專利名稱：一種修飾的重組人內(nèi)皮抑素及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物制品制藥技術領域，涉及一種修飾的重組人內(nèi)皮抑素及其應用。
背景技術：
1971年，F(xiàn)olkman教授提出"腫瘤的生長依賴于新生血管生成"這一觀點，通過 阻斷新生血管生成，就有可能控制腫瘤生長，達到遏制腫瘤侵襲、復發(fā)、轉移的目的， 從此開創(chuàng)了腫瘤治療的新領域。
1997年，哈佛大學O'Reilly等發(fā)現(xiàn)小鼠血管內(nèi)皮瘤細胞的培養(yǎng)基具有內(nèi)皮細胞抑制 作用，通過純化發(fā)現(xiàn)該活性物質在一定濃度范圍內(nèi)(100ng/ml~600ng/ml)特異性對內(nèi)皮 細胞表現(xiàn)出劑量依從的生長抑制作用。通過N端氨基酸測序表明該物質為膠原xvm的C 末端片段，分子量20kD左右，這個蛋白就被命名為內(nèi)皮抑素(Endostatin， ES)。
研究表明內(nèi)皮抑素能夠有效控制非小細胞性肺癌、結腸癌、腦膠質瘤、纖維瘤、間 皮瘤及淋巴瘤等各種實體瘤的生長、浸潤和轉移。目前，內(nèi)皮抑素的獲得都是通過基因 工程的方法。由于真菌表達內(nèi)皮抑素成本太高，人們更傾向于利用大腸桿菌作為表達體 系，但這樣表達出的蛋白存在復性率低等問題。為此，人們開始嘗試對天然內(nèi)皮抑素進 行結構改造。其中羅永章等在天然Endostatin的N末端添加了9個氨基酸，不僅使ES穩(wěn) 定性提高，半衰期延長，而且生物活性增加，蛋白的復性率也高于一般生產(chǎn)方法。該藥 物已正式上市，命名為恩度(Endostar)。所生產(chǎn)的重組人內(nèi)皮抑制素由192個氨基酸構
成，其氨基酸序列為
(M)GGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGL AGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVP匿LKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIF SFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLL GQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK,其中當由大腸桿菌表達時其N末端的Met有時 會被部分刪除。
ni期臨床實驗表明改造后的內(nèi)皮抑素與化療藥物NP聯(lián)用可能有一定的協(xié)同作用， 可延長患者的腫瘤進展時間。
臨床實驗證實內(nèi)皮抑素毒副作用很小，適合與放療或化療聯(lián)用。但是內(nèi)皮抑素作為 小分子蛋白，性質不穩(wěn)定，有研究表明，內(nèi)皮抑素在缺氧條件下容易降解，當內(nèi)皮抑素 與內(nèi)皮細胞在低氧環(huán)境下共孵育48小時后，含量會下降20%左右。而腫瘤內(nèi)部恰是低 氧環(huán)境，對于其活性的發(fā)揮很不利。另一方面，目前Endostar臨床用藥量很大，為 7.5mg/m2，需要每天靜脈滴注3 4小時完成給藥。實驗表明，給藥方式為腹腔注射時， 內(nèi)皮抑素在2小時內(nèi)清除。這些現(xiàn)象表明，內(nèi)皮抑素在進入體內(nèi)后，尤其是在發(fā)揮藥效 的腫瘤局部可能會被蛋白水解酶水解。如何對蛋白分子進行保護，防止酶解，降低清除 率從而減少給藥劑量是急待解決的問題。
聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是一種安全的、無活性、無毒的聚合物。通 過共價連接至蛋白質上進行化學修飾，聚乙二醇化(pegylation)在保留天然蛋白質的內(nèi) 在生物學活性的同時，能有效地克服蛋白質類藥物在臨床應用中的一些缺點，如可以 提高血漿半衰期，增強生物利用度，減低蛋白質免疫原性、提高藥物療效及安全性等。 目前為止，成功上市的PEG修飾蛋白多肽藥物有酰苷脫胺酶(Adagen"、天冬酰胺酶 (Oncaspar )、干擾素a-2b(PEG-intron )、干擾素a-2a(Pegasys⑧)等，而更有尿酸酶、水蛭 素、白介素-2、白介素-6等20多種藥物正進行臨床研究。
