重組蛋白由載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在體內(nèi)產(chǎn)生，其中該載體或 含有該載體的細(xì)胞已經(jīng)對受試者施用，即基因治療。在正常個體即該 蛋白質(zhì)不缺乏的個體中，重組ASM蛋白和野生型蛋白質(zhì)可能是區(qū)分 不開的。治療應(yīng)用本發(fā)明進(jìn)一步提供一種預(yù)防或治療A型和B型NPD的方法，該 方法包括在需要這種治療的受試者或患者中提高突變ASM酶的表達(dá) 或活性，或者提高重組野生型替代ASM酶的活性。"受試者，，或"患者，，是已經(jīng)發(fā)展或者可能發(fā)展為NPD的人或動物， 更特別地是哺乳動物，優(yōu)選嚙齒動物或靈長類動物，最優(yōu)選人類。在一個實施方案中，患者是已經(jīng)診斷為或者已經(jīng)確定為由于ASM基因 的遺傳突變而使發(fā)展NPD的危險性提高的德裔猶太人群體的成員。 在另外一個實施方案中，患者是新斯科舍的法裔加拿大人群體的成 員，北非馬格里布地區(qū)(突尼斯、摩洛哥、阿爾及利亞)的居民(B型)， 或新墨西哥州南部和科羅拉多州的西班牙裔美國人群體的成員。然 而，尼曼-皮克病是在全部人種中發(fā)生的，術(shù)語受試者包括世界上患 有NPD或者在遺傳學(xué)上具有發(fā)展NPD的危險的任何人。術(shù)語"預(yù)防"是指疾病發(fā)作的預(yù)防，意思是預(yù)防性地干預(yù)導(dǎo)致疾病 的病理才幾制。在本發(fā)明上下文中，這種病理機(jī)制可以是突變蛋白4斤疊 和ASM表達(dá)的提高。術(shù)語"治療"意思是治療性地干預(yù)顯示該疾病癥狀的受試者中疾 病的發(fā)展。在本發(fā)明的上下文中，這樣的癥狀包括但不限于，例如， 網(wǎng)狀內(nèi)皮溶酶體中鞘磷脂的積累，其導(dǎo)致肝脾大、精神運(yùn)動性阻滯、 肺異常、進(jìn)行性神經(jīng)變性。在一些情況下，治療將防止由NPD引起 的死亡。如此處所使用的術(shù)語"治療有效量，，意思是足以使突變ASM表達(dá) 水平提高例如正常細(xì)胞中所見水平的約3-5%,優(yōu)選約10%，更優(yōu)選約30%的ASSC (即鞘磷脂、神經(jīng)酰胺或核苷酸類似物)的量或劑量。 優(yōu)選地，治療有效量可以改善或防止受試者ASM活性的臨床顯著的 缺乏?；蛘?，治療有效量是足以引起受試者臨床重要狀況的改善，例 如B型NPD患者中進(jìn)行性神經(jīng)變性的改善的量。根據(jù)本發(fā)明，"治療有效量，，也指提高而不抑制ASM蛋白活性的 小分子類似物的量，即有效量的提高多于抑制，因此凈效果是提高。 該有效量一般處于低于ASM抑制劑的IC5o值的某處，或者低于約 50|uM。提高突變ASM表達(dá)或活性的小分子類似物有利地用藥物可接受 的載體配制在藥物組合物中。在上下文中，小分子類似物是活性成分 或治療劑?；钚猿煞值臐舛然蛄咳Q于需要的劑量和如下文所述的施用方案。小分子類似物的合適的劑量范圍可包括從約1 mg/kg至約 100mg/kg體重每天。 聯(lián)合治療ASSC和蛋白質(zhì)替代。本發(fā)明的藥物組合物除了鞘磷脂、神經(jīng)酰 胺或核苷酸類似物以外還可以含有其他生物活性化合物。例如，在一 個實施方案中，可以在替代治療的酶輸注過程中，在含替代野生型(或 功能性)重組ASM的溶液中施用小分子類似物。蛋白質(zhì)替代治療通 過以輸注方式外源引入野生型或生物功能蛋白質(zhì)提高了蛋白質(zhì)的量。 這種治療已經(jīng)開發(fā)用于許多遺傳病，包括戈謝病和法布里病。野生型酶從重組細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(例如哺乳動物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞-見Desnick等人的美國專利號5,580,757; Selden等人的6,395,884和6,458,574; Calhoun等人的6，461 ，609; Miyamura等人的6,210,666; Selden等人 的6,083,725; Rasmussen等人的6,451,600; Rasmussen等人的 5,236,838;和Ginns等人的5,879,680)、人胎盤或動物奶(見Reuser 等人的美國專利號6,188，045)中純化。輸注后，預(yù)期外源ASM酶被組織通過非特異性或受體特異性機(jī) 制吸收。通常吸收效率不高，外源蛋白質(zhì)的循環(huán)時間較短(Ioannu等 人，Am. J. Hum. Genet. 2001;68:14-25)。另外，外源ASM在循環(huán)中不 穩(wěn)定，被快速細(xì)胞內(nèi)降解。因此，預(yù)期與小分子類似物ASM的ASSC 共施用將提高穩(wěn)定性并防止外源施用的ASM的降解。在另外一個實施方案中，小分子類似物也可以與重組功能性ASM 蛋白一起施用，但不必在同一組合物中施用。在該實施方案中，替代 ASM蛋白和小分子類似物配制在分別的組合物中。該小分子類似物 和替代ASM可以通過相同的途徑施用，例如^爭月永輸注，或通過不同 的途徑施用，例如靜脈輸注替代蛋白，而經(jīng)口施用ASSC。ASSC和基因治療。另外，本發(fā)明的小分子類似物組合物可以與 編碼野生型或功能性ASM基因的重組載體一起施用，即與基因治療 聯(lián)合應(yīng)用。最近，重組基因治療方法正在臨床上或臨床前開發(fā)用于溶 酶體jie:積病的治療，參見，例如美國專利號5,658,567,關(guān)于法布里病的重組oc-半乳糖苷酶A治療；美國專利號5,580,757,關(guān)于生物活性 ot-半乳糖苷酶A的克隆和表達(dá)為融合蛋白；美國專利號6，066，626, 關(guān)于治療溶酶體貯積病的組合物和方法；美國專利號6,083,725,關(guān)于 轉(zhuǎn)染的表達(dá)人oc-半乳糖苷酶A蛋白的人細(xì)胞；美國專利號6,335,011, 關(guān)于利用重組腺伴隨病毒病毒體將DNA遞送至肌細(xì)胞內(nèi)治療溶酶體 貝5積病的方法；Bishop, D. F.等人，Proc. Natl. Acad Sci. USA 1986; 83: 4859-4863; Medin， J.A.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:7917-7922; Novo, F. J. ， Gene Therapy 1997; 4:488-492; Ohshima, T. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997; 94:2540-2544; Sugimoto Y.等人， Human Gene Therapy 1995; 6:905-915; Sly等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99(9):5760-2; Raben等人，Curr. Mol. Med 2002; 2(2): 145-66; Eto等人，Curr. Mol. Med. 2002; 2 (1):83-9; Vogler等人，Pediatr. Dev. Pathol. 2001; 4 (5):421-33; Barranger等人，Expert Opin. Biol. Ther. 2001; l(5):857-67; Yew等人，Curr. Opin. Mol. Ther. 2001; 3(4): 399-406; Caillaud等人，Biomed. Pha麵cother. 2000; 54 (10):505-12和Ioannu等 人，J. Am. Soc. Nephrol. 2000; ll(8):1542-7。重要的是要指出，除了穩(wěn)定所表達(dá)的ASM酶以外，小分子類似 物還會穩(wěn)定和增強(qiáng)由于阻止在ER內(nèi)正確折疊和加工的突變所導(dǎo)致缺 陷的任一內(nèi)源性突變ASM的表達(dá)。制劑和施用短語"藥物可接受的，，是指當(dāng)施用于大多數(shù)人時能夠生理性耐受 的并且一般不產(chǎn)生變應(yīng)性或類似的不利反應(yīng)如嘈雜、頭暈等的分子和 組合物。優(yōu)選地，如此處所使用的，術(shù)語"藥物可接受的"意思是指聯(lián) 邦政府或州政府管理局批準(zhǔn)的或者美國藥典或其他用于動物的并且 更特別地用于人的公認(rèn)的藥典中列出的。術(shù)語"載體"指與化合物一起 施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。此類藥用載體可以是無菌液 體例如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的，如花生油、豆 油、礦物油、芝麻油等。水或水溶液、鹽溶液和水溶右旋糖和甘油溶液優(yōu)選用作載體，特別是用于可注射溶液。適當(dāng)?shù)乃幱幂d體在E. W. Martin的"Remington's Pharmaceutical Sciences"中進(jìn)行了描述。#4居本發(fā)明，本發(fā)明的藥物組合物，例如D-MAPP,可以腸胃夕卜、 經(jīng)粘膜，例如經(jīng)口、經(jīng)鼻或經(jīng)直腸或經(jīng)皮引入。腸胃外途徑包括靜脈 內(nèi)、^敖動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)和顱內(nèi)施用。關(guān)于與蛋白質(zhì)替代的聯(lián)合治療，在ASCC與替代ASM酶在同一 組合物中施用的實施方案中，該制劑優(yōu)選地適合腸胃外施用，包括靜 脈內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)施用，但是，也包括適合其他施用途徑如經(jīng)口 (例 如包封的酶)、鼻內(nèi)或經(jīng)皮的制劑。在一個實施方案中，經(jīng)皮施用通過脂質(zhì)體實現(xiàn)。脂雙層嚢泡是封 閉的、填充流體的微球體，其主要由具有極性(親水性)和非極性(親 脂性)部分的各種分子形成。親水性部分可含有磷酸基、甘油磷酸基、 羧基、硫酸基、氨基、羥基、膽堿或其他極性基團(tuán)。親脂性基團(tuán)的例 子有飽和或不飽和烴，如烷基、鏈烯基或其他脂質(zhì)基團(tuán)。