專利名稱：仙人掌蘆薈抗癌膠囊及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種藥物，具體地說(shuō)是一種具有抗癌功能的藥物。本發(fā)明還涉及這種藥物的制備方法。
背景技術(shù)：
目前腫瘤治療中使用的療效比較好的一線藥物多為化療藥物，化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，將機(jī)體的正常細(xì)胞也同時(shí)殺傷，對(duì)人體的傷害很大，很多腫瘤患者最終并不是死于腫瘤本身，而是死于放化療的毒性，因此，開(kāi)發(fā)一種低毒有效的腫瘤治療藥物非常必要。含有多糖類成分的中藥制劑是目前常用的治療癌癥的藥物，目前的多糖類成分主要的藥理作用為免疫增強(qiáng)作用，而沒(méi)有細(xì)胞毒作用?？鼓[瘤多糖類制劑主要通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫力來(lái)達(dá)到抗腫瘤作用，在臨床上常用作腫瘤患者放化療后的輔助用藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種既有免疫增強(qiáng)作用，又有細(xì)胞毒作用的仙人掌蘆薈抗癌膠囊。本發(fā)明的目的還在于提供一種仙人掌蘆薈抗癌膠囊的制備方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的 本發(fā)明的產(chǎn)品是仙人掌與蘆薈的粗多糖的重量比為1∶1的混合物。其中 所述的仙人掌的粗多糖是采用以下方法提取所得到的提取物 將仙人掌洗凈、打漿后加1.5倍量95％乙醇，80℃水浴上回流提取90-100min，藥渣干燥后在85℃水煮3次，每次1小時(shí)；水提液減壓濃縮至稠，加4倍量95％乙醇、使醇終濃度在75％-80％，靜止48小時(shí)后抽濾；沉淀物用無(wú)水乙醇抽洗后，揮散溶劑至干，置于P2O5真空干燥器中干燥保存。
所述的蘆薈的粗多糖時(shí)采用以下方法提取所得到的提取物 將新鮮蘆薈，洗凈去刺后，置多功能打漿機(jī)中打漿；向漿液中加1.5倍量95％的乙醇，80℃水浴加熱恒溫回流提取90-100min；提取完畢后過(guò)濾，將藥渣干燥后，加3倍量蒸餾水，90℃水浴，提取60min后過(guò)濾；按上述條件水提三次，合并水提取液，加入無(wú)水乙醇使終濃度為80％，沉淀48h，過(guò)濾沉淀；用無(wú)水乙醇抽洗沉淀，揮干有機(jī)溶劑后，置P2O5干燥器中保存。
本發(fā)明的產(chǎn)品是采用這樣的方法來(lái)制備的 將仙人掌洗凈、打漿后加1.5倍量95％乙醇，80℃水浴上回流提取90-100min，藥渣干燥后在85℃水煮3次，每次1小時(shí)；水提液減壓濃縮至稠，加4倍量95％乙醇、使醇終濃度在75％-80％，靜止48小時(shí)后抽濾；沉淀物用無(wú)水乙醇抽洗后，揮散溶劑至干，置于P2O5真空干燥器中干燥保存； 將新鮮蘆薈，洗凈去刺后，置多功能打漿機(jī)中打漿；向漿液中加1.5倍量95％的乙醇，80℃水浴加熱恒溫回流提取90-100min；提取完畢后過(guò)濾，將藥渣干燥后，加3倍量蒸餾水，90℃水浴，提取60min后過(guò)濾；按上述條件水提三次，合并水提取液，加入無(wú)水乙醇使終濃度為80％，沉淀48h，過(guò)濾沉淀；用無(wú)水乙醇抽洗沉淀，揮干有機(jī)溶劑后，置P2O5干燥器中保存； 按照仙人掌與蘆薈的粗多糖的重量比為1∶1的比例將二者混合，灌裝成膠囊。
采用本發(fā)明的提取方法在提取多糖成分后，沒(méi)有進(jìn)行除蛋白的過(guò)程，即保留了仙人掌和蘆薈中的蛋白成分，多糖鏈上的蛋白結(jié)構(gòu)能夠發(fā)揮細(xì)胞毒作用。從而使本發(fā)明的產(chǎn)品既有免疫增強(qiáng)作用，又有細(xì)胞毒作用，從而很好地解決了多糖類制劑一般只能增強(qiáng)腫瘤患者的機(jī)體免疫力，而對(duì)腫瘤細(xì)胞沒(méi)有直接的殺傷作用這樣一個(gè)難題，以及化療藥物不但殺傷腫瘤細(xì)胞亦殺傷正常細(xì)胞降低機(jī)體免疫力這樣一個(gè)弊端，使患者機(jī)體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞能夠被殺傷同時(shí)又使機(jī)體免疫力增強(qiáng)。
