專利名稱：：一種白花蛇舌草有效組分及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬中藥提取物，具體地說涉及從白花蛇舌草中提取的有效組分，及其制備方法，以及該有效組分在制備治療、預防腫瘤藥物中的應(yīng)用。技術(shù)背景腫瘤是一種常見病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴重的一類疾病。目前業(yè)內(nèi)對惡性腫瘤的治療主要還是以手術(shù)、放療、化療為主，但許多化學抗癌藥物在作用于靶細胞時往往累及正常細胞，造成嚴重的副反應(yīng)。植物藥的遺傳毒性不明顯，中草藥在抗癌抗突變方面有獨特的優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用前景，而且中藥在對腫瘤的輔助治療中也起到不容忽視的作用。紫杉醇即是典型的從植物中獲得的具有良好抗癌活性的天然化合物，現(xiàn)已開發(fā)為抗腫瘤藥物。目前我國危害性最為嚴重的腫瘤為肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病及淋巴瘤等。特別是肝癌的發(fā)生率近年來有所增加。值得重視，這些腫瘤的病因?qū)W、發(fā)病學及其防治，均為我國腫瘤研究的重點。尋找高效低毒的抗癌藥物以及抗癌輔助藥物是當前腫瘤研究的重要內(nèi)容。我國藥用生物資源十分豐富，其生理活性物質(zhì)是研究和發(fā)現(xiàn)新藥先導化學物，開發(fā)新藥的天然寶庫。目前，我國從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，用于開發(fā)成治療腫瘤疾病、安全性好、毒性低的新藥還很少，從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，開發(fā)成具有抗腫瘤療效的新藥，具有重要應(yīng)用價值和廣闊發(fā)展前景。白花蛇舌草01denlandiadiffusa(Willd)Roxb為茜草科植物白花蛇舌草的帶根全草，始載于《廣西中藥志》。其葉形似蛇舌，開白花，故名。別名蛇舌草，廣泛分布于長江流域及以南，主產(chǎn)福建、廣東、廣西等地。其性味苦、甘、寒，入心、肝、脾三經(jīng)，功效清熱解毒，活血化瘀，消炎止痛。民間常用此草藥治療咽喉腫痛、蛇傷疔瘡、癌腫等，現(xiàn)代研究表明，白花蛇舌草具有增強非特異性免疫作用。白花蛇舌草的化學成分主要含有蒽醌類化合物、環(huán)烯醚苷萜類、甾醇類、烷烴類等成分。白花蛇舌草具有增強動物免疫功能的作用(秦鳳華，上海免疫學雜志，1990，10(6):321-323)，對荷瘤小鼠免疫器官功能有顯著促進作用(許鳳云等，河南中醫(yī)，1997，17(4):209-212)，本品提取物對肝癌細胞H印G2有明顯的增殖抑制作用(李玉祥等，中國藥科大學學報，1999，30(1):37-42)。此外，白花蛇舌草還具有保肝利膽、消炎抗菌等作用，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可呈鎮(zhèn)靜、催眠、鎮(zhèn)痛作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種白花蛇舌草有效組分，該有效組分主要含有A(2-甲氧基-3-羥基蒽醌)，B(2-甲基-3-羥基蒽醌)兩種化合物，其中A的含量為5575%，B的含量為15~25%。優(yōu)選A的含量為6070%，B的含量為17~23%最佳選A的含量為63~68%，B的含量為1921%。本發(fā)明中，A的結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>本發(fā)明中，B的結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>本發(fā)明的另一目的是提供該白花蛇舌草有效組分的制備方法，通過以下步驟實現(xiàn)將白花蛇舌草藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液n，將洗脫液n濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。優(yōu)選的白花蛇舌草有效組分制備方法，包括下列步驟將白花蛇舌草藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1:0.81.2)，加熱回流0.8-1.2小時，提取1~3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(4753:1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(813:1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為911ml/min，柱溫為室溫，收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。最佳的白花蛇舌草有效組分制備方法，包括下列步驟將白花蛇舌草藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:l)，加熱回流l小時，提取2次，合并濾液得提取液；將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(10:1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱(ZorbaxSB-C18;21.2mmx250mm)，流動相為水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相A為80%的水溶液、流動相B為20%的乙腈溶液；45分鐘時，流動相A為5%的水溶液、流動相B為95。/。的乙腈溶液；50分鐘時，流動相A為5%的水溶液、流動相B為95%的乙腈溶液；流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段22.4~28.lmin收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。本發(fā)明的再一個目的是提供該白花蛇舌草有效組分在制備治療、預防腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的白花蛇舌草有效組分可以作為活性成分，加入藥劑學上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學上記載的方法制成制劑。本發(fā)明的白花蛇舌草有效組分還可以作為活性成分之一，還含有其他抗腫瘤藥物，加入藥劑學上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學上記載的方法制成制劑。所述藥物的制劑形式包括液體制劑、固體制劑、膠囊劑、膠丸劑。包括注射液、滴注液、粉針劑、顆粒劑、片劑、沖劑、散劑、口服液、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、崩解劑、口崩片、微丸等。本發(fā)明的有益效果為1.