專利名稱：7-羥基-3-[(4-羥基)-3-(3-甲基-丁基-2-烯基)苯基]-4h-1-苯并吡喃-4-酮的用途的制作方法
7-羥基-3-[(4-羥基)-3-(3-甲基-丁基-2-烯基)苯基]-4H-l-苯并吡喃-4-酮的用途技術(shù)領(lǐng)本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及天然化合物在制備抗腫瘤藥，骨質(zhì)疏松，老年癡呆藥物方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雌激素是一種由內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的類固醇類激素，它在生殖系統(tǒng)、骨組織、心血管、免 疫系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都發(fā)揮著重要的作用[J Cell Sci， 2003， 116 (4):585-586]。雌激素信 號(hào)傳遞系統(tǒng)在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡過(guò)程中都起到很大的作用。雌激素依賴型腫瘤，如 乳腺癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌等的發(fā)生和發(fā)展都與雌激素有著密切的關(guān)系[J Steroid Biochem Mol Biol， 2002, 81 (1):1-24, J Mammary Gland Biol Neoplasia, 1998, 3(1):49-61, Curr. Drug Targets Immune Endocr. Metabol. Disord, 2001, 1(1):1-12, Cancer Res, 1998,58(23):5367陽(yáng)5373， J Psychiatry Neurosci， 2002,27(1): 1 -27]，因此對(duì)雌激素受體的研究具有可以指導(dǎo)抗雌激素和雌 激素受體拮抗劑等藥物的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，并對(duì)雌激素依賴型腫瘤等疾病的治療具有重要的意義 [Nat Rev Drug Discov.， 2004,3(11):950-964]。目前己知的雌激素受體分為a、e兩種亞型。雌激素受體a在1958年被Toft和Gorski 等人[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1966 ，55(6) :1574-1581]率先從老鼠子宮細(xì)胞中分離得到， 1986年Green [Nature, 1986， 320 (6058): 134-139]和Greene [Science, 1986, 231 (4742): 1150-1154] 等人克隆得到第一個(gè)分子量為66kDa的人雌激素受體ERa ; 1996年，Kuiper等[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93 (12):5925-5930]從大鼠前列腺中克隆得到另一種雌激素受體ERP 。 此后，Mosselman等[FEBS Lett. 1996, 392 (1):49-53]人從人睪丸組織中克隆得到不完整的人 ERP ; Ogawa[Biochem. Biophys. Res. Co腿un. 1998,243(1) :122-126]和Moore等[Biochem Biophys Res Commun, 1998, 247 (1):75-78]人相繼克隆得到完整的人ER e 。
雌激素受體ER a 與ERe亞型具有相同的序列組成[FEBS Lett. 2003, 546: 17-24, Biochem. Soc. Trans. 2003， 31: 56~59];它們都由三個(gè)獨(dú)立但又相互作用的功能區(qū)組成位于N端的A/B區(qū)，中間的C區(qū)， 以及C端的D/E/F區(qū)。N端的A/B區(qū)是一個(gè)不依賴于配體的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)(AF-1)，負(fù)責(zé)與共活 化因子的結(jié)合以及轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)的耙基因(圖1)。 C區(qū)是DNA結(jié)合區(qū)，含有兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，對(duì) 于分子的二聚化以及和特定DNA序列的結(jié)合致關(guān)重要。