也可以包含 固醇類(例如月旦固醇)和其他藥物可接受的佐劑(包括抗氧化劑如ot-生育酚)以提高嚢泡穩(wěn)定性或賦予其他需要的特性。脂質(zhì)體是這樣的雙層嚢泡中的一個亞類，主要由磷脂分子組成， 該磷脂分子含有兩條由脂肪酸鏈組成的疏水尾。在暴露于水后，這些 分子自發(fā)排列，形成球形雙層膜，各層中分子的親脂末端在膜中心會 合，相對的極性末端形成雙層膜的各自的內(nèi)表面和外表面。因此，膜 的每一側(cè)都呈現(xiàn)親水表面，而膜的內(nèi)部含有親脂性介質(zhì)。這些膜可以 排列為由薄水層隔開的 一 系列的同心球形膜，其排列方式與圍繞內(nèi)水 間隙的洋蔥層沒有不同。通過施加剪切力可以將這樣的多層嚢泡 (MLV)轉(zhuǎn)化為單層嚢泡(UV)。根據(jù)本發(fā)明的方法使用脂質(zhì)體遞送神經(jīng) 酰胺和鞘磷脂類似物的優(yōu)點是脂質(zhì)體可以通過血腦屏障。由于A型 NPD的特征為鞘磷脂積累引起的神經(jīng)變性，因此向腦部有效靶向是對 于A型的任何治療方法的關(guān)鍵。適合注射使用的藥物制劑包括無菌水溶液(水溶性時)或分散劑 和用于即時制備無菌注射溶液或分散劑的無菌粉末。在所有情況下，形式都必須是無菌的，并且必須是易于注射的流體。其在生產(chǎn)和貯存 條件下必須穩(wěn)定，并且必須防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。載 體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其中含有例如水、乙醇、多元醇(例如， 丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)，它們的適當(dāng)?shù)幕旌衔?，和植物油?例如通過應(yīng)用包被材料如卵磷脂，在分散液的情況下通過維持所需的 顆粒大小，和通過應(yīng)用表面活性劑，可維持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。微生物?用的預(yù)防可以用各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑實現(xiàn)，例如對羥苯甲酸酯、 氯代丁醇、苯酚、山梨酸等。在許多情況中，優(yōu)選包含等滲劑，例如 糖或氯化鈉。通過在組合物中使用延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明 膠，可實現(xiàn)注射型組合物延長的吸收。無菌注射溶液這樣制備，將純化的ASM酶和小分子類似物以需 要的量摻入合適的溶劑中，需要時含有上述各種其他成分，然后過濾 或最終滅菌。通常，分散劑這樣制備，將各種滅菌的活性成分摻入含 有基本分散介質(zhì)和上述所需其他成分的無菌載體中。在用于制備無菌 注射溶液的無菌粉末的情況中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干 燥技術(shù)，它們由事先無菌過濾的溶液產(chǎn)生活性成分加需要的任何其他 成分的粉末。優(yōu)選地，該制劑含有賦形劑?？砂谥苿┲械乃幬锟山邮艿馁x 形劑是緩沖液，如檸檬酸鹽緩沖液、磚酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液和 碳酸氫鹽緩沖液，氨基酸，尿素，醇，抗壞血酸，磷脂；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、膠原和明膠；鹽，如EDTA或EGTA，和氯化鈉；脂質(zhì) 體；聚乙烯吡咯烷酮；糖，如葡聚糖、甘露醇、山梨醇和丙三醇；丙 二醇和聚乙二醇(例如PEG-4000, PEG-6000);甘油；甘氨酸或其他 氨基酸；和脂類。用于制劑的緩沖系統(tǒng)包括檸檬酸鹽、乙酸鹽、碳酸 氫鹽和磷酸鹽緩沖液。磷酸鹽緩沖液是優(yōu)選實施方案。制劑優(yōu)選地也含有非離子型去污劑。優(yōu)選的非離子型去污劑包括 Polysorbate 20、 Polysorbate 80、 Triton X-100、 Triton X-114、 Nonidet P_40、辛基oc-葡糖苷、辛基(3-葡糖苷、Brij 35、 Pluronic和Tween 20。對于ASM酶和小分子ASSC制劑的凍干，酶濃度可以為0.1-10mg/mL?？梢韵騼銮Щ旌衔镏刑砑优蛎泟绺拾彼?、甘露醇、 白蛋白和葡聚糖。另外，也可以向凍千混合物中添加可能的冷凍保護(hù) 劑，如二糖、氨基酸和PEG。也可以添加以上列出的任何緩沖液、賦 形劑和去污劑。用于吸入施用的小分子類似物制劑(含有或不含ASM)可以含有 乳糖或其他賦形劑，或者可以是可含有聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘氨膽 酸鹽或脫氧膽酸鹽的水溶液。 一種優(yōu)選的吸入氣霧劑的特征在于具有 小質(zhì)量密度和大尺寸的粒子。質(zhì)量密度低于0.4克每立方厘米且平均 直徑大于5 nm的粒子將吸入的治療劑有效遞送到全身循環(huán)中。這樣 的粒子被吸入到肺的深部，逃脫了肺的自然清除^li制，直到吸入的粒 子釋放它們的治療負(fù)載(Edwards等人，Science. 1997; 276:1868-1872)。 本發(fā)明的替代蛋白質(zhì)制劑可以以霧化形式施用，例如應(yīng)用如美國專利 號5，654，007、 5,780,014和5,814,607所述的制備方法和制劑，這些專 利在此引用作為參考。用于鼻內(nèi)施用的制劑可包括用于以滴鼻劑形式 施用或作為鼻內(nèi)施用凝膠的油性溶液。通過用皮膚病學(xué)可接受的載體，如洗劑、乳膏、軟膏或皂劑分散 組合物，可以配制用于向皮膚表面局部施用小分子類似物的制劑。特 別有用的是能夠在皮膚上形成膜或?qū)訌亩植客糠蟛⑶曳乐骨宄?載體。對于內(nèi)組織表面的局部施用，組合物可以分散在液體組織粘合 劑或已知能增強(qiáng)組織表面吸收的其他物質(zhì)中?；蛘?，可以使用組織包 被溶液，如含膠質(zhì)的制劑。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的制劑在方便施用預(yù)定劑量的制劑的 裝置中以液體或粉末制劑的形式提供；這樣的裝置的例子包括用于皮 下或肌肉注射的無針注射器，和計量氣霧劑遞送裝置。在其他的例子 中，該制劑可以以適合持續(xù)釋放的形式供應(yīng)，例如為了經(jīng)皮施用而對 皮膚施用的貼劑或敷劑，或者通過用于經(jīng)粘膜施用的可腐蝕裝置。在 以片劑或膠嚢形式經(jīng)口施用制劑例如D-MAPP或其他小分子類似物 的例子中，該制劑可以在具有可移去的蓋子的瓶中或在泡罩包裝中提 供。在分開施用小分子類似物或者僅施用ASSC作為單一治療的實施 方案中，小分子類似物可以是適合任何施用途徑的形式，包括但不限 于上述所有形式，例如作為無菌水溶液、鼻吸入、經(jīng)皮或凍干粉，在 重新配制過程中或之后立即加入替代蛋白質(zhì)的制劑中，以防止施用前 的體外聚集。此外，在一個優(yōu)選實施方案中，小分子類似物為了經(jīng)口 施用可以配制為片劑或膠嚢形式，其通過常規(guī)方法用藥物可接受的賦 形劑如結(jié)合劑(例如預(yù)膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基曱 基纖維素)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例 如硬脂酸鎂、滑石粉或硅石)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或淀粉羥乙酸 鈉)或濕潤劑(例如十二烷基硫酸鈉)制備而成。 <吏用本領(lǐng)域已知的方法 可以將片劑進(jìn)行包衣。用于經(jīng)口施用小分子類似物的液體制劑可以采用例如溶液、糖漿 或混懸液的形式，或者可以是在使用前用水或其他適當(dāng)々某介物進(jìn)行配 制的干產(chǎn)品。此種液體制劑可以用常失見方法使用藥物可接受的添加劑 例如懸浮劑(例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂)、乳化劑 (例如卵磷脂或阿拉伯膠)、非水媒介物(例如杏仁油、油酯類、乙醇或 分餾植物油)和防腐劑(例如對羥基苯甲酸曱酯或丙酯或山梨酸)來配 制。制劑還可以包含適當(dāng)?shù)木彌_鹽、調(diào)味劑、著色劑和甜味劑。用于 經(jīng)口施用的制劑可以適當(dāng)配制，以荻得活性化合物的控制釋放。對于與基因療法的聯(lián)合治療(或者作為單一治療)，小分子類似 物ASSC可以分開配制，用于例如經(jīng)口、腸胃外、透皮或經(jīng)粘膜途徑 施用，包括但不限于以上所述。在一個優(yōu)選實施方案中，小分子類似 物作為通過常規(guī)方法用如上所述的藥物可接受的賦形劑配制的片劑 或月交嚢經(jīng)口施用?；蛘?，小分子類似物也可以配制成用于通過注射例 如快速注射或連續(xù)輸注而進(jìn)行腸胃外施用。用于注射的制劑可以與添 加的防腐劑 一起以單位劑量形式存在，例如存在于安瓿或多劑量容器 中。組合物可以采用諸如混懸液、溶液或在油或水々某介物中的乳劑的 形式，并且可含有諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑的配制試劑。在另 外一個實施方案中，小分子類似物可能是粉末的形式，在使用前用適當(dāng)?shù)拿浇槲锢鐪缇鸁o熱原水進(jìn)行配制。小分子類似物還可配制成直腸組合物例如栓劑或保留灌腸劑，例 如它們含有諸如可可脂或其他甘油酯的常規(guī)栓劑基質(zhì)。除了前面所描述的制劑外，小分子類似物還可以制劑成貯庫制劑(depot preparation)。這種長歲支制劑可以通過才直入(例如皮下或月幾內(nèi))或 肌肉注射的方法施用。因此，例如小分子類似物可以與適當(dāng)?shù)亩嗑畚?或疏水材料(例如可接受油中的乳劑)或離子交換樹脂配制，或作為微 溶的衍生物，例如作為微溶鹽。時限。當(dāng)替代ASM蛋白和小分子類似物在分別的制劑中時，施 用可以同時進(jìn)行，或者小分子類似物可以在ASM替代蛋白之前或之 后施用。例如，當(dāng)ASM替代蛋白靜脈施用時，小分子類似物可以在 之后的0-6小時內(nèi)施用?；蛘撸》肿宇愃莆锟梢栽谠摰鞍踪|(zhì)之前0-6 小時施用。在一個優(yōu)選實施方案中，其中小分子類似物和替代蛋白質(zhì)分開施 用，并且具有較短的循環(huán)半壽期(例如小分子)，該小分子類似物可 以經(jīng)口連續(xù)施用，如每日施用，以維持循環(huán)中的恒定水平。