本發(fā)明的提取分離工藝中使用了正相硅膠柱，能有效地除去糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等雜質(zhì)，提高有效成分的含量，同時采用了制備色譜，能快速準確的得到有效成分。2.本發(fā)明提供的白花蛇舌草有效組分化學成分簡單明確，在藥理研究上更易于闡明其作用機制，在生產(chǎn)中更易于藥物的質(zhì)量控制。3.本發(fā)明提供的方法首次從白花蛇舌草中得到A、B等幾個成分的組合物，并首次將其在多種腫瘤細胞株上進行藥效篩選，得到較好的藥理活性。圖1為本發(fā)明白花蛇舌草有效組分的HPLC分析圖。圖2為本發(fā)明白花蛇舌草有效組分ELSD圖譜。具體實施方式本發(fā)明結(jié)合附圖和下面實施例進一步詳細說明本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容，該實施例僅用于說明本發(fā)明而并非對本發(fā)明的限制。實施例一白花蛇舌草有效組分的制備將200g白花蛇舌草藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液，將提取液濃縮成浸膏21.6g，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品3.6g;用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫。樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段22.4~28.lmin收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分0.16g。實施例二白花蛇舌草有效組分的制備將500g白花蛇舌草藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1:0.81.2)，加熱回流0.8-1.2小時，提取1~3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏41.8g，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(4753:1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(813:1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液n濃縮干燥后得樣品7.0g;用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為9~llml/min，柱溫為室溫。樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段22.428.1min收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分0.30g。實施例三白花蛇舌草有效組分的制備取白花蛇舌草藥材250g，將其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:l)，加熱回流1小時，提取2次，濾液合并得提取液。將提取液濃縮成浸膏得23.2g，將浸膏和硅膠拌樣，用正相硅膠柱進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作為流動相，得洗脫液I，然后改換氯仿和甲醇(10:1)作為流動相，得洗脫液II，濃縮干燥后得3.9g樣品。用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品。制備色譜的分離條件色譜柱為Agient制備柱(ZorbaxSB-C18;2L2mmx250mm)，流動相為水(A)和乙腈(B),梯度洗脫程序如下O分鐘時，流動相A為80%的水溶液、流動相B為20。/。的乙腈溶液；45分鐘時，流動相A為5。/。的水溶液、流動相B為95%的乙腈溶液；50分鐘時，流動相A為5。/。的水溶液、流動相B為95。/。的乙腈溶液；流速為10ml/min，柱溫為室溫。樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時間段22.4~28.lmin收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分0.18g。實施例四白花蛇舌草有效組分HPLC-ELSD指紋圖譜色譜條件色譜柱AgilentZorbaxSB-C18柱(4.6mmx150mm，5pm);采用梯度洗脫，流動相A相為0.2%冰醋酸水溶液，流動相B相為含0.2%冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相A為卯％的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為10%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；10分鐘時，流動相A為50%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為50%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；30分鐘時，流動相A為5%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為95%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；35分鐘時，流動相A為5%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為95°/。的0.2%冰醋酸的乙腈。溶液流速0.5mL'min";檢測波長全波長；柱溫3(TC。ELSD參數(shù)氮氣流速2.0L/min;漂移管溫度105°C。供試品溶液的制備稱取本品，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。測定方法精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，依色譜分析條件測定，即得。分析結(jié)果白花蛇舌草有效組分的HPLC-ELSD分析譜圖見圖1和圖2，兩圖中的l、2、號峰，分別是A、B。兩個峰的相對保留時間依次為16.7(A)，17.4(B)o本發(fā)明中，A的結(jié)構(gòu)式為:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>本發(fā)明中，B的結(jié)構(gòu)式為:實施例五白花蛇舌草有效組分制劑取實施例三的白花蛇舌草有效組分0.5g與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至68"C液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。實施例六白花蛇舌草有效組分制劑取實施例三的白花蛇舌草有效組分0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸鈉0.9g和蒸餾水lml，上述組分混合均勻后，冷凍干燥，分裝500支，即得。