專利名稱：速效胰島素的鼻內(nèi)施用的制作方法
專利說明速效胰島素的鼻內(nèi)施用
背景技術(shù)：
胰島素是一種重要的葡萄糖調(diào)節(jié)多肽激素。它是通過胰腺分泌的天然生成的激素。體內(nèi)細(xì)胞需要胰島素來除去和使用血中的葡萄糖。葡萄糖使細(xì)胞生成所需能量以進(jìn)行細(xì)胞的功能。此外，作為碳水化合物穩(wěn)態(tài)的原發(fā)性效應(yīng)物(primary effector)，胰島素對脂肪代謝有影響。它能改變肝臟釋放脂肪儲備的能力。胰島素有各種貫穿全身的藥效作用。
研究人員于1922年首次向年輕的糖尿病患者給予含有胰島素的胰腺活性提取物，并且FDA于1939年首次批準(zhǔn)胰島素。目前，用于治療的胰島素來源于牛和豬的胰腺以及重組(人)技術(shù)。第一個(gè)重組人胰島素于1982年獲FDA批準(zhǔn)。
胰島素在醫(yī)學(xué)上用于某些形式的糖尿病。糖尿病患者沒有能力攝取和使用血液的葡萄糖，因而血中的葡萄糖水平升高。在1型糖尿病中，胰腺不能產(chǎn)生足夠的胰島素。因此，需要胰島素治療。在2型糖尿病中，患者產(chǎn)生胰島素，但遍布全身的細(xì)胞不能對胰島素正常地反映。然而，胰島素也可用于2型糖尿病以克服對胰島素的細(xì)胞抗性。通過增加葡萄糖的細(xì)胞攝取和降低血液的葡萄糖濃度，胰島素預(yù)防或減少糖尿病的長期并發(fā)癥，包括對血管、眼睛、腎臟和神經(jīng)的損害。胰島素通常通過皮膚下(皮下)注射施用。優(yōu)選為腹部的皮下組織，因?yàn)橐葝u素在這個(gè)位置的吸收比其他位置的皮下組織更穩(wěn)定(consistent)。
當(dāng)胰島素首次被發(fā)現(xiàn)、并用于糖尿病患者時(shí)，僅有一種短效胰島素。這需要每天注射數(shù)次。隨著時(shí)間推移，開發(fā)出持續(xù)更長時(shí)間的新胰島素，只需更少次數(shù)的注射，但需要嚴(yán)格注意進(jìn)餐時(shí)間?，F(xiàn)在，有不同類型的胰島素可用。這使在施用的次數(shù)和時(shí)間上更靈活，且更容易保持靶血糖水平，基于患者的生活方式。胰島素可以不同的形式使用，例如速效、中效和長效。胰島素通常經(jīng)皮下注射遞送。可使用其他選擇如泵遞送、以及近來的肺部遞送。
用重組DNA技術(shù)制備的一些胰島素類似物可供臨床使用。在這些藥物中有門冬胰島素(NovoLogTM；Novo Nordisk Pharmaceuticals)，其與常規(guī)人胰島素類似，除在B28位置上天冬氨酸單取代脯氨酸之外。這種單取代減少了該分子形成六聚體的趨勢。因此，門冬胰島素在皮下注射后能被更快速地吸收，且比短效胰島素起效更快，效應(yīng)持續(xù)時(shí)間更短。
胰島素混合物也特別用于2型糖尿病患者。胰島素混合物允許用不同類型的胰島素以一種組合施用進(jìn)行治療。
可注射的胰島素有三種不同的形式瓶子、預(yù)填充的注射器和藥筒(cartridges)。該藥筒在使注射簡單化的筆型裝置中使用。人重組胰島素、賴脯胰島素(insulin lispro)、門冬胰島素(insulin aspart)和甘精胰島素(insulin glargine)都是常用的胰島素。很少使用牛胰島素和豬胰島素。常規(guī)人胰島素(Novolin R；Humulin R)以瓶子、藥筒以及預(yù)填充的注射器供應(yīng)。
NPH人胰島素(Novolin N；Humulin N)以瓶子、藥筒以及預(yù)填充的注射器供應(yīng)。70％NPH人胰島素和30％常規(guī)人胰島素(Novolin 70/30；Humulin 70/30)的混合物以瓶子、藥筒以及預(yù)填充的注射器供應(yīng)。
50％NPH人胰島素和50％常規(guī)人胰島素(Humulin 50/50)的混合物以瓶子供應(yīng)。慢人胰島素(Lente human insulin)(Novolin L；Humulin L)以瓶子供應(yīng)。超慢人胰島素(Ultralente human insulin)(Humulin U)以瓶子供應(yīng)。賴脯胰島素(Humalog)以瓶子和藥筒供應(yīng)。門冬胰島素(Novolog)以瓶子和藥筒供應(yīng)。甘精胰島素(Lantus)以瓶子和藥筒供應(yīng)。
胰島素的單體形式包括胰島素同系物，且已知為速效的，如賴谷胰島素(LysB3；GluB29)、HMR-1153(LysB3；IleB28)、HMR-1423(GlyA21、HisB31、HisB32)、門冬胰島素(AspB28)或(AspB10)、賴脯胰島素(LysB28、ProB29)。上述的每個(gè)例子中，類似物的命名法是基于氨基酸在胰島素A鏈或B鏈上特定位置取代的描述，并從該鏈N-末端編號，其中該序列的剩余部分為天然人胰島素的剩余部分。
已描述速效胰島素的干粉制劑用于肺部遞送，所述干粉制劑包括具有天然人胰島素的氨基酸序列(美國專利第6,737,045號)的胰島素。這需要進(jìn)一步開發(fā)包括速效胰島素的藥物制劑，即能在60分鐘內(nèi)提供峰值血清水平和在90分鐘內(nèi)提供葡萄糖谷值血清水平的藥物制劑。
有數(shù)種選擇可用于接受胰島素注射的患者。胰島素可手動(dòng)注射，或可借助稱為胰島素泵的小型電輸注裝置輸注至體內(nèi)。注射器可能是最常用的和最具成本效益的選擇，且對于接受混合在一起的兩種類型胰島素的患者而言是有用的。注射器的替代品是胰島素筆，其用胰島素預(yù)填充，可以是一次性的或可重復(fù)用的(用一次性的胰島素藥筒)。該裝置類似于大號的筆，其中帽下有細(xì)針，而在另一端有柱塞。刻度(dial)允許使用者調(diào)整劑量。胰島素筆也可供給最常開處方的各類型胰島素的混合物，如70/30(NPH和常規(guī)胰島素)。有些患者優(yōu)選筆而不是注射器，因?yàn)楣P攜帶和使用方便。
另一個(gè)稱作胰島素噴射注射器(jet injector)的裝置是通過使用高壓空氣射流工作以傳送胰島素的精細(xì)噴霧穿過皮膚。這對那些害怕針頭的患者是個(gè)不錯(cuò)的選擇。然而，噴射注射器需要不菲的資金投入，且不總在保險(xiǎn)涵蓋的范圍內(nèi)。
胰島素泵可以是控制某些1型糖尿病患者的更有效的方式，由于其更近似地模擬胰腺的胰島素生成。胰島素泵是緊湊的電裝置，其連接有輸注套件(或管)，所述輸注套件全天對患者施用少量且穩(wěn)定流量(稱為“基礎(chǔ)速率”)的胰島素。進(jìn)餐前，泵使用者將該泵編程以遞送速效胰島素“追加量”從而掩蓋進(jìn)餐后血糖水平相應(yīng)的升高。泵流量也可通過使用者根據(jù)需要全天手動(dòng)調(diào)整。
葡萄糖調(diào)節(jié)肽是已顯示對治療胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、妊娠期糖尿病或非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)、肥胖癥和血脂異常有治療潛力的一類肽。參見美國專利第6,506,724號；美國專利申請公開第20030036504A1號；歐洲專利第EP 1083924B1號；國際專利申請公開第WO 98/30231A1號；和國際專利申請第WO 00/73331A2號。除胰島素和胰島素類似物之外，葡萄糖調(diào)節(jié)肽包括胰高血糖素樣肽、GLP如GLP-1、Exendins(特別是Exendin-4，也稱為艾塞那肽(Exenatide))以及支鏈淀粉肽和支鏈淀粉類似物如普蘭林肽。迄今為止，已通過注射對人施用這些肽。
因而，需要開發(fā)除通過注射之外施用葡萄糖調(diào)節(jié)肽(特別是速效胰島素)的藥物制劑。



附圖1兔子研究1比較單獨(dú)PDF與PDF和吐溫的制劑的PK結(jié)果； 附圖2兔子研究2比較PDF和吐溫的制劑IN施用與NovoLog SQ施用的PK結(jié)果； 附圖3比較IN對照組、IN PDF、IN PDF和吐溫、IV和SC制劑葡萄糖％(Log線性范圍)的兔子研究1的PD結(jié)果； 附圖4比較研究1與研究2自初始起葡萄糖％數(shù)據(jù)的PD結(jié)果(線性圖)； 附圖5臨床前研究3中給藥組自初始起葡萄糖％的PD數(shù)據(jù)(線性圖)； 附圖6比較IN PDF和吐溫(有和沒有DDPC)、SC PDF和SC對照制劑的臨床前研究3給藥組的PK數(shù)據(jù)； 附圖7比較含有0.2％明膠或PG的IN PDF和吐溫(有和沒有DDPC)的臨床前研究4給藥組的PD數(shù)據(jù)； 附圖8比較含有0.2％明膠或PG的IN PDF和吐溫(有和沒有DDPC)、TDM低滲、TDM等滲、口服PDF(有和沒有PG和/或DDPC)、SC對照組的臨床前研究4給藥組的PK數(shù)據(jù)； 附圖9使用增粘劑制劑(明膠、HPMC、MC、卡波姆和CMC)的所有給藥組自初始起葡萄糖％的PD數(shù)據(jù)；和 附圖10使用增粘劑制劑(明膠、HPMC、MC、卡波姆和CMC)的所有給藥組的PK數(shù)據(jù)。