這種恒定 水平是已經(jīng)測定對患者無毒并且在施用期間與靶替代蛋白相互作用 方面是最佳的水平，以提供非抑制性的治療效果。在另外一個實施方案中，小分子類似物在替代ASM蛋白周轉(zhuǎn)所 需的時間期限內(nèi)施用(施用小分子類似物將延長這個期限)。無論時限如何，施用都必須使ASM蛋白和小分子類似物的濃度 為使得小分子類似物穩(wěn)定但不阻止或抑制該蛋白質(zhì)的體內(nèi)活性。這也 適用于替代ASM蛋白和小分子類似物在同一制劑中施用的情況。對于小分子類似物和基因治療聯(lián)合治療的時限，根據(jù)本發(fā)明的小 分子類似物的施用通常在ASM基因遞送之后進(jìn)行，以允許靶細(xì)胞/組 織表達(dá)重組ASM酶。由于ASM基因的表達(dá)會維持一段時間，所以只 要該基因是可表達(dá)的，小分子類似物就會作為重組ASM酶的陪伴分 子和穩(wěn)定劑保持有效。因此，小分子類似物的施用有必要持續(xù)與基因 表達(dá)相同的時間。在一個優(yōu)選實施方案中，由于小分子類似物具有短的循環(huán)半壽 期，小分子類似物優(yōu)選連續(xù)經(jīng)口施用，例如每日施用，以維持循環(huán)中 的恒定水平。此種恒定水平是已經(jīng)測定對患者無毒并且在與蛋白質(zhì)相 互作用方面是最佳的水平，它將是持續(xù)產(chǎn)生的，以便產(chǎn)生非抑制性的 治療效果。根據(jù)本發(fā)明，在治療性ASM基因補(bǔ)償了內(nèi)源性突變ASM基因不 足的活性的情況下，因為有效量能夠提高內(nèi)源性突變ASM的活性并 且提高治療性ASM基因產(chǎn)物的效果，因此小分子類似物遞送的時限 變得不太重要。對于所施用的ASM基因編碼的ASM酶，其ASSC如D-MAPP 的存在有利于提高ER內(nèi)合成過程中的蛋白質(zhì)加工效率(即通過防止 聚集)并延長循環(huán)中和組織中ASM酶的半壽期，從而能夠在較長的時 間階段內(nèi)維持有效的水平。這會導(dǎo)致臨床上受累組織內(nèi)的表達(dá)增強(qiáng)。 這會給NPD患者帶來有益的效果，如更好地緩解、減少治療次數(shù)、 和/或降低所施用ASM基因的量。它也會減少治療費(fèi)用。基因治療。用于與本發(fā)明的ASSC聯(lián)合治療的ASM核酸可以用 任何已知的方法施用，包括本領(lǐng)域可用的用于基因治療的方法。于是 經(jīng)鑒定和分離的基因可以插入到適當(dāng)?shù)目寺≥d體中。適宜用于基因治 療的載體包括病毒，例如腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、牛痘、皰疹病 毒、桿狀病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒、細(xì)小病毒、1曼病毒、噬菌體、粘粒、質(zhì) 粒、真菌載體和其他在本領(lǐng)域中常用的、已經(jīng)描述用于在多種真核和 原核宿主中進(jìn)行表達(dá)的、并且可用于基因治療和簡單蛋白質(zhì)表達(dá)的重 組載體。在一個優(yōu)選實施方案中，載體是病毒載體。病毒載體，特別是腺 病毒載體，可以和陽離子親水脂分子，例如陽離子脂類、多聚L-賴氨 酸(PLL)和二乙氨乙基葡聚糖(DELAE-葡聚糖)復(fù)合，這些陽離子親水 脂分子提供了提高的病毒對靶細(xì)胞感染的效率(見，例如1997年11 月20日提交的PCT/US97/21496,在此引用作為參考)。用于本發(fā)明的 優(yōu)選的病毒載體包括從牛痘、皰瘆病毒、AAV和逆轉(zhuǎn)錄病毒4汙生的載體。特別是皰滲病毒，特別是諸如在美國專利號5,672,344所公開(其 公開內(nèi)容在此引用作為參考)的單純皰滲病毒(HSV),對于將轉(zhuǎn)基因遞 送進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞是特別有用的。諸如在美國專利號5,139,941 、 5，252,479和5，753,500和PCT公開W097/09441中(其公開內(nèi)容在此引 用作為參考)公開的AAV載體也是有用的，因為這些載體整合入宿主 染色體，對重復(fù)施用載體具有最低的需求。關(guān)于基因治療中的病毒載 體的綜述見Mah等人，Clin. Pharmacokinet. 2002; 41 (12):901-11; Scott 等人，Neuromuscul. Disord. 2002; 12 Suppl 1 :S23-9。此外，見美國 專利號5,670,488。欲被遞送的基因的編碼序列可以有效地連接于表達(dá)控制序列，例 如指導(dǎo)基因表達(dá)的啟動子。如此處所使用的，短語"有效地連接"，指多 核香酸/基因與核苷酸的調(diào)節(jié)和效應(yīng)序列例如啟動子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄和 翻"^終止位點和其他信號序列的功能性關(guān)系。例如，核酸與啟動子有 效地連接指多核苷酸和啟動子之間的物理性和功能性的關(guān)系，以致于 DNA的轉(zhuǎn)錄被能夠特異性識別和結(jié)合到啟動子上的RNA聚合酶從啟 動子處起始，并且其中該啟動子指導(dǎo)著從多核苷酸到RNA的轉(zhuǎn)錄。在一個實施方案中，使用了其中編碼序列和任何其他需要的序列的側(cè)翼是能夠促進(jìn)在基因組的預(yù)期部位進(jìn)行同源重組的區(qū)域的載體， 從而提供了由整合到基因組內(nèi)的核酸分子表達(dá)該構(gòu)建體(Koller和Smithies, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 1989， 86:8932-8935; Zijlstra等人， Nature 1989, 342:435-438)。在一個特定的實施方案中，載體是直接在體內(nèi)施用的，此時載體 進(jìn)入生物體的細(xì)胞并且介導(dǎo)構(gòu)建體的表達(dá)。這可以通過本領(lǐng)域公知的 和下面描述的多種方法中的任何方法實現(xiàn)，例如通過將其構(gòu)建為適當(dāng) 表達(dá)載體的一部分并且對其進(jìn)行施用以致于使它變成細(xì)胞內(nèi)的，例如 使用缺陷型或減毒逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒載體進(jìn)行感染(見，美國專 利號4,980,286)，或者通過直接注射棵DNA,或者使用微粒轟擊(例 如基因槍；Biolistic, Dupont),或者用脂類或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染試 劑進(jìn)行包被，用生物聚合物(例如聚-(3-l-64-N-乙酰葡糖胺多糖；見美國專利號5,635，493)進(jìn)行包封，用脂質(zhì)體、微顆?；蛭⒛z嚢進(jìn)行包封； 通過連接到已知將進(jìn)入細(xì)胞核的肽或其他配體上進(jìn)行施用；或者通過 連接到能夠發(fā)生受體介導(dǎo)的胞吞作用的配體上而施用(見，例如Wu 和Wu, J. Biol. Chem. 1987, 62:4429-4432)等等。在另一實施方案中， 可以形成核酸和配體復(fù)合物，其中配體含有石皮壞內(nèi)體的致融合病毒 肽，從而使核酸免受溶酶體的降解，或者含有例如從觸角 (antennapedia)來源的、可用于轉(zhuǎn)移治療性DNA進(jìn)入細(xì)月包的陽離子 12mer肽(Mi等,Mol. Therapy 2000,2:339-47)。在另一個實施方案中， 通過靶向特異的受體可以將核酸在體內(nèi)進(jìn)行耙向，用于細(xì)胞特異的攝 入和表達(dá)(見，例如PCT公開號WO92/06180, WO 92/22635, WO 92/20316和WO 93/14188)。最近， 一種叫做磁性轉(zhuǎn)染的技術(shù)已經(jīng)用 于將載體遞送進(jìn)入哺乳動物。該技術(shù)將載體和用于在磁場的影響下進(jìn) 行遞送的超順磁納米顆粒進(jìn)行結(jié)合。這種應(yīng)用縮短了遞送時間并且提 高了載體的效果(Scherer等，Gene Therapy 2002;9'. 102-9)。在一個特定實施方案中，核酸可以用脂質(zhì)載體施用。脂質(zhì)載體可 以與棵核酸(例如質(zhì)粒DNA)結(jié)合，以利于通過細(xì)胞膜。陽離子、 陰離子或中性脂質(zhì)可以用于此目的。但是，優(yōu)選陽離子脂質(zhì)，因為它 們已經(jīng)表現(xiàn)為更好地與通常帶有負(fù)電荷的DNA結(jié)合。陽離子脂質(zhì)還 顯示能夠介導(dǎo)質(zhì)粒DNA的細(xì)胞內(nèi)遞送(Felgner和Ringold， Nature. 1989; 337:387)。已經(jīng)表明向小鼠內(nèi)靜脈內(nèi)注射陽離子脂質(zhì)-質(zhì)粒復(fù)合 物導(dǎo)致DNA在肺中表達(dá)(Brigham等人，Am. J. Med. Sci. 1989; 298:278)。參見，Osaka等人，J. Pharm. Sci. 1996; 85 (6):612-618; San 等人，Human Gene Therapy 1993; 4:781-788; Senior等人，Biochemica et Biophysica Acta. 1991; 1070:173-179); Kaba,和Kaba麗, Bioconjugate Chem. 1995; 6:7-20; Liu等人，Pha麵ceut. 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實施例1: D-MAPP對ASM活性的恢復(fù)
一種小分子，稱作D-MAPP的神經(jīng)酰胺類似物(結(jié)構(gòu)見圖1),作 為用于NPD的可能ASSC進(jìn)行評價。 材料與方法
D-MAPP獲自Matreya (Pleasant Gap, PA,目錄號1859)，并且在 乙醇中重新配制為2mM的濃度。