實施例七白花蛇舌草有效組分制劑取降香油1.5g，加入到13ml飽和的羥丙基e-環(huán)糊精中，攪拌溶解，濾過，濾葉低溫干燥，的降香油和羥丙基e-環(huán)糊精的包合物粉末。除上述降香油合羥丙基e-環(huán)糊精的包合物粉末外，再取實施例三的白花蛇舌草提取物0.5g、甘露醇5.5g、依地酸鈣鈉0.9g和蒸餾水2ml，上述組分混勻后，冷凍干燥，分裝300支，即得。實施例八白花蛇舌草有效組分的藥理實驗藥理模型HL60腫瘤細胞細胞培養(yǎng)與種板細胞培養(yǎng)使用RPMI1640(Gibco)藤加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，胎牛血清(四季青)10%，非必需氨基酸(Gibco)1%混合培養(yǎng)HL60細胞，密度需低于1Q6個/mL。計算需要細胞總量NT=pcel卜mL—、VT(p=2"04個/mL)，其中V產(chǎn)0.1mLx孔數(shù)+細胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10ijL，加10ML胎盤藍稀釋，計算計數(shù)板上活細胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細胞數(shù)N為NJ4x10、2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液、mL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2-Nt/Nx、。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100ijL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對照，剩余孔加入100nLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案白花蛇舌草有效組分用DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150iJL。在新的96孔板中加入220mL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88iJL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50pL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50ng/mL。孵育48h。每個濃度設(shè)4個平行復孔，每板設(shè)空白組(blank,只加培養(yǎng)液，不含細胞)，及陰性對照組(negative,細胞中加入空白溶液，空白溶液配法一加入200iJL的培養(yǎng)液，將吸取0.88IJLDMSO加入混勻)。SRB染色細胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，每孔加入40。/。(質(zhì)量/體積)的三氯乙酸(TCA)100yL固定細胞，室溫放置5min，4'C冰箱中放置1h。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中干燥后，每孔加0.4。/。的SRB100"L(1%色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min，棄去各孔內(nèi)液體后用1%乙酸洗滌5遍，去除未結(jié)合的染料，空氣中干燥后用10mmol/LTris150yL/孔溶解，振蕩5min，使用酶標儀(ELx800)測定，所用波長為490nm。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=藥物組逾一空白組難x100%陰性對照組^值一空白組力值藥效結(jié)果見表l。根據(jù)HL60腫瘤細胞抑制率結(jié)果，白花蛇舌草有效組分對抑制HL60腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.2藥理模型K562腫瘤細胞細胞培養(yǎng)與種板細胞培養(yǎng)使用RPMI1640(Gibco)[添加2g/L碳酸氫鈉]90%,小牛血清(賽樂)10%，非必需氨基酸(Gibco)1。/?；旌吓囵B(yǎng)K562細胞。計算需要細胞總量NT-pcellTnL-lxVT(p-8x103個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10^iL，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數(shù)板上活細胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液V1mL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2=NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入10(HiL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對照，剩余孔加入10(^LPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案白花蛇舌草有效組分加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心?？蓛Υ?20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150pL。在新的96孔板中加入220pL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88pL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入5(HiL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pg/mL。孵育48h。每個濃度設(shè)4(2)個平行復孔，每板設(shè)陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200pL的培養(yǎng)液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿霉素終濃度4pg/mL)。SRB染色細胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，每孔加入40%(質(zhì)量/體積)的三氯乙酸(TCA)70uL固定細胞，4。C冰箱中放置lh。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中干燥后，每孔加0.4。/。的SRB100uL(1%色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min，棄去各孔內(nèi)液體后用1%乙酸洗滌5遍，去除未結(jié)合的染料，空氣中干燥后用lOmmol/LTrisl50uL/孔溶解，振蕩5min，使用酶標儀(ELx800)測定，所用波長為490nm。