發(fā)明描述 為更好地理解本發(fā)明，提供下述定義 胰島素和胰島素類似物 目前發(fā)明主要集中在鼻內(nèi)施用速效胰島素，其能在60分鐘內(nèi)提供峰值血清水平和在90分鐘內(nèi)提供葡萄糖谷值血清水平。根據(jù)本發(fā)明，葡萄糖調(diào)節(jié)肽也包括游離堿、酸加成鹽或金屬鹽(如所述肽的鉀鹽或鈉鹽)和通過下述方法修飾的肽如酰胺化、糖基化、酰化、硫酸化、磷酸化、乙?；?、環(huán)化和其他公眾已知的共價(jià)修飾方法。
如本文所使用的術(shù)語“人胰島素”包括重組的人胰島素。
藥學(xué)上可接受的鹽包括無機(jī)酸鹽、有機(jī)胺鹽、有機(jī)酸鹽、堿土金屬鹽和其混合物。藥學(xué)上可接受的鹽合適的例子包括但不限于鹵化物、氨基葡萄糖、烷基氨基葡萄糖、硫酸鹽、鹽酸鹽、碳酸鹽、氫溴酸鹽、N，N’-二芐基乙二胺、三乙醇胺、二乙醇胺、三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、二環(huán)己胺、磷酸鹽、硫酸鹽、磺酸鹽、苯甲酸鹽、乙酸鹽、水楊酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、甲磺酸鹽、葡萄糖酸鹽、甲苯磺酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、硬脂酸鹽及其混合物。
因而，根據(jù)本發(fā)明，上述肽及其混合物結(jié)合至適用于透粘膜遞送(特別是鼻內(nèi)遞送)的藥物制劑。
肽類似物和模擬物(Mimetics) 包括在用于本發(fā)明的生物活性肽的定義中有天然的或合成的、治療活性的或預(yù)防活性的肽(包括兩個(gè)或兩個(gè)以上共價(jià)連接的氨基酸)、蛋白質(zhì)、肽或蛋白質(zhì)片段、肽或蛋白質(zhì)類似物、以及活性肽或蛋白質(zhì)經(jīng)化學(xué)修飾的衍生物或鹽。多種葡萄糖調(diào)節(jié)肽的有用類似物和模擬物被包括用于本發(fā)明，且可根據(jù)已知方法制備并測試生物活性。經(jīng)常，用于本發(fā)明的葡萄糖調(diào)節(jié)肽的肽或蛋白質(zhì)、或其他生物活性肽或蛋白質(zhì)是突變蛋白，其可通過部分置換、添加或缺失天然生成的或天然的(例如野生型的、天然生成的突變體或等位基因變異體)肽或蛋白質(zhì)序列的氨基酸而容易地獲得。此外，包括天然的肽或蛋白質(zhì)的生物活性片段。這些突變體衍生物和片段基本上保留了該天然肽或蛋白質(zhì)的希望的生物活性。在含有碳水化合物鏈的肽或蛋白質(zhì)的情況下，通過在這些碳水化合物種類上的變化標(biāo)記的生物活性變異體也包括于本發(fā)明中。
如本文所使用的術(shù)語“保守性氨基酸置換”是指具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的通用互換性(general interchangeability)。例如，一組通用可互換的具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；一組具有脂肪族羥基側(cè)鏈的氨基酸為絲氨酸和蘇氨酸；一組具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸為天冬酰胺和谷氨酰胺；一組具有芳香側(cè)鏈的氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸為賴氨酸、精氨酸和組氨酸；和一組具有含硫側(cè)鏈的氨基酸為半胱氨酸和蛋氨酸。保守性置換的例子包括非極性(疏水性)殘基對另一個(gè)殘基的置換，所述非極性(疏水性)殘基如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或蛋氨酸。同樣地，本發(fā)明包括極性(親水性)殘基的置換，如精氨酸和賴氨酸之間、谷氨酰胺和天冬酰胺之間、以及蘇氨酸和絲氨酸之間。此外，也包括堿性殘基(如賴氨酸、精氨酸或谷氨酸)對另一個(gè)殘基的置換，或酸性殘基(如天冬氨酸或谷氨酸)對另一個(gè)殘基的置換。示例性的保守性氨基酸置換基團(tuán)為纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、和天冬酰胺-谷酰胺。通過肽或蛋白質(zhì)類似物最優(yōu)地與相應(yīng)的天然肽或蛋白質(zhì)比對，并通過使用合適的分析法如粘附蛋白或受體結(jié)合分析法，以檢測選擇的生物活性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地鑒別用于本發(fā)明方法和組合物的可操作的肽和蛋白質(zhì)類似物?？刹僮鞯碾暮偷鞍踪|(zhì)類似物通常與隨相應(yīng)的天然肽或蛋白質(zhì)增加的抗體有特異性的免疫反應(yīng)性。
粘膜遞送增強(qiáng)劑 “粘膜遞送增強(qiáng)劑”定義為下述的化學(xué)品和其他賦形劑，當(dāng)其加至含有水、鹽和/或常用緩沖劑的制劑時(shí)，葡萄糖調(diào)節(jié)肽(對照制劑)產(chǎn)生如下制劑其能有效地增加葡萄糖調(diào)節(jié)肽的跨粘膜轉(zhuǎn)運(yùn)，如在濃度對時(shí)間的圖(plot)中通過最大血液、血清或腦脊液濃度(Cmax)或通過曲線下面積(AUC)測量。粘膜包括鼻、口腔、腸腔、頰、支氣管肺、陰道和直腸的粘膜表面，以及實(shí)際上包括襯砌(lining)在所有與外部相通的體腔或通道的所有分泌粘液的膜。粘膜遞送增強(qiáng)劑有時(shí)稱為“載體”。
“無內(nèi)毒素的制劑”是指包括葡萄糖調(diào)節(jié)肽和一種或多種粘膜遞送增強(qiáng)劑的制劑，所述粘膜遞送增強(qiáng)劑基本上沒有內(nèi)毒素和/或相關(guān)的熱原物質(zhì)。內(nèi)毒素包括禁閉(confined)在微生物中的毒素，且只有當(dāng)該微生物被破壞或死去時(shí)才釋放。熱原物質(zhì)包括來自細(xì)菌和其他微生物外膜的引起發(fā)熱的熱穩(wěn)定物質(zhì)(糖蛋白)。如果對人施用，這些物質(zhì)都能引起發(fā)熱、低血壓和休克。生產(chǎn)無內(nèi)毒素的制劑需要特殊的裝備、專家技術(shù)人員，且比制備非無內(nèi)毒素的制劑明顯地更昂貴。因?yàn)樵趯X動(dòng)物輸注內(nèi)毒素的同時(shí)靜脈內(nèi)施用GLP或糊精，已顯示能預(yù)防與單獨(dú)施用內(nèi)毒素相關(guān)的低血壓甚至死亡(美國專利第4,839,343號)，所以并未預(yù)期到生產(chǎn)這些和其他葡萄糖調(diào)節(jié)肽治療劑的無內(nèi)毒素制劑對非腸道外(非注射)施用是必需的。
非輸注施用 “非輸注施用”是指不涉及直接注射入動(dòng)脈或靜脈的任何遞送方法，即推動(dòng)或驅(qū)使(通常為流體)至某處的方法，特別是借助針、注射器或其他侵入性(invasive)方法引入至身體部位。非輸注施用包括皮下注射、肌內(nèi)注射、腹腔注射和遞送至粘膜的非注射方法。
遞送的方法和組合物 對哺乳動(dòng)物受治療者粘膜施用葡萄糖調(diào)節(jié)肽的改進(jìn)方法和組合物優(yōu)化了葡萄糖調(diào)節(jié)肽的劑量時(shí)間表。本發(fā)明提供了與一種或多種粘膜遞送增強(qiáng)劑配制的葡萄糖調(diào)節(jié)肽的粘膜遞送，其中葡萄糖調(diào)節(jié)肽劑量釋放在粘膜施用后基本上正常化和/或在葡萄糖調(diào)節(jié)肽的有效遞送期間持續(xù)釋放，其持續(xù)釋放的范圍從約0.1-2.0小時(shí)；0.4-1.5小時(shí)；0.7-1.5小時(shí)；或0.8-1.0小時(shí)。通過利用本發(fā)明方法和組合物的外源性葡萄糖調(diào)節(jié)肽的重復(fù)施用，可促進(jìn)所達(dá)到的葡萄糖調(diào)節(jié)肽的持續(xù)釋放。對哺乳動(dòng)物受治療者粘膜施用葡萄糖調(diào)節(jié)肽的改進(jìn)組合物和方法優(yōu)化了葡萄糖調(diào)節(jié)肽的劑量時(shí)間表。本發(fā)明提供了改進(jìn)的粘膜(如鼻)遞送制劑，所述制劑包括與一種或多種粘膜遞送增強(qiáng)劑和一種或多種任選的持續(xù)釋放增強(qiáng)劑組合的葡萄糖調(diào)節(jié)肽。本發(fā)明的粘膜遞送增強(qiáng)劑在遞送中產(chǎn)生有效的增加，例如增加最大血漿濃度(Cmax)以增強(qiáng)粘膜施用的葡萄糖調(diào)節(jié)肽的治療活性。在血漿中和CNS中影響葡萄糖調(diào)節(jié)肽的治療活性的第二個(gè)因素是停留時(shí)間(RT)。與鼻內(nèi)遞送增強(qiáng)劑組合的持續(xù)釋放增強(qiáng)劑增加了Cmax以及延長了葡萄糖調(diào)節(jié)肽的停留時(shí)間(RT)。本文公開了聚合物遞送運(yùn)載體(vihicle)和其他試劑，例如聚乙二醇(PEG)，以及本發(fā)明產(chǎn)生增強(qiáng)持續(xù)釋放的制劑的方法。
