專利名稱：一種烏賊墨多糖硫酸化衍生物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種新的烏賊墨多糖(又稱糖胺聚糖)硫酸化衍生物及其制備方法。
背景技術(shù)：
從曼氏無針烏賊(Sepiella maindroni de Rochebrune)墨中提取得到的烏賊墨多糖是一種全新結(jié)構(gòu)的多糖，具有免疫調(diào)節(jié)、抗突變活性，與抗腫瘤藥物合用可提高抗腫瘤藥物的作用。對多糖進行結(jié)構(gòu)修飾常常會增加其生物活性或者使其產(chǎn)生新的活性。多糖的硫酸化是一種常用的化學(xué)修飾方法，研究表明硫酸化多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抑制血管生成等生物活性。但是，經(jīng)檢索，未見對烏賊墨多糖進行硫酸化結(jié)構(gòu)修飾的研究論文及專利報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于采用硫酸化方法對烏賊墨多糖進行修飾，提供一種具有抗腫瘤活性的新的多糖硫酸化衍生物及其制備方法。
本發(fā)明所述的烏賊墨多糖硫酸化衍生物，由烏賊墨多糖糖鏈上的自由羥基連接硫酸基團構(gòu)成，其特征在于所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物中硫酸基的含量以重量百分比計為7％～36％；所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物的取代度Ds為0.14～0.96；所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物的分子量范圍是3000D～45000D；其中所述烏賊墨多糖的重均分子量范圍是3000D～35000D。
上述的烏賊墨多糖硫酸化衍生物優(yōu)選形式是所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物中硫酸基的含量以重量百分比計為17％～30％；所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物的取代度Ds為0.40～0.76；所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物的分子量范圍是5000D～35000D；其中所述烏賊墨多糖的重均分子量范圍是4000D～30000D。
本發(fā)明所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物的制備方法，由以下步驟組成(1)烏賊墨多糖的硫酸化稱取烏賊墨多糖純品，用其2～10倍重量的無水甲酰胺溶解，待用；以體積比為1∶2的比例計，將氯磺酸逐滴加入甲酰胺中并溶解，制得混合溶液；將混合液逐滴加入烏賊墨多糖溶液中，于25℃～30℃下攪拌反應(yīng)2～10小時，反應(yīng)液取出后，立即加入2～6倍體積量無水乙醇終止反應(yīng)，4℃放置過夜，過濾或離心收集沉淀；將沉淀配成5％～20％水溶液，調(diào)pH至中性，加入2～4倍體積量無水乙醇沉淀；將沉淀配成5％～20％水溶液，用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH為8～10，60℃～85℃水浴加熱除氨至幾無氨味，冷卻，微孔濾膜過濾，得濾液；上述濾液用酸調(diào)pH至6.5，加入2～6倍體積量的無水乙醇沉淀，沉淀物真空干燥，得烏賊墨多糖硫酸化產(chǎn)物；(2)烏賊墨多糖硫酸化產(chǎn)物的純化將上述干燥后產(chǎn)物用蒸餾水溶解并對用蒸餾水透析1～3天，所用透析袋的分子量截留值為2000；對透析內(nèi)液進行冷凍干燥，得到烏賊墨多糖硫酸化衍生物產(chǎn)品。
上述烏賊墨多糖硫酸化衍生物的制備方法，優(yōu)選由以下步驟組成(1)烏賊墨多糖的硫酸化稱取烏賊墨多糖純品，用其4～7倍重量的無水甲酰胺溶解，待用；以體積比為1∶2的比例計，將氯磺酸逐滴加入甲酰胺中并溶解，制得混合溶液；將混合液逐滴加入烏賊墨多糖溶液中，于25℃～30℃下攪拌反應(yīng)5～10小時，反應(yīng)液取出后，立即加入3～5倍體積量無水乙醇終止反應(yīng)，4℃放置過夜，過濾或離心收集沉淀；將沉淀配成8％～15％水溶液，調(diào)pH至中性，加入2～4倍體積量無水乙醇沉淀；將沉淀配成8％～15％水溶液，用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH為8～10，65℃～75℃水浴加熱除氨至幾無氨味，冷卻，微孔濾膜過濾，得濾液；上述濾液用酸調(diào)pH至6.5，加入3～5倍體積量的無水乙醇沉淀，沉淀物真空干燥，得烏賊墨多糖硫酸化產(chǎn)物；(2)烏賊墨多糖硫酸化產(chǎn)物的純化將上述干燥后產(chǎn)物用蒸餾水溶解并對蒸餾水透析2～3天，所用透析袋的分子量截留值為2000；對透析內(nèi)液進行冷凍干燥，得到烏賊墨多糖硫酸化衍生物產(chǎn)品。
