專利名稱：枸櫞酸鐵在制備防治血管鈣化的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血管鈣化領(lǐng)域，是枸櫞酸鐵在防治血管鈣化中的用途，尤其是涉及防治心血管異位鈣化的研究領(lǐng)域，具體地說，是枸櫞酸鐵在防治心血管異位鈣化中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管鈣化(也稱心血管系統(tǒng)異位鈣化)是與臨床心血管疾病密切相關(guān)的一種病理改變，主要發(fā)生于動脈血管壁及心臟瓣膜，與衰老、動脈粥樣硬化性血管病變、主動脈瓣狹窄以及糖尿病、終末期腎病等密切相關(guān)，可增加急性心肌梗死、外周血管疾病缺血發(fā)作及血管成形術(shù)后內(nèi)膜撕裂等嚴(yán)重臨床事件的發(fā)生，是心血管疾病發(fā)生率和死亡率的預(yù)測因素。
血管鈣化主要發(fā)生在血管壁的兩個部位點(diǎn)內(nèi)膜和中膜。鈣化發(fā)生于內(nèi)膜稱為內(nèi)膜性鈣化(內(nèi)膜鈣化)，主要與動脈粥樣硬化性疾病相關(guān)聯(lián)；鈣化發(fā)生于中膜稱為中膜性鈣化(中膜鈣化)，其獨(dú)立于冠狀動脈硬化病變存在，主要發(fā)生于衰老、糖尿病、尿毒癥等病理狀態(tài)。兩個位點(diǎn)的鈣化有不同的形態(tài)學(xué)及病理學(xué)特征，參見下表。內(nèi)膜鈣化發(fā)生于脂質(zhì)條紋形成期，形態(tài)為小的呈彌漫分布的羥基磷灰石晶體鈣沉積，并形成與生理性骨化類似的細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)小泡。中膜鈣化發(fā)生于無炎性細(xì)胞浸潤及脂質(zhì)沉積的環(huán)境中，在人頸動脈中膜鈣化位點(diǎn)并未發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞及肥大細(xì)胞，已在人動脈中膜的彈力層發(fā)現(xiàn)基質(zhì)小泡，中膜鈣化的機(jī)制目前不清楚。
表內(nèi)膜鈣化與中膜鈣化的對比


心血管系統(tǒng)異位鈣化是一個特殊的、主動的、可調(diào)節(jié)的過程。應(yīng)用免疫組化及原位雜交的方法發(fā)現(xiàn)在生理性骨化過程中出現(xiàn)的羥基磷灰石、基質(zhì)小泡、I型膠原及非膠原性骨結(jié)合蛋白(NCPs)，包括骨橋蛋白、基質(zhì)Gla蛋白、骨鈣素、骨連接素及骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)等存在于動脈粥樣硬化斑塊、鈣化的動脈及瓣膜；MGP基因敲除小鼠出生2個月內(nèi)因主動脈瓣、彈力及肌性大動脈發(fā)生廣泛鈣化死于動脈破裂及心臟衰竭；CVCs細(xì)胞的克隆揭示血管壁中存在類似旁細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞，可自發(fā)形成鈣化小結(jié)，GF-β1、25-羥膽固醇、17β-雌二醇及1，25-維生素D3等可促進(jìn)體外培養(yǎng)的牛主動脈平滑肌細(xì)胞鈣化。血管鈣化與生理性骨質(zhì)形成類似，是主動的、可調(diào)節(jié)的過程。
心血管系統(tǒng)鈣化是一個多病因、多途徑、由多種分子參與的十分復(fù)雜的過程，其中心環(huán)節(jié)是靶細(xì)胞在各種外界因素(如衰老、脂質(zhì)沉積、粥樣硬化、壞死等)的啟動作用及體內(nèi)外多種因素(如1，25-維生素D3、TGF-β1等)的促進(jìn)作用下，基因表型發(fā)生改變，逐漸向成骨細(xì)胞分化，分泌成骨細(xì)胞樣基質(zhì)，而分泌的骨基質(zhì)又可作用于細(xì)胞，兩者互相作用，最終形成鈣化。
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究雖然已經(jīng)認(rèn)識到心血管系統(tǒng)異位鈣化的危害，但目前仍沒有有效的治療方法。目前業(yè)內(nèi)比較認(rèn)可并采用的鈣通道阻斷劑治療方法，動物實(shí)驗(yàn)表明在減少動脈鈣沉積方面是有效的，但是在不同的血管鈣化區(qū)域?qū)︹}通道阻斷劑的治療反應(yīng)是不同的，總體來說臨床效果亦不甚滿意。有報(bào)道絕經(jīng)后服用激素替代療法的婦女比沒有服用激素的婦女冠脈鈣化程度低，但雌激素不能作為動脈鈣化治療的首選劑。臨床研究結(jié)果表明維生素K減輕血管鈣化同時還能改善部分患者的骨質(zhì)疏松癥，維生素K治療的耐受性好，并未引起高凝狀態(tài)。在目前所有能夠阻止動脈鈣化進(jìn)展的藥物中，3-羥-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxyl-3-methyl glutaryl CoA，HMG CoA)還原酶抑制劑可能是最具有潛能的藥物。HMG CoA還原酶抑制劑可能對血管鈣化與骨質(zhì)疏松并存的患者有特殊的益處，因?yàn)镠MG CoA還原酶抑制劑還能抑制破骨細(xì)胞的形成和骨的再吸收，并促進(jìn)新骨的生成。