本發(fā)明提供改進(jìn)的葡萄糖調(diào)節(jié)肽遞送方法和劑型，其用于治療與下述疾病或病癥相關(guān)的癥狀包括糖尿病、高血糖、血脂異常、誘導(dǎo)個(gè)體的飽腹感、促進(jìn)個(gè)體的體重減輕、肥胖癥、結(jié)腸癌、前列腺癌、或哺乳動(dòng)物受治療者的其他癌癥。
在本發(fā)明的粘膜遞送制劑和方法中，葡萄糖調(diào)節(jié)肽經(jīng)常與適用于粘膜遞送的載體或運(yùn)載體組合或協(xié)同施用。如本文所使用的術(shù)語“載體”是指藥學(xué)上可接受的固體或液體填充劑、稀釋劑或包封材料。含水的液體載體可包括藥學(xué)上可接受的添加劑，如酸化劑、堿化劑、抗微生物防腐劑、抗氧化劑、緩沖劑、螯合劑、絡(luò)合劑、增溶劑、保濕劑、溶劑、懸浮劑和/或增粘劑、等張劑(tonicity agent)、潤濕劑或其他生物相容性材料。上述種類所列的成分列表(tabulation)可參見U.S.Pharmacopeia National Formulary，1857-1859，1990。能用作藥學(xué)上可接受的載體的材料的一些例子有糖(如乳糖、葡萄糖和蔗糖)、淀粉(如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉)、纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和纖維素乙酸酯)、粉末狀的西黃蓍膠、麥芽糖、明膠、滑石粉、賦形劑(如可可脂、栓劑蠟)、油(如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油)、二醇(如丙二醇)、多元醇(如丙三醇、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇)、酯(如油酸乙酯、月桂酸乙酯)、瓊脂、緩沖劑(如氫氧化鎂和氫氧化鋁)、海藻酸、無熱原水、等滲鹽水、林格氏(Ringer’)液、乙醇和磷酸鹽緩沖液、和其他在藥物制劑中使用的非毒性可相容的物質(zhì)及其混合物。
因而，保濕劑的一些例子包括丙二醇、甘油、三乙酸甘油酯、多元醇、聚合多元醇、乳酸、脲及其混合物。
緩沖劑和緩沖鹽的一些例子是基于谷氨酸鹽、乙酸鹽、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、乳酸鹽、甲酸鹽、乙醇酸鹽及其混合物。
根據(jù)制劑人員的希望，潤濕劑、乳化劑和潤滑劑(如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂)以及著色劑、釋放劑(release agent)、包衣劑、增甜劑、調(diào)味劑和增香劑(perfuming agent)、防腐劑和抗氧化劑也可存在于組合物中。藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的例子包括水溶性抗氧化劑如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；油溶性抗氧化劑如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和金屬螯合劑如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及其混合物?？膳c載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分量隨著施用的特定方式而改變。
在本發(fā)明的粘膜遞送組合物和方法中，不同的遞送增強(qiáng)劑可用來增強(qiáng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽遞送進(jìn)入或跨過粘膜表面。在這方面中，遞送葡萄糖調(diào)節(jié)肽跨過粘膜上皮細(xì)胞可“跨細(xì)胞”或“細(xì)胞旁”發(fā)生。這些通道對該葡萄糖調(diào)節(jié)肽的總通量(overall flux)和生物利用度貢獻(xiàn)的程度，取決于粘膜的環(huán)境、活性劑的物理化學(xué)性質(zhì)和該粘膜上皮細(xì)胞的性質(zhì)。細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)只涉及被動(dòng)擴(kuò)散，而跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)通過被動(dòng)、易化或主動(dòng)過程發(fā)生。通常，親水性的、被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的、極性溶質(zhì)通過細(xì)胞旁路徑擴(kuò)散，而更多的親脂性溶質(zhì)使用跨細(xì)胞路徑。就本發(fā)明任何選定的葡萄糖調(diào)節(jié)肽的細(xì)胞旁和跨細(xì)胞遞送組分而言，各種被動(dòng)吸收和主動(dòng)吸收的溶質(zhì)的吸收和生物利用度(例如，通過滲透系數(shù)或生理分析來反映)可容易地評價(jià)。對被動(dòng)吸收的藥物，細(xì)胞旁和跨細(xì)胞通道對藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的相對貢獻(xiàn)取決于pKa、分配系數(shù)、分子半徑、藥物的電荷、遞送藥物的腔環(huán)境pH以及吸收表面積。細(xì)胞旁的路徑代表鼻粘膜上皮細(xì)胞可接近的表面積相對小的部分。大體上講，已報(bào)道細(xì)胞膜所占的粘膜表面積比細(xì)胞旁空間所占的面積大一千倍。因此，更小的可接近的面積、以及基于大小和電荷的辨別大分子滲透，表明該細(xì)胞旁路徑與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的跨細(xì)胞遞送相比通常是個(gè)不太有利的路徑。令人驚奇的是，本發(fā)明的方法和組合物提供了顯著增強(qiáng)的生物治療藥物經(jīng)由所述細(xì)胞旁路徑進(jìn)入和跨過粘膜上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，本發(fā)明的方法和組合物成功地靶向細(xì)胞旁和跨細(xì)胞的路徑，可選地在單一方法或組合物中。
如本文所使用的“粘膜遞送增強(qiáng)劑”包括的試劑能增強(qiáng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽或其他生物活性化合物的釋放或溶解性(例如，從制劑遞送運(yùn)載體)、擴(kuò)散速率、滲透能力和定時(shí)、攝取、停留時(shí)間、穩(wěn)定性、有效半衰期、峰值或持續(xù)的濃度水平、清除率以及其他希望的粘膜遞送特征(例如，在遞送部位或在選擇的活性目標(biāo)部位如血流或中樞神經(jīng)系統(tǒng)測量)。因而增強(qiáng)粘膜遞送可通過任何的各種機(jī)理發(fā)生，例如通過增強(qiáng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)運(yùn)、持久性或穩(wěn)定性、以及提高膜流動(dòng)性、調(diào)控鈣和其他調(diào)整細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞旁滲透的離子的有效性或作用、增溶粘膜的組成(如脂質(zhì))、改變在粘膜組織中的非蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)巰基水平、增加跨過該粘膜表面的水流量、調(diào)控上皮細(xì)胞的連接生理學(xué)、減少上覆(overlying)于該粘膜上皮細(xì)胞的粘液粘度、減少粘液纖毛清除率和其他機(jī)理。
如本文所使用的“葡萄糖調(diào)節(jié)肽的粘膜有效量”包括葡萄糖調(diào)節(jié)肽的有效粘膜遞送至受治療者中藥物活性的靶部位，其可能涉及各種遞送或轉(zhuǎn)運(yùn)路徑。例如，給定的活性劑可通過粘膜細(xì)胞之間的間隙找到路，并到達(dá)相鄰的血管壁，同時(shí)通過另一條路徑該活性劑被動(dòng)或主動(dòng)地，可被攝取進(jìn)入粘膜細(xì)胞以在細(xì)胞內(nèi)作用，或可被排出或被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞以到達(dá)第二個(gè)靶部位如全身性循環(huán)。本發(fā)明的方法和組合物沿著一種或多種這樣選擇性的路徑促進(jìn)活性劑的易位(translocation)，或可直接作用在該粘膜組織或近端的血管組織上以促進(jìn)該活性劑的吸收或滲透。本文中吸收或滲透的促進(jìn)作用并不限于這些機(jī)理。