本發(fā)明的技術(shù)效果通過(guò)以下方法來(lái)驗(yàn)證 一、本發(fā)明的產(chǎn)品對(duì)紅細(xì)胞免疫黏附腫瘤細(xì)胞能力的影響 小鼠灌胃本發(fā)明的產(chǎn)品7天后，分別接種S180和H22瘤株，繼續(xù)給藥7天后，眶靜脈取血，離心、洗滌制成紅細(xì)胞懸液(1×108/mL)待用。采用觀察免疫黏附花環(huán)的方法觀察免疫增強(qiáng)能力。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明S180荷瘤小鼠和H22荷瘤小鼠紅細(xì)胞免疫黏附腫瘤細(xì)胞的花環(huán)率較正常組均有下降。本發(fā)明的產(chǎn)品能夠顯著升高S180和H22荷瘤小鼠紅細(xì)胞免疫黏附能力(P＜0.01)，基本能夠恢復(fù)到正常生理狀態(tài)，與正常組比較P＞0.05。
表1本發(fā)明的產(chǎn)品對(duì)S180小鼠紅細(xì)胞免疫黏附腫瘤細(xì)胞能力的影響 注*與生理鹽水組比較P＜0.05，**與生理鹽水組比較P＜0.01，△與正常組比較P＞0.05 表2本發(fā)明的產(chǎn)品對(duì)H22小鼠紅細(xì)胞免疫黏附腫瘤細(xì)胞能力的影響 注*與生理鹽水組比較P＜0.05，**與生理鹽水組比較P＜0.01，△與正常組比較P＞0.05 二、本發(fā)明的產(chǎn)品對(duì)荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜唾液酸含量及膜流動(dòng)性的影響 分組及給藥及取血方法同前，分別采用唾液酸試劑盒和DPH探針標(biāo)記，熒光分光光度計(jì)的方法測(cè)定紅細(xì)胞膜唾液酸含量及膜流動(dòng)性的變化。
紅細(xì)胞膜唾液酸的含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表3、表4)表明本發(fā)明的產(chǎn)品組能夠顯著升高S180荷瘤小鼠和H22荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜唾液酸的含量(P＜0.05)。
膜流動(dòng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5、表6，表明S180荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜微黏度較正常小鼠紅細(xì)胞膜微黏度升高，即膜流動(dòng)性降低，本發(fā)明的產(chǎn)品高、中、低劑量(1g/kg，0.5g/kg，0.25g/kg)均能夠降低S180荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜的微黏度，即升高膜流動(dòng)性。
表3本發(fā)明的產(chǎn)品對(duì)S180荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜唾液酸含量的影響 注*與生理鹽水組比較P＜0.05，**與生理鹽水組比較P＜0.01 表4本發(fā)明的產(chǎn)品對(duì)H22荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜唾液酸含量的影響 注*與生理鹽水組比較P＜0.05，**與生理鹽水組比較P＜0.01 表5本發(fā)明的產(chǎn)品對(duì)S180小鼠紅細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響 注與正常組比較*P＜0.005 **P＜0.001 與陰性對(duì)照組比較△P＜0.05 △△P＜0.01 表6本發(fā)明的產(chǎn)品對(duì)H22小鼠紅細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響 注與正常組比較*P＜0.05 **P＜0.01與陰性對(duì)照組比較△P<0.05 △△P＜0.01 三、本發(fā)明的產(chǎn)品含藥血清對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 小鼠灌胃本發(fā)明的產(chǎn)品7天后，于末次給藥后2小時(shí)眼眶取血制備含藥血清，采用MTT法觀察含藥血清對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。結(jié)果表明本發(fā)明的產(chǎn)品1g·kg-1含藥血清對(duì)HepG2的抑制率達(dá)到49.85％，雖然不及經(jīng)典的化療藥5-FU，但作用一種純中藥制劑療效已經(jīng)很好，并且其毒副作用要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于5-FU。