C端的D/E/F區(qū)是一個(gè)配體結(jié)合區(qū)， 由它介導(dǎo)配體的結(jié)合，受體的二聚化，核定位，以及配體依賴的轉(zhuǎn)錄活化功能(AF-2)。根據(jù)傳統(tǒng)理論，雌激素通過(guò)與細(xì)胞漿或核內(nèi)的雌激素受體(ER)結(jié)合并通過(guò)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn) 錄而發(fā)揮生物功能。近十年來(lái)對(duì)雌激素信號(hào)通路又有了許多新的認(rèn)識(shí)雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 包括細(xì)胞核途徑(經(jīng)典途徑)和細(xì)胞膜途徑(非經(jīng)典途徑)。因此雌激素的生物效應(yīng)，并不完 全依賴于配體-受體的細(xì)胞核激活途徑，還可通過(guò)其他信號(hào)通路發(fā)揮作用。非經(jīng)典雌激素信號(hào) 通路在不同細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)各異，例如17e雌二醇(E2P)可通過(guò)膜信號(hào)通路及P38激酶和 PI3K激酶調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞調(diào)亡，從而對(duì)心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用[Curr. Treat. Options Cardiovasc. Med.2001，3(l):67-79];此外，細(xì)胞內(nèi)幾個(gè)重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路如G-蛋白信號(hào)通路、磷脂酶 C，腺苷酸環(huán)化酶及MAPK等信號(hào)傳導(dǎo)通路都和非經(jīng)典的雌激素膜信號(hào)通路有相互作用[Trends in Endocrinol. Metabol., 2002, 13, 349-354]。人們廣泛認(rèn)為血清中的高水平雌激素通過(guò)經(jīng)典及 非經(jīng)典雌激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑刺激腺管上皮細(xì)胞的持續(xù)增生，從而參與雌激素依賴型腫瘤，如 乳腺腫瘤、子宮內(nèi)膜癌及卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。然而非經(jīng)典雌激素膜信號(hào)通路的作用目前尚 不清楚。Flouriot等[五M50， 2001， 19: 4688-4700]的研究發(fā)現(xiàn)除了全長(zhǎng)的ER-a 66外還有一個(gè)缺 失了第一個(gè)外顯子所編碼的173個(gè)氨基酸的ER- a同源異構(gòu)體。這個(gè)新發(fā)現(xiàn)的分子量為46kDa 的ER- a同源異構(gòu)體被稱為ER- a 46，而較早發(fā)現(xiàn)的分子量為66kDa的ER- a [Nature, 1986， 320 (6058): 134-139; Science, 1986， 231(4742): 1150-1154]就被稱為ER-a 66。該異構(gòu)體缺失了 AF1 功能區(qū)，但保持了其他功能區(qū)的完整性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ER- a 46能競(jìng)爭(zhēng)性抑制ER- a 66的 AF1的功能，而對(duì)AF2的作用沒(méi)有影響。2005年另一個(gè)分子量為36kDa的全新的ER-a的同源異構(gòu)體被發(fā)現(xiàn)并克隆了，并將其命 名為ER- a 36[Biochem. and Biophy. Res. Co腿u. 2005, 336: 1023 - 1027; Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2006， 103 (24):卯63-9068]。該異構(gòu)體從ER- a 66基因的第一個(gè)內(nèi)含子中的啟動(dòng)子開(kāi)始 轉(zhuǎn)錄，經(jīng)一小段外顯子后，利用ER-a66的外顯子2-6進(jìn)行編碼。因此，ER-a 36缺失兩個(gè) 轉(zhuǎn)錄功能區(qū)AF1和AF2，但保留了 DNA結(jié)合功能區(qū)和二聚化功能區(qū)。重要的是ER-a 36激素 配體結(jié)合區(qū)(ligand binding domain)缺失了 8-12螺旋區(qū)(helix)，從而完全改變了其與激素 配體結(jié)合的專一性和親和力(圖l)。