現(xiàn)有技術(shù)中枸櫞酸鐵的應(yīng)用目前枸櫞酸鐵主要為補(bǔ)鐵的食品添加劑或?yàn)闋I養(yǎng)增補(bǔ)劑(鐵質(zhì)強(qiáng)化)，例如，可以添加于餅干、改質(zhì)的奶粉和小麥粉等，印度也用于食鹽；也有用于治療慢性腎衰患者高磷血癥的報(bào)道，Wu-Chang Yang等報(bào)道枸櫞酸鐵作為新的磷結(jié)合劑可用于慢性腎功能衰竭的血液透析患者，其與食物同時服用，可以結(jié)合食物中的磷酸鹽，減少胃腸道對磷酸鹽的吸收，從而降低慢性腎功能衰竭患者的高磷血癥。由于慢性腎臟疾病患者也存在心血管鈣化的現(xiàn)象，有觀點(diǎn)認(rèn)為高磷血癥是引起ESRD(終末期腎衰)患者心血管鈣化的影響因素，高磷血癥參與了ESRD的血管異位鈣化，但實(shí)驗(yàn)證明有部分血管鈣化的ESRD患者的血磷及血鈣仍然正常，另外動脈粥樣硬化等伴發(fā)的血管鈣化與人體血磷水平?jīng)]有直接關(guān)系。因此，慢性腎衰的心血管系統(tǒng)鈣化是多病因、多途徑、由多種分子參與的十分復(fù)雜的過程，血磷水平對鈣化的影響未知。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，枸櫞酸鐵可有效防治由維生素D3和尼古丁造成的大鼠的動脈鈣化，從而證明了枸櫞酸鐵通過干預(yù)軟組織鈣化形成過程，可有效抑制心血管異位鈣化，并有可能逆轉(zhuǎn)異位鈣化的發(fā)生。
本發(fā)明的目的在于提供枸櫞酸鐵的新用途，即，枸櫞酸鐵在制備防治血管鈣化的藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的還在于提供枸櫞酸鐵的一種新用途，尤其是，枸櫞酸鐵在制備防治心血管系統(tǒng)鈣化相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了枸櫞酸鐵在制備防治血管鈣化的藥物中的應(yīng)用。
上述血管鈣化尤其指的是心血管異位鈣化。
本發(fā)明提供了枸櫞酸鐵的一種新的用途，即對心血管異位鈣化的防治作用。
本發(fā)明還提供了枸櫞酸鐵在制備防治心血管異位鈣化的藥物中的應(yīng)用。
其中所述的心血管異位鈣化包括內(nèi)膜鈣化和/或中膜鈣化，所述的內(nèi)膜鈣化包括發(fā)生于動脈粥樣硬化或相關(guān)病理狀態(tài)下的血管鈣化；所述的中膜鈣化包括發(fā)生于衰老及糖尿病、尿毒癥等病理狀態(tài)下的血管鈣化。
本發(fā)明所述的防治心血管異位鈣化既包括預(yù)防心血管異位鈣化，同時也包括治療心血管異位鈣化，其中，本發(fā)明所述的預(yù)防血管鈣化包括預(yù)防由血管鈣化引起的并發(fā)癥，如高血壓等。實(shí)驗(yàn)證明，枸櫞酸鐵在預(yù)防和治療異位鈣化的過程中均能達(dá)到預(yù)期的效果。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語“預(yù)防”，不僅指完全預(yù)防某一種影響，也指在疾病發(fā)作前或發(fā)作早期任何部分基本上預(yù)防、減弱、降低、減退或消除這種影響。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語“治療”，指任何對疾病的進(jìn)展有益的效果，包括在疾病發(fā)作后減弱、降低、減退或消除病理的發(fā)展。
本發(fā)明提供的枸櫞酸鐵在制備防治血管鈣化的藥物中的應(yīng)用，該應(yīng)用包括枸櫞酸鐵在制備防治由衰老、糖尿病、終末期腎病或動脈粥樣硬化等病癥伴發(fā)或引起的血管鈣化的藥物中的應(yīng)用。
曾有過枸櫞酸鐵治療慢性腎衰患者高磷血癥的報(bào)道，而高磷血癥是引起ESRD(終末期腎衰)患者心血管鈣化的影響因素，高磷血癥參與了ESRD的血管異位鈣化，所以有觀點(diǎn)認(rèn)為枸櫞酸鐵也許可通過降低血磷值來影響心血管鈣化，但本發(fā)明的大量實(shí)驗(yàn)證明，有部分血管鈣化的ESRD患者的血磷及血鈣仍然正常，說明異位鈣化的機(jī)制是復(fù)雜的，雖然不排除可能存在高血磷的影響，但是不可質(zhì)疑的是，局部因素(如PDGF)或抑制鈣化因素(如fetuin-A、MGP等)也在起作用，例如，MGP基質(zhì)Gla蛋白，在局部組織強(qiáng)烈抑制鈣磷鹽的沉積，PDGF血小板源生長因子能增加平滑肌細(xì)胞對磷的攝取并不增加對磷的親和力，同時PDGF也在以一種時間和劑量依賴的方式誘導(dǎo)NPC的活化和表達(dá)，并促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的鈣化，說明PDGF介導(dǎo)的鈣化可發(fā)生在血磷正常的情況下。另外動脈粥樣硬化等伴發(fā)的血管鈣化與人體血磷水平?jīng)]有直接關(guān)系。因此，慢性腎衰的心血管系統(tǒng)鈣化是多病因、多途徑、由多種分子參與的十分復(fù)雜的過程，血磷水平對鈣化的影響未知。