本文所使用的“葡萄糖調(diào)節(jié)肽在血漿中的峰值濃度(Cmax)”、“葡萄糖調(diào)節(jié)肽在血漿中濃度對時(shí)間的曲線下面積(AUC)”、“葡萄糖調(diào)節(jié)肽在血漿中達(dá)到最大血漿濃度的時(shí)間(tmax)”都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。Laursen等人，Eur.J.Endocrinology 135309-315，1996?！皾舛葘r(shí)間曲線”測量對受治療者通過鼻內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或其他腸道外施用路徑施用一定劑量的葡萄糖調(diào)節(jié)肽后，葡萄糖調(diào)節(jié)肽在受治療者血清中與時(shí)間相對的濃度。“Cmax”是在對受治療者施用單一劑量的葡萄糖調(diào)節(jié)肽后，葡萄糖調(diào)節(jié)肽在受治療者血清中的最大濃度?！皌max”是在對受治療者施用單一劑量的葡萄糖調(diào)節(jié)肽后，到達(dá)葡萄糖調(diào)節(jié)肽在受治療者血清中的最大濃度的時(shí)間。
如本文所使用的“葡萄糖調(diào)節(jié)肽在血漿中濃度對時(shí)間的曲線下面積(AUC)”根據(jù)線性梯形法則以及加上殘留面積計(jì)算。檢測到在兩個(gè)劑量之間減少23％或增加30％的概率是90％(型II誤差β＝10％)。通過比較達(dá)到最大濃度(Cmax)的時(shí)間(tmax)來評價(jià)“遞送速率”或“吸收速率”。Cmax和tmax都使用非參數(shù)方法來分析。比較肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)和鼻內(nèi)葡萄糖調(diào)節(jié)肽施用的藥代動(dòng)力學(xué)通過方差分析(ANOVA)來進(jìn)行。對于成對比較，Bonferroni-Holmes序貫方法用于評價(jià)顯著性。通過回歸分析評價(jià)在三種鼻劑量之間劑量-反應(yīng)的聯(lián)系。認(rèn)為P＜0.05時(shí)有顯著性。所給的結(jié)果為平均值+/-SEM。
盡管促進(jìn)吸收的機(jī)理可隨本發(fā)明不同的粘膜遞送增強(qiáng)劑而改變，然而本文中的有用試劑基本上沒有不利地影響該粘膜組織，并根據(jù)特殊的葡萄糖調(diào)節(jié)肽或其他活性或遞送增強(qiáng)劑而選擇。在本文中，增加粘膜組織的穿透或滲透性的遞送增強(qiáng)劑經(jīng)常導(dǎo)致該粘膜的保護(hù)性滲透性屏障有些改變。對于這些在本發(fā)明中有價(jià)值的遞送增強(qiáng)劑，通常認(rèn)為在該粘膜的滲透性中任何顯著的改變，在適于藥物遞送的所需期間的時(shí)限之內(nèi)是可逆的。而且，這應(yīng)該不是實(shí)質(zhì)的、蓄積的毒性，也不是在長期使用該粘膜的屏障性質(zhì)中誘發(fā)的任何長久有害的變化。
本發(fā)明的某些方面中，與本發(fā)明的葡萄糖調(diào)節(jié)肽協(xié)同施用或組合制劑的吸收促進(jìn)劑選自小的親水性分子，包括但不限于二甲基亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺、乙醇、丙二醇和2-吡咯烷酮?；蛘撸L鏈兩親性分子如去乙酰甲基亞砜、氮酮、十二烷基硫酸鈉、油酸和膽汁鹽可用來促進(jìn)葡萄糖調(diào)節(jié)肽的粘膜滲透。在其他方面表面活性劑(如聚山梨酯)用作輔助的化合物、處理劑(processing agents)或制劑添加劑以促進(jìn)鼻內(nèi)遞送葡萄糖調(diào)節(jié)肽。如果在遞送環(huán)境中以足夠高的濃度存在(例如，通過在治療制劑中預(yù)先施用或結(jié)合)，這些試劑如DMSO、聚乙二醇和乙醇能進(jìn)入粘膜的水相、改變粘膜的增溶性質(zhì)，由此增加葡萄糖調(diào)節(jié)肽從所述運(yùn)載體至該粘膜的分配。
因此，增溶劑的一些例子包括環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精、磺丁基醚-β-環(huán)糊精、甲基-β-環(huán)糊精以及其混合物。
用于本發(fā)明的協(xié)同施用和制備方法和組合制劑中的其他粘膜遞送增強(qiáng)劑包括但不限于混合膠束；烯胺；一氧化氮供體(如S-亞硝基-N-乙酰基-DL-青霉素胺、NOR1、NOR4-優(yōu)選這些與NO清除劑如羧基-PITO或雙氯芬酸鈉(doclofenac sodium)共同施用)；水楊酸鈉；乙酰乙酸的甘油酯(如1，3-二乙酰乙酸甘油酯或3-乙酰乙酸1，2-異亞丙基甘油酯)；和其他釋放-擴(kuò)散、或上皮細(xì)胞內(nèi)或跨上皮細(xì)胞的滲透促進(jìn)劑，所述滲透促進(jìn)劑對粘膜遞送是生理上相容的。其他吸收促進(jìn)劑選自增強(qiáng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽的粘膜遞送、穩(wěn)定性、活性或跨上皮細(xì)胞滲透的各種載體、基質(zhì)和賦形劑。這些尤其包括環(huán)糊精和β-環(huán)糊精衍生物(例如2-羥丙基-β-環(huán)糊精和七(2，6-二氧-甲基-β-環(huán)糊精))。這些化合物，任選地與一種或多種活性成分共軛和進(jìn)一步任選地在油質(zhì)性基質(zhì)中配制，提高了本發(fā)明粘膜制劑的生物利用度。然而，適用于粘膜遞送的其他吸收增強(qiáng)劑包括中鏈脂肪酸，其包括單甘油酯和甘油二酯(如癸酸鈉--椰子油的提取物，Capmul)和甘油三酯(如淀粉糊精、Estaram299、Miglyol 810)。
本發(fā)明的粘膜治療和預(yù)防的組合物可用任何適合的滲透促進(jìn)劑補(bǔ)充，所述的滲透促進(jìn)劑促進(jìn)葡萄糖調(diào)節(jié)肽跨過粘膜屏障的吸收、擴(kuò)散或滲透。所述滲透促進(jìn)劑(promoter)可以是任何藥學(xué)上可接受的促進(jìn)劑。因此，在本發(fā)明更詳細(xì)的方面，提供了組合物，所述組合物結(jié)合一種或多種選自下述的滲透促進(jìn)劑水楊酸鈉和水楊酸衍生物(乙酰水楊酸鹽、膽堿水楊酸鹽、水楊酰胺等)；氨基酸及其鹽(例如單氨基羧酸，如甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸等；羥基氨基酸，如絲氨酸；酸性氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酸等；和堿性氨基酸，如賴氨酸等-包括它們的堿金屬鹽或堿土金屬鹽)；和N-乙酰氨基酸(N-乙酰丙氨酸、N-乙酰苯丙氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-乙酰甘氨酸、N-乙酰賴氨酸、N-乙酰谷氨酸、N-乙酰脯氨酸、N-乙酰羥基脯氨酸等)以及它們的鹽(堿金屬鹽和堿土金屬鹽)。也提供了本發(fā)明的方法和組合物中作為滲透促進(jìn)劑的物質(zhì)，其通常用作乳化劑(例如油基磷酸鈉、月桂基磷酸鈉、月桂基硫酸鈉、肉豆蔻基硫酸鈉、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基酯等)、己酸、乳酸、蘋果酸和檸檬酸以及其堿金屬鹽、吡咯烷酮羧酸、烷基吡咯烷酮羧酸酯、N-烷基吡咯烷酮、脯氨酸?；サ?。
在本發(fā)明的不同方面，提供了改進(jìn)的鼻粘膜遞送制劑和方法，其允許葡萄糖調(diào)節(jié)肽和本發(fā)明的其他治療藥物遞送跨過施用和所選靶部位之間的粘膜屏障。某些制劑特別適用于所選的靶細(xì)胞、組織或器官、或甚至特殊的疾病狀態(tài)。在其他方面，制劑和方法提供了葡萄糖調(diào)節(jié)肽有效的、選擇性的胞吞作用或轉(zhuǎn)胞吞作用(transcytosis)，所述葡萄糖調(diào)節(jié)肽的特異性路線是沿著指定的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間通道。通常，該葡萄糖調(diào)節(jié)肽以有效的濃度水平被有效地加載至載體或其他遞送運(yùn)載體中，并被遞送且以穩(wěn)定的形式保持，如在鼻粘膜和/或在穿過細(xì)胞內(nèi)的室和膜至藥物作用的遠(yuǎn)程靶部位(例如血流或指定的組織、器官或細(xì)胞外的室)期間。所述葡萄糖調(diào)節(jié)肽可以在遞送運(yùn)載體中提供或另外進(jìn)行修飾(例如，以前藥的形式)，其中該葡萄糖調(diào)節(jié)肽的釋放或活化通過生理的刺激物(例如pH變化、溶酶體酶等)觸發(fā)。經(jīng)常，該葡萄糖調(diào)節(jié)肽為藥理學(xué)上惰性直到它到達(dá)活性靶部位。在最多的例子中，所述葡萄糖調(diào)節(jié)肽和其他制劑組分為非毒性、且非免疫原性。在本文中，通常選擇載體和其他制劑組分是根據(jù)它們在生理?xiàng)l件下快速降解和排泄的能力。同時(shí)，因有效貯存，制劑在劑型中化學(xué)和物理穩(wěn)定。本發(fā)明提供了各種有效控制水含量以提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的添加劑、稀釋劑、基質(zhì)和遞送運(yùn)載體。這些在這種意義上有效地用作抗聚集劑的試劑和載體材料包括例如不同官能的聚合物，如聚乙二醇、葡聚糖、二乙氨基乙基葡聚糖和羧甲基纖維素，其顯著地提高穩(wěn)定性，且減少與其混合或與其連接的肽和蛋白質(zhì)的固相聚集。在一些例子中，蛋白質(zhì)的活性或物理穩(wěn)定性也能通過將不同的添加劑加至所述肽或蛋白質(zhì)藥物的水溶液中而得到提高。例如，可以使用添加劑如多元醇(包括糖)、氨基酸、蛋白質(zhì)(如膠原和明膠)以及不同的鹽。