因此，ER-a 36具有和ER-a 66及ER-e完全不同的激 素配體結(jié)合能力，為篩選針對(duì)ER- a 36的特異性配體提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。因ER- a 36缺失AF1和AF2功能區(qū)，ER- a 36本身缺失任何轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，但可以有效 地抑制ER-a66介導(dǎo)的經(jīng)典的雌激素核信號(hào)通路。ER-a36主要分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中， 少量分布于細(xì)胞核中。ER-a 36從而可通過(guò)非經(jīng)典的雌激素膜信號(hào)傳導(dǎo)通路并經(jīng)過(guò)MAPK/ERK 信號(hào)傳遞途徑刺激細(xì)胞分裂[PNAS, 2006， 103(24): 9063-9068] 。 ER- a 36在不同的雌激素依賴 型腫瘤，如乳腺癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌中皆有高表達(dá)。因此ER-a36介導(dǎo)的信號(hào)途徑可能 參與了多種雌激素依賴型腫瘤的形成和發(fā)展
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過(guò)對(duì)天然有效成分的研究，提供新的可以調(diào)節(jié)ER-a 36生物傳導(dǎo)系統(tǒng) 的化合物，可以用于抗腫瘤，心臟疾病，骨質(zhì)疏松和老年癡呆的作用.式(I)化合物或式(I)化合物的藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物(I)在制備治療因雌激素受體ER-a引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。所述式(I)化合物或式(I)化合物的藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物是作為雌激素受體ER- a 的調(diào)節(jié)劑。所述藥物包括片劑，口嚼劑，膠囊劑，懸浮液劑，溶液劑。 所述疾病包括腫瘤，骨質(zhì)疏松，哮喘，心臟疾病，老年癡呆。所述腫瘤為乳腺癌，卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌，胃癌，結(jié)腸癌，前列腺癌，血癌或肺癌。所述腫瘤為乳腺癌，前列腺癌.所述腫瘤為乳腺癌.式(I)化合物可從豆科植物補(bǔ)骨脂果實(shí)中提取分離得到(J Asian Nat Prod Res. 2007, 9， 41-4; J Nat Prod. 1998， 61， 362-6; J Nat Prod. 2003, 66, 734; Phytochemistry， 1994， 36,1047-51;補(bǔ)骨脂化學(xué)成分的分離與鑒定， <<云南化工>>2005年02期，陳業(yè)高，于麗麗，黃榮；補(bǔ)骨 脂中活性成分的提取分離與抗癌實(shí)驗(yàn)研究， <<中藥材》2003年03期，郭江寧，吳侯，翁新 楚，顏建華，畢開(kāi)順)。其藥效未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)表明正常乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)少量ER-a36，而在700例乳腺癌的檢查中發(fā)現(xiàn)大約 39. 9%乳腺癌樣品高表達(dá)ER- a 36，且40%雌激素受體陰性的乳腺癌樣品雖不表達(dá)ER- a 66， 但可表達(dá)ER-a36。 ER- a 36也表達(dá)在100% ER-， PR- and HER-2+乳腺癌樣品.上述結(jié)果 表明ER-d36不僅參與ER陽(yáng)性的乳腺癌的形成和發(fā)展，而且可能參與過(guò)去被認(rèn)為是ER陰 性的乳腺癌的形成和發(fā)展。進(jìn)一步研究表明，表達(dá)ER-cx36的乳腺腫瘤預(yù)后極差，并對(duì)抗雌 激素藥物，如他莫昔芬的治療反應(yīng)不強(qiáng)。雌激素受體陰性的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231不表達(dá)ER- a 66，但高表達(dá)ER- a 36，而且 雌激素可促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞快速增殖。因此ER- a 36啟動(dòng)的雌激素促細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可 導(dǎo)致細(xì)胞增殖。同時(shí)表達(dá)ER- a 66和ER- a 36的ER-陽(yáng)性MCF7細(xì)胞，對(duì)雌激素剌激可產(chǎn)生