重組ASM。為了確定能夠用于陪伴分子ASM的D-MAPP的非抑 制濃度范圍，測定純化的野生型ASM的Ki。通過公開的方法(He等 人，Biochim et Biophys Acta. 1999; 1432:251-264),從過量表達(dá)中國倉 鼠卵巢細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化重組人ASM(rASM)。簡要地說，包括通 過DEAE Sephacel、伴刀豆球蛋白A和Superose 12層析。D-MAPP 獲自Matreya Inc (Pleasant Gap, PA目錄號1859)。
抑制測定。對于使用純酶的體外研究， 一份母液在氮?dú)庀赂稍铮?然后重懸浮在含有熒光ASM底物BODIPY鞘磷脂(Molecular Probes, Eugene OR)的乙酸鈉緩沖液中。超聲處理該溶液，加入一份純rASM。 底物在試驗中的終濃度為100微摩爾(iaM)， D-MAPP的濃度為 10-500|aM。測定如前所述進(jìn)行(He等人，Biochem. 2003; 314:116-120)。
獲得(知情同意)具有兩個拷貝R496L突變的A型NPD皮膚成 纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞，并在含有10%熱滅活的胎牛血清的 標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)基(DMEM， GIBCO)中培養(yǎng)。向培養(yǎng)基中加入不同濃度 的D-MAPP (5-50pM),將細(xì)胞溫育不同的時間。在溫育結(jié)束時，將細(xì) 胞用胰蛋白酶消化，用乳膠刮刷收獲，用鹽水洗滌，重懸浮在10mM Tris緩沖液，pH 7.0中。通過超聲處理制備細(xì)胞提取物，將碎片超聲 處理，如以前所述(He等人，Biochem. 2003; 314:116-120)，利用BODIPY鞘磷脂用上清液測定ASM的活性。
結(jié)果
圖4顯示D-MAPP以約50nM的Ki抑制純ASM的活性。圖5顯 示當(dāng)來自含有兩個拷貝R496L突變的A型NPD患者的培養(yǎng)皮膚成纖 維細(xì)胞在D-MAPP (5-50 iuM)存在下溫育三天時，殘余ASM活性^提高 最高達(dá)3倍，或者提高至正常值的約3%(從不到正常值1%的起始活 性起)。在約10|liM時發(fā)現(xiàn)最大提高，在該濃度時對細(xì)胞生長或生存力 沒有有害作用。因此，D-MAPP,野生型ASM活性的一種小分子抑 制劑，可以用作NPD治療的ASSC。
實施例2:新鞘磷脂類似物對ASM活性的恢復(fù) 材料與方法
預(yù)期當(dāng)對NPD成纖維細(xì)胞施用時，此處所述的鞘磷脂類似物將 提高正常的ASM活性，并且拯救突變ASM的活性，因為這些化合物 是竟?fàn)幮訟SM抑制劑(即，它們減少底物結(jié)合——數(shù)據(jù)未示出)。這樣 的鞘磷脂類似物顯示在圖2B-D中。 一種優(yōu)選的化合物是圖2D所示 的類似物。
重組ASM。如上對于D-MAPP所述測定圖2D中鞘磷脂類似物 對于野生型重組ASM的Ki。
成纖維細(xì)胞測定。也如以上對于D-MAPP在NPD成纖維細(xì)月包中 所述測定正常皮膚成纖維細(xì)胞中ASM抑制的Ki。
另外，具有兩個拷貝的R496L突變的A型NPD皮膚成纖維細(xì)胞 和正常皮膚成纖維細(xì)胞在以上對于D-MAPP所述的條件下用約 0.5-50pM的圖2B-D所示的鞘磷脂類似物處理5天。
結(jié)果
鞘磷脂類似物以約70pM的Kj抑制純重組ASM的活性，而在 20pM時將正常皮膚成纖維細(xì)胞中的ASM抑制大約90%。
預(yù)計這些類似物將與以上D-MAPP所示相似地提高野生型活性。 也預(yù)計這些類似物將拯救突變成纖維細(xì)胞中突變ASM的活性。實施例3:向應(yīng)用酶替代或基因療法治療的尼曼-皮克病小鼠中共
施用小分子類似物
材料與方法與結(jié)果
ASM缺乏小鼠(NPD KO小鼠)以前已經(jīng)產(chǎn)生(Dhami等人，Lab Invest 2001; 81 (7):987-99)。這些小鼠的特征在于至IO周齡時它們的 肺空隙中的細(xì)胞數(shù)顯著高于正常小鼠，主要由增大的和通常多核的巨 噬細(xì)胞組成。這些小鼠可以在實驗中應(yīng)用，該實驗設(shè)計為用來證明無 論單獨(dú)應(yīng)用還是與基因療法或酶替代療法聯(lián)合應(yīng)用，小分子神經(jīng)酰 胺、鞘磷脂或核苷酸類似物都能用于治療NPD病。
Genzyme公司以及Transkaryotic Therapies (TKT)已經(jīng)開發(fā)了用于 幾種溶酶體貯積病的酶替代療法。預(yù)期向通過輸注替代酶進(jìn)行治療的 ASM敲除小鼠中共施用D-MAPP或其他神經(jīng)酰胺、鞘磷脂或磷核苷 酸類似物(即ASSC)，如此處所述的那些，會提高替代酶的體內(nèi)穩(wěn)定 性，例如半壽期，因為ASSC穩(wěn)定了酶并且防止降解。按照以前對于 法布里病KO小鼠所述(Ioannu等人，Am JHum Genet. 2001; 68:14-25) 類似的方案，在輸注野生型ASM后向KO小鼠經(jīng)口施用小分子類似 物。在一段時間之后測定包括心臟、腎臟、脾臟、肝臟和肺在內(nèi)的多 種組織和血清中的ASM活性，并且將其與沒有接受ASCC的對照小 鼠和只接受小分子類似物但沒有接受酶的小鼠的活性進(jìn)行比較。延長 的時間表明共施用ASSC能夠提高酶替代療法的療效。
向應(yīng)用基因療法治療的ASM KO小鼠中共施用小分子類似物會 提高基因治療的療效，因為它顯著地提高治療性基因產(chǎn)物的表達(dá)，特 別是通過防止在靶細(xì)胞的ER中聚集。遵循基因治療方案的KO小鼠 接受溶解于飲用水中的如此處所述的D-MAPP或鞘磷脂或核苷酸類 似物，并且在一段時間之后測定包括心臟、腎臟、脾臟、肝臟和肺在 內(nèi)的多種組織和血清中的小分子類似物活性，并且將其與沒有接受小 分子類似物的對照小鼠和接受小分子類似物但沒有接受基因治療的 小鼠的活性進(jìn)行比較。較高的酶活性和較長的保持時間表明共施用小 分子類似物能夠提高基因治療的療效。本發(fā)明不限于此處描述的特定實施方案的范圍。的確，除了此處 所描述的那些，從前面的描述和附圖來看，本發(fā)明的多種改變對于本 領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。這些改變處于后附的權(quán)利要求書的范圍 之內(nèi)。
專利、專利申請、出版物、程序等等在整個本申請中被引用，其 公開內(nèi)容在此全部引用作為參考。序列表
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<212〉 PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400〉 1
Met Pro Arg 1
Tyr Gly Ala Ser Leu Arg Gin Ser Cys Pro Arg Ser Gly 5 10 15
Arg Glu Gin Gly Gin Asp Gly Thr Ala Gly Ala Pro Gly Leu Leu Trp
20
25 30
Met Gly Leu Val Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ser
35
40 45
Asp Ser Arg Val Uu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu Ser Pro
50
55 60
Gin Gly His Pro Ala Arg L_eu His Arg lie Val Pro Arg Leu Arg Asp
65
70 75 80
Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro lie Cys Lys Gly Leu Phe
85
90 95
Thr Ala lie Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn Val Ala Arg Val
100
105 110
Gly Ser Val Ala lie Lys Leu Cys Asn Uu Uu Lys lie Ala Pro Pro
115
120 125
Ala Val Cys Gin Ser lie Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met Val Glu 130 135 140
Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly Leu Leu
145
150
155 160
Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp lie Phe Ser Ser Trp Asn lie
165
170 175
Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser Pro Pro
180
185 190
Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg lie Uu Phe Leu Thr Asp Leu His
195
200 205
Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala Asp Pro210215220Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg Pro Gly225230235240Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp Leu Pro Leu Arg Thr 2& 250 255Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe Asp Met 260 265 270Val Tyr Trp Thr Gly Asp lie Pro Ala His Asp Val Trp His Gin Thr 275 280 285Arg Gin Asp Gin Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val Thr Ala Leu Val Arg290295300Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val Gly Asn His Glu305310315320Ser lie Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe lie Glu Gly Asn His 325 330 335Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys Ala T卬Glu Pro Trp 340 345 350Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg lie Gly Gly Phe Tyr Ala 355 360 365Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu lie Ser Leu Asn Met Asn Phe370375380Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu lie Asn Ser Thr Asp Pro Ala385390395400Gly Gin Leu Gin Trp Leu Val Gly Glu Leu Gin Ala Ala Glu Asp Arg 405 410 415Gly Asp Lys Val His lie lie Gly His lie Pro Pro Gly His Cys Leu 420 425 430.Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg lie Val Ala Arg Tyr Glu Asn 435' 440 445Thr Leu Ala Ala Gin Phe Phe Gly His Thr His Val Asp Glu Phe Glu 450 455 460Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Uu Ser Arg Pro Leu Ala Val Ala Phe465470475480Leu Ala Pro Ser'Ala Thr Thr Tyr lie Gly Leu Asn Pro Gly Tyr Arg 485 490 495Val Tyr Gin lie Asp Gly Asn Tyr Ser Arg Ser Ser His Val Val Leu 500 505 510Asp His Glu Thr Tvr Il.e Leu Asn Leu Thr Gin Ala Asn lie Pro Gly 515 520 525Ala lie Pro His Trp Gin Leu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr Tyr Gly530535 540Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu Val Tyr Arg Met545550 555 560Arg Gly Asp Met Gin Uu Phe Gin Thr Phe Trp Phe Leu Tyr His Lys 565 570 575Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu Ala Thr 580 5& 590Leu.Cys Ala Gin Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu Cys Arg595600 605His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gin Ser Leu Trp Pro610Arg Pro Leu Phe Cys 625〈210〉 2<211> 629<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<400〉 2615 620Met Pro Arg Tyr Gly Ala Ser Leu Arg Gin Ser Cys Pro Arg Ser Gly 15 10 15Arg Glu Gin Gly Gin Asp Gly Thr Ala Gly Ala Pro Gly Leu Leu Trp 20 25 30Met Gly Leu Val Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ser '35 40 45Asp Ser Arg Val Leu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu Ser Pro 50 '55 60Gin Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg lie Val Pro Arg Leu Arg Asp65 707580Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro lie Cys Lys Gly Uu Phe 85 90 95Thr Ala lie Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn Val Ala Arg Val100 105110Gly Ser Val Ala lie Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys lie Ala Pro Pro115 120125Ala Val Cys Gin Ser lie Val His Uu Phe Glu Asp Asp Met Val Glu130 135140Val Trp Arg Arg Ser Val Uu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly Leu Leu145 150155160Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp lie Phe Ser Ser Trp Asn lie 165 17G 175Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser Pro Pro 180 185 190Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg lie Leu Phe Leu Thr Asp Leu His 195 200 205Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala Asp Pro 210 215 220Leu Cvs Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg Pro Gly 225 230 235 240Ala Gly Tyr Trp G1y Glu 丁yr Ser Lys Cys Asp乙eu Pro Leu Arg Thr 245 250 255Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu G1y Pro Ala Gly Pro Phe Asp Met 260 265 270Val Tyf Trp Thr Gly Asp lie Pro Ala His Asp Val Trp His Gin Thr 275 280 285Arg Gin Asp Gin Leu Arg Ala Leu Thr Thr Var Thr Ala Leu Val Arg 290 295 300Us Phe Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val Gly Asn His Giu 3b5 310 315 320Ser lie Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe lie Glu Gly Asn His 325 330 335Ser Ser Arg Trp Uu Tyr Glu Ala Met iUa Lys Ala Trp Glu Pro Trp 340 345 350Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg lie Gly Gly Phe Tyr Ala 355 360 365Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Uu lie Ser Leu Asn Met Asn Phe 370 375 380Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu lie Asn Ser Thr Asp Pro Ala 355 390 395 400Gly Gin Leu Gin Trp Leu Val Gly Glu Leu Gin Ala Ala Glu Asp Arg 405 410 415Gly Asp Lys Val His lie lie G1y His lie Pro Pro Gly His Cys Leu ' '420 425 430Lys Ser Trp Ser Trp Asn TVr Tyr Arg lie Val Ala Arg Tyr Glu Asn 435 440 445thr Leu Ala Ala Gin Phe Phe Gly His Thr His Val Asp Glu Phe Glu 455 460Leu 450Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Uu Ser Arg Pro Leu Ala Val Ala Phe465 470 475 480Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr lie Gly Uu Asn Pro Gly Tyr Leu485490 495Val Tyr Gin lie Asp Gly Asn Tyr Ser Arg Ser Ser His Val Val Leu500505 510Asp His Glu Thr Tyr lie Leu Asn Uu Thr Gin Ala Asn lie Pro Gly515 520525Ala lie Pro His Trp Gin Leu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr Tyr Gly530 535540Leu Pro Asn 丁hr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu Val Tyr Arg Met545 550555 560Arg Gly Asp Met Gin