專利名稱：：一種產(chǎn)生抗腫瘤化合物Norharmane的海洋放線菌的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生抗腫瘤化合物的海洋放線菌WBF9的鑒定和發(fā)酵，以及抗腫瘤化合物的分離純化和細胞毒活性，屬于微生物藥物領域。
背景技術(shù)：
：眾所周知，陸地放線菌是抗菌、抗腫瘤以及免疫抑制劑等多種藥物的重要來源。但是隨著時間的推移，從陸生放線菌中發(fā)現(xiàn)新化合物的幾率越來越低，結(jié)果白白耗費了大量的人力物力，因此有必要開發(fā)新的藥物資源。近年來，海洋放線菌逐漸成為藥物開發(fā)的重要源泉，由于其生活在高鹽、高壓、低溫和低營養(yǎng)的特殊環(huán)境中，能產(chǎn)生很多結(jié)構(gòu)獨特c作用新穎的化合物，具有陸地微生物無法比擬的優(yōu)勢。從海洋放線菌中分離到新活性化合物的數(shù)量逐年增多，包括了很多活性很高的細胞毒化合物，其中thiocoraline、salinospommideA和ECO-4601已經(jīng)進入臨床研究。因此，海洋放線菌作為一種細胞毒化合物的新來源，已經(jīng)引起廣泛的關注。為了能夠從海洋放線菌中分離到新的化合物，本實驗室已經(jīng)從威海海洋樣品中分離到116株放線菌，并篩選到一株抗腫瘤活性很好的放線菌WBF9。通過傳統(tǒng)分類和16SrDNA基因分析，將其鑒定為灰略紅鏈霉菌的一個新菌株；從其發(fā)酵液中分離到一個具有細胞毒活性很高的化合物，并對該化合物的抗腫瘤活性進行了初步的研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是鑒定海洋放線菌wBra，從其發(fā)酵液中分離抗腫瘤化合物，并且研究該化合物的細胞毒活性。本發(fā)明涉及海洋放線菌的鑒定，即經(jīng)過傳統(tǒng)分類和16SrDNA基因分析，將其鑒定為灰略紅鏈霉菌(Sre^cw^cMgn'won^em)的一個新菌株，菌株WBF9是首次從海洋中分離到的灰略紅鏈霉菌。菌株WBF9應用培養(yǎng)基(葡萄糖1%，土豆15%，酵母粉0.6%，氯化鈣0.12%，天然海水，pH7.2)進行發(fā)酵，從其發(fā)酵液中分離提取到抗腫瘤活性很強的化合物，經(jīng)MS和NMR技術(shù)將其鑒定為Norharmane，是首次從海洋放線菌中分離到該化合物。通過MTT法，發(fā)現(xiàn)該化合物對四種腫瘤細胞KB、BGC803、HepG2和SGC7卯1具有很強的細胞毒作用。圖1是海洋放線菌WBF9的孢子鏈結(jié)構(gòu)，(a)光鏡(X400)(b)掃描電鏡(X7000)圖2是以16SrDNA為基礎構(gòu)建的N-J進化樹圖3是放線菌WBF9的發(fā)酵時效曲線圖4是抗腫瘤化合物Norharmane的結(jié)構(gòu)示意5是抗腫瘤化合物Norharmane作用后，BGC803腫瘤細胞的形態(tài)變化(xl00)，a、b、c和d分別為Norharmane2.8、4.2和5.6ug/mL，以及陰性對照具體實施方式實施例11、采用插片法在高氏合成一號培養(yǎng)基上培養(yǎng)WBF9，在OlympusBH-2光學顯微鏡下觀察菌絲體(x400;圖la)，在AKASHISX-40掃描電鏡下觀察孢子絲和孢子形態(tài)(x7000;圖lb)。結(jié)果見圖l，孢子鏈呈現(xiàn)規(guī)則的螺旋型，每個孢子鏈有4-8個螺旋，有10個以上孢子；所有孢子表面都有短刺，孢子呈現(xiàn)圓形或者卵圓形；孢子直徑約0.5-1.0pm，長約0.6-1.4nm，由此可以判斷該菌株是鏈霉菌屬。2、依照國際鏈霉菌計劃(ISP)及Waksman所推薦的培養(yǎng)基配方對海洋菌株WBI^進行培養(yǎng)，并觀察培養(yǎng)特征和生理生化特性。菌株WBF9的培養(yǎng)特征菌株WBF9在典型的放線菌鑒別培養(yǎng)基上培養(yǎng)(即酵母麥芽膏瓊脂、燕麥瓊脂、淀粉無機鹽瓊脂、蛋白胨酵母粉瓊脂、酪氨酸瓊脂、葡萄糖天冬氨酸瓊脂、高氏合成瓊脂、土豆條培養(yǎng)基)。菌株在多數(shù)培養(yǎng)基上生長良好，孢子堆呈現(xiàn)灰色，無可溶性色素產(chǎn)生。菌株WBF9的部分生理生化特征能液化明膠、使牛奶凝固和胨化、水解淀粉、降解纖維素，但是不能產(chǎn)生黑色素、硫化氫。能夠利用葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖和肌醇，不能利用蔗糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。3、采用LechevaKer全細胞壁制備方法及王平快速薄層分析法對全細胞壁氨基酸和糖組份進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株WBF9細胞壁中只含L，L-二氨基庚二酸(L,L-DAP);無特征性糖，屬于細胞壁I型，糖型C，與鏈霉菌的細胞壁特征相同。