某些添加劑，特別是糖和其他多元醇，也能給予干燥如凍干的蛋白質(zhì)顯著的物理穩(wěn)定性。這些添加劑不僅在凍干期間而且在干燥狀態(tài)的貯存期間，均可用于本發(fā)明以保護(hù)蛋白質(zhì)抗聚集。例如，蔗糖和Ficoll 70(帶有蔗糖單位的聚合物)在不同條件下的固相培養(yǎng)期間顯示出抗肽或蛋白質(zhì)聚集的顯著的保護(hù)作用。這些添加劑也可提高嵌入聚合物基體內(nèi)的固體蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。
然而，其他的添加劑如蔗糖穩(wěn)定蛋白質(zhì)以抵抗于升高的溫度在潮濕環(huán)境中的固態(tài)聚集，如在本發(fā)明某些緩釋制劑中可能發(fā)生。蛋白質(zhì)如明膠和膠原，也用作穩(wěn)定劑或增量劑(bulking agent)以減少本文中不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的變性和聚集。這些添加劑可結(jié)合至本發(fā)明的聚合物熔解過程和組合物。例如多肽微?？赏ㄟ^將含有上述不同穩(wěn)定添加劑的溶液簡單凍干或噴霧干燥來制備。未聚集的肽和蛋白質(zhì)可由此在延長的時(shí)間周期內(nèi)獲得持續(xù)釋放。
本文提供了不同的其他制備的組分和方法、以及具體的制劑添加劑，其產(chǎn)生用于易聚集的肽和蛋白質(zhì)粘膜遞送的制劑，其中所述肽或蛋白質(zhì)通過使用增溶劑以基本上純凈且未聚集的形式穩(wěn)定。多種組分和添加劑被預(yù)期用于這些方法和制劑。這些增溶劑的示例是環(huán)糊精(CD)，其選擇性地結(jié)合多肽的疏水側(cè)鏈。已發(fā)現(xiàn)這些CD以明顯地抑制聚集的方式結(jié)合蛋白質(zhì)的疏水斑(patches)。這種抑制相對于涉及的CD和蛋白質(zhì)是選擇性的。這種蛋白質(zhì)聚集的選擇性抑制提供了本發(fā)明的鼻內(nèi)遞送方法和組合物的其他優(yōu)勢。用于本文的其他試劑包括CD二聚體、三聚體和四聚體，其具有特異性阻斷肽和蛋白質(zhì)聚集的連接體(linker)控制的可變化幾何結(jié)構(gòu)。然而，本發(fā)明結(jié)合的增溶劑和方法涉及選擇性地阻斷蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的肽和肽模擬物的使用。在一個(gè)方面，經(jīng)由使用類似地阻斷蛋白質(zhì)聚集的肽和肽模擬物，報(bào)道的CD多聚體與疏水性側(cè)鏈的特異性結(jié)合擴(kuò)展至蛋白質(zhì)。范圍廣泛的合適方法和抗聚集劑可用于結(jié)合入本發(fā)明的組合物和方法。
電荷修飾和pH控制劑和方法 為改進(jìn)增強(qiáng)遞送跨過疏水粘膜屏障的生物活性劑(其包括葡萄糖調(diào)節(jié)肽、其他活性肽和蛋白質(zhì)、以及大分子和小分子藥物)的轉(zhuǎn)運(yùn)特征，本發(fā)明也提供用于所選的生物活性劑或本文所述遞送增強(qiáng)劑的電荷修飾的技術(shù)和試劑。在這個(gè)方面，大分子的相對滲透性通常與它們的分配系數(shù)相關(guān)。分子的離子化程度取決于分子的pKa和在粘膜表面的pH，并也影響該分子的滲透性。生物活性劑(包括本發(fā)明的葡萄糖調(diào)節(jié)肽和類似物)粘膜遞送的滲透和分配可通過該活性劑或透化劑(permeabilizing agent)的電荷改變或電荷擴(kuò)散而促進(jìn)，例如這通過改變荷電的官能團(tuán)、通過調(diào)節(jié)遞送運(yùn)載體或遞送該活性劑的溶液pH、或通過改變電荷或改變pH的試劑與該活性劑協(xié)同施用而實(shí)現(xiàn)。
與這些通常的教導(dǎo)相一致，當(dāng)該活性劑以基本上非離子或中性的、荷電狀態(tài)遞送至粘膜表面時(shí)，實(shí)質(zhì)上改進(jìn)了粘膜遞送本發(fā)明方法和組合物中荷電的大分子種類(包括葡萄糖調(diào)節(jié)肽和其他生物活性肽和蛋白質(zhì))。
用于本發(fā)明的粘膜制劑的某些葡萄糖調(diào)節(jié)肽和其他生物活性肽和蛋白質(zhì)組分將被荷電修飾以使所述肽或蛋白質(zhì)的正電荷密度升高。這些修飾也可擴(kuò)展至本文所公開的肽和蛋白質(zhì)共軛物、載體和其他遞送形式的陽離子化。陽離子化提供了改變本發(fā)明的蛋白質(zhì)和大分子的生物分布和轉(zhuǎn)運(yùn)性質(zhì)的便捷的方式。以基本上維持該活性劑的生物活性且潛在地限制不良副作用(包括組織損害和毒性)的方式進(jìn)行陽離子化。
“緩沖劑”通常用于使溶液的pH保持在接近恒定的值。甚至當(dāng)少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿加至該溶液中時(shí)，通過預(yù)防或消除氫離子和氫氧根離子的大的濃度改變，緩沖劑保持溶液的pH。緩沖劑通常由弱酸和其適當(dāng)?shù)柠}(或弱堿和其適當(dāng)?shù)柠})組成。弱酸適當(dāng)?shù)柠}包括如弱酸中存在的相同陰離子(參見Lagowski，Macmillan Encyclopedia of Chemistry，第一卷，Simon和Schuster，New York，1997，第273-4頁)。Henderson-Hasselbach方程式pH＝pKa+log10[A-]/[HA]用于描述緩沖劑，且基于弱酸解離的標(biāo)準(zhǔn)方程式

。常用的緩沖劑源的例子包括下述乙酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、乳酸鹽、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、谷氨酸鹽、蛋氨酸、甲酸鹽、乙醇酸鹽。
“緩沖容量”是指在明顯的pH變化發(fā)生之前可加至緩沖溶液的酸或堿的量。如果pH值位于弱酸pK-1和pK+1的范圍之內(nèi)，則該緩沖容量是可觀的，但是如在該范圍之外，該緩沖容量則下落至很小的值。因此，給定的系統(tǒng)只在弱酸(或弱堿)的pK每側(cè)一個(gè)pH單位的范圍中有可用的緩沖作用(參見Dawson，Data for Biochemical Research，第三版，Oxford SciencePublications，1986年，第419頁)。通常，選擇合適的濃度以使該溶液的pH與所述弱酸(或弱堿)的pKa相接近(參見Lide，CRC Handbook ofChemistry and Physics，第86版，Taylor和Francis Group，2005-2006，第2-41頁)。此外，強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的溶液通常不分類為緩沖溶液，且它們不顯示在pH值2.4-11.6之間的緩沖容量。
降解酶抑制劑和方法 另一個(gè)可包括于跨粘膜制劑的賦形劑是降解酶抑制劑。示例性的可用于本發(fā)明粘膜遞送制劑和方法的粘膜粘附聚合物酶抑制劑絡(luò)合物包括，但不限于羧甲基纖維素-胃蛋白酶抑制劑(具有抗胃蛋白酶活性)；聚(丙烯酸)-Bowman-Brik抑制劑(抗糜蛋白酶)；聚(丙烯酸)-糜蛋白酶抑制劑(抗糜蛋白酶)；聚(丙烯酸)-彈性蛋白酶抑制劑(抗彈性蛋白酶)；羧甲基纖維素-彈性蛋白酶抑制劑(抗彈性蛋白酶)；聚卡波菲-彈性蛋白酶抑制劑(抗彈性蛋白酶)；殼聚糖-木瓜蛋白酶抑制劑(抗胰蛋白酶)；聚(丙烯酸)-桿菌肽(抗氨肽酶N)；殼聚糖-EDTA(抗氨肽酶N、抗羧肽酶A)；殼聚糖-EDTA-木瓜蛋白酶抑制劑(抗胰蛋白酶、抗糜蛋白酶、抗彈性蛋白酶)。如下文更詳細(xì)地描述，本發(fā)明的某些實(shí)施方案任選地結(jié)合新型殼聚糖衍生物或殼聚糖的化學(xué)修飾形式。一種用于本發(fā)明的這類新型衍生物表示為β-[1→4]-2-胍基-2-去氧-D-葡萄糖聚合物(聚-GuD)。
任何抑制酶的活性以保護(hù)生物活性劑的抑制劑可有用地用于本發(fā)明的組合物和方法。例如，用于保護(hù)生物活性的蛋白質(zhì)和肽的有用的酶抑制劑包括大豆胰蛋白酶抑制劑、exendin胰蛋白酶抑制劑、糜蛋白酶抑制劑、馬鈴薯(solanum tuberosum L.)塊莖中分離的胰蛋白酶和糜蛋白酶抑制劑。可使用抑制劑的組合或混合物。用于本發(fā)明的蛋白水解酶的其他抑制劑包括卵類粘蛋白酶、甲磺酸加貝酯(gabaxate mesylate)、α-抗胰蛋白酶、抑肽酶、抑氨肽酶A素(amastatin)、抑氨肽酶B素(bestatin)、嘌呤霉素、桿菌肽、亮肽素(leupepsin)、α2-巨球蛋白、胃蛋白酶抑制劑、蛋清或大豆胰蛋白酶抑制劑。這些和其他抑制劑能單獨(dú)或組合使用。所述抑制劑在與該生物活性劑的組合或在分別施用(例如預(yù)先施用)的制劑中，可以結(jié)合至或結(jié)合于載體例如親水聚合物，所述載體包衣在接觸該鼻粘膜的劑型表面或結(jié)合在該表面的淺層。