本發(fā)明采用與人體心血管系統(tǒng)鈣化相關(guān)性很好的大鼠VDN動物模型。維生素D和尼古丁(VDN)造成成年大鼠的彈性動脈鈣化，是與由年齡和年齡相關(guān)的血管病理變化最相關(guān)的血管鈣化動物模型，在人動脈粥樣硬化病變過程中發(fā)現(xiàn)的鈣結(jié)合蛋白--S-100，與VDN大鼠動脈中膜鈣化相關(guān)，VDN大鼠模型動脈鈣化的機(jī)理和結(jié)果與人動脈粥樣硬化血管鈣化十分相似，人動脈鈣化的基本特征是老齡或年齡相關(guān)的血管病變，如動脈粥樣硬化、糖尿病和腎臟疾病，而大鼠是研究與老齡和/或年齡相關(guān)的病理改變等發(fā)生血管鈣化的最常用動物模型。采用維生素D和尼古丁(VDN)造成成年大鼠的彈性動脈鈣化的強(qiáng)度與人相近，可作為用于研究人血管鈣化導(dǎo)致動脈硬化的動物模型，具體參見Nathalie Niederhoffer，Yuri V.Bobryshev，et al.Aortic calcification produced by Vitamin D3 plus nicotine.Journal ofvascular research 1997；34386-398。
為評價枸櫞酸鐵在防治心血管系統(tǒng)異位鈣化方面的有效性，本發(fā)明做以下述藥理藥效實(shí)驗(yàn)。
一、枸櫞酸鐵給藥對于異位鈣化的治療作用1.材料雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，150～180g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心提供(合格證號SCXK京2002-0001)；尼古丁、維生素D3購自Sigma公司；45CaCl2購自美國New England Nuclear公司；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測定試劑盒購自北京利德曼公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純；枸櫞酸鐵由協(xié)和藥業(yè)有限公司提供，用4％淀粉溶液制成混懸液，按不同給藥劑量灌胃給藥。
2.實(shí)驗(yàn)方法2.1大鼠血管鈣化模型制備和實(shí)驗(yàn)分組參照Niederhoffer方法，制備大鼠血管鈣化動物模型。雄性SD大鼠54只，體重150～180g，隨機(jī)分為5組(1)血管鈣化組(VDN)(n＝12)實(shí)驗(yàn)第一天9:00給大鼠肌注維生素D3(3×105U/kg)和尼古丁溶于大豆油(25mg/kg，5ml/kg)灌胃，18:00尼古丁重復(fù)灌胃1次，此后不做任何處理，常規(guī)喂養(yǎng)4周后，每天4％淀粉溶液灌胃，連續(xù)4周；(2)空白對照組(control，n＝10)給予等量大豆油肌注、單純大豆油灌胃代替維生素D3和尼古丁，此后不做任何處理，常規(guī)喂養(yǎng)4周后，每天4％淀粉溶液灌胃，連續(xù)4周；(3)血管鈣化+枸櫞酸鐵低劑量組(VDN+L)(n＝12)鈣化處理同(1)，此后不做任何處理，常規(guī)喂養(yǎng)4周后，每天按劑量370mg/kg給予枸櫞酸鐵，連續(xù)灌胃給藥4周；(4)血管鈣化+枸櫞酸鐵中劑量組(VDN+A)(n＝10)給藥方法同(3)，劑量為740mg/kg；(5)血管鈣化+枸櫞酸鐵高劑量組(VDN+H)(n＝10)給藥方法同(3)，劑量為1110mg/kg枸櫞酸鐵，連續(xù)灌胃給藥4周。
各組動物常規(guī)飼養(yǎng)，3天測一次體重，每周測一次尾動脈壓；8周后，烏拉坦1g/kg腹腔注射麻醉動物，眼底取血，測定血液生化指標(biāo)；摘取心臟和全長胸腹主動脈，用生理鹽水沖洗后，心臟稱重，-70℃儲存?zhèn)溆谩?br> 2.2von Kossa染色從主動脈弓起，取1～1.5cm的胸主動脈血管條，用4％多聚甲醛固定；用石蠟包埋胸主動脈并切片，7μm，常規(guī)脫蠟、脫水；浸入1％硝酸銀溶液，在日光下照射30min后，將玻片放于5％硫代硫酸鈉溶液中1min，堿性品紅返染；脫水、透明、封片，光鏡觀察。
2.3組織45Ca沉積取胸主動脈(約20mg)，制備成0.3mm左右的組織薄片，置于1ml DMEM孵育液中，加入37kBq/mL45CaCl2，通體積分?jǐn)?shù)為95％O2-5％CO2氣體，37℃恒溫水浴中持續(xù)平衡孵育10h后，用雙蒸水沖洗3次；烤干(80℃，2h)，稱重，取0.5mL甲酸消化組織；取0.4mL消化液置于閃爍瓶中，加4mL閃爍液，用β-液閃計(jì)數(shù)儀測45Ca2+放射活性(CPM/mg)。
2.4血管鈣含量取腹主動脈(約10mg)，80℃烤干(2-3h)，稱重，轉(zhuǎn)移至石英杯內(nèi)，加入2mol/L硝酸1ml，2滴高氯酸，180℃消化并烤干，冷卻后用去離子水復(fù)溶，定容至2ml。原子發(fā)射光譜在422.7nm讀取吸光度，換算成組織的鈣含量(μmol/g dw)。
2.5ALP(堿性磷酸酶)活性測定取腹主動脈約10mg，以等滲PBS制備組織勻漿(勻漿緩沖液20mmol/LHEPES，pH7.4，0.2％NP-40，20mmol/L MgCl2，PBS定容至50ml)。勻漿后8000×g離心10min，吸取上清液。BCA法進(jìn)行蛋白定量。按ALP測定試劑盒說明，采用SFBC速率法測定血管組織ALP活性[U/(mg·Pro)]。具體方法將待測樣品，試劑1，試劑2按1∶50∶10的比例混合，混合物在37℃保溫60秒后，用酶標(biāo)儀在405nm處讀取2分鐘內(nèi)吸光度變化。ALP活性用ρ-2硝基苯酚作為標(biāo)準(zhǔn)值計(jì)算，1單位表示30min內(nèi)生成1nmol硝基苯酚。結(jié)果用蛋白含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