在蛋白質PEG化過程中，活化的PEG分子偶聯(lián)到蛋白分子中的自由氨基上，主要 是Lys上。由于蛋白質鏈中自由氨基不只一個，反應產(chǎn)物中不僅存在單分子、雙分子甚 至三分子等多類修飾產(chǎn)物，而且各類修飾產(chǎn)物中還包括多種異構體。與單分子修飾產(chǎn)物 相比，多分子修飾產(chǎn)物活性損失大，不僅浪費了反應底物，而且降低了反應產(chǎn)物的總體 活性。通過控制反應條件和采用純化手段可以克服多分子修飾產(chǎn)物的問題，而獲得單分 子修飾產(chǎn)物。但是單分子修飾還存在異構體的問題，異構體在生物活性上可能存在較大 差異且異構體的混合物通常很難進行純化。所以最好的是能通過控制反應條件，實現(xiàn)定 點修飾，以幫助產(chǎn)物的純化和性質研究。而且定點修飾對蛋白活性的保持更為有利。 Kinstler利用N末端的a氨基比賴氨酸的氨基有更低的pKa值發(fā)明了一種方法。用PEG 乙醛修飾粒細胞集落刺激因子(G-CSF)得到了Pegfilgrastin 。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種修飾的重組人內(nèi)皮抑素 CH30-(CH2CH20)m-CH2CH2CH2- NaH-Endostar，使得Endostar在體內(nèi)的穩(wěn)定性增強，從 而可以提高有效血藥濃度，延長半衰期，降低給藥劑量。CH30-(CH2CH20)m-CH2CH2CH2-的重均分子量在20kD 40kD，優(yōu)選CH30-(CH2CH20)m-CH2CH2CH2-的重均分子量為
20kD (以下采用m=20kD的方式表示)，另一優(yōu)選CH30-(CH2CH20)m-CH2CH2CH2-的重 均分子量為40kD (以下采用m-40kD的方式表示)，分散度《1.2，優(yōu)選分散度為1.1。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述修飾的重組人內(nèi)皮抑素 CH30-(CH2CH20)m-CH2CH2CH2- NaH-Endostar在制備抗腫瘤藥中的應用。
本發(fā)明的目的是通過下列措施實現(xiàn)的
1、 Endostar的N-末端化學修飾。反應式為
NaCNBH3
CH30-(CH2CH20)m-CH2CH2CH(OCH2CH3)2+H2Na-Endostar -^
CH30-(CH2CH20)m-CH2CH2CH2- NaH-Endostar;
4 NaCNBH3
或CH30-(CH2CH20)m-CH2CH2CHO+H2Na-Endostar -
CH30-(CH2CH20)m-CH2CH2CH2- NaH-Endostar。
(1) Endostar的來源本發(fā)明中所用的重組人血管內(nèi)皮抑素是來自江蘇先聲麥得 津生物制藥有限公司。是大腸桿菌表達的N末端帶有(Met) GlyGlyXaa HisHisHisHisHis 附加氨基酸序列的Endostatin,其中Xaa代表中性氨基酸或不存在，當由大腸桿菌表達 時其N末端的Met有時會被部分刪除，分子量為21kD。
(2) 本發(fā)明中所用的重組人血管內(nèi)皮抑素和單甲基聚乙二醇衍生物在還原劑氰基 硼氫化鈉存在的條件下(終濃度10mM 30mM),于0。C 25。C反應10h 40h,生成 CH30-(CH2CH20)m-CH2CH2CH2-NaH-Endostar。
本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明提供的修飾的重組人內(nèi)皮抑素
(CH30-(CH2CH20)m-CH2CH2CH2-NaH-Endostar)，具有下列優(yōu)點
(1) 與Endostar相比，CH30-(CH2CH20)m-CH2CH2CH2-NaH-Endostar的體內(nèi)有效 血藥濃度更高；
(2) 與Endostar相比，CH30-(CH2CH20)m-CH2CH2CH2-NaH-Endostar的抗內(nèi)皮細 胞增殖活性顯著增加；
(3) 與Endostar相比，CH30-(CH2CH20)m-CH2CH2CH2-NaH-Endostar的體內(nèi)半衰 期更長；
(4) 與Endostar相比，CH30-(CH2CH20)m-CH2CH2CH2-NaH-Endostar的AUC更大。 上述優(yōu)點表明，Endostar經(jīng)修飾后增強了體內(nèi)穩(wěn)定性，提高了血藥濃度，延長了半
衰期，抗內(nèi)皮細胞增殖活性顯著增加，從而能夠減少給藥劑量，降低給藥頻率，減輕病
人的身體上痛苦，同時還能減輕病人的經(jīng)濟負擔。該
CH30-(CH2CH20)m-CH2CH2CH2-NaH-Endostar可用于制備抗腫瘤藥物。


