專利名稱：Tpo基因修飾的人骨髓間質(zhì)干細胞及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因修飾骨髓間質(zhì)干細胞領(lǐng)域。
技術(shù)背景促血小板生成素(thrombopoietin， TPO)是調(diào)節(jié)巨核細胞和血小板生成 的細胞因子，TPO具有啟動巨核細胞克隆形成、刺激高倍性巨核細胞生成和 成熟巨核細胞的產(chǎn)生以及支持功能性血小板生成的全程性功能。動物實驗表明，重組人TPO在恢復(fù)血小板水平、促進其他造血因子活力 的功能上比其他造血因子更為有效；臨床實驗也表明重組人TPO能有效減輕 化療引發(fā)的血小板減少。目前應(yīng)用于臨床研究的TPO主要有兩種形式由細 菌表達的經(jīng)PEG修飾的半長分子TPO (PEG-rHuMGDF)和哺乳動物細胞表 達的全長的、糖基化的TPO (rhTPO)。然而，多劑量PEG-rHuMGDF治療癌 癥患者和用于健康志愿者的實驗研究中發(fā)現(xiàn)，PEG-rHuMGDF在應(yīng)用中產(chǎn)生 一種中和抗體，這種PEG-rHuMGDF的Ig G型抗體與內(nèi)源性的TPO發(fā)生交叉 反應(yīng)，中和了它的生物學(xué)效應(yīng)，繼而發(fā)生血小板減少癥。因其副作用， PEG-rHuMGDF已于1998年9月在美國被撤出臨床試驗。而目前對于rhTPO 的研究顯示，在rfiTPOII、 III期臨床中，癌癥患者體內(nèi)幾項TPO毒性實驗結(jié) 果證實rhTPO應(yīng)用是可行的，但具有心臟、肺、血管或血液病史的患者卻仍 是排除在II、 III期臨床實驗之列的。由于反復(fù)使用重組TPO可能產(chǎn)生中和抗體的危險及其高額費用，因此， 用基因治療的策略代替注射重組TPO來治療血小板減少癥將是另一個重要出 路，有著廣闊的發(fā)展前景。骨髓間質(zhì)千細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)和分化的基質(zhì)細胞組 成骨髓微環(huán)境，能調(diào)節(jié)造血干細胞(haemopoietic stem cell, HSC)的存活、 自我更新、遷移以及分化，產(chǎn)生廣泛的細胞因子。MSCs能產(chǎn)生許多細胞因子 支持造血，例如SCF、 LIF、 SDF-1、 OSM、 BMP-4、 Flt-3、 TGF-0 、 IL-l、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-ll、 IL-12、 IL-14、 IL隱15。 MSCs中IL-6, IL-ll， LIF， SCF， TPO在轉(zhuǎn)錄水平均有表達，但是用ELISA方法能檢測到IL-6， IL-ll， LIF， SCF蛋白的表達，卻不能檢測到TPO蛋白的表達。如果用TPO基因修飾的MSCs 來支持造血細胞的生成， 一方面能使TPO協(xié)同MSCs分泌的已知或未知的細 胞因子支持造血生成；另一方面，能避免在支持造血的體系中另外加入細胞 因子。因此，TPO基因修飾的骨髓間質(zhì)干細胞將成為一種新的促進血小板生 成的支持細胞。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于用重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)TPO基因，將TPO基因轉(zhuǎn)染到人 MSCs，用TPO基因修飾的MSCs來支持造血細胞的生成。本發(fā)明的TPO基因修飾的人骨髓間質(zhì)干細胞，由重組腺相關(guān)病毒將TPO 基因介導(dǎo)轉(zhuǎn)染到人骨髓間質(zhì)干細胞而獲得。本發(fā)明的TPO基因修飾的人骨髓間質(zhì)干細胞的具體制備方法包含以下步 驟(1)克隆人胎肝TPO基因，構(gòu)建載體質(zhì)粒pAAV-TPO-IRES-hrGFP (pAAV-TPO); (2)制備rAAV-TPO病毒載體；(3)培養(yǎng)人骨髓間質(zhì)干細胞； (4)將rAAV-TPO轉(zhuǎn)染到人骨髓間質(zhì)干細胞。 ，其中，步驟(1)中的TPO基因片段通過EcoRI酶切后插入pAAV-GFP; 構(gòu)建的質(zhì)粒pAAV-TPO-IRES-hrGFP在e-globin intron序列中合成一段引物 做為測序引物ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC。為了繼續(xù)檢測TPO基因的全 長序列，分別在TPO基因的480bp位置和858bp位置合成測序引物，分別為: 5'-GCGTTTCCTGATGCTTGTAG-3' ， 5'畫CAACCTCCAGCCTGGATATT-3'。步驟(2)采用磷酸鈣共沉淀法將pAAV-TPO、 pAAV-RC、 pHelper三種 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293而制備得到rAAV-TPO病毒載體。步驟(4)將rAAV-TPO轉(zhuǎn)染到人骨髓間質(zhì)干細胞的過程為將人MSCs 用0.25n/。胰蛋白酶/0.02。/。EDTA消化后，用PBS緩沖液洗滌，計數(shù)細胞，按l 個MSCs加入105顆粒的rAAV-TPO病毒液混勻培養(yǎng)。步驟(4)中選用的人骨髓間質(zhì)干細胞最好為生長融合達到80% 90%的 第3代人MSCs。TPO基因修飾的人骨髓間質(zhì)干細胞，以及TPO基因修飾的人骨髓間質(zhì)干 細胞分泌液，可以用來制備成促血小板生成的藥物，用來治療血小板減少癥。TPO基因修飾的骨髓間質(zhì)干細胞將成為一種新的促進血小板生成的支持 細胞。用TPO基因修飾的MSCs制備成促血小板生成的藥物，由于它通過細胞分泌產(chǎn)生內(nèi)源性TPO,用于治療血小板減少，因此不存在注射人重組TPO 所出現(xiàn)的副作用，它一方面能使TPO協(xié)同MSCs分泌的己知或未知的細胞因 子支持造血生成，另一方面，能避免在支持造血的體系中另外加入細胞因子， 其支持造血細胞生成的功能比單純使用人重組TPO更勝一籌。


圖l: pAAV-TPO-IRES-GFP載體質(zhì)粒表達框示意圖；圖2:用地高辛標(biāo)記的GFP基因作探針，檢測純化后rAAV-TPO滴度的點雜交圖；圖3:不同物理滴度的rAAV-TPO轉(zhuǎn)染HEK293細胞，在100倍倒置熒光 顯微鏡下的照片；① 102顆粒/細胞 ④105顆粒/細胞② 103顆粒/細胞 106顆粒/細胞 @104顆粒/細胞圖4:體外原代培養(yǎng)第14天的人MSCs在200倍倒置顯微鏡下的照片； 圖5: RT-PCR檢測MSCs中TPO mRNA表達的電泳圖； 圖6: Western blot檢測MSCs中TPO蛋白表達的電泳圖；具體實施方式
以下結(jié)合附圖詳細說明本發(fā)明的具體實施(1) 構(gòu)建pAAV-TPO-IRES-hrGFP:從人胎肝總RNA經(jīng)RT-PCR的方法 獲得全長TPO cDNA，將TPO基因克隆至pAAV-IRES-hrGFP載體的多克隆位 點，從而構(gòu)建pAAV-TPO-IRES-hrGFP (pAAV-TPO)，其結(jié)構(gòu)如附圖1所示。pAAV-IRES-hrGFP質(zhì)粒中0 -globin intron ( 0 -珠蛋白內(nèi)含子)序列位于 EcoRI位點的上游，TPO基因片段通過EcoR I酶切后插入pAAV-GFP，故在 e-globin intron序列中合成一段引物做為測序引物。測序引物序列為 ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC。為了繼續(xù)檢測TPO基因的全長序列，分別在 TPO基因的480bp位置和858bp位置合成測序引物，分別為 5'-GCGTTTCCTGATGCTTGTAG-3'， 5'-CAACCTCCAGCCTGGATATT-3'。(2) 制備rAAV-TPO病毒載體將HEK293細胞按3 X 104/皿培養(yǎng)48-60 小時左右達到80%~85%融合，采用磷酸媽共沉淀法將pAAV-TPO、 pAAV-RC、 pHelper三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293細胞。轉(zhuǎn)染混合液配置過程為:pAAV-TPO、pAAV-RC、 pHelper各10ug/皿，1.5mol/L的CaCl2，加水至20ml，混勻組成 轉(zhuǎn)染混合液；再逐滴滴加2XHEPES20ml，充分混勻，靜置5min，待混合液 出現(xiàn)白色云霧狀，開始轉(zhuǎn)染。