本發(fā)明所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物的制備方法，步驟簡便、成本低廉、產(chǎn)率高且產(chǎn)品純；本發(fā)明制得的烏賊墨多糖硫酸化衍生物經(jīng)實驗驗證，具有一定的抗腫瘤活性和抑制新生血管生成活性。
具體實施例方式
實施例1烏賊墨多糖硫酸化衍生物的制備。
(1)烏賊墨多糖的硫酸化稱取烏賊墨多糖0.5g，用無水甲酰胺3ml溶解。
將氯磺酸0.75ml逐滴加入甲酰胺1.5ml中，制得混合溶液。
將混合液逐滴加入烏賊墨多糖溶液中，于25～30℃下攪拌反應(yīng)6小時，反應(yīng)液取出后，立即加入3倍體積量無水乙醇終止反應(yīng)，離心收集沉淀。
將沉淀配成10％溶液，調(diào)pH至中性，加入3倍體積量無水乙醇沉淀。
將沉淀配成10％溶液，加入0.5％的亞硫酸氫鈉，用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH為9.5，65℃水浴加熱除氨至幾無氨味，冷卻，微孔濾膜過濾。
上述溶液用鹽酸調(diào)pH至6.5，加入3倍體積量的無水乙醇沉淀，沉淀物真空干燥，得烏賊墨多糖硫酸化產(chǎn)物。
(2)烏賊墨多糖硫酸化產(chǎn)物的純化將上述干燥后產(chǎn)物用適量水溶解，對蒸餾水透析3天，所用透析袋的分子量截留值為2000。
對透析內(nèi)液進行冷凍干燥，得到烏賊墨多糖硫酸化衍生物產(chǎn)品。
實施例2烏賊墨多糖硫酸化衍生物的制備方法，由以下步驟組成(1)烏賊墨多糖的硫酸化稱取烏賊墨多糖純品15g，用其5倍重量的無水甲酰胺溶解，待用；以體積比為1∶2的比例計，將氯磺酸逐滴加入甲酰胺中并溶解，制得混合溶液；將混合液逐滴加入烏賊墨多糖溶液中，于28℃下攪拌反應(yīng)5小時，反應(yīng)液取出后，立即加入4倍體積量無水乙醇終止反應(yīng)，4℃放置過夜，過濾或離心收集沉淀；將沉淀配成8％水溶液，調(diào)pH至中性，加入3倍體積量無水乙醇沉淀；將沉淀配成8％水溶液，用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH為8.5，75℃水浴加熱除氨至幾無氨味，冷卻，微孔濾膜過濾，得濾液；上述濾液用鹽酸調(diào)pH至6.5，加入3倍體積量的無水乙醇沉淀，沉淀物真空干燥，得烏賊墨多糖硫酸化產(chǎn)物；(2)烏賊墨多糖硫酸化產(chǎn)物的純化將上述干燥后產(chǎn)物用蒸餾水溶解并對蒸餾水透析2天，所用透析袋的分子量截留值為2000；對透析內(nèi)液進行冷凍干燥，得到烏賊墨多糖硫酸化衍生物產(chǎn)品。
實施例3烏賊墨多糖硫酸化衍生物的制備方法，由以下步驟組成(1)烏賊墨多糖的硫酸化稱取烏賊墨多糖純品50g，用其10倍重量的無水甲酰胺溶解，待用；以體積比為1∶2的比例計，將氯磺酸75ml逐滴加入150ml甲酰胺中并溶解，制得混合溶液；將混合液逐滴加入烏賊墨多糖溶液中，于30℃下攪拌反應(yīng)10小時，反應(yīng)液取出后，立即加入5倍體積量無水乙醇終止反應(yīng)，4℃放置過夜，過濾或離心收集沉淀；將沉淀配成15％水溶液，調(diào)pH至中性，加入4倍體積量無水乙醇沉淀；將沉淀配成15％水溶液，用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH為10，85℃水浴加熱除氨至幾無氨味，冷卻，微孔濾膜過濾，得濾液；上述濾液用酸調(diào)pH至6.5，加入6倍體積量的無水乙醇沉淀，沉淀物真空干燥，得烏賊墨多糖硫酸化產(chǎn)物；(2)烏賊墨多糖硫酸化產(chǎn)物的純化將上述干燥后產(chǎn)物對蒸餾水溶解并用蒸餾水透析3天，所用透析袋的分子量截留值為2000；對透析內(nèi)液進行冷凍干燥，得到烏賊墨多糖硫酸化衍生物產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種烏賊墨多糖硫酸化衍生物，由烏賊墨多糖糖鏈上的自由羥基連接硫酸基團構(gòu)成，其特征在于所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物中硫酸基的含量以重量百分比計為7％～36％；所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物的取代度Ds為0.14～0.96；所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物的分子量范圍是3000D～45000D；其中所述烏賊墨多糖的重均分子量范圍是3000D～35000D。