2.6血磷、血鈣含量測定大鼠麻醉后，眼底取血，采用磷鉬酸法和鄰甲酚酞絡(luò)合銅(OCPC)法測定血磷、血鈣含量(mmol/L)。
2.7大鼠尾動脈壓測定采用RBP-1B型大鼠無創(chuàng)血壓計(jì)測量大鼠尾動脈壓(mmHg)，每周一次。
2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表1實(shí)驗(yàn)各組大鼠心肌和主動脈組織一般特征(x±s)

**表示與VDN組相比有顯著性差異P＜0.05；##表示與control組相比有顯著性差異P＜0.05表2實(shí)驗(yàn)各組大鼠尾動脈血壓(x士s)


**與VDN組相比有顯著性差異P＜0.05；##表示與對照組相比有顯著性差異P＜0.05。
2.9結(jié)果(1)大鼠血管鈣化的一般特征與對照組相比，見表1，維生素D3和尼古丁誘導(dǎo)的VDN組大鼠的血管堿性磷酸酶的活性高1.9倍(P＜0.05)，血管組織鈣含量高1.2倍(P＜0.05)，45Ca沉積高1.7倍(P＜0.05)，血漿中磷的含量降低了10.68％(P＜0.05)，血液中鈣含量無顯著性差異，心臟與體重比值無顯著性差異。
(2)枸櫞酸鐵對大鼠鈣化的影響與模型組(VDN組)相比，見表2，VDN+L組，VDN+A組，VDN+H組大鼠的堿性磷酸酶的活性分別降低3.96％，7.45％，25.52％；血管組織鈣含量分別降低17.90％(P＜0.05)，4.65％，2.93％；鈣沉積分別降低19.26％(P＜0.05)，17.08％，12.90％；血漿中鈣磷含量各組與VDN組相比則沒有顯著性差異，心臟與體重比值無顯著性差異；各組大鼠的尾動脈壓較VDN組平均降低11.22％，10.2％，8.7％，均P＜0.05。
二.枸櫞酸鐵對大鼠血壓和血磷、血鈣濃度的影響1.與空白對照組相比，經(jīng)維生素D3和尼古丁誘導(dǎo)的大鼠VDN模型組的血壓和血鈣、血磷濃度沒有明顯變化；與模型組(VDN組)相比，四周給藥期間，除VDN+枸櫞酸鐵高劑量組在第二周血壓降低6.5％外，P＜0.05，其余各組在四周內(nèi)血壓沒有顯著變化，見表3。
表3實(shí)驗(yàn)各組大鼠血壓測定值的比較


*P＜0.05與正常組相比；**P＜0.05與模型組相比。
第一周各組血壓之間無明顯差異；藥物空白組第二、三周分別比正常組血壓升高8.5％和11.5％，且有顯著性差異；大劑量組第二周比模型組血壓降低6.5％，且有顯著性差異；第四周各組血壓之間無顯著性差異。
2.與模型組(VDN組)相比，VDN+枸櫞酸鐵低劑量、中劑量、高劑量組的血鈣濃度均升高，P＜0.05，而血磷濃度沒有顯著差異，見表4。
表4實(shí)驗(yàn)各組大鼠血磷、血鈣測定值的比較

*P＜0.05與模型組相比血鈣含量方面，藥物各劑量組比模型組血鈣含量分別高52.4％、8％、4.3％，模型與空白無顯著性差異，藥物空白組較高；血磷含量方面，藥物各劑量組與模型組相比無顯著性差異，各組之間也無明顯的趨勢，表明枸櫞酸鐵并非如業(yè)內(nèi)推測是通過降低血磷含量來降低血鈣含量的。
三.血管鈣含量及血管堿性磷酸酶活性測定(枸櫞酸鐵的預(yù)防鈣化作用)。
1.材料雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，150～180g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心提供(合格證號SCXK京2002-0001)；尼古丁、維生素D3購自Sigma公司；45CaCl2購自美國New England Nuclear公司；堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)測定試劑盒購自北京利德曼公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。
2.方法2.1大鼠血管鈣化模型制備和實(shí)驗(yàn)分組參照Niederhoffer方法，制備大鼠血管鈣化動物模型。雄性SD大鼠50只，體重150～180g，隨機(jī)分為5組(1)血管鈣化組(VDN，n＝10)實(shí)驗(yàn)第一天9:00給大鼠肌注維生素D3(3×105U/kg)和尼古丁溶于大豆油(25mg/kg，5ml/kg)灌胃，18:00尼古丁重復(fù)灌胃1次，此后不做任何處理，常規(guī)喂養(yǎng)4周后，每天4％淀粉溶液灌胃，連續(xù)4周；(2)空白對照組(control，n＝10)給予等量大豆油肌注、單純大豆油灌胃代替維生素D3和尼古丁，此后不做任何處理，常規(guī)喂養(yǎng)4周后，每天4％淀粉溶液灌胃，連續(xù)4周；(3)血管鈣化+枸櫞酸鐵低劑量組(VDN+L，或VDN+低)(n＝10)鈣化處理同(1)，每天按劑量370mg/kg給予枸櫞酸鐵，連續(xù)灌胃給藥4周；(4)血管鈣化+枸櫞酸鐵中劑量組(VDN+A，或VDN+中)(n＝10)給藥方法同(3)，劑量為740mg/kg；(5)血管鈣化+枸櫞酸鐵高劑量組(VDN+H，或VDN+高，n＝10)給藥方法同(3)，劑量為1110mg/kg枸櫞酸鐵，連續(xù)灌胃給藥4周。