表7本發(fā)明的產(chǎn)品含藥血清對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 四、本發(fā)明的產(chǎn)品含藥血清誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡作用的觀察 誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡作用通過(guò)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)1.本發(fā)明的產(chǎn)品含藥血清對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響；2.本發(fā)明的產(chǎn)品含藥血清對(duì)HepG2細(xì)胞DNA的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(1)采用Hoechst33258標(biāo)記，confocal技術(shù)觀察含藥血清對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)正常HepG2細(xì)胞為圓形，本發(fā)明的產(chǎn)品作用后細(xì)胞變?yōu)槎噙呅?、腎形、梭形等不規(guī)則的細(xì)胞凋亡形態(tài)；(2)細(xì)胞凋亡發(fā)生后，細(xì)胞DNA碎裂為180bp-200bp整數(shù)倍大小的凋亡小體，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察表現(xiàn)為梯狀拖尾，被稱為“DNA Ladder”，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的產(chǎn)品含藥血清誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞出現(xiàn)“DNA Ladder”，綜合以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明本發(fā)明的產(chǎn)品能夠通過(guò)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡而達(dá)到抗腫瘤作用。
1.本發(fā)明的產(chǎn)品含藥血清對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響 其結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。
2.瓊脂糖凝膠電泳觀察本發(fā)明的產(chǎn)品對(duì)HepG2 DNA的影響 其結(jié)果見(jiàn)圖3。
三、本發(fā)明的產(chǎn)品對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的影響 細(xì)胞內(nèi)Ca2+在細(xì)胞內(nèi)的第二信使中處于樞紐地位，其濃度的微量變化與細(xì)胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)。本項(xiàng)目采用Fluo-3/AM標(biāo)記，confocal技術(shù)觀察本發(fā)明的產(chǎn)品對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響，結(jié)果表明本發(fā)明的產(chǎn)品能夠升高HepG2細(xì)胞內(nèi)CA2+含量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8及圖3，采用激光掃描共聚焦顯微術(shù)觀察了本發(fā)明的產(chǎn)品對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的變化，同時(shí)對(duì)所采集的圖象進(jìn)行了定量分析，本發(fā)明的產(chǎn)品組能夠顯著升高腫瘤細(xì)胞內(nèi)Ca2+的含量，并具有一定的劑量相關(guān)性，而抗腫瘤西藥5-FU組熒光強(qiáng)度也有所升高，但與陰性組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。圖3也顯示出了同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