Uu Phe Gin Thr Phe Trp Phe Leu Tyr His Lys565570 575Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu Ala Thr580585 590Leu Cys Ala Gin Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu Cys Arg595 600605His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gin Ser Leu Trp Pro610 615Arg Pro Leu Phe Cys 625<210〉 3〈211〉 629〈212〉 PRT<213> 人(Homo sapiens)620<400> 3Met 1Pro ArgTyr Gly Ala Ser Leu 5Arg Gin Ser Cys Pro Arg Ser Gly 10 15Arg Glu Gin Gly Gin Asp Gly .Thr Ala Gly Ala Pro Gly Leu Leu Trp2025 30Met Gly Leu Val Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ser3540 45Asp Ser Arg Val Uu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu Ser Pro5055 60Gin Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg lie Val Pro Arg Leu Arg Asp6570 75 80Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro lie Cys Lys Gly Leu Phe 85 90 95Thr Ala lie Asn Leu Gly Leu Lys Us Glu Pro Asn Val Ala Arg Val 100 li)5 110Gly Ser Val Ala lie Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys lie Ala Pro Pro 115 1》0 125Ala Val Cys Gin Ser lie Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met Val Glu 130 135 140Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly Leu Leu 145 150 155 ' 160Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp lie Phe Ser Ser Trp Asn lie 165 170 175Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser Pro Pro 180 185 190Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg lie Leu Phe Leu Thr Asp Leu His 195 200 205Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala Asp Pro 210 215 220Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg Pro Gly 225 23打 235 240Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cvs Asp Leu Pro Uu Arg Thr 24b 2S0 255Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe Asp Met 260 265 270Val Tvr Trp Thr Glv Asp lie Pro Ala His Asp Val T卬His Gin Thr '275 280 285Arg Gin 290Asp Gin Leu Arg Ala Leu Thr Thr Vai Thr Ala Pro Val Arg 295 300Lys Phe 305Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val Gly Asn 310 315His Glu320Ser lie Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe lie Glu Gly Asn His 325 330 335Ser Ser Arg Trp Leu Tvr Glu Ala Met Ala Us Ala Trp Glu Pro Trp 340 345 350Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg lie Gly Gly Phe Tyr Ala 355 360 365Uu Ser Pro Tvr Pro Gly Leu Arg匕eu lie Ser Leu Asn Met Asn Phe 370 375 380Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu lie Asn Ser Thr Asp Pro Ala 3& 390 395 400Gly Gin Leu Gin Trp Uu Val Gly Glu Uu Gin Ala Ala Glu八sp Arg 405 410 415Gly Asp Lys Val His lie lie Gly His lie Pro Pro Gly His Cys Leu 420 425 430Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg lie Val Ala Arg Tyr Glu Asn 435 440 445Thr Leu Ala Ala Gin Phe Phe Gly His Thr His Val Asp Glu Phe Glu 450 455 460Val Phe Tyr Asp Glu Giu Thr Leu Ser Arg Pro Leu Ala Val Ala Phe 465 470 475 480Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr lie Gly Leu Asn Pro Gly Tyr Arg 485 490 495Val Tyr Gin lie Asp Gly Asn Tyr Ser Arg Ser Ser His Val Val Leu 500 505 510Asp His Glu Thr Tyr lie Leu Asn Leu Thr Gin Ala Asn lie Pro Gly 515 520 525Ala lie Pro His Trp Gin Leu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr Tyr Gly 530 535 540丄eu Pro Asn Thr Uu Pro Thr Als Trp His Asn Leu Val Tyr Arg Met 545 550 555 560Arg G1y Asp Met Gin Leu Phe Gin Thr Phe Trp Phe Uu Tyr His Lys 565 570 575Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu Ala Thr 580 585 590Leu Cys Ala Gin Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu Cys Arg '595 600 605His Uu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gin Ser Leu Trp Pro 610 615 620Arg Pro Leu Phe Cys 625<210> 4〈211〉 628<212〉 PRT<213> 人(Homo sapiens)<400> 4Met Pro Arg Tyr Gly Ala Ser Leu Arg Gin Ser Cys Pro Arg Ser Gly 1 5 10 15Arg Glu Gin Gly Gin Asp Gly Thr Ala Gly Ala Pro Gly Leu Leu Trp 20' 25 30Met Gly Leu Val Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ser '35 40 45Asp Ser Arg Val Uu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu Ser Pro 50 55 60Gin Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg lie Val Pro Arg Leu Arg Asp 65 70 75 80Val Phe G]y Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro lie Cys Lys Gly Leu Phe 85 90 95丁hr Ala lie Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn Val Ala Arg Val 100 lt)5 110Glv Ser Val A〗a lie Lys Leu Cys Asn Leu Leu Us lie Ala Pro Pro 115 120 125Ala Val Cys Gin Ser lie Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met Val Glu 130 135 140Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly Leu Leu 145 150 155 160Leu Gly Ser Thr Oys Gly His Trp Asp lie Phe Ser Ser Trp Asn lie 比5 170 175Ser Leu Pro Thr