4、采用酚氯仿抽提法，提取菌株總DNA。應用16SrDNA引物正向引物P1(5'-CGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和反向引物P2(5'-AAAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')進行PCR擴增。25uLPCR反應體系去離子水12.2uL，10xPCRbuffer2.5pL，MgCl22.0mM，dNTP0.4mM，PI0.6pM，P20.6pM，Taq酶1.5U，總DNA1.0ug。擴增程序為94'C預變性5min;然后94'C變性45s，55'C復性45s，72'C延伸2min進行30個循環(huán);最后于72。C延伸10min。PCR產(chǎn)物直接送上海生工生物技術(shù)公司測序。菌株WBF9的16SrDNA直接測序，提交至IJNCBI，獲得Genbank序列號為EF010987，同Genbank數(shù)據(jù)庫中已有的序列進行對比，用鄰接法(Neighbour-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，見圖2，結(jié)果表明菌株WBF9與灰略紅鏈霉菌(S^印tow少c^gn'wow^ra)親緣關系最近，其同源性為100%(圖3)。5、根據(jù)上述形態(tài)特征、生理生化特性、細胞壁組分分析以及16SrDNA的基因進化分析結(jié)果，查閱《放線菌的分類和鑒定》，將海洋放線菌WBF9鑒定為灰略紅鏈霉菌的一個新菌株。菌株WBF9是首次從海洋中分離到的灰略紅鏈霉菌。實施例21、海洋放線菌WBF9發(fā)酵實驗采用培養(yǎng)基組分為葡萄糖1%，土豆15%，酵母粉0.6%，氯化鈣0.12%，天然海水，pH7.2。將菌株WBF9的孢子接種到250mL三角瓶(含50mL培養(yǎng)基)中，28。C下200r/min搖床培養(yǎng)2d，作為種子液r在1000mL三角瓶中(含400mL培養(yǎng)基)按5%接種種子液，相同條件下培養(yǎng)10d,每隔24小時取樣lOmL，然后在4,000r/min下離心lOmin，取上清液，一部分用于測pH值和含糖量，另一部分用0.22Pm濾膜過濾除菌，保存于4'C冰箱待測抗腫瘤活性；而將菌球于9(TC烘烤至重量不再變化，測菌體干重。2、發(fā)酵液的抗腫瘤活性檢測方法將處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液(終濃度約2.5X10VmL)，按180uL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，預培養(yǎng)24h后，加入20uL待測樣品，使發(fā)酵液樣品最終稀釋倍數(shù)為10、20、40、80、160、320、640、1280、2560倍，并設陰性對照組和空白對照組(二甲基亞砜)，均設三個重復，繼續(xù)培養(yǎng)44h;然后每孔加入濃度為5mg/mL的MTT液20uL，再培養(yǎng)4h后，吸去上清，每孔加入150uL二甲基亞砜，充分溶解，將培養(yǎng)板置于酶標儀上，用490nm波長測各孔的吸光值(A)，計算抑制率，公式如下迪審脆0/陰性對照組A值-實驗組A值訓0/鵬'卿％二陰性對照組A值-空白對照組雄"000^本文應用ID5o評價發(fā)酵液樣品的抗腫瘤活性，將其定義為抑制率為50%時液體的稀釋倍數(shù)，ID5o越大表明液體樣品的抗腫瘤活性越高。ID5o值通過SPSS11.5中的probit模型進行計算。3、發(fā)酵實驗結(jié)果見圖3，從圖中可以看到發(fā)酵液的抗腫瘤活性(IDso值)、菌體量、含糖量及其pH值之間存在密切的關系。在發(fā)酵初期，細胞生物量很低、發(fā)酵液含糖量很高、發(fā)酵液活性很低；隨著放線菌菌體量的增大，發(fā)酵液的含糖量逐漸降低、抗腫瘤活性逐漸升高，培養(yǎng)基pH值從第1天的6.8降低到5.0;當放線菌進入對數(shù)生長期時，大量釋放堿性代謝產(chǎn)物，使得發(fā)酵液的pH值從5.0上升到8.0;放線菌在第7天達到平臺期，基本停止代謝，發(fā)酵液的抗腫瘤活性、菌體量、含糖類及其pH值不再發(fā)生變化。因此，發(fā)酵菌株WBF9時選擇第7天結(jié)束培養(yǎng)。實施例3根據(jù)發(fā)酵實驗結(jié)果，發(fā)酵菌株WBF9，共收集發(fā)酵液40L。將發(fā)酵液離心，收集上清液，減壓濃縮。用乙酸乙酯萃取獲得膏狀物，通過MTT法活性追蹤，采取硅膠柱層析、SephadexLH-20分子篩層析及其反相高效液相制備方法，獲得抗腫瘤活性化合物單體Norharmane。