表8本發(fā)明的產(chǎn)品含藥血清對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的影響 與陰性對(duì)照組比較**P＜0.01 四、本發(fā)明的產(chǎn)品對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞鈣泵的活性的影響 鈣泵是細(xì)胞膜上的一種特殊蛋白，主要的生理功能是將細(xì)胞內(nèi)Ca2+由細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，以維持細(xì)胞內(nèi)外Ca2+的穩(wěn)定和正常的生理功能，在前面的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的產(chǎn)品能夠升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+，鈣泵作為一種調(diào)節(jié)Ca2+濃度的主要功能蛋白是否與其變化有關(guān)，因此在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中我們采用比色法觀察了本發(fā)明的產(chǎn)品對(duì)鈣泵活性的影響。結(jié)果表明本發(fā)明的產(chǎn)品能夠降低HepG2細(xì)胞的鈣泵活性。
表9蘆抗癌膠囊含藥血清對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞鈣泵的活性的影響 與陰性對(duì)照組比較**P＜0.01 本發(fā)明的產(chǎn)品作為一種純中藥制劑，具有毒性低、在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)增強(qiáng)機(jī)體免疫力的優(yōu)勢(shì)。本項(xiàng)目主要觀察了本發(fā)明的產(chǎn)品的免疫增強(qiáng)作用及對(duì)人肝癌細(xì)胞的殺傷作用及作用機(jī)制。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的產(chǎn)品能夠增強(qiáng)荷瘤機(jī)體的紅細(xì)胞免疫黏附能力，同時(shí)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞有較好的殺傷作用，這種殺傷作用是通過(guò)本發(fā)明的產(chǎn)品作用于腫瘤細(xì)胞的鈣泵，降低鈣泵的活性，從而減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+向細(xì)胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)，間接升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡作用機(jī)制，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生，最終達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。
本發(fā)明的產(chǎn)品作為一種粗多糖制劑，既能增強(qiáng)機(jī)體免疫力又能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑發(fā)揮細(xì)胞毒作用，這是本項(xiàng)目的創(chuàng)新之處。
四

圖1和圖2是本發(fā)明的產(chǎn)品對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響，其中圖1是陰性對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)圖；圖2是本發(fā)明的產(chǎn)品0.5g/kg組的細(xì)胞形態(tài)圖。
圖3本發(fā)明的產(chǎn)品對(duì)HepG2細(xì)胞DNA的影響的DNA Ladder電泳圖，其中1.DNA maker 2.陰性對(duì)照組3.本發(fā)明的產(chǎn)品0.5g/ml 4.本發(fā)明的產(chǎn)品1g/ml。
圖4-圖8是本發(fā)明的產(chǎn)品含藥血清對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i影響的confocal圖，其中圖4為陰性對(duì)照組；圖5為5-FU組；圖6為0.25g·kg-1組；圖7為0.50g·kg-1組；圖8為1.00g·kg-1組。
五具體實(shí)施例方式 下面舉例對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的描述 取仙人掌新鮮莖(挖除刺狀葉)1kg，洗凈，打漿后加1.5倍量95％乙醇，80℃水浴上回流提取90min，以除去單糖及其它醇溶性成分(生物堿、黃酮甙、強(qiáng)心甙、皂甙、色素)，藥渣干燥后在85℃水煮3次，每次1小時(shí)。水提液減壓濃縮至稠。加4倍量95％乙醇(使醇終濃度在75％-80％)，靜止48小時(shí)后抽濾。沉淀物用無(wú)水乙醇抽洗后，揮散溶劑至干，置于P2O5真空干燥器中干燥保存。