各組動物常規(guī)飼養(yǎng)，3天測一次體重，每周測一次尾動脈壓。4周后，烏拉坦1g/kg腹腔注射麻醉動物，眼底取血，測定血液生化指標(biāo)；摘取心臟和全長胸腹主動脈，用生理鹽水沖洗后，心臟稱重，-70℃儲存?zhèn)溆谩?br> 2.2von Kossa染色從主動脈弓起，取1～1.5cm的胸主動脈血管條，用4％多聚甲醛固定。用石蠟包埋胸主動脈并切片，7μm，常規(guī)脫蠟、脫水；浸入1％硝酸銀溶液，在日光下照射30min后，將玻片放于5％硫代硫酸鈉溶液中1min，堿性品紅返染；脫水、透明、封片，光鏡觀察。
2.3血管鈣含量取腹主動脈約10mg，80℃烤干(2-3h)，稱重，轉(zhuǎn)移至石英杯內(nèi)，加入2mol/L的硝酸1ml，2滴高氯酸，180℃消化并烤干，冷卻后用去離子水復(fù)溶，定容至2ml。原子發(fā)射光譜在422.7nm處讀取吸光度，換算成組織的鈣含量(μmol/g dw)。
2.4ALP(alkaline phosphatase，堿性磷酸酶)活性測定取腹主動脈約10mg，以等滲PBS制備組織勻漿(勻漿緩沖液20mmol/LHEPES，pH7.4，0.2％NP-40，20mmol/L MgCl2，PBS定容至50ml)。勻漿后8000×g離心10min，吸取上清液。BCA法進(jìn)行蛋白定量。按ALP測定試劑盒說明，采用SFBC速率法測定血管組織ALP活性[U/(mg·Pro)]。具體方法將待測樣品，試劑1，試劑2按1∶50∶10的比例混合，混合物在37℃保溫60秒后，用酶標(biāo)儀在405nm處讀取2分鐘內(nèi)吸光度變化。ALP活性用ρ-2硝基苯酚作為標(biāo)準(zhǔn)值計(jì)算，1單位表示30min內(nèi)生成1nmol硝基苯酚。結(jié)果用蛋白含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
2.5血磷、血鈣含量測定大鼠麻醉后，眼底取血，采用磷鉬酸法和鄰甲酚酞絡(luò)合銅(OCPC)法測定血磷、血鈣含量(mmol/L)。
2.6大鼠尾動脈壓測定采用RBP-1B型大鼠無創(chuàng)血壓計(jì)測量大鼠尾動脈壓(mmHg)，每周一次。
2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表5實(shí)驗(yàn)各組大鼠血管鈣及血管堿性磷酸酶活性測定值比較

注x±s，n＝10，**P＜0.01，鈣化模型組與空白組比較；##P＜0.01，表5結(jié)果表明，與對照組比較，經(jīng)維生素D3和尼古丁誘導(dǎo)的血管鈣化大鼠(VDN組)的血管和心肌鈣含量分別升高。
本實(shí)驗(yàn)的VDN組動物與對照組相比血管鈣含量及血管ALP活性均顯著增高(P＜0.01)。
四、枸櫞酸鐵給藥治療三個月對于異位鈣化的治療作用1.材料雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，150～180g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心提供(合格證號SCXK京2002-0001)。尼古丁、維生素D3購自Sigma公司；45CaCl2購自美國New England Nuclear公司；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測定試劑盒購自北京利德曼公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。
2.方法2.1大鼠血管鈣化模型制備和實(shí)驗(yàn)分組參照Niederhoffer方法，制備血管鈣化動物模型。雄性SD大鼠54只，體重150～180g，隨機(jī)分為5組(1)血管鈣化模型組(VDN)(n＝12)實(shí)驗(yàn)第一天9:00給大鼠肌注維生素D3(3×105U/kg)和尼古丁溶于大豆油(25mg/kg，5ml/kg)灌胃，18:00尼古丁重復(fù)灌胃1次，此后不做任何處理，常規(guī)喂養(yǎng)4周后，每天4％淀粉溶液灌胃，連續(xù)12周；(2)空白對照組(control)(n＝10)給予等量大豆油肌注、單純大豆油灌胃代替維生素D3和尼古丁，此后不做任何處理，常規(guī)喂養(yǎng)4周后，每天4％淀粉溶液灌胃，連續(xù)12周；(3)治療組[1]血管鈣化+枸櫞酸鐵低劑量組(VDN+L)(n＝12)鈣化處理同模型組，此后不做任何處理，常規(guī)喂養(yǎng)4周后，每天按劑量180mg/kg給予枸櫞酸鐵，連續(xù)灌胃給藥12周；[2]血管鈣化+枸櫞酸鐵中劑量組(VDN+A)(n＝10)給藥方法同(1)，劑量為370mg/kg；[3]血管鈣化+枸櫞酸鐵高劑量組(VDN+H)(n＝10)給藥方法同模型組，劑量為740mg/kg。