更強(qiáng)增殖反應(yīng)，并對(duì)抗雌激素藥物如他莫昔酚有抵抗作用。此外，研究表明，心臟疾病，骨質(zhì)疏松和老年癡呆等疾病同ER-ct36的生物功能有著直 接的關(guān)系.因此以ER-a 36為耙點(diǎn)篩選治療激素依賴型腫瘤藥物將提供一種新的篩選抗腫瘤， 心臟疾病，骨質(zhì)疏松和老年癡呆藥物的途徑。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，式(I)化合物，在低濃度條件下，不改變ERci66， ERa46和ER a 36 的表達(dá)。然而高濃度的化合物(I)能同時(shí)抑制三者的表達(dá)；同時(shí)化合物(I)能殺死表達(dá)ER a 66， ERa46和ERa36的乳腺癌細(xì)胞MCF7細(xì)胞。而式(I)化合物可作為雌激素受體ER a 36的調(diào)節(jié)劑，用于治療因雌激素受體ERa36的表達(dá)而引起的疾病，如腫瘤，骨質(zhì)疏松，哮 喘，心臟疾病或老年癡呆等病癥。


圖l雌激素受體的結(jié)構(gòu)分區(qū)圖2 ERa66， ERa46和ERa36乳腺癌組織中的表達(dá)。1、正常乳腺組織2、患者l浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織，3、患者2浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織，4、浸潤(rùn)性 導(dǎo)管癌組織，5、患者A浸潤(rùn)性小葉癌，6、患者B浸潤(rùn)性小葉癌，7、非浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌 圖3在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中，抗ER a 36特異性抗體顯色情況a ER-a 36，陽(yáng)性結(jié)果顯示為綠色，DAPI，陽(yáng)性結(jié)果顯示為藍(lán)色，聯(lián)合顯色者標(biāo)注為"Merge"。 圖4 MCF7細(xì)胞經(jīng)化合物(I)處理后，Western blot檢測(cè)ERa 66， ERa 46和ER a 36表達(dá)的 情況。圖5 MCF7細(xì)胞經(jīng)化合物(I)處理后，存活細(xì)胞數(shù)量變化情況。 圖6化合物(I)對(duì)八3 25.35誘導(dǎo)？<:12細(xì)胞損傷的體外保護(hù)結(jié)果。
具體實(shí)施方式
式(I)化合物7-羥基-3-[(4-羥基)-3-(3-甲基-丁基-2-烯基)苯基]-4H-l-苯并吡喃-4-酮從上海友思生物技術(shù)有限公司購(gòu)買。實(shí)施例l式(I)化合物的體外生物試驗(yàn) 1.1試驗(yàn)試驗(yàn)方法含有不同人乳腺癌組織蛋白的pre-blot濾膜片購(gòu)至ProSci公司(Poway, CA)。 使用ERa36特異性的抗ERa36抗體[ER-a36特異抗體(對(duì)ER-a36 C-端的20個(gè)氨基酸) 是由Alpha Diagnostic International (San Antonio, TX)制備.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006，
103 (24): 9063-9068]， HRP標(biāo)記的二抗以及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL， AmerSham Pharmacia Biotech)檢測(cè)濾膜片并顯色。該膜洗脫后，使用能同時(shí)檢測(cè)ER三種亞型(ERa66， ER a 46 和ERa36)的抗ERa抗體H222 (Novocastra Laboratories Ltd, UK)檢測(cè)膜片。(見(jiàn)圖2) 試驗(yàn)結(jié)果ERa66， ERa46和ERa36在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(泳道2)、浸潤(rùn)性小葉癌(泳道 5)和非浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(泳道7)中表達(dá)。此外，ERa36在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(泳道4)和浸潤(rùn)性 小葉癌(泳道6)中表達(dá)。泳道2和泳道3是來(lái)源于兩位不同患者的浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。