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=藥物組應(yīng)-空白組應(yīng)x100%陰性對照組力值一空白組^(值藥效結(jié)果見表2。根據(jù)K562腫瘤細胞抑制率結(jié)果，白花蛇舌草有效組分對抑制K562腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.3藥理模型MCF-7腫瘤細胞細胞培養(yǎng)與種板細胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，小牛血清(賽樂)10%，非必需氨基酸(Gibco)1。/。混合培養(yǎng)MCF-7細胞。計算需要細胞總量NT-pcelhmL-lxVT(p二2x103個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取l(^L，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數(shù)板上活細胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液V1mL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2:NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100pL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對照，乘IJ余孔加入100pLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案白花蛇舌草有效組分根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心。可儲存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150^L。在新的96孔板中加入220pL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88pL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入5(^L，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pig/mL。孵育48h。每個濃度設(shè)4(2)個平行復孔，每板設(shè)陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200pL的培養(yǎng)液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿霉素終濃度4pg/mL)。MTT比色法測定取出培養(yǎng)板，去處每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液二10:1)100nL，孵育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150pL的DMSO，振蕩10min，550nm酶標儀(Elx800)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=細應(yīng)-空白歸x100%陰性對照組^值一空白組/<值藥效結(jié)果見表3。根據(jù)MCF-7腫瘤細胞抑制率結(jié)果，白花蛇舌草有效組分對抑制MCF-7腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>細胞培養(yǎng)與種板細胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，小牛血清(賽樂)10%，非必需氨基酸(Gibco)1%混合培養(yǎng)KB細胞。計算需要細胞總量NT二pcell，mL-lxVT(p二2x103個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10^iL，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數(shù)板上活細胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液V1mL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2=NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100pL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對照，剩余孔加入100iiLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案白花蛇舌草有效組分根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心?？蓛Υ?20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液15(HiL。在新的96孔板中加入220)iL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88jiL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入5(^L，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pg/mL。孵育48h。每個濃度設(shè)4(2)個平行復孔，每板設(shè)陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200mL的培養(yǎng)液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿霉素終濃度4pg/mL)。MTT比色法測定取出培養(yǎng)板，去處每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液二10:1)100fiL，孵育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150pL的DMSO，振蕩10min，550nm酶標儀(Elx,)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=藥物射值一空白組難x100%陰性對照組力值一空白組^值藥效結(jié)果見表4。根據(jù)KB腫瘤細胞抑制率結(jié)果，白花蛇舌草有效組分對抑制KB腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.5藥理模型HepG2腫瘤細胞細胞培養(yǎng)與種板細胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]^)%，胎牛血清(四季青)10%，非必需氨基酸(Gibco)1%混合培養(yǎng)HepG2細胞。