圖1顯示的是CH3O-(CH2CH2O)20kD-CH2CH2CH(OCH2CH3)2與Endostar的偶聯(lián)。圖 中1 4號電泳道分別對應1、分子量分別為14400， 20100, 31000， 43000， 66200, 97400 的標準蛋白；2 、 Endostar ;3 、反應混合物；4 、 CH3O-(CH2CH2O)20kD-CH2CH2CH(OCH2CH3)2。
圖2顯示的是CH30-(CH2CH20)2okD-CH2CH2CH2-NaH-Endostar的純化層析圖。
圖3顯示的是純化后CH30-(CH2CH20)2okD-CH2CH2CH2- NaH-Endostar的SDS-PAGE 鑒定。圖中1 4號電泳道分別對應1、純化后的CH30-(CH2CH20)2()kD-CH2CH2CH2-NaH-Endostar; 2、反應混合物；3、 CH30-(CH2CH20)2okD-CH2CH2CH(OCH2CH3)2; 4、 分子量分別為14400， 20100， 31000， 43000， 66200， 97400的標準蛋白。
圖4顯示的CH30-(CH2CH20)4()kD-CH2CH2CHO與Endostar的偶聯(lián)。圖中1 5號電 泳道分別對應1 4、反應混合物；5、 CH30-(CH2CH20)4()kD-CH2CH2CHO。
圖5顯示的是CH30-(CH2CH20)4(MrCH2CH2CH2-NaH-Endostar的純化層析圖。
圖6顯示的是純化后CH3O-(CH2CH2O)40kD-CH2CH2CH2-NaH-Endostar的SDS-PAGE 鑒定。圖中1 3號電泳道分別對應1 2、純化后的 CH3O-(CH2CH2O)40kD-CH2CH2CHrNaH-Endostar; 3、分子量分別為14400， 20100， 31000， 43000， 66200， 97400的標準蛋白。
圖7顯示的是Endostar修飾前后的血藥濃度和時間的關系曲線。
圖8顯示的是Endostar修飾前后抗內(nèi)皮細胞增殖活性。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不是對本發(fā)明保護范圍的限制。 實施例1 、重均分子量為20kd的CH30-(CH2CH20)2()kD-CH2CH2CH(OCH2CH3)2和
Endostar的偶聯(lián)物(簡寫為PEG2o-ENDO)的制備
(1) CH3O-(CH2CH2O)20kD-CH2CH2CH(OCH2CH3)2與Endostar的偶聯(lián) 20ml Endostar原液(PH5.0~5.5， HAC/NaAC Buffer,蛋白質含量為5mg/ml)，加入
還原劑氰基硼氫化鈉NaCNBH3至終濃度為20mM，加入單甲氧基聚乙二醇-3,3-二乙氧
基丙烷lOOmg，使其與Endostar的摩爾比為1: 1，在4'C攪拌過夜，即形成PEG2(rENDO
修飾物，產(chǎn)物用SDS-PAGE鑒定，鑒定結果見圖l。
(2) PEG2(rENDO的純化
上述反應產(chǎn)物用CM-Sepharose柱，AKTA層析儀分離、純化。樣品以20mM， pH7.0 的PB緩沖液稀釋后上樣，以20mM， pH7.0的PB緩沖液平衡至基線，再分別以含O.IM、 0.2M、 0.5M NaCl的20mM， pH7.0的PB緩沖液階段洗脫(圖2)，分部收集器收集， 修飾產(chǎn)物用SDS-PAGE鑒定。(圖3)
實施例2、重均分子量為40kd的CH30-(CH2CH20)4()kD-CH2CH2CHO和Endostar的 偶聯(lián)物(簡寫為PEG4c-ENDO)的制備
(1) CH3O-(CH2CH2O)40kD-CH2CH2CHO與Endostar的偶聯(lián)
20ml Endostar原液(PH5.0~5.5， HAC/NaAC Buffer,蛋白質含量為5mg/ml)，加入 還原劑氰基硼氫化鈉NaCNBH3至終濃度為20mM，加入單甲氧基聚乙二醇-3，3-二乙氧 基丙烷400mg，使其與Endostar的摩爾比為1: 2，在4'C攪拌過夜，即形成PEG4Q-ENDO 修飾物，產(chǎn)物用SDS-PAGE鑒定。(圖4)
(2) PEG40-ENDO的純化
上述反應產(chǎn)物用CM—Sepharose柱，AKTA層析儀分離、純化。樣品以20mM， pH7.0 的PB緩沖液稀釋后上樣，以20mM， pH7.0的PB緩沖液平衡至基線，再分別以含0 0.5M NaCl的20mM, pH7.0的PB緩沖液梯度洗脫(圖5),分部收集器收集，修飾產(chǎn) 物用SDS-PAGE鑒定。(圖6)