物理數(shù)據(jù)及其波譜數(shù)據(jù)如下Norharmane:白色針狀固體(乙酸乙酯)，可溶于二甲基亞砜、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑，碘化鉍鉀反應為橘紅色，ESI-MS在m/z169出現(xiàn)分子離子峰[M+H]+,分子式為CUH8N2，其不飽和度為9;MP198-199°C;TLC0.3(EtOAc);UV(MeOH)入maxnm:226、250、288、336nm?；衔锏腲-NMR、l3C-NMR、H-HCOSY、HMBC和HSQC波譜數(shù)據(jù)見Table1，其結(jié)構(gòu)見圖4。表l.抗腫瘤化合物的NMR數(shù)據(jù)(PYR-D5，500MHz，TMS)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例41、檢測Norharmane的抗腫瘤活性方法基本同實施例2中的2，不同之處固體藥品的最終濃度設定為40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125ng/mL，以順鉑為陽性藥物(CDDP)，應用IC5o評價固體藥品的抗腫瘤活性。從表2可以看出，Norharmane對四種腫瘤細胞均有抑制作用，其中對KB口腔上皮癌細胞作用最強，其ICM)為3.25±0.53yg/mL，而對HepG2肝癌細胞作用較弱，ICso為15.86±2.38ng/mL。2、將胃癌BGC803細胞接種于24孔培養(yǎng)板，每孔含0.6><104個細胞，培養(yǎng)24hr后，加入抗腫瘤化合物Norharmane，使其終濃度分別為2.8、4.2和5.6ug/mL，并于藥物作用后48hr在倒置顯微鏡下，發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化(圖5)。與陰性對,睹組相比，Norharmane處理后的細胞體積縮小、變形，與周圍細胞分離，以分散的單個形式存在，染色質(zhì)固縮，細胞槳濃縮或裂解成質(zhì)膜包繞的碎片。表2.Norharmane在體外對四種腫瘤細胞增殖的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1、一種抗腫瘤化合物Norharmane，以采自威海海洋沉積物的海洋放線菌WBF9的發(fā)酵液為原料，經(jīng)溶劑萃取和多種層析技術(shù)相結(jié)合，分離到的一種生物堿類抗腫瘤化合物，采用質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)確定了該化合物的結(jié)構(gòu)，體外實驗表明該化合物對腫瘤細胞有很強的細胞毒作用。2、權(quán)利要求1所述的海洋放線菌，其特征在于采用傳統(tǒng)分類和16SrDNA基因序列分析方法，將其鑒定為灰略紅鏈霉菌(&w;to附j;c"gnkw7^e似)的一個新菌株，菌株WBF9是首次從海洋中分離到的灰略紅鏈霉菌。3、權(quán)利要求1所述的抗腫瘤化合物Norharmane的發(fā)酵方法，其特征在于培養(yǎng)基的組成為葡萄糖1%，馬鈴薯15%，酵母粉0.6%，氯化鈣0.12%，天然海水，pH7.2。馬鈴薯處理方法去皮，切塊后用陳海水煮沸30min，四層紗布過濾，濾液作為培養(yǎng)基組分。4、權(quán)利要求1所述的發(fā)酵液抗腫瘤活性的評價方法，其特征在于采用ID5Q值(抑制率為50%時液體的稀釋倍數(shù))作為評價標準，IDso值越大表明液體樣品的抗腫瘤活性越高。5、權(quán)利要求l所述的抗腫瘤化合物Norharmane的來源，其特征在于該化合物第一次分離自海洋放線菌。6、權(quán)利要求1所述的化合物Norharmane的細胞毒活性，其特征在于該化合物對四種腫瘤細胞KB、BGC803、HepG2和SGC7901具有細胞毒作用。全文摘要本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生抗腫瘤化合物的海洋放線菌WBF9的鑒定和發(fā)酵，以及抗腫瘤化合物的分離純化和細胞毒活性，屬于微生物藥物領域。菌株WBF9經(jīng)傳統(tǒng)分類及其16SrDNA基因分析，鑒定為灰略紅鏈霉菌(Streptomycesgriseorubens)的一個新菌株，菌株WBF9是首次從海洋中分離到的灰略紅鏈霉菌。該菌株應用培養(yǎng)基(葡萄糖1％，土豆15％，酵母粉0.6％，氯化鈣0.12％，天然海水，pH7.2)進行發(fā)酵，從其發(fā)酵液中分離提取到抗腫瘤活性很強的化合物，經(jīng)MS和NMR技術(shù)將其鑒定為Norharmane，是第一次從海洋放線菌中分離到該化合物；通過MTT法，發(fā)現(xiàn)該化合物對四種腫瘤細胞KB、BGC803、HepG2和SGC7901具有細胞毒作用，有可能成為有潛力的抗腫瘤藥物。文檔編號A61P35/00GK101126102SQ20071002363公開日2008年2月20日申請日期2007年6月12日優(yōu)先權(quán)日2007年6月12日發(fā)明者亮葉,濤奚,邢瑩瑩,那廣水申請人:中國藥科大學