泳道5 和泳道6是來(lái)源于兩位不同患者的浸潤(rùn)性小葉癌。該結(jié)果顯示ER a 36可以在ER a 66和ER a 46表達(dá)陰性的乳腺癌中表達(dá)，而在正常乳腺組織中無(wú)表達(dá)(泳道l)。1.2試驗(yàn)試驗(yàn)方法:MDA-MB-231細(xì)胞系是公認(rèn)的缺乏ER a 66和ER a 46表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系[Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumors: an update. 5re3s亡Ca"cer y esearc/ a/^ 7>eatoe"t 2004, 83: 249-289]]] MDA-MB-231細(xì)胞(購(gòu)至ATCC細(xì)胞庫(kù))傳 代置于8孔BIOCOAT玻片(BD Science Discovery Labware)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，并在37°C， 5% C02的條件下培養(yǎng)12小時(shí)。使用無(wú)菌PBS沖洗兩遍，4X多聚甲醛(PBS 配制，PH7.4)在室溫固定30分鐘；然后用PBS洗，和0.5% (v/v) Triton X-100破膜10 分鐘；PBS洗，3%血清在室溫封閉1小時(shí)；抗ER a 36特異性抗體在室溫孵育1小時(shí)，含0. 5 % Triton X-100的PBS (PBST)洗三次；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的熒光二抗孵育1小 時(shí)；PBST洗三次，PBS洗一次;防淬滅封片劑(Molecular Probes, Eugene, OR)封片。于 Nikon E600顯微鏡下觀察，使用MRC-1024激光共聚焦顯微鏡(Bio-Rad)拍攝圖像。(見(jiàn)圖3) 試驗(yàn)結(jié)果在ER a 66和ER a 46表達(dá)陰性的的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中，抗ER a 36特 異性抗體顯色陽(yáng)性(標(biāo)注為aER-a36，陽(yáng)性結(jié)果顯示為綠色)，并可以被用作免疫的多肽所 阻斷。細(xì)胞核使用4， 6-聯(lián)咪-2-苯基-lH-(l引哚染色(標(biāo)注為DAPI，陽(yáng)性結(jié)果顯示為藍(lán)色)。 聯(lián)合顯色者標(biāo)注為"Merge"。(圖中的+P印tide表明在實(shí)驗(yàn)中加免疫原蛋白來(lái)阻斷抗體)1.3試驗(yàn)MCF7細(xì)胞經(jīng)濃度為0um至25um的化合物(I)處理后，Western blot檢測(cè)ERa 66， ER a46和ERa36表達(dá)的情況。(見(jiàn)圖4)。試驗(yàn)結(jié)果如圖所示，隨著化合物(I)濃度的上升，ERa66和ERa46的表達(dá)下降，而ER a36的表達(dá)逐漸上升。然而高濃度的化合物(I)能抑制三者的表達(dá)1.4試驗(yàn)試驗(yàn)方法MCF7細(xì)胞系是高表達(dá)ER a 66， ER a 46和ER a 36的乳腺癌細(xì)胞系(Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumors: an update. Marc Lacroix， Guy Leclercq, 5r譜f C雄er 7 esearc/ 朋t/ 7潔t腦t 83; 249-289(2004))。 MCF7細(xì)胞(購(gòu) 至ATCC細(xì)胞庫(kù))培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(Ivitrogen) ， 37°C， 5% C02的 條件中培養(yǎng)12小時(shí)?；衔?I)(購(gòu)至上海有思生物技術(shù)公司)，通過(guò)DMSO溶解稀釋。MCF7 細(xì)胞按1X105的密度接種于100mm直徑的培養(yǎng)皿中，由濃度為0u m至25 w m的化合物(I) 處理兩周后，使用血球計(jì)數(shù)器在顯微鏡下對(duì)存活的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。按照濃度進(jìn)行分組，5個(gè) 培養(yǎng)皿為一組。(見(jiàn)圖5)圖示的是MCF7細(xì)胞經(jīng)濃度分別為0um， 5"m， ll)"m， 15um， 20 u m和25 ii m的化合 物(I)處理兩周后，細(xì)胞數(shù)目變化的表現(xiàn)。