實施例3、聚乙二醇修飾的重組人內(nèi)皮抑素的藥代動力學研究 將15只雄性SD大鼠隨機分成3組，按4.5mg/kg體重給藥。A組為未修飾的Endostar， B組為PEG20-ENDO, C組為PEG40-ENDO。給藥后5min、 10min、 15min、 30rain、 lh、 4h、 6h、 12h、 24h、 48h、 96h取血，肝素抗凝，血樣立即6000r/min，離心10min，得 到血漿樣品。采用Human Endostatin Protein Accucyte EIA試劑盒測定血漿中樣品的 含量。經(jīng)測定修飾后內(nèi)皮抑素有效血藥濃度提高20倍以上(圖7), Endostar的半衰期 為8小時，PEG20-ENDO的體內(nèi)半衰期為18h， PEG4(rENDO的體內(nèi)半衰期為97h。與 Endostar相比，PEG2C)-ENDO的AUC提高至少10倍，PEG4o-ENDO的AUC提高至少 100倍。
(Endostar的AUC。- =1065.46pg/L*h; PEG20-ENDO的AUC?！? 1133103.46ng/L*h; PEG40-ENDO的AUCh- 19759375. 66ng/L*h)實施例4、聚乙二醇修飾的恩度的生物活性測定
1、 將牛主動脈內(nèi)皮細胞用含10%胎牛血清的1^^1- 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置37 。C、 5%C02 培養(yǎng)箱中，選對數(shù)生長期的細胞用于實驗。
2、 調(diào)細胞濃度(10000個/ml)后分10組接種于96孔板上，每組設5個復孔，置37'C、 5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h待細胞貼壁后，分別加入終濃度為100ng/ml、 25嗎/ml、 6.25ng/ml、 1.56ng/ml、 0.39ng/ml的Endostar、 PEG20-ENDC^nPEG40-ENDO。對照組加含2% FCS的1640 培養(yǎng)基和力B2。/q FCS十bFGF的1640培養(yǎng)基，最后四周孔用含2% FCS的1640培養(yǎng)基封閉。
3、 以MTT法測定每孔的OD值。根據(jù)OD值求出細胞抑制率，計算公式為抑制率(IR)= (對照組OD值均數(shù)-實驗組OD值均數(shù))/對照組OD值均數(shù)。
4、 PEG2o-ENDO和PEG4o-ENDO的抗內(nèi)皮細胞增殖活性有顯著提高，PEG2o-ENDO活 性提高更多。(圖8)
序歹IJ 表
〈110〉江蘇先聲藥物研究有限公司，中國藥科大學，山東先聲麥得津生物制藥有限公司
〈120〉一種修飾的重組人內(nèi)皮抑素及其應用
<160〉 2
<210> 1 〈211> 192 <212〉 PRT <213>人工序列 〈220〉
〈223>大腸桿菌表達的重組人內(nèi)皮抑制素 〈400〉 1
Met Gly Gly Ser His 1 5 Gin Pro Val Leu His 20
Gly Met Arg Gly lie 35
Ala Arg Ala Val Gly 50
Ser Arg Leu Gin Asp 65
Ala Ala Val Pro lie 80
Ser Trp Glu Ala Leu 95
Gly Ala Arg lie Phe 110
Pro Thr Trp Pro Gin 125
Gly Arg Arg Leu Thr 140
Ala Pro Ser Ala Thr 155
Leu Leu Gly Gin Ser 170
Leu Cys lie Glu Asn 185
〈210〉 2 〈211〉 191 〈212〉 PRT
9
His His His His His Ser His Arg Asp Phe
10 15 Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly
25 30 Arg Gly Ala Asp Phe Gin Cys Phe Gin Gin
40 45 Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser
55 60 Leu Tyr Ser lie Val Arg Arg Ala Asp Arg
70 75 Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe Pro
85 90 Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro
訓 105 Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His
115 120 Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn
130 135 Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu
145 150 Gly Gin Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg
160 165 Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr lie Val
175 180 Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys
〈213〉人工序列 <220>
<223>大腸桿菌表達的重組人內(nèi)皮抑制素 <400〉 2
GlyGlySerHisHisHisHisHisHisSerHisArgAspPheGin
51015
ProValLeuHisLeu 20ValAlaLeuAsnSer 25ProLeuSerGlyGly 30
MetArgGlylieArg 35GlyAlaAspPheGin 40CysPheGinGinAla 45
ArgAlaValGlyLeu 50AlaGlyThrPheArg 55AlaPheLeuSerSer 60
ArgLeuGinAspLeu 65TyrSerlieValArg 70ArgAlaAspArgAla 75
AlaValProlieVal 80AsnLeuLysAspGlu 85LeuLeuPheProSer 90
TrpGluAlaLeuPhe 95SerGlySerGluGly 100ProLeuLysProGly 105
AlaArgliePheSer noPheAspGlyLysAsp 115ValLeuArgHisPro 120
ThrTrpProGinLys 125SerValTrpHisGly 130SerAspProAsnGly 135
ArgArgLeuThrGlu 140SerTyrCysGluThr 145TrpArgThrGluAla 150
ProSerAlaThrGly 155GinAlaSerSerLeu 160LeuGlyGlyArgLeu 165
LeuGlyGinSerAla 170AlaSerCysHisHis 175AlaTyrlieValLeu 180
CyslieGluAsnSerPheMetThrAla SerLys
185190
權利要求
1、一種修飾的重組人內(nèi)皮抑制素，其特征在于其結構為CH3O-(CH2CH2O)m-CH2CH2CH2-NαH-Endostar，其中CH3O-(CH2CH2O)m-CH2CH2CH2-的重均分子量在20kD～40kD。
2、 根據(jù)權利要求1所述的修飾的重組人內(nèi)皮抑制素，其特征在于 CH30-(CH2CH20)m-CH2CH2CH2-的重均分子量為20kD。
3、 根據(jù)權利要求1所述的修飾的重組人內(nèi)皮抑制素，其特征在于 CH30-(CH2CH20)m-CH2CH2CH2-的重均分子量為40kD。
4、 權利要求1至3中任一項所述的修飾的重組人內(nèi)皮抑制素在制備抗腫瘤藥物中 的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種修飾的重組人內(nèi)皮抑素及其應用。該修飾的重組人內(nèi)皮抑制素結構為CH₃O-(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂CH₂-N^αH-Endostar，中CH₃O-(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂CH₂-的重均分子量在20kD～40kD。該修飾的重組人內(nèi)皮抑制素增強了體內(nèi)穩(wěn)定性，提高了血藥濃度，延長了半衰期，抗內(nèi)皮細胞增殖活性顯著增加，從而能夠減少給藥劑量，降低給藥頻率，減輕病人身體痛苦及經(jīng)濟負擔。該修飾的重組人內(nèi)皮抑制素可用于制備抗腫瘤藥物。
文檔編號A61K38/17GK101381413SQ20071013156
公開日2009年3月11日 申請日期2007年9月5日 優(yōu)先權日2007年9月5日
發(fā)明者姚文兵, 李海瑞, 浤 田, 玥 童, 許向陽, 高向東 申請人:江蘇先聲藥物研究有限公司;中國藥科大學;山東先聲麥得津生物制藥有限公司