各組動物常規(guī)飼養(yǎng)，3天測一次體重，每周測一次尾動脈壓。16周后，烏拉坦1g/kg腹腔注射麻醉動物，眼底取血，測定血液生化指標(biāo)；摘取心臟和全長胸腹主動脈，用生理鹽水沖洗后，心臟稱重，-70℃儲存?zhèn)溆谩?br> 2.2組織45Ca沉積取胸主動脈(約20mg)，制備成0.3mm左右的組織薄片，置于1ml DMEM孵育液中，加入37kBq/mL45CaCl2，通體積分?jǐn)?shù)為95％O2-5％CO2氣體，在37℃恒溫水浴中持續(xù)平衡孵育10h后，用雙蒸水沖洗3次；烤干(80℃，2h)，稱重，取0.5mL甲酸消化組織；取0.4mL消化液置于閃爍瓶中，加4mL閃爍液，用β-液閃計(jì)數(shù)儀測45Ca2+放射活性(CPM/mg)。
2.3血管鈣含量取腹主動脈(約10mg)，烤干(80℃2～3h)，稱重，轉(zhuǎn)移至石英杯內(nèi)，加入2mol/L的硝酸1ml，2滴高氯酸，180℃硝化并烤干，冷卻后用去離子水復(fù)溶，定容至2ml。原子發(fā)射光譜在422.7nm處讀取吸光度，換算成組織的鈣含量(μmol/gdw)。
2.4 ALP(堿性磷酸酶)活性測定取腹主動脈約10mg，以等滲PBS制備組織勻漿(勻漿緩沖液20mmol/LHEPES，pH7.4，0.2％NP-40，20mmol/L MgCl2，PBS定容至50ml)。勻漿后8000×g離心10min，吸取上清液。BCA法進(jìn)行蛋白定量。按ALP測定試劑盒說明，采用SFBC速率法測定血管組織ALP活性[U/(mg·Pro)]。具體方法將待測樣品，試劑1，試劑2按1∶50∶10的比例混合，混合物在37℃保溫60秒后，用酶標(biāo)儀在405nm處讀取2分鐘內(nèi)吸光度變化。ALP活性用ρ-2硝基苯酚作為標(biāo)準(zhǔn)值計(jì)算，1單位表示30min內(nèi)生成1nmol硝基苯酚。結(jié)果用蛋白含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
2.5血磷、血鈣含量測定大鼠麻醉后，眼底取血，采用磷鉬酸法和鄰甲酚酞絡(luò)合銅(OCPC)法測定血磷、血鈣含量(mmol/L)。
2.6大鼠尾動脈壓測定采用RBP-1B型大鼠無創(chuàng)血壓計(jì)測量大鼠尾動脈壓(mmHg)，每周一次。
2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。
2.8結(jié)果見表6和7。治療三個月的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，枸櫞酸鐵治療組的鈣化明顯減輕，模型組的血壓遠(yuǎn)高于枸櫞酸鐵治療組和正常組，治療組血壓已恢復(fù)至正常水平。
表6鈣化大鼠心肌和主動脈組織一般特征(x±s)

*表示與VDN組相比有顯著性差異P＜0.05；**表示與VDN組相比有顯著性差異P＜0.01；***表示與VDN組相比有顯著性差異P＜0.005。
表7.大鼠尾動脈血壓測定結(jié)果(x±s)

*表示與VDN組相比有顯著性差異P＜0.05；**表示與VDN組相比有顯著性差異P＜0.01；***表示與VDN組相比有顯著性差異P＜0.005。
結(jié)果1.枸櫞酸鐵對大鼠血管鈣含量、ALP活性的影響枸櫞酸鐵可以有效降低維生素D3和尼古丁誘導(dǎo)的大鼠血管鈣化中血管鈣含量，抑制堿性磷酸酶(ALP)活性；與空白對照組比較，經(jīng)維生素D3和尼古丁誘導(dǎo)的血管鈣化大鼠(VDN組)的血管鈣含量升高67％，血管堿性磷酸酶活性是空白對照組的2.79倍；與模型組相比，枸櫞酸鐵低劑量組、中劑量組和高劑量組的血管鈣含量分別降低43.1％(P＜0.01)，27.3％(P＜0.01)和45.9％(P＜0.01)；堿性磷酸酶活性分別降低21.1％(P＜0.05)，16.0％和55.2％(P＜0.01)。
本發(fā)明采用與人體心血管系統(tǒng)鈣化相關(guān)性很好的大鼠VDN動物模型，具體參見Nathalie Niederhoffer，Yuri V.Bobryshev，et al.Aortic calcification produced byVitamin D3 plus nicotine.Joumal of vascular research 1997；34386-398，采用維生素D和尼古丁(VDN)造成成年大鼠的彈性動脈鈣化，其為與年齡和年齡相關(guān)的血管病理變化相關(guān)的血管鈣化動物模型。在人動脈粥樣硬化病變過程中發(fā)現(xiàn)的鈣結(jié)合蛋白--S-100，與VDN大鼠動脈中膜鈣化相關(guān)。VDN大鼠模型動脈鈣化的機(jī)理和結(jié)果與人動脈粥樣硬化血管鈣化十分相似。人動脈鈣化的基本特征是老齡或年齡相關(guān)的血管病變，如動脈粥樣硬化、糖尿病和腎臟疾病，另外，大鼠是研究與老齡和/或年齡相關(guān)的病理改變等發(fā)生血管鈣化的最常用動物模型，采用維生素D和尼古丁(VDN)造成成年大鼠的彈性動脈鈣化的強(qiáng)度與人相近，可作為用于研究人血管鈣化導(dǎo)致動脈硬化的動物模型。
為評價枸櫞酸鐵防治心血管系統(tǒng)異位鈣化的有效性，本發(fā)明采用維生素D3和尼古丁誘導(dǎo)的大鼠VDN模型，分別在建立模型同時給予枸櫞酸鐵，考察枸櫞酸鐵對VDN模型大鼠血管鈣化的影響；在建立模型后給予枸櫞酸鐵，考察枸櫞酸鐵對血管鈣化的治療作用。研究結(jié)果如下枸櫞酸鐵可有效減少VDN大鼠模型血管鈣化斑塊的產(chǎn)生、降低血管鈣含量，對血管鈣化的進(jìn)程產(chǎn)生有益療效。同時對于已經(jīng)產(chǎn)生血管鈣化的VDN大鼠，枸櫞酸鐵可以降低血管和組織鈣含量，有效減少鈣化，同時維持血壓在正常水平。