細(xì)胞計(jì)數(shù)的單位為1X104個(gè)。試驗(yàn)結(jié)果如圖所示，MCF7細(xì)胞經(jīng)濃度為5um的化合物(I)處理后數(shù)量明顯下降。實(shí)施例2式(I)化合物的體內(nèi)抑瘤藥效學(xué)試驗(yàn) 2. 1對(duì)人乳腺癌BCAP-37的作用實(shí)驗(yàn)方法采用BALB/c-nu裸鼠，25只，平均體重19_21g。實(shí)驗(yàn)給藥前，裸鼠右前肢腋下移 植人乳腺癌BCAP-37瘤株。參照抗腫瘤藥物"他莫昔芬(Tamoxifen)臨床人有效口服劑量 10-20mg， 口服，2次/日計(jì)算，將化合物(I)設(shè)單一劑量組，既33mg/kg (0.66mg/天/ 只)，另設(shè)陽(yáng)性藥他莫昔芬對(duì)照組(16.5mg/kg， 0.33mg/天/只)和陰性荷瘤裸鼠對(duì)照組，給 藥組每組設(shè)9只裸鼠，陰性荷瘤裸鼠對(duì)照組設(shè)7只裸鼠，雌性。采用經(jīng)口灌胃給藥，每天一 次。裸鼠移植人乳腺癌BCAP-37瘤株后經(jīng)口灌胃"乙烯雌酚"，連續(xù)給藥6天，第7天分組后 開(kāi)始口服化合物(1)，連續(xù)給藥18天，荷瘤裸鼠給藥期間每4天測(cè)量動(dòng)物體重和移植腫瘤 生長(zhǎng)體積，并計(jì)算各劑量組動(dòng)物腫瘤體積(VT)、相對(duì)體積(RVT)、腫瘤增殖率T/C (%)。停 藥后24小時(shí)后處死各組裸鼠，完整剝離瘤組織，用1/10000分析天平稱重，計(jì)算平均腫瘤重 量和腫瘤生長(zhǎng)抑制率 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.給藥期間各組荷瘤人乳腺癌BCAP-37瘤株裸鼠均無(wú)死亡，各給藥組動(dòng)物給藥期間體重變化 與陰性對(duì)照組動(dòng)物比較均未見(jiàn)顯著差異。各藥物組荷瘤裸鼠給藥期間各組體重變化(見(jiàn)表2)表2.各實(shí)驗(yàn)組荷瘤裸鼠給藥期間體重(g)變化比較 組別 給藥l天給藥4天 給藥8天給藥ll天給藥14天給藥18天陰性X寸照組 20.19±1.06 21.19±1.10 21.96±0.57 21.83 ±1.16 22.97±0.97 24.50±1.05
他莫昔芬組 20.29±0.63 20.39±0.98 20.49±0.70 20.83±1.03 21.52±0.91 23.31±1.91 化合物I組 20.87±0.78 21.30±0.83 21.77±1.19 22.90±1.17 23.50±1.14 24.20土1.19 注各組間均無(wú)顯著差異2. 化合物(I)組荷瘤裸鼠給藥18天期間其腫瘤體積(VT)、相對(duì)體積(RVT)除給藥組給藥 第1天、第4天的腫瘤體積(VT)相對(duì)體積(RVT)與同期陰性對(duì)照組統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p值大于 0.05夕卜、給藥組其他給藥時(shí)段的腫瘤體積(VT)和相對(duì)體積(RVT)均值與同期陰性對(duì)照組 相比均有顯著性差異(p〈 0.01)。 荷瘤裸鼠給藥期間各組裸鼠腫瘤體積變化(見(jiàn)表3)表3.各實(shí)驗(yàn)組荷瘤裸鼠給藥期間腫瘤體積(mm3)變化比較 組別 給藥l天給藥4天給藥7天 給藥ll天給藥14天 給藥18天 陰性對(duì)照組33.00±21.31 181.23±106.77624.49± 154.16803.15±330.57 1325.05±484.24 2317.38±68.69 他莫昔芬組41.34± 12.73 164.23±68.46 249.74±32.96a323.55±63.23a 536.20± 143.17a 1089.98±75.23a 化合物I組4L01士14.81 120.15±46.58293.85 ± 113.47a 314.14± 102.82a 514.30±198.37a 1037.66±261.49a 注分別與各批次陰性對(duì)照組比較a: p<0.01;b: p<0.05; 各藥物組荷瘤裸鼠相對(duì)腫瘤體積(RTV)比較(見(jiàn)表4)表4.各實(shí)驗(yàn)組荷瘤裸鼠給藥期間相對(duì)腫瘤體積(RTV)變化比較 組別 例數(shù)給藥4天 給藥7天給藥ll天給藥14大 給藥18天 陰性對(duì)照組 7 6.57±3.18 25.53 ±15.86 30.09± 12.9749.32±28.06 92.35±23.48a 他莫昔芬組 9 4.24±1.88 6.57±2.33a 8.69±3.22a 13.81 ±5.59a 28.27±8.80a 化合物I組 9 3.98±3.65 8.36±5.03a 9.23±5.18a 15.16±9.50a 30.