取新鮮蘆薈，洗凈去刺后，置多功能打漿機(jī)中打漿。將漿液置圓底燒瓶中，加1.5倍量95％的乙醇，80℃水浴加熱恒溫回流提取90min。提取完畢后過(guò)濾，將藥渣干燥后，加3倍量蒸餾水，90℃水浴，提取60min后過(guò)濾。按上述條件水提三次，合并水提取液，減壓濃縮至小體積，加入無(wú)水乙醇使終濃度為80％，沉淀48h，過(guò)濾沉淀。用無(wú)水乙醇抽洗沉淀，揮干有機(jī)溶劑后，置P2O5干燥器中保存。
取仙人掌多糖和蘆薈多糖，紫外線照射滅菌10min，按1∶1裝膠囊，0.3克/膠囊，紫外線照射滅菌30min，裝瓶。
本品為膠囊劑，內(nèi)容物為淡黃色粉末，味微甜。
水分、裝量、崩解時(shí)限、微生物限度檢查項(xiàng)均以中國(guó)藥典2005年一部相關(guān)規(guī)定為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種仙人掌蘆薈抗癌膠囊，其特征是它是仙人掌與蘆薈的粗多糖的重量比為1∶1的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的仙人掌蘆薈抗癌膠囊，其特征是所述的仙人掌的粗多糖是采用以下方法提取所得到的提取物
將仙人掌洗凈、打漿后加1.5倍量95％乙醇，80℃水浴上回流提取90-100min，藥渣干燥后在85℃水煮3次，每次1小時(shí)；水提液減壓濃縮至稠，加4倍量95％乙醇、使醇終濃度在75％-80％，靜止48小時(shí)后抽濾；沉淀物用無(wú)水乙醇抽洗后，揮散溶劑至干，置于P2O5真空干燥器中干燥保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的仙人掌蘆薈抗癌膠囊，其特征是所述的蘆薈的粗多糖時(shí)采用以下方法提取所得到的提取物
將新鮮蘆薈，洗凈去刺后，置多功能打漿機(jī)中打漿；向漿液中加1.5倍量95％的乙醇，80℃水浴加熱恒溫回流提取90-100min；提取完畢后過(guò)濾，將藥渣干燥后，加3倍量蒸餾水，90℃水浴，提取60min后過(guò)濾；按上述條件水提三次，合并水提取液，加入無(wú)水乙醇使終濃度為80％，沉淀48h，過(guò)濾沉淀；用無(wú)水乙醇抽洗沉淀，揮干有機(jī)溶劑后，置P2O5干燥器中保存。
4.一種仙人掌蘆薈抗癌膠囊的制備方法，其特征是
將仙人掌洗凈、打漿后加1.5倍量95％乙醇，80℃水浴上回流提取90-100min，藥渣干燥后在85℃水煮3次，每次1小時(shí)；水提液減壓濃縮至稠，加4倍量95％乙醇、使醇終濃度在75％-80％，靜止48小時(shí)后抽濾；沉淀物用無(wú)水乙醇抽洗后，揮散溶劑至干，置于P2O5真空干燥器中干燥保存；
將新鮮蘆薈葉，洗凈去刺后，置多功能打漿機(jī)中打漿；向漿液中加1.5倍量95％的乙醇，80℃水浴加熱恒溫回流提取90-100min；提取完畢后過(guò)濾，將藥渣干燥后，加3倍量蒸餾水，90℃水浴，提取60min后過(guò)濾；按上述條件水提三次，合并水提取液，加入無(wú)水乙醇使終濃度為80％，沉淀48h，過(guò)濾沉淀；用無(wú)水乙醇抽洗沉淀，揮干有機(jī)溶劑后，置P2O5干燥器中保存；
按照仙人掌與蘆薈的粗多糖的重量比為1∶1的比例將二者混合，灌裝成膠囊。
全文摘要
本發(fā)明提供的是一種仙人掌蘆薈抗癌膠囊及其制備方法。將仙人掌加乙醇，80℃水浴上回流提取。藥渣干燥后在85℃水煮提取3次，水提液減壓濃縮至稠，加乙醇，使醇終濃度在75％-80％，靜止48小時(shí)后抽濾；沉淀物用無(wú)水乙醇抽洗后，揮散溶劑至干。將新鮮蘆薈打漿；向漿液中加乙醇，80℃水浴加熱恒溫回流提取90min；提取完畢后過(guò)濾，將藥渣干燥后，加3倍量蒸餾水，90℃水浴，提取60min后過(guò)濾；按上述條件水提三次，加入無(wú)水乙醇使終濃度為80％，沉淀48h，過(guò)濾沉淀；用無(wú)水乙醇抽洗沉淀，揮干有機(jī)溶劑后。按照仙人掌與蘆薈的水提取物的重量比為1∶1的比例將二者混合，灌裝成膠囊。采用本發(fā)明的方法得到的產(chǎn)品既有免疫增強(qiáng)作用，又有細(xì)胞毒作用。
文檔編號(hào)A61K9/48GK101116713SQ200710072159
公開(kāi)日2008年2月6日 申請(qǐng)日期2007年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日
發(fā)明者高世勇, 季宇彬, 翔 鄒, 汲晨鋒, 張宇金 申請(qǐng)人:哈爾濱商業(yè)大學(xué)