Vsl Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser Pro Pro i80 185 190Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg lie Leu Phe Leu Thr Asp Leu His 19^ 200 205Trp Asp His Asp Tvr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala Asp Pro 210 215 220Leu Cys225Cys Arg Arg Gly Ser Gly Uu Pro Pro Ala Ser Arg 230 235Pro G1y 240Ala Gly Tvr Trp Gly Glu Tyr Ser Us Cys Asp Uu Pro Leu ' 245 250Arg Thr 255Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Ptie Asp Met 260 265 270Val Tyr Trp Thr Gly Asp lie Pro Ala His Asp Val Trp His Gin Thr '275 280 285Arg Gin Asp Gin Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val Thr Ala Leu Val Arg 290 295 300Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val Gly Asn His Glu 3b5 310 315 320Ser lie Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe lie Glu Gly Asn His 325 330 335Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu 340Ala Met 345Ala Lys Ala Trp Glu Pro Trp 350Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg lie Gly Gly Phe Tyr Ala 355 360 365Thr I>eu 360Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu lie Ser Leu Asn Met Asn Phe 370 375 380Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu lie Asn Ser Thr Asp Pro Ala 385 390 395 400Gly Gin Leu Gin Trp Leu Val Gly Glu Leu Gin Ala Ala Glu Asp Arg 405 410 415Gly Asp Us Val His lie lie Gly His lie Pro Pro Gly His Cys Leu 420 425 430Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg lie Val Ala Arg Tyr Glu Asn 435 .440 445Thr Leu Ala Ala Gin Phe Phe Gly His Thr His Val Asp Glu Phe Glu 450 455 460Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro Leu Ala Val Ala Phe 465 470 475 480Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr lie Gly Leu Asn Pro Gly Tyr Arg 485 490 艦Val Tyr Gin lie Asp Gly Asn Tyr Ser Arg Ser Ser His Val Val Leu 500 505 510Asp His Glu Thr Tyr lie Leu Asn Leu Thr Gin Ala Asn lie Pro Gly 515 520 525Ala lie Pro His Trp Gin Uu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr Tyr Gly 530 535 540Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu Val Tyr Arg Met 545 550 555 560Arg Gly Asp Met Gin Leu Phe Gin Thr Phe Trp Phe Leu Tyr His Lys ' 565 570 575Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu Ala Thr 580 585 590Uu Cys Ala Gin Uu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu Cys His 595 600 605leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gin Ser Leu Trp Pro Arg 610 615 620Pro Leu Phe Cys 62權(quán)利要求
1.一種提高酸性鞘磷脂酶(ASM)蛋白質(zhì)活性的方法，該方法包括將該蛋白質(zhì)在藥物可接受的載體中接觸有效量的一種為神經(jīng)酰胺或鞘磷脂類似物的化合物，或為磷核苷酸類似物的化合物。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述鞘磷脂類似物化合物具有下式I:j問-o-0 r3 其中每一個R如果存在則獨(dú)立地是任選取代的Cwo烷基、鹵素、 N02、 CN、 0H、 Cw烷氧基；R!、 R2和R3獨(dú)立地是H、 Cw。烷基、 芳基或芳烷基；n是0-5, m是l-3。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述鞘磷脂類似物化合物具有下式<formula>formula see original document page 2</formula>其中R!、 R2、 R3和m如上所述定義，R4是Cuj-2o烷基，R5和R 獨(dú)立地是H、 Cwo烷基、芳基或芳烷基。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)酰胺類似物化合物具有下式<formula>formula see original document page 2</formula>其中Rn如上所述定義，R7是H或OH, Rs是H、氧、Cw。烷基、芳基或芳烷基，R9是C^.2。烷基。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述化合物是D-MAPP,由以下結(jié)構(gòu) 代表
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是具有以下結(jié)構(gòu)的核苷酸 類似物
7. 權(quán)利要求1的方法，其中所述ASM蛋白是一種突變ASM蛋白。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述突變蛋白是L!3(^P(SEQIDNO:3) 。
9. 權(quán)利要求7的方法，其中所述突變蛋白是R496L(SEQIDNO:2)。
10. 權(quán)利要求7的方法，其中所述突變蛋白是AR608 (SEQ ID NO:4) 。
11. 權(quán)利要求1的方法，其中所述ASM蛋白是野生型ASM蛋白。
12. 權(quán)利要求1的方法，其中所述ASM是全長ASM。
13. 權(quán)利要求1的方法，其中所述ASM是具有酶活性的截短的 ASM。
14. 一種延長用于和藥學(xué)上可接受的載體一起施用于個體的純化 ASM蛋白的半壽期和活性的方法，該方法包括將ASM蛋白接觸有效 量的一種為神經(jīng)酰胺或鞘磷脂類似物的化合物，或為核苷酸類似物的 化合物，其中所述化合物是ASM的抑制劑。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述化合物是一種鞘磷脂類似物并 且具有下式I:<formula>formula see original document page 4</formula>其中每一個R如果存在則獨(dú)立地是任選取代的Cwo烷基、鹵素、 N02、 CN、 OH、 C"烷氧基；R^、 R2和R3獨(dú)立地是H、 Cw。烷基、 芳基或芳烷基；n是0-5， m是l-3。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述化合物是鞘磷脂類似物并且具有下式n:<formula>formula see original document page 4</formula>其中Rp R2、 R3和m如上所述定義，R4是Cu)-2o烷基，Rs和R6 獨(dú)立地是H、 Cw。烷基、芳基或芳烷基。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述化合物是神經(jīng)酰胺類似物并且 具有下式III:其中Rn如上所述定義，R7是H或OH, Rs是H、氧、Cw。烷基、芳基或芳烷基，R9是d。.2Q垸基。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述化合物是D-MAPP，由以下結(jié) 構(gòu)代表<formula>formula see original document page 5</formula>
19.權(quán)利要求14的方法，其中所述化合物是具有以下結(jié)構(gòu)的核苷 酸類似物跳<formula>formula see original document page 5</formula>
20. 權(quán)利要求14的方法，其中所述ASM蛋白與所述化合物共施
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述共施用在同一制劑中。