%±20.94a注分別與各批次陰性對(duì)照組比較a: p<0.01;b: p<0.05。3. 給藥第18天，化合物(I)組腫瘤增殖率(T/C)為33.5%。陽(yáng)性藥他莫昔芬組為52.8%。 各藥物組荷瘤裸鼠相對(duì)腫瘤增殖率(T/C)比較(見(jiàn)表5)表5.各給藥組荷瘤裸鼠給藥期間相相對(duì)腫瘤增殖率(T/C)變化比較(％) 組別給藥4天 給藥7天 給藥12天給藥14天 給藥18天 他莫昔芬組 0.645 0.257 0.289 0.280 0.528化合物I組 0.605 0.327 0.307 0.307 0.3354. 給藥組實(shí)測(cè)平均腫瘤重量分別為受試藥物化合物(I)組1.037士0.229g，給藥組腫瘤重 量分別與空白對(duì)照組(2.201士0.805g)比較，p值小于0.01。5. 給藥組腫瘤生長(zhǎng)抑制率為受試藥物化合物(I)組53%，陽(yáng)性藥他莫昔芬組為54%。 各藥物組荷瘤裸鼠腫瘤重量和腫瘤生長(zhǎng)抑制率比較(見(jiàn)表6)表6.各實(shí)驗(yàn)組荷瘤裸鼠腫瘤重量(g)和腫瘤生長(zhǎng)抑制率(％)變化比較 組別 例數(shù)腫瘤重量(g) p值 腫瘤生長(zhǎng)抑制率(％)陰性對(duì)照組7 2.201 ±0.805 — 一他莫昔芬組 9 0.992 ±0.142 0.00053 0.54化合物I組 9 1.037±0.229 0.00095 0.53注p值<0. 001 :各給藥組與陰性對(duì)照組相比。6.受試藥物化合物(I)平均腫瘤重量與陽(yáng)性藥對(duì)照藥組(他莫昔芬)比較，瘤重量無(wú)顯著 性差異(p>0.05)。實(shí)施例4式(I)化合物式(I)對(duì)老年性癡呆的藥效學(xué)試驗(yàn)雌激素受體在基底前腦、間腦、中腦、海馬、杏仁體、大腦皮質(zhì)、小腦皮質(zhì)等均有廣泛 分布，且具有性別差異。Alzheimer' s Disease是老年癡呆中最常見(jiàn)的一種，AD老年婦女中 發(fā)病率是同齡男子的1.5 3倍。流行病學(xué)資料表明，健康絕經(jīng)后婦女中既往已接受過(guò)或現(xiàn)在 正在接受雌激素替代治療的人，AD的發(fā)病率低于從未接受過(guò)的婦女，并且絕經(jīng)后婦女體內(nèi)雌 激素水平與AD的發(fā)病率呈反比(Aging Clin. Exp. Res. 2007,19(2): 165-168; Alzheimer Disease Associated Disorder 2006 20(4): 322-323; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006 103(45): 16983-16988.J Alzheimers Dis. 2006 9(3): 273-278). PC-12細(xì)胞是一個(gè)常用的神經(jīng)細(xì)胞株。PC12 細(xì)胞為大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞克隆化的細(xì)胞株，具有較典型的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特征，是廣 泛用于研究神經(jīng)細(xì)胞分化、離子通道、受體、遞質(zhì)分泌的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用P-淀粉樣蛋白(Ap25-35) 誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞凋亡以建立阿爾茨海默病(老年癡呆癥))細(xì)胞模型方法體外培養(yǎng)PC-12細(xì)胞, 以不同濃度A|325-35誘導(dǎo)并于不同時(shí)間收獲細(xì)胞,應(yīng)用MTT法觀察細(xì)胞活力.AP25-35作用于 PC-12細(xì)胞后,細(xì)胞活力逐漸下降，并呈時(shí)間和劑量依賴性.Ap25-35誘導(dǎo)后PC-12細(xì)胞活力下降: 作為較理想的阿爾茨海默病細(xì)胞模型.4.1對(duì)Ae 25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的體外保護(hù)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法.-1. 藥物配制化合物用100。/。DMSO溶解成10—2M，再用DMEM培養(yǎng)液稀釋。2. 用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，以密度為1X105PC12細(xì)胞/ml接種于96孔培養(yǎng)板上， 接種體積為100 u L/孔，隨后放入含5%C02的37。