抑制劑如任選地結(jié)合至本發(fā)明組合物的蛋白水解酶抑制劑的量隨下述因素而變化(a)具體抑制劑的性質(zhì)；(b)存在于該分子(其可反應(yīng)以引進(jìn)與水凝膠形成單體共聚所需的烯基不飽和度)中的官能團(tuán)的數(shù)目；和(c)存在于抑制劑分子的凝集素基團(tuán)如糖苷的數(shù)目。這也取決于預(yù)期施用的具體治療劑。通常而言，酶抑制劑的有用量從所述制劑量的約0.1mg/ml至約50mg/ml，經(jīng)常從約0.2mg/ml至約25mg/ml，更通常從約0.5mg/ml至5mg/ml(即單一的蛋白酶抑制劑制劑或與抑制劑和生物活性劑的組合制劑)。
在胰蛋白酶抑制劑的情況下，合適的抑制劑可選自例如抑肽酶、BBI、大豆胰蛋白酶抑制劑、雞卵類粘蛋白、雞卵抑制劑、人exendin胰蛋白酶抑制劑、甲磺酸卡莫司他、黃酮抑制劑、木瓜蛋白酶抑制劑、亮肽素、對氨基苯甲咪、AEBSF、TLCK(甲苯磺酰賴氨酰氯甲酮)、APMSF、DFP、PMSF和聚(丙烯酸酯)衍生物。在糜蛋白酶抑制劑的情況下，合適的抑制劑可選自例如抑肽酶、BBI、大豆胰蛋白酶抑制劑、糜蛋白酶抑制劑、芐氧基羰基-Pro-Phe-CHO、FK-448、雞卵抑制劑、糖二苯基硼酸絡(luò)合物、DFP、PMSF、β-苯基丙酸酯和聚(丙烯酸酯)衍生物。在彈性蛋白酶抑制劑的情況下，合適的抑制劑可選自例如彈性蛋白酶抑制劑、甲氧基丁二酰基-Ala-Ala-Pro-Val-氯甲基酮(MPCMK)、BBI、大豆胰蛋白酶抑制劑、雞卵抑制劑、DFP和PMSF。
用于本發(fā)明的其他酶抑制劑選自范圍廣泛的非蛋白質(zhì)抑制劑，它們效力和毒性的程度是變化的。如下述更詳細(xì)的描述，將這些輔助劑固定至基質(zhì)或其他遞送運(yùn)載體、或開發(fā)化學(xué)修飾的類似物可容易地實(shí)施，以當(dāng)它們相遇時(shí)減少或甚至消除毒性作用。在候選酶抑制劑的廣泛組中用于本發(fā)明的是有機(jī)磷抑制劑，如二異丙基氟磷酸酯(DFP)和苯甲磺?；?PMSF)，其是絲氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶和糜蛋白酶)的強(qiáng)效、不可逆轉(zhuǎn)的抑制劑。通過這些化合物的乙酰膽堿酯酶的其他抑制作用使它們在不受控制的遞送裝配(settings)中具有高毒性。另一個(gè)候選的抑制劑4-(2-氨基乙基)-苯磺酰基氟化物(AEBSF)與DFP和PMSF相比具有抑制活性，但它毒性顯著地較低。(4-氨基苯基)-甲烷磺酰氟鹽酸鹽(APMSF)是另一個(gè)胰蛋白酶的強(qiáng)效抑制劑，但其在不受控制的裝配中有毒性。與這些抑制劑比較，4-(4-異丙基哌啶羰基)苯基1，2，3，4-四氫-1-萘甲酸酯甲磺酸鹽(FK-448)是低毒性物質(zhì)，代表糜蛋白酶強(qiáng)效和特異性的抑制劑。這些非蛋白質(zhì)類抑制劑候選物的更多代表是甲磺酸卡莫司他(N，N’-二甲基氨甲酰基甲基-P-(P’-呱基-苯甲酰氧基)苯乙酸酯甲磺酸鹽)。
還用于本發(fā)明方法和組合物的另一類型酶抑制劑是阻礙特異性治療化合物的酶降解的氨基酸及經(jīng)修飾的氨基酸。對于在本文中的使用，氨基酸和經(jīng)修飾的氨基酸基本上為非毒性、且可低成本制備。然而，由于它們分子大小較小且溶解性好，因此其容易稀釋，并在粘膜的環(huán)境中容易吸收。然而在適當(dāng)?shù)臈l件下，氨基酸可以用作蛋白酶的可逆的、競爭性抑制劑。某些經(jīng)修飾的氨基酸能顯示更強(qiáng)的抑制活性。本文中希望的經(jīng)修飾的氨基酸已知為“過渡態(tài)”抑制劑。這些化合物強(qiáng)抑制活性是基于它們結(jié)構(gòu)與它過渡態(tài)幾何構(gòu)型的底物的相似性，而通常選擇它們是因其對酶的活性部位比底物本身具有更高的親和力。過渡態(tài)抑制劑是可逆的、競爭性抑制劑。這類抑制劑的例子有α-氨基硼酸衍生物，如硼-亮氨酸、硼-纈氨酸和硼-丙氨酸。這些衍生物中的硼原子能形成四面體硼酸鹽離子，其被認(rèn)為在它們通過氨肽酶類的水解期間與過渡態(tài)的肽類似。這些氨基酸衍生物為強(qiáng)效且可逆的氨肽酶類抑制劑，且據(jù)報(bào)道硼-亮氨酸的酶抑制作用比抑氨肽酶B素更有效超過100倍，且比嘌呤霉素更有效超過1000倍。另一個(gè)據(jù)報(bào)道具有強(qiáng)蛋白酶抑制活性的經(jīng)修飾的氨基酸是N-乙酰半胱氨酸，其能抑制氨肽酶N的酶活性。這種輔助劑也顯示溶解粘液的性質(zhì)，所述性質(zhì)能適用于本發(fā)明的方法和組合物以減少粘液擴(kuò)散屏障的影響。
還有其他用于本發(fā)明協(xié)同施用方法和組合制劑的有用的酶抑制劑，其可選自肽和經(jīng)修飾的肽酶抑制劑。這類抑制劑重要的代表是環(huán)狀十二肽、從地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)獲得的桿菌肽。此外，這些類型的肽類、某些二肽類和三肽類對一些蛋白酶顯示弱的、非特異性抑制活性。通過與氨基酸類比，它們的抑制活性可通過化學(xué)修飾而得到提高。例如，次磷酸二肽類似物也是對氨肽酶類具有強(qiáng)抑制活性的“過渡態(tài)”抑制劑。據(jù)報(bào)道，它們已用于穩(wěn)定鼻施用的亮氨酸腦啡肽。另一個(gè)過渡態(tài)類似物的例子是經(jīng)修飾的五肽胃蛋白酶抑制劑，其是非常強(qiáng)效的胃蛋白酶抑制劑。通過測試數(shù)種合成類似物的抑制活性，胃蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)分析證實(shí)該分子的主要結(jié)構(gòu)官能特征影響該抑制活性。經(jīng)修飾的肽的另一種特別類型包括在它們結(jié)構(gòu)中末端有醛官能的抑制劑。例如，已發(fā)現(xiàn)序列芐氧羰基-Pro-Phe-CHO是這類靶蛋白酶強(qiáng)效的可逆抑制劑，其實(shí)現(xiàn)糜蛋白酶已知的主要和次要的特異性需要。末端有醛官能的更多抑制劑(例如木瓜蛋白酶抑制劑、亮肽素、糜蛋白酶抑制劑和彈性蛋白酶抑制劑)的化學(xué)結(jié)構(gòu)也是本領(lǐng)域已知的，例如其他已知的、可逆的、經(jīng)修飾的肽抑制劑的結(jié)構(gòu)，如磷酰胺素、抑氨肽酶B素、嘌呤霉素和抑氨肽酶A素。
由于它們比較高的分子量，多肽蛋白酶抑制劑比較小的化合物更易接受在藥物載體的基體中的集中遞送。本發(fā)明制劑和方法的蛋白酶抑制劑的其他試劑涉及螯合劑的使用。這些試劑通過從鼻內(nèi)環(huán)境(或制備的或治療的組合物)中奪去二價(jià)陽離子以介導(dǎo)酶抑制作用，所述二價(jià)陽離子是很多蛋白酶的輔助因子。例如，螯合劑EDTA和DTPA作為協(xié)同施用的或組合配制的輔助劑以合適的濃度足夠抑制選擇的蛋白酶，從而增強(qiáng)本發(fā)明的生物活性劑鼻內(nèi)遞送。這類抑制劑的更多代表是EGTA、1，10-鄰菲咯啉、羥基喹啉。此外，由于它們螯合二價(jià)陽離子的傾向，這些螯合劑和其他螯合劑作為直接的吸收促進(jìn)劑有用于本發(fā)明。
如本文其他地方更詳細(xì)地描述，本發(fā)明也包括使用不同的聚合物(特別是粘膜粘附聚合物)作為本發(fā)明協(xié)同施用、多工序和/或組合制劑的方法和組合物的酶抑制劑。例如，聚(丙烯酸酯)衍生物如聚(丙烯酸)和聚卡波菲能影響不同蛋白酶(包括胰蛋白酶和糜蛋白酶)的活性。這些聚合物的抑制作用也可基于二價(jià)陽離子如Ca2+和Zn2+的絡(luò)合。本發(fā)明進(jìn)一步包括這些聚合物可用作上述的其他酶抑制劑的共軛配體或載體。例如，已開發(fā)殼聚糖-EDTA共軛物，其在本發(fā)明中有用，并且其顯示對鋅依賴型蛋白酶的酶活性有強(qiáng)抑制作用。隨著本文中其他酶抑制劑的共價(jià)連接，并不期望聚合物粘膜粘附的性質(zhì)作出實(shí)質(zhì)上的妥協(xié)，也不期望作為本發(fā)明生物活性劑遞送運(yùn)載體的這些聚合物的一般效用(general utility)降低。相反，當(dāng)該共價(jià)鍵合酶抑制劑保持集中于藥物遞送的位點(diǎn)，通過所述粘膜粘附機(jī)理提供的遞送運(yùn)載體和粘膜表面之間減少的距離將使該活性劑的循環(huán)前(presystemic)代謝降至最低，并將不希望的抑制劑稀釋效應(yīng)以及由此引起的毒性和其他副作用降至最低。以這種方式，協(xié)同施用的酶抑制劑的有效量由于排除稀釋效應(yīng)可以減少。
示例性的有用于本發(fā)明粘膜制劑和方法的粘膜粘附聚合物-酶抑制劑絡(luò)合物包括但不限于羧甲基纖維素-胃蛋白酶抑制劑(具有抗胃蛋白酶活性)；聚(丙烯酸)-Bowman-Brik抑制劑(抗糜蛋白酶)；聚(丙烯酸)-糜蛋白酶抑制劑(抗糜蛋白酶)；聚(丙烯酸)-彈性蛋白酶抑制劑(抗彈性蛋白酶)；羧甲基纖維素-彈性蛋白酶抑制劑(抗彈性蛋白酶)；聚卡波菲-彈性蛋白酶抑制劑(抗彈性蛋白酶)；殼聚糖-木瓜蛋白酶抑制劑(抗胰蛋白酶)；聚(丙烯酸)-桿菌肽(抗氨肽酶N)；殼聚糖-EDTA(抗氨肽酶N、抗羧肽酶A)；殼聚糖-EDTA-木瓜蛋白酶抑制劑(抗胰蛋白酶、抗糜蛋白酶、抗彈性蛋白酶)。