枸櫞酸鐵可以有效預(yù)防和治療心血管系統(tǒng)鈣化，同時減少血管鈣化引起的高血壓等并發(fā)癥。


圖1空白對照組von Kossa染色結(jié)果；圖2模型組von Kossa染色結(jié)果；圖3枸櫞酸鐵低劑量組von Kossa染色結(jié)果；圖4枸櫞酸鐵中劑量組von Kossa染色結(jié)果；圖5枸櫞酸鐵高劑量組von Kossa染色結(jié)果；圖6枸櫞酸鐵治療大鼠VDN誘導(dǎo)的血管鈣化模型組von Kossa染色結(jié)果；圖7枸櫞酸鐵治療大鼠VDN誘導(dǎo)的血管鈣化的小劑量組von Kossa染色結(jié)果；圖8枸櫞酸鐵治療大鼠VDN誘導(dǎo)的血管鈣化的中劑量組von Kossa染色結(jié)果；圖9枸櫞酸鐵治療大鼠VDN誘導(dǎo)的血管鈣化的大劑量組von Kossa染色結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1枸櫞酸鐵的制備參照《食品添加劑手冊》化學(xué)工業(yè)出版社收載的制備方法，采用氫氧化鐵與檸檬酸反應(yīng)制備枸櫞酸鐵。
稱取經(jīng)微粉化處理的氫氧化鐵106.9g與220.7g一水檸檬酸，置于帶攪拌的燒瓶中，加入1000ml水，用水浴加熱至60℃，持續(xù)攪拌反應(yīng)72小時，反應(yīng)終點(diǎn)判斷，吸取1ml上清液，加入10ml水，用分光光度法檢測，溶液基本澄清即達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)。
將反應(yīng)溶液在60℃以下濃縮至溶液相對密度為1.26，得褐色粘稠濃縮液。
該濃縮液在60℃以下減壓干燥，得枸櫞酸鐵粗品307g。
將上述枸櫞酸鐵置于燒杯中，加入300ml乙醇浸泡15分鐘，濾出乙醇后，繼續(xù)加入300ml乙醇，重復(fù)浸泡15分鐘，過濾在60℃以下減壓干燥即得枸櫞酸鐵成品。
實(shí)施例2枸櫞酸鐵小鼠急性毒性試驗(yàn)在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，取昆明種小鼠70只(19～21g，雌雄各半)，禁食15小時后，隨機(jī)分為7組，每組10只。用4％淀粉糊將實(shí)施例1制備的枸櫞酸鐵配制成7種濃度的均勻混懸液，設(shè)置7個劑量組，給藥劑量由高到低依次為10.00、8.00、6.40、5.12、4.10、3.28和2.62g/kg。按20ml/kg分別給予小鼠灌胃，即刻觀察并記錄給藥后動物的活動、進(jìn)食、皮膚、粘膜、糞便和死亡情況，并于給藥后兩周內(nèi)至少每天觀察一次。對死亡動物進(jìn)行尸體解剖，觀察各組織器官的變化情況。用Bliss法計(jì)算半數(shù)致死量。結(jié)果參見下表8；表8.各劑量組動物死亡數(shù)

用Bliss法計(jì)算半數(shù)致死量，其中LD50＝4.2821g/kg；95％可信限為3.7019-4.8935g/kg(見表9)。
表9.小鼠口服枸櫞酸鐵急性毒性LD50計(jì)算表(Bliss法)

回歸方程Y(Probit)＝0.53937+7.0617Log(D)半數(shù)致死量LD50＝4.2821g/kg
LD50(Feiller校正)95％可信限＝3.7019-4.8935g/kgLD5＝2.5046g/kgLD95＝7.3214g/kg小鼠口服枸櫞酸鐵的LD50為4.28g/kg，動物在給藥后即刻無明顯變化，約1小時后出現(xiàn)活動減少，狀態(tài)萎靡，呼吸困難等反應(yīng)。約1.5小時后開始出現(xiàn)死亡，死亡均發(fā)生在用藥后24小時之內(nèi)。死亡動物經(jīng)解剖，各臟器未見明顯異常。
實(shí)施例3枸櫞酸鐵治療動脈鈣化的研究將實(shí)施例1制備的枸櫞酸鐵用4％淀粉溶液制成混懸液，按不同給藥劑量灌胃給藥。
實(shí)驗(yàn)方法參照Niederhoffer方法制備大鼠血管鈣化動物模型。
雄性SD大鼠54只，體重150～180g，隨機(jī)分為5組(1)血管鈣化組(VDN)(n＝12)實(shí)驗(yàn)第一天9:00給大鼠肌注維生素D3(3×105U/kg)和尼古丁溶于大豆油(25mg/kg，5ml/kg)灌胃，18:00尼古丁重復(fù)灌胃1次，此后不做任何處理，常規(guī)喂養(yǎng)4周后，每天4％淀粉溶液灌胃，連續(xù)4周；(2)空白對照組(control，n＝10)給予等量大豆油肌注、單純大豆油灌胃代替維生素D3和尼古丁，此后不做任何處理，常規(guī)喂養(yǎng)4周后，每天4％淀粉溶液灌胃，連續(xù)4周；(3)血管鈣化+枸櫞酸鐵低劑量組(VDN+L)(n＝12)鈣化處理同(1)，此后不做任何處理，常規(guī)喂養(yǎng)4周后，每天按劑量370mg/kg給予枸櫞酸鐵，連續(xù)灌胃給藥4周；(4)血管鈣化+枸櫞酸鐵中劑量組(VDN+A)(n＝10)給藥方法同(3)，劑量為740mg/kg；(5)血管鈣化+枸櫞酸鐵高劑量組(VDN+H)(n＝10)給藥方法同(3)，劑量為1110mg/kg枸櫞酸鐵，連續(xù)灌胃給藥4周。