逐滴將混合液均勻地滴在HEK293細胞培養(yǎng)皿 中，2ml服，在100倍的顯微鏡下看到均勻的細小顆粒。繼續(xù)培養(yǎng)60 72小時 左右，顯微鏡下觀察到細胞出現(xiàn)明顯的病理改變。將細胞從培養(yǎng)皿上刮下， 室溫2000rpm離心IO分鐘，棄上清，加入PBS緩沖液(pH7.4)重懸，室溫 下2000rpm離心IO分鐘，棄上清，分離純化rAAV-TPO。通過地高辛標(biāo)記的GFP為探針的斑點雜交來測定rAAV-TPO，具體做法 為取2.5iig或者0.25ug的pAAV-GFP質(zhì)粒溶于100ul無菌雙蒸水中，以 20XSSC按1:2對倍稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)；取純化后的rAAV-TPO病毒1 u 1或0.1 " 1溶于100ii 1無菌雙蒸水中，以20XSSC按1:2對倍稀釋后點樣于尼龍膜上， 以GFP基因片斷作為探針雜交。經(jīng)過預(yù)雜交、雜交、洗膜、顯色后結(jié)果如圖 2所示。經(jīng)過計算rAAV-TPO的物理滴度為1.2X 1012 particles/ml。分別采用不同的pAAV-TPO物理滴度(l(^顆粒湖胞，103顆粒/細胞，104 顆粒/細胞，105顆粒/細胞，106顆粒/細胞)轉(zhuǎn)染HEK293細胞，結(jié)果如圖3 所示，10S顆粒/細胞是rAAV-TPO轉(zhuǎn)染細胞時較為合適的濃度。(3) 培養(yǎng)人骨髄間質(zhì)干細胞取胸外科手術(shù)切除的人肋骨用含15%胎牛 血清(FCS)的DMEM沖出骨髓細胞，1 500rpm離心10min ，棄上清及脂肪 層，用DMEM充分混勻，輕輕加到密度為1.077Xl(^g/L的淋巴細胞分離液 上，2 500rpm離心30min,收集單個核細胞層，DMEM洗滌2次。收集細胞， 調(diào)整細胞密度，按1 X 106個/咖2密度接種，培養(yǎng)條件為含15%FCS的DMEM 培養(yǎng)液，置37'C、 5%C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)(即原代，標(biāo)記為PO)。 48h 后全量換液以除去未貼壁細胞，以后每3 4天半量換液一次。待細胞長至80% 左右匯合度時，用無鈣鎂離子的PBS緩沖液洗兩次,37t:下用0.25%胰蛋白酶 /0.02%EDTA消化3 5min，用完全培養(yǎng)基終止消化，1200 rpm離心5min， 去上清，以l: 3比例傳代，各代依次記為P1,P2，P3…。原代培養(yǎng)的14天左 右接近匯合，此時細胞形態(tài)多為長梭形，類似于成纖維樣細胞(如圖4)。(4) 將rAAV-TPO轉(zhuǎn)染到人骨髓間質(zhì)干細胞取生長融合達到80%~90% 的第3代(P3)人骨髓MSCs，用0.25^胰蛋白酶/0.02。/c)EDTA消化后，用PBS 緩沖液洗滌1次，計數(shù)細胞。以105顆粒的rAAV-TPO/1個MSCs的轉(zhuǎn)染比例轉(zhuǎn)染。用100 ii 1無血清的DMEM重懸MSCs，加入100 u 1的rAAV-TPO病 毒液，混勻后，置于37'C， 5%<:02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時，每隔15分鐘彈懸 混勻1次。轉(zhuǎn)染后用PBS緩沖液洗滌2次，細胞重新置于100mm皿中培養(yǎng)。 提取未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染后的MSCs的RNA和蛋白，分別用RT-PCR和Western blot的方法檢測TPO在mRNA和蛋白水平的表達。用RT-PCR法檢測未轉(zhuǎn)染 的MSCs和rAAV介導(dǎo)TPO基因轉(zhuǎn)染的MSCs中人TPO mRNA的表達。結(jié)果 (如圖5所示)表明，病毒介導(dǎo)TPO基因轉(zhuǎn)染的MSCs中人TPO mRNA的 表達量明顯高于未轉(zhuǎn)染的MSCs中人TPO mRNA的表達量。P -actin的表達 無明顯差異。Western blot結(jié)果(如圖6所示)表明rAAV介導(dǎo)TPO基因轉(zhuǎn)染 的MSCs和胎肝陽性對照組中TPO蛋白質(zhì)表達水平明顯增加。然而，未轉(zhuǎn)染 的MSCs中未檢測到TPO蛋白質(zhì)表達，這可能與MSCs中TPO蛋白表達極低 有關(guān)0