粘液溶解劑(mucolytic)和粘液清除劑及方法 有效遞送經(jīng)由鼻內(nèi)施用的生物治療劑必須考慮跨過襯砌在該鼻粘膜的保護(hù)性粘液的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)率的減少、以及由于結(jié)合至該粘液層的糖蛋白的藥物損失。正常粘液是粘彈性的像凝膠樣的物質(zhì)，由水、電解質(zhì)、粘蛋白、大分子和脫落的上皮細(xì)胞組成。它主要用作上覆(underlying)粘膜組織的細(xì)胞保護(hù)和潤滑的覆蓋物(covering)。粘液通過位于該鼻上皮細(xì)胞和其他粘膜上皮細(xì)胞的隨機(jī)分布的分泌細(xì)胞分泌。粘液的結(jié)構(gòu)單位是粘蛋白。這種糖蛋白主要為粘液的粘彈特性負(fù)責(zé)，盡管其他大分子也可有助于這種性質(zhì)。在呼吸道的粘液中，這種大分子包括局部產(chǎn)生的分泌型IgA、IgM、IgE、溶菌酶和支氣管轉(zhuǎn)鐵蛋白(bronchotransferrin)，其也在宿主防御機(jī)理中起重要的作用。
本發(fā)明的協(xié)同施用方法任選地結(jié)合有效的粘液溶解劑或粘液清除劑，這有助于降解鼻內(nèi)粘膜表面的薄或透亮的粘液以促進(jìn)鼻內(nèi)施用的生物治療劑的吸收。在這些方法中，粘液溶解劑或粘液清除劑協(xié)同施用作為輔助的化合物以增強(qiáng)該生物活性劑的鼻內(nèi)遞送?；蛘?，有效量的粘液溶解劑或粘液清除劑在本發(fā)明的多工序方法中作為處理劑結(jié)合或在本發(fā)明的組合制劑中作為添加劑，以提供通過減少鼻內(nèi)粘液的屏障作用而增強(qiáng)生物治療化合物鼻內(nèi)遞送的改進(jìn)制劑。
各種粘液溶解劑或粘液清除劑可用于結(jié)合在本發(fā)明的方法和組合物中?；谒鼈冏饔玫臋C(jī)理，粘液溶解劑和粘液清除劑經(jīng)?？杀环诸愔料率鼋M清除粘蛋白糖蛋白的蛋白質(zhì)核心的蛋白酶類(例如鏈霉蛋白酶、木瓜蛋白酶)；分裂粘蛋白二硫鍵的巰基化合物；和斷裂粘液內(nèi)的非共價(jià)鍵的洗滌劑(例如Triton X-100、吐溫20)。在本文中的其他化合物包括但不限于膽汁鹽和表面活性劑(例如脫氧膽酸鈉、?；敲撗跄懰徕c、甘膽酸鈉)和溶血磷脂酰膽堿。
在引起粘液的結(jié)構(gòu)破壞中膽汁鹽的有效性按順序排列脫氧膽酸鹽＞?；悄懰猁}＞甘膽酸鹽。根據(jù)本發(fā)明方法減少粘液粘度或粘附力以促進(jìn)鼻內(nèi)遞送的其他有效試劑包括例如短鏈脂肪酸，和通過螯合作用工作的粘液溶解劑，如N-?；z原肽、膽酸和皂苷(后者的官能部分是通過螯合在維持粘液層結(jié)構(gòu)中起重要作用的Ca2+和/或Mg2+)。
用于本發(fā)明方法和組合物的其他粘液溶解劑包括N-乙?；?L-半胱氨酸(ACS)，其為減少支氣管肺粘液的粘度和粘附力的強(qiáng)效粘液溶解劑，且據(jù)報(bào)道其在麻醉的大鼠中能適度地提高人生長激素的鼻生物利用度(從7.5％至12.2％)。這些以及其他粘液溶解劑或粘液清除劑與該鼻粘膜接觸，通常濃度范圍為約0.2-20mM，且與施用該生物活性劑協(xié)同以減少鼻內(nèi)粘液的極性粘度和/或彈性。
還有其他粘液溶解劑或粘液清除劑可選自糖苷酶的范圍，所述糖苷酶能裂解該粘液糖蛋白的糖苷鍵。α-淀粉酶和β-淀粉酶是這類酶的代表，盡管它們?nèi)芙庹骋旱淖饔每赡苁艿较拗?。相反，?xì)菌性糖苷酶允許這些微生物滲透它們宿主的粘液層。
對于與本發(fā)明的大部分生物活性劑(包括肽和蛋白質(zhì)治療藥物)組合使用，非離子洗滌劑通常也用作粘液溶解劑或粘液清除劑。這些試劑通常不會改變或基本上不會損害治療性多肽的活性。
纖毛停滯劑(ciliostatic)和方法 由于某些粘膜組織(例如鼻粘膜組織)通過粘膜纖毛清除率的自我清除能力作為保護(hù)性功能(例如去除灰塵、過敏原和細(xì)菌)是必需的，所以通常認(rèn)為這種功能基本上不受粘膜給藥損害。在呼吸道的粘膜纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)是抗感染的特別重要的防御機(jī)理。為實(shí)現(xiàn)這種功能，在鼻和呼吸通道中擺動(dòng)(beating)的纖毛沿著粘膜移動(dòng)粘液層以去除吸入的顆粒和微生物。
纖毛停滯劑可用于本發(fā)明的方法和組合物以增加葡萄糖調(diào)節(jié)肽、類似物和模擬物、以及本文公開的其他生物活性劑粘膜(例如鼻內(nèi))施用的停留時(shí)間。特別，在某些方面通過與一種或多種具有可逆地抑制粘膜細(xì)胞纖毛活動(dòng)的功能的纖毛停滯劑協(xié)同施用或組合制劑，能顯著增強(qiáng)本發(fā)明的方法和組合物中這些試劑的遞送，從而能暫時(shí)地、可逆地提高粘膜施用的活性劑的停留時(shí)間。對于在本發(fā)明這些方面中的使用，上述纖毛停滯因子(不管是特異性還是間接地影響它們活性)是以合適的量(取決于濃度、持續(xù)時(shí)間和遞送的方式)成功地用作纖毛停滯劑的所有候選物，以至它們在施用的粘膜部位的粘膜纖毛清除率暫時(shí)(例如可逆)減少或停止，從而增強(qiáng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽、類似物和模擬物和本文公開的其他生物活性劑的遞送，且沒有不可接受的不良副作用。
在更詳細(xì)的方面，特異性的纖毛停滯因子用于與一種或多種葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物和/或本文公開的其他生物活性劑的組合制劑或協(xié)同施用方案。所述文獻(xiàn)中分離的和表征的各種細(xì)菌性纖毛停滯因子可用于本發(fā)明的這些實(shí)施方案中。細(xì)菌綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)的纖毛停滯因子包括吩嗪衍生物、綠膿桿菌素(pyo)化合物(2-烷基-4-羥基喹啉)和鼠李糖脂(也已知為溶血素)。所述綠膿桿菌素化合物產(chǎn)生濃度為50μg/ml的纖毛停滯劑，且沒有明顯的超微結(jié)構(gòu)的病變。所述吩嗪衍生物也抑制纖毛的運(yùn)動(dòng)，但引起一些膜的破裂，盡管在明顯高于400μg/ml的濃度時(shí)。氣管外植體(tracheal explants)與鼠李糖脂的有限接觸導(dǎo)致纖毛停滯，所述纖毛停滯與改變的纖毛膜相關(guān)。與鼠李糖脂的更廣泛接觸與軸絲的動(dòng)力蛋白臂的去除相關(guān)。
表面活性劑和方法 在本發(fā)明的更詳細(xì)方面，一種或多種膜滲透增強(qiáng)劑可用于本發(fā)明粘膜遞送方法或制劑，以促進(jìn)葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物以及本文公開的其他生物活性劑粘膜遞送。本文中膜滲透增強(qiáng)劑可以選自(i)表面活性劑；(ii)膽汁鹽；(iii)磷脂添加劑、混合膠束、脂質(zhì)體、或載體；(iv)醇；(v)烯胺；(vi)NO供體化合物；(vii)長鏈的兩親分子；(viii)小分子親水滲透增強(qiáng)劑；(ix)水楊酸鈉或水楊酸衍生物；(x)乙酰乙酸的甘油酯；(xi)環(huán)糊精或β-環(huán)糊精衍生物；(xii)中鏈脂肪酸；(xiii)螯合劑；(xiv)氨基酸或其鹽；(xv)N-乙酰氨基酸或其鹽；(xvi)降解成所選膜組分的酶；(xvii)脂肪酸合成的抑制劑；(xviii)膽固醇合成的抑制劑；或(xix)(i)-(xviii)所述的膜滲透增強(qiáng)劑的任何組合。
某些表面活性劑作為粘膜吸收增強(qiáng)劑易結(jié)合于本發(fā)明的粘膜遞送制劑和方法中。這些試劑可與葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物以及本文公開的其他生物活性劑協(xié)同施用或組合配制，且可選自已知表面活性劑的廣泛組合。表面活性劑通常會分為三類(1)非離子型聚氧乙烯醚；(2)膽汁鹽如甘膽酸鈉(SGC)和脫氧膽酸鈉(DOC)；和(3)梭鏈孢酸的衍生物如牛磺二氫梭鏈孢酸鈉(STDHF)。這些不同類別表面活性劑的作用機(jī)理通常包括生物活性劑的增溶作用。對經(jīng)常形成聚集的肽和蛋白質(zhì)來說，這些吸收促進(jìn)劑的表面活性性質(zhì)能使蛋白質(zhì)相互作用，以至于更小的單位如表面活性劑包衣的單體可以更容易地保持于溶液中。其他表面活性劑的例子是二癸?；鵏-α-磷脂酰膽堿(DDPC)、聚山梨酯80和聚山梨酯20。假定這些單體是更易轉(zhuǎn)運(yùn)而不是聚集的單元。第二個(gè)潛在的機(jī)理是保護(hù)所述肽或蛋白質(zhì)不受在粘膜環(huán)境中蛋白酶的蛋白水解降解。膽汁鹽和一些梭鏈孢酸衍生物據(jù)報(bào)道通過鼻勻漿(homogenates)在少于或等于增強(qiáng)蛋白質(zhì)吸收所需的濃度，都能抑制蛋白質(zhì)的蛋白水解降解。這種蛋白酶抑制作用可能對生物半衰期短的肽類特別重要。