各組動物常規(guī)飼養(yǎng)，3天測一次體重，每周測一次尾動脈壓；8周后，烏拉坦1g/kg腹腔注射麻醉動物，眼底取血，測定血液生化指標(biāo)；摘取心臟和全長胸腹主動脈，用生理鹽水沖洗后，心臟稱重，-70℃儲存?zhèn)溆谩?br> 常規(guī)方法von Kossa染色，組織45Ca沉積，用β-液閃計(jì)數(shù)儀測45Ca2+放射活性(CPM/mg)，測血管鈣含量和ALP(堿性磷酸酶)活性，結(jié)果用蛋白含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；采用磷鉬酸法和鄰甲酚酞絡(luò)合銅法測定血磷、血鈣含量。
結(jié)果顯示枸櫞酸鐵對大鼠鈣化的影響與模型組(VDN組)相比，VDN+枸櫞酸鐵低劑量組，VDN+枸櫞酸鐵中劑量組，VDN+枸櫞酸鐵高劑量組大鼠的堿性磷酸酶的活性分別降低3.96％，7.45％，25.52％；血管組織鈣含量分別降低17.90％(P＜0.05)，4.65％，2.93％；鈣沉積分別降低19.26％(P＜0.05)，17.08％，12.90％；血漿中鈣磷含量各組與VDN組相比則沒有顯著性差異，心臟與體重比值無顯著性差異；各組大鼠的尾動脈壓較VDN組平均降低11.22％，10.2％，8.7％，均P＜0.05。
枸櫞酸鐵對大鼠血壓和血磷、血鈣濃度的影響與空白對照組相比，經(jīng)維生素D3和尼古丁誘導(dǎo)的大鼠VDN模型組的血壓和血鈣、血磷濃度沒有明顯變化；與模型組(VDN組)相比，四周給藥期間，除VDN+枸櫞酸鐵高劑量組在第二周血壓降低6.5％外，P＜0.05，其余各組在四周內(nèi)血壓沒有顯著變化。
血鈣含量方面，藥物各劑量組比模型組血鈣含量分別高52.4％、8％、4.3％，模型與空白無顯著性差異，藥物空白組較高；血磷含量方面，藥物各劑量組與模型組相比無顯著性差異，各組之間也無明顯的趨勢，表明枸櫞酸鐵并非如業(yè)內(nèi)推測是通過降低血磷含量來降低血鈣含量的。
枸櫞酸鐵的預(yù)防鈣化作用結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)的VDN組動物與對照組相比，血管鈣含量及血管ALP活性均顯著增高(P＜0.01)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1至圖9，其中圖1-5是空白組、對照組以及枸櫞酸鐵各劑量組von Kossa染色結(jié)果，圖6是枸櫞酸鐵治療大鼠VDN誘導(dǎo)的血管鈣化模型組von Kossa染色結(jié)果，圖7-9是枸櫞酸鐵治療大鼠VDN誘導(dǎo)的血管鈣化各劑量組von Kossa染色結(jié)果。
以上描述了本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式，然其并非用以限定本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員對在此公開的實(shí)施方案可進(jìn)行并不偏離本發(fā)明范疇和精神的改進(jìn)和變化。
權(quán)利要求
1.枸櫞酸鐵在制備防治血管鈣化的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的血管鈣化為心血管異位鈣化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述的心血管異位鈣化為內(nèi)膜和/或中膜鈣化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的血管鈣化為衰老伴發(fā)或引起的血管鈣化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的血管鈣化為糖尿病伴發(fā)或引起的血管鈣化。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的血管鈣化為終末期腎病伴發(fā)或引起的血管鈣化。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的血管鈣化為動脈粥樣硬化伴發(fā)或引起的血管鈣化。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其為枸櫞酸鐵在制備預(yù)防血管鈣化的藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述的預(yù)防血管鈣化包括預(yù)防由血管鈣化引起的并發(fā)癥。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其為枸櫞酸鐵在制備治療血管鈣化的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及枸櫞酸鐵在制備防治血管鈣化的藥物中的應(yīng)用，其中包括枸櫞酸鐵在防治心血管異位鈣化等方面的用途，該用途療效確切，實(shí)驗(yàn)證明，枸櫞酸鐵通過干預(yù)鈣化形成過程，可以有效抑制鈣化并有可能逆轉(zhuǎn)鈣化的發(fā)生。
文檔編號A61P13/12GK101019848SQ200710079180
公開日2007年8月22日 申請日期2007年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月17日
發(fā)明者蘇榮仁 申請人:蘇榮仁