計算需要細胞總量NT二pcell'mL-lxVT(p二2xl03個/mL)，其中VT-0.1mLx孔數(shù)+細胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10pL，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數(shù)板上活細胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液VlmL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2-NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100^L，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對照，剩余孔加入100pLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案白花蛇舌草有效組分根據(jù)所稱量的藥品的重量，根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心?？蓛Υ?20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150pL。在新的96孔板中加入220)iL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88^L藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50^iL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50ng/mL。孵育48h。每個濃度設(shè)4(2)個平行復孔，每板設(shè)陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200pL的培養(yǎng)液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿霉素終濃度4pg/mL)。MTT比色法測定取出培養(yǎng)板，去處每孔上清，加入培養(yǎng)液—MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液二10:1)100^L，孵育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150jiL的DMSO，振蕩10min，550nm酶標儀(Elx800)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=藥物組力值-空白組^值x1QQ%陰性對照組^值一空白組」值藥效結(jié)果見表5。根據(jù)HepG2腫瘤細胞抑制率結(jié)果，白花蛇舌草有效組分對抑制HepG2腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>權(quán)利要求1.一種白花蛇舌草有效組分，其特征是該有效組分含有化合物A2-甲氧基-3-羥基蒽醌和化合物B2-甲基-3-羥基蒽醌，其中化合物A的含量為55～75％，化合物B的含量為15～25％，A的結(jié)構(gòu)式為B的結(jié)構(gòu)式為2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白花蛇舌草有效組分的制備方法，其特征是通過以下步驟實現(xiàn)將白花蛇舌草藥材粉碎后加入1:0.8L2的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流0.81.2小時，提取13次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用47~53:1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，再用813:1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的目的物；制備色譜的分離條件為色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為9llml/min，柱溫為室溫，收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種白花蛇舌草有效組分的制備方法，其特征是所述梯度洗脫程序為O分鐘時，流動相為80%的水溶液和20%的乙腈溶液；45分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液；50分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種白花蛇舌草有效組分的制備方法，其特征是色譜分離后，在22.428.1min時間段收集溶液。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白花蛇舌草有效組分在制備治療、預防腫瘤藥物中的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種白花蛇舌草有效組分的應(yīng)用，其特征是-所制備的藥物還含有制劑允許的藥物賦形劑或載體。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種白花蛇舌草有效組分的應(yīng)用，其特征是所制備的藥物還含有其他抗腫瘤藥物。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種白花蛇舌草有效組分的應(yīng)用，其特征是所述藥物的制劑形式包括液體制劑、固體制劑、膠囊劑、膠丸劑。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種白花蛇舌草有效組分的應(yīng)用，其特征是-所述藥物的給藥方式包括口服給藥、注射給藥。全文摘要本發(fā)明提供一種白花蛇舌草有效組分，主要含有2-甲氧基-3-羥基蒽醌(A)和2-甲基-3-羥基蒽醌(B)兩種化合物，其中A的含量為55～75％，B的含量為15～25％。通過加熱提取，濃縮，硅膠柱分離，洗脫，洗脫液濃縮干燥，再用液相色譜繼續(xù)分離，收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。本發(fā)明提供的白花蛇舌草有效組分可在制備治療、預防腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明方法設(shè)計合理，能快速準確的得到有效成分，在生產(chǎn)中更易于藥物的質(zhì)量控制。文檔編號A61K45/06GK101129521SQ20071007127公開日2008年2月27日申請日期2007年9月11日優(yōu)先權(quán)日2007年9月11日發(fā)明者靂劉,強史,水文波,瞿海斌,程翼宇,靜竇,葛志偉,慶賀申請人:浙江大學