權(quán)利要求
1. TPO基因修飾的人骨髓間質(zhì)干細胞，其特征在于所述人骨髓間質(zhì)干細胞由重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的TPO基因所修飾。
2. TPO基因修飾的人骨髓間質(zhì)干細胞的制備方法，其特征在于依次包含以下 步驟(l)克隆人胎肝TPO基因，構(gòu)建載體質(zhì)粒pAAV-TPO-IRES-hrGFP; (2) 制備rAAV-TPO病毒載體；(3)培養(yǎng)人骨髓間質(zhì)干細胞；(4)將rAAV-TPO 轉(zhuǎn)染到人骨髓間質(zhì)干細胞。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中的TPO基因片 段通過EcoR I酶切后插入pAAV-GFP;構(gòu)建的質(zhì)粒pAAV-TPO-IRES-hrGFP 在P -giobin intron序列中合成 一 段引物作為測序引物 ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC;另外，在TPO基因的480bp位置和858bp 位置合成測序引物，分別為5'-GCGTTTCCTGATGCTTGTAG-3'， 5'-CAACCTCCAGCCTGGATATT-3'。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(2)采用磷酸鈣共沉淀 法將pAAV-TPO、 pAAV-RC、 pHelper三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293而制備得到 rAAV-TPO病毒載體。
5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(4) rAAV-TPO轉(zhuǎn)染到人 骨髓間質(zhì)千細胞的過程為將人MSCs用0.25n/。胰蛋白酶/0.02Q/。EDTA消化后， 用PBS緩沖液洗滌，按1個MSCs加入105顆粒的rAAV-TPO病毒液混勻， 培養(yǎng)。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述人骨髓間質(zhì)干細胞為生長融 合達到80%~90%的第3代人MSCs。
7. TPO基因修飾的人骨髓間質(zhì)干細胞在制備促血小板生成藥物中的用途，其 特征在于用TPO基因修飾的人骨髓間質(zhì)干細胞或TPO基因修飾的人骨髓間 質(zhì)干細胞分泌液制備成促血小板生成的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了TPO基因修飾的人骨髓間質(zhì)干細胞及其制備方法和用途。該人骨髓間質(zhì)干細胞被由重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的TPO基因所修飾而得到，具體的制備方法依次包括下述步驟克隆人胎肝TPO基因，構(gòu)建載體質(zhì)粒pAAV-TPO-IRES-hrGFP；制備rAAV-TPO病毒載體；培養(yǎng)人骨髓間質(zhì)干細胞；將rAAV-TPO轉(zhuǎn)染到人骨髓間質(zhì)干細胞。本發(fā)明的TPO基因修飾的人骨髓間質(zhì)干細胞或TPO基因修飾的人骨髓間質(zhì)干細胞分泌液可以用于制備促血小板生成藥物。由于TPO基因修飾的MSCs通過細胞分泌產(chǎn)生內(nèi)源性TPO，用于治療血小板減少，因此不存在注射人重組TPO所出現(xiàn)的副作用。
文檔編號A61P7/00GK101240263SQ20071003439
公開日2008年8月13日 申請日期2007年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月7日
發(fā)明者周小瑩, 譚孟群 申請人:中南大學(xué)