C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3. PC12細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，將各組的培養(yǎng)液均換成無(wú)血清無(wú)酚紅的DMEM培養(yǎng)液。 4. 給藥組中加入相應(yīng)濃度的化合物預(yù)孵育2小時(shí)。5. 化合物孵育2小時(shí)后，給藥組與損傷組中分別加入luMAe 25-35損傷劑。6. 繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，各組中加入5mg/ml MTT10 u 1/孔，進(jìn)行活細(xì)胞染色。7. 待3-4小時(shí)后，各組中加入20。/。SDS終止液100uL/孔，室溫過(guò)夜。8. 570/630nm的雙波長(zhǎng)下測(cè)定各組的0D值。各組化合物分別以10-5， 10-6測(cè)定3次結(jié)果， 用Duncans test方法統(tǒng)計(jì)，給藥組及損傷組與對(duì)照組100%±SEM值進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下表和圖6。分 組X±SD對(duì)照組100.00 ±0. 00A e 25-35組52.49±2. 1010 u M組58.01 ±1. 13**1 uM組55.47±1. 39*與AP 25-35組比較**P〈0.01, *P<0.05 實(shí)驗(yàn)結(jié)論化合物在1 U M及10 U M濃度下對(duì)A e 25.35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷均有不同程度保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.式(I)化合物或式(I)化合物的藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物在制備治療與雌激素受體ER-α相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述式(I)化合物或式(I)化合物的藥學(xué)上可接受的鹽 或溶劑合物是作為雌激素受體ER-a的調(diào)節(jié)劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，所述藥物包括片劑，口嚼劑，膠囊劑，懸浮液劑，溶液劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，所述疾病包括腫瘤，骨質(zhì)疏松，哮喘，心臟疾病，老年癡 呆。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，所述腫瘤為乳腺癌，卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌，胃癌，結(jié)腸癌， 前列腺癌，血癌或肺癌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，所述腫瘤為乳腺癌，前列腺癌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，所述腫瘤為乳腺癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及“7-羥基-3-[(4-羥基)-3-(3-甲基-丁基-2-烯基)苯基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮的用途。該化合物或化合物的藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物在制備治療與雌激素受體ER-α相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，在低濃度條件下，不改變ERα66，ERα46和ERα36的表達(dá)。然而高濃度的該化合物能同時(shí)抑制三者的表達(dá)；同時(shí)該化合物能殺死表達(dá)ERα66，ERα46和ERα36的乳腺癌細(xì)胞MCF7細(xì)胞。因此該化合物可作為雌激素受體ERα36的調(diào)節(jié)劑，用于治療因雌激素受體ERα36的表達(dá)而引起的疾病，如腫瘤，骨質(zhì)疏松，哮喘，心臟疾病或老年癡呆等病癥。
文檔編號(hào)A61P11/06GK101129353SQ20071012185
公開(kāi)日2008年2月27日 申請(qǐng)日期2007年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月17日
發(fā)明者坤 孟, 靖 李 申請(qǐng)人:北京珅奧基醫(yī)藥科技有限公司