2.如權(quán)利要求1所述的烏賊墨多糖硫酸化衍生物，其特征在于所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物中硫酸基的含量以重量百分比計為17％～30％；所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物的取代度Ds為0.40～0.76；所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物的分子量范圍是5000D～35000D；其中所述烏賊墨多糖的重均分子量范圍是4000D～30000D。
3.權(quán)利要求1或2所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物的制備方法，由以下步驟組成(1)烏賊墨多糖的硫酸化稱取烏賊墨多糖純品，用其2～10倍重量的無水甲酰胺溶解，待用；以體積比為1∶2的比例計，將氯磺酸逐滴加入甲酰胺中并溶解，制得混合溶液；將混合液逐滴加入烏賊墨多糖溶液中，于25℃～30℃下攪拌反應(yīng)2～10小時，反應(yīng)液取出后，立即加入2～6倍體積量無水乙醇終止反應(yīng)，4℃放置過夜，過濾或離心收集沉淀；將沉淀配成5％～20％水溶液，調(diào)pH至中性，加入2～4倍體積量無水乙醇沉淀；將沉淀配成5％～20％水溶液，用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH為8～10，60℃～85℃水浴加熱除氨至幾無氨味，冷卻，微孔濾膜過濾，得濾液；上述濾液用酸調(diào)pH至6.5，加入2～6倍體積量的無水乙醇沉淀，沉淀物真空干燥，得烏賊墨多糖硫酸化產(chǎn)物；(2)烏賊墨多糖硫酸化產(chǎn)物的純化將上述干燥后產(chǎn)物用蒸餾水溶解并對蒸餾水透析1～3天，所用透析袋的分子量截留值為2000；對透析內(nèi)液進行冷凍干燥，得到烏賊墨多糖硫酸化衍生物產(chǎn)品。
4.如權(quán)利要求3所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物的制備方法，由以下步驟組成(1)烏賊墨多糖的硫酸化稱取烏賊墨多糖純品，用其4～7倍重量的無水甲酰胺溶解，待用；以體積比為1∶2的比例計，將氯磺酸逐滴加入甲酰胺中并溶解，制得混合溶液；將混合液逐滴加入烏賊墨多糖溶液中，于25℃～30℃下攪拌反應(yīng)5～10小時，反應(yīng)液取出后，立即加入3～5倍體積量無水乙醇終止反應(yīng)，4℃放置過夜，過濾或離心收集沉淀；將沉淀配成8％～15％水溶液，調(diào)pH至中性，加入2～4倍體積量無水乙醇沉淀；將沉淀配成8％～15％水溶液，用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH為8～10，65℃～75℃水浴加熱除氨至幾無氨味，冷卻，微孔濾膜過濾，得濾液；上述濾液用酸調(diào)pH至6.5，加入3～5倍體積量的無水乙醇沉淀，沉淀物真空干燥，得烏賊墨多糖硫酸化產(chǎn)物；(2)烏賊墨多糖硫酸化產(chǎn)物的純化將上述干燥后產(chǎn)物用蒸餾水溶解并對蒸餾水透析2～3天，所用透析袋的分子量截留值為2000；對透析內(nèi)液進行冷凍干燥，得到烏賊墨多糖硫酸化衍生物產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種烏賊墨多糖硫酸化衍生物，所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物由烏賊墨多糖糖鏈上的自由羥基連接硫酸基團構(gòu)成；其中所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物中硫酸基的含量以重量百分比計為7％～36％；所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物的取代度Ds為0.14～0.96；所述烏賊墨多糖硫酸化衍生物的分子量范圍是3000D～45000D。本發(fā)明還公開了烏賊墨多糖硫酸化衍生物的制備方法，具有步驟簡便、成本低廉、產(chǎn)率高且產(chǎn)品純的特點；本發(fā)明制得的烏賊墨多糖硫酸化衍生物經(jīng)實驗驗證，具有一定的抗腫瘤活性和抑制新生血管生成的活性。
文檔編號A61K31/737GK101077891SQ20071001660
公開日2007年11月28日 申請日期2007年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月26日
發(fā)明者王鳳山, 李玉華, 劉純慧, 曹吉超, 劉玉紅 申請人:山東大學(xué)