22. —種提高宿主細(xì)胞產(chǎn)生重組ASM蛋白的方法，其中該宿主 細(xì)胞包含表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含編碼該重組ASM蛋白的核酸序 列，該方法包括在含有有效量的神經(jīng)酰胺或鞘磷脂類似物或為核苷酸 類似物的化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，其中所述化合物是ASM 的抑制劑。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述化合物是鞘磷脂類似物并且具 有下式I:<formula>formula see original document page 6</formula>其中每一個R如果存在則獨(dú)立地是任選取代的Cwo烷基、鹵素、 N02、 CN、 OH、 d.6烷氧基；R!、 R2和R3獨(dú)立地是H、 Cwo烷基、 芳基或芳烷基；n是0-5， m是l-3。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述化合物是鞘磷脂類似物并且具 有下式II:<formula>formula see original document page 6</formula>其中R!、 R2、 R3和m如上所述定義，R4是C,o-2o烷基，R5和Re 獨(dú)立地是H、 Cwo烷基、芳基或芳烷基。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所述化合物是神經(jīng)酰胺類似物并且 具有下式III:<formula>formula see original document page 7</formula>其中Rn如上述定義，R7是H或OH，R8是H、氧、C1-10烷基、芳基或芳烷基，R9是C10-20烷基。
26.權(quán)利要求25的方法，基中所述化合物是D-MAPP,由以下結(jié)構(gòu)代表<formula>formula see original document page 7</formula>
27.權(quán)利要求22的方法，其中所述化合物是具有以下結(jié)構(gòu)的核苷 酸類似物跳<formula>formula see original document page 7</formula>
28.純化的野生型ASM以及ASM活性」提高量的為神經(jīng)酰胺或鞘 磷脂類似物的化合物、或為核苷酸類似物的化合物在制備治療患尼曼 -皮克病個體的藥物中的用途，其中所述化合物是ASM的抑制劑。<formula>formula see original document page 7</formula>其中Rn如上所述定義，R7是H或OH， Rs是H、氧、C^烷基、芳基或芳坑基，R9是Co_20棍基。
29.權(quán)利要求28的用途，其中所述化合物是鞘磷脂類似物并且具 有下式I:<formula>formula see original document page 8</formula>其中每一個R如果存在則獨(dú)立地是任選取代的Cwo烷基、鹵素、 N02、 CN、 OH、 C^烷氧基；R2和R3獨(dú)立地是H、 Cw。烷基、 芳基或芳烷基；n是0-5， m是l-3。
30.權(quán)利要求28的用途，其中所述化合物是鞘磷脂類似物并且具 有下式II:<formula>formula see original document page 8</formula>其中R4、 R2、 R3和m如上所述定義，R4是C!o-2o烷基，R5和& 獨(dú)立地是H、 Cw。烷基、芳基或芳烷基。
31.權(quán)利要求28的用途，其中所述化合物是神經(jīng)酰胺類似物并且 具有下式III-.<formula>formula see original document page 8</formula>其中Rn如上所述定義，R7是H或OH, Rs是H、氧、Cwo烷基、芳基或芳烷基，R9是C^20烷基。
32.權(quán)利要求31的用途，其中所述化合物是D-MAPP，由以下結(jié) 構(gòu)代表<formula>formula see original document page 9</formula>
33.權(quán)利要求28的用途，其中所述化合物是具有以下結(jié)構(gòu)的核苷 酸類似物<formula>formula see original document page 9</formula>
34. 權(quán)利要求28的用途，其中所述個體患有A型尼曼-皮克病。
35. 權(quán)利要求28的用途，其中所述個體患有B型尼曼-皮克病。
36. 權(quán)利要求28的用途，其中所述個體具有編碼突變ASM蛋白 的突變ASM基因。
37. 權(quán)利要求36的用途，其中所述突變蛋白是L302P (SEQ ID NO:3) 。
38. 權(quán)利要求36的用途，其中所述突變蛋白是R496L (SEQ ID NO: 2)。
39. 權(quán)利要求36的用途，其中所述突變蛋白是AR608 (SEQIDNO:4) 。
40. 有效量的為神經(jīng)酰胺或鞘磷脂類似物的化合物、或為核苷酸類 似物的化合物在制備用于提高個體細(xì)胞中重組ASM蛋白體內(nèi)表達(dá)水平的藥物中的用途，其中所述化合物是ASM的抑制劑，所述蛋白由已經(jīng)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)載體表達(dá)。
41.權(quán)利要求40的用途，其中所述化合物是鞘磷脂類似物并且具 有下式I:<formula>formula see original document page 10</formula>其中每一個R如果存在則獨(dú)立地是任選取代的d-k)烷基、鹵素、N02、 CN、 OH、 Cw烷氧基；Ri、 R2和R3獨(dú)立地是H、 Cw。烷基、 芳基或芳烷基；n是0-5， m是l-3。
42.權(quán)利要求40的用途，其中所述化合物是鞘磷脂類似物并且具 有下式II:<formula>formula see original document page 10</formula>其中Rp R2、 R3和m如上所述定義，R4是Cu)-2o烷基，Rs和R^ 獨(dú)立地是H、 Cw。烷基、芳基或芳烷基。
43.權(quán)利要求40的用途，其中所述化合物是神經(jīng)酰胺類似物并且 具有下式III:<formula>formula see original document page 10</formula>其中Rn如上所述定義，R7是H或OH, Rs是H、氧、Cwo烷基'芳基或芳烷基，R9是Cu).20烷基。
44.權(quán)利要求43的用途，其中所述化合物是D-MAPP,由以下結(jié) 構(gòu)代表c筑
45.權(quán)利要求40的用途，其中所述化合物是具有以下結(jié)構(gòu)的核苷 酸類似物<formula>formula see original document page 11</formula>其中所述載體是病毒載體。 其中所述病毒載體是腺病毒載體。其中所述個體具有編碼突變ASM蛋白
46. 權(quán)利要求40的用途
47. 權(quán)利要求40的用途
48. 權(quán)利要求40的用途 的突變ASM基因。
49. 權(quán)利要求48的用途，其中所述突變蛋白是L302 (SEQ ID NO:3) 。
50. 權(quán)利要求48的用途，其中所述突變蛋白是R496L (SEQ ID NO: 2)。
51. 權(quán)利要求48的用途，其中所述突變蛋白是AR608 (SEQIDNO:4) 。
52. ASM活性提高量的為神經(jīng)酰胺或鞘磷脂類似物的化合物、或 為核苷酸類似物的化合物在制備用于治療已患尼曼-皮克病個體或者 在遺傳學(xué)上易發(fā)展為尼曼-皮克病個體的藥物中的用途，其中所述化 合物是ASM的抑制劑。
53. 權(quán)利要求52的用途，其中所述化合物是下式I的鞘磷脂類似 物化合物<formula>formula see original document page 12</formula>|其中每一個R如果存在則獨(dú)立地是任選取代的Cwo垸基、鹵素、 N02、 CN、 0H、 Cw烷氧基；R!、 R2和R3獨(dú)立地是H、 Cwo烷基、 芳基或芳烷基；n是0-5， m是l-3。
54.權(quán)利要求52的用途，其中所述化合物是下式II的鞘磷脂類 似、物:<formula>formula see original document page 12</formula>3其中R" R2、 R3和m如上所述定義，R4是Cn)-2o烷基，Rs和Re 獨(dú)立地是H、 Cwo烷基、芳基或芳烷基。
55.權(quán)利要求52的用途，其中所述化合物是下式III的神經(jīng)酰胺類似物<formula>formula see original document page 12</formula>其中Rn如上所述定義，R7是H或OH， Rs是H、氧、Cwo烷基、芳基或芳烷基，R9是Cu).20烷基。
56.權(quán)利要求55的用途，其中所述化合物是D-MAPP,由以下結(jié) 構(gòu)代表<formula>formula see original document page 13</formula>
57.權(quán)利要求52的用途，其中所述化合物是具有以下結(jié)構(gòu)的核苷 酸類似物<formula>formula see original document page 13</formula>
58. 權(quán)利要求52的用途，其中所述個體具有編碼突變ASM蛋白 的突變ASM基因。
59. 權(quán)利要求58的用途，其中所述突變蛋白是L302 (SEQ ID NO:3) 。
60. 權(quán)利要求58的用途，其中所述突變蛋白是R"6L (SEQ ID NO: 2)。
61. 權(quán)利要求58的用途，其中所述突變蛋白是AR608 (SEQ ID NO:
全文摘要
本發(fā)明提供一種治療患酸性鞘磷脂酶缺陷型尼曼-皮克病(即A型或B型尼曼-皮克病)個體的方法，是通過施用小分子作為與該病相關(guān)的缺陷酸性鞘磷脂酶(ASM)的特異性分子“陪伴分子”。該分子是神經(jīng)酰胺、鞘磷脂或磷核苷酸的類似物。
文檔編號A61K31/685GK101214249SQ200710153520
公開日2008年7月9日 申請日期2004年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月25日
發(fā)明者愛德華·H·舒克曼, 羅伯特·J·德斯尼克 申請人:紐約大學(xué)西奈山醫(yī)學(xué)院