因而，一些表面活性劑的例子包括非離子型聚氧乙烯醚、梭鏈孢酸及其衍生物、牛磺二氫梭鏈孢酸鈉、二癸?；鵏-α-磷脂酰膽堿、聚山梨酯80、聚山梨酯20、聚乙二醇、十六醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羊毛脂醇、脫水山梨醇單油酸酯及其混合物。
增粘劑 增粘劑或懸浮劑可影響藥物從制劑釋放的速率和吸收速率?？捎米魉帉W(xué)上可接受的增粘劑的這些材料的一些例子有明膠、甲基纖維素(MC)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羧甲基纖維素(CMC)、纖維素、淀粉、羥乙基淀粉、泊洛沙姆、普朗尼克(pluronics)、CMC鈉、山梨醇、阿拉伯膠、聚維酮、卡波姆、聚卡波菲、殼聚糖、殼聚糖微球、海藻酸鹽微球、殼聚糖谷氨酸鹽、amberlite樹脂、透明質(zhì)酸、乙基纖維素、麥芽糊精DE、滾筒干燥方式(drum-dried way)玉米淀粉(DDWM)、可降解的淀粉微球(DSM)、脫氧甘膽酸鹽(GDC)、羥乙基纖維素(HEC)、羥丙基纖維素(HPC)、微晶纖維素(MCC)、聚甲基丙烯酸和聚乙二醇、磺丁基醚B環(huán)糊精、交聯(lián)依地索姆(eldexomer)淀粉生物微球、?；嵌渌箧滄咚徕c(STDHF)、N-三甲基氯化殼聚糖(TMC)、降解的淀粉微球、amberlite樹脂、殼聚糖納米微球、噴霧干燥的交聯(lián)聚維酮、噴霧干燥的葡聚糖微球、噴霧干燥的微晶纖維素、和交聯(lián)依地索姆淀粉微球。在Ugwoke等人，Adv.Drug Deliv.Rev.291656-57，1998中的其他增粘劑通過引用結(jié)合至本文。
降解酶與脂肪酸和膽固醇合成的抑制劑 在本發(fā)明的相關(guān)方面，粘膜施用的葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物以及其他生物活性劑與滲透增強(qiáng)劑一起配制或協(xié)同施用，其中所述滲透增強(qiáng)劑選自降解酶、或代謝刺激劑、或脂肪酸、甾醇或其他所選的上皮細(xì)胞屏障組分合成的抑制劑，美國專利第6,190,894號。例如，降解酶例如磷脂酶、透明質(zhì)酸酶、神經(jīng)氨酸酶和軟骨素酶可用于增強(qiáng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物以及其他生物活性劑的粘膜滲透，且不會對粘膜屏障引起不可逆轉(zhuǎn)的傷害。在一個(gè)實(shí)施方案中，軟骨素酶可用于本文提供的方法或組合物，以改變該粘膜滲透性屏障的糖蛋白或糖脂組成，由此增強(qiáng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物以及本文公開的其他生物活性劑的粘膜吸收。
關(guān)于粘膜屏障組成的合成抑制劑，應(yīng)了解游離脂肪酸占上皮細(xì)胞脂質(zhì)以重量計(jì)的20％-25％。在游離脂肪酸生物合成中的兩種限速酶是乙酰CoA羧化酶和脂肪酸合成酶。通過一系列步驟，游離脂肪酸代謝成為磷脂。因此，用于本發(fā)明方法和組合物的游離脂肪酸合成和代謝的抑制劑包括，但不限于乙酰CoA羧化酶抑制劑(如5-四癸氧基-2-呋喃羧酸(TOFA))；脂肪酸合成酶的抑制劑；磷脂酶A抑制劑(如戈米辛A(gomisin A)、2-(對戊烷基肉桂基)氨基-4-氯苯甲酸、溴苯甲酰甲基溴、monoalide、7，7-二甲基-5，8-二十碳二烯酸、尼麥角林(nicergoline)、千金藤素、尼卡地平、槲皮素、二丁酰基-環(huán)狀A(yù)MP、R-24571、N-油酰乙醇胺、N-(7-硝基-2，1，3-苯并噁二唑-4-基)磷脂酰基絲氨酸、環(huán)孢菌素A、局部麻醉藥(包括地布卡因)、普尼拉明、視黃素(如所有反式和13-順-視黃酸)、W-7、三氟拉嗪、R-24571(鈣咪唑啉(calmidazolium))、1-十六烷基-3-三氟乙基甘油-sn-2-磷甲醇(MJ33))；鈣通道阻滯劑(包括尼卡地平、維拉帕米、地爾硫卓、硝苯地平和尼莫地平)；抗瘧藥(包括阿的平、米帕林、氯喹和羥基氯喹)；β阻滯劑(包括普萘洛爾(propanalol)、拉貝洛爾)；鈣調(diào)素拮抗劑；EGTA；硫汞撒(thimersol)；糖皮質(zhì)激素(包括地塞米松、強(qiáng)的松龍)；非甾體抗炎藥(包括吲哚美辛和萘普生)。
游離甾醇(主要是膽固醇)占上皮細(xì)胞脂質(zhì)以重量計(jì)的20％-25％。在膽固醇的生物合成中的限速酶是3-羥基-3-甲基戊二?；?HMG)CoA還原酶。用于本發(fā)明的方法和組合物的膽固醇合成的抑制劑包括，但不限于(HMG)CoA還原酶的競爭性抑制劑(如辛伐他汀、洛伐他汀、fluindostatin(氟伐他汀)、普伐他汀、美伐他汀、以及其他HMG CoA還原酶抑制劑(如膽固醇油酸酯、膽固醇硫酸酯和磷酸酯)、和氧合甾醇如25-OH-和26-OH-膽固醇)；角鯊烯合成酶抑制劑；角鯊烯環(huán)氧酶抑制劑；DELTA7或DELTA24還原酶抑制劑如22，25-二氮雜膽甾醇、20，25-二氮雜膽甾醇、AY9944和曲帕拉醇。
每個(gè)脂肪酸合成抑制劑或甾醇合成抑制劑可以與一種或多種葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物、以及本文公開的其他生物活性劑協(xié)同施用或組合配制，以實(shí)現(xiàn)該活性劑的上皮細(xì)胞滲透的增強(qiáng)。在粘膜遞送的治療性或輔助的制劑中該甾醇抑制劑的有效濃度范圍以總數(shù)的重量計(jì)通常從約0.0001％至約20％，更通常從約0.01％至約5％。
一氧化氮供體劑和方法 在本發(fā)明的其他相關(guān)方面，一氧化氮(NO)供體被選擇用作膜滲透增強(qiáng)劑以增強(qiáng)一種或多種葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物以及本文公開的其他生物活性劑的粘膜遞送。各種NO供體在本領(lǐng)域已知，且在本發(fā)明的方法和制劑有效的濃度中有用。示例性的NO供體包括但不限于硝酸甘油、硝普鹽(nitropruside)、NOC5〔3-(2-羥基-1-(甲基-乙基)-2-亞硝基肼基)-1-丙胺〕、NOC12〔N-乙基-2-(1-乙基-羥基-2-亞硝基肼基)-乙胺〕、SNAP〔S-亞硝基-N-乙?；?DL-青霉胺〕、NORI和NOR4。在本發(fā)明的方法和組合物中，所選的NO供體的有效量與一種或多種葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物和/或本文公開的其他生物活性劑協(xié)同施用或組合配制進(jìn)入或通過該粘膜上皮細(xì)胞。
用于調(diào)控上皮細(xì)胞的連接結(jié)構(gòu)和/或生理學(xué)的試劑 本發(fā)明提供藥物組合物，所述組合物包括一種或多種葡萄糖調(diào)節(jié)肽、蛋白質(zhì)、類似物或模擬物、和/或其他生物活性劑，且與本文公開的粘膜遞送增強(qiáng)劑組合配制成用于粘膜遞送的藥物制品。
該透化劑可逆地增強(qiáng)粘膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)，通常通過在受治療者的粘膜上皮細(xì)胞表面上調(diào)控上皮細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)和/或生理學(xué)。這種效應(yīng)通常涉及在鄰近上皮細(xì)胞的上皮細(xì)胞膜粘附蛋白質(zhì)之間同型或異型結(jié)合該透化劑的抑制作用。阻斷同型或異型結(jié)合的靶向蛋白質(zhì)可選自不同相關(guān)的連接粘附分子(JAM)、咬合素(occludins)或整合素(claudins)。這種的例子是結(jié)合至這些蛋白質(zhì)的細(xì)胞外區(qū)域的抗體、抗體片段或單鏈抗體。
仍然在其他詳細(xì)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于增強(qiáng)粘膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)的滲透肽及肽類似物和模擬物。這種對象肽及肽類似物和模擬物通常通過調(diào)控在哺乳動(dòng)物受治療者中的上皮細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)和/或生理學(xué)而在本發(fā)明的組合物和方法中工作。在某些實(shí)施方案中，該肽和肽類似物和模擬物有效地抑制上皮細(xì)胞膜粘附蛋白質(zhì)的同型和/或異型結(jié)合，所述上皮細(xì)胞膜粘附蛋白質(zhì)選自連接粘附分子(JAM)、咬合素或整合素。
一種已廣泛研究的這類試劑是霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的細(xì)菌毒素，其稱為“封閉帶毒素”(zonula occludens toxin)(ZOT)。這種毒素介導(dǎo)增強(qiáng)的腸粘膜滲透性，且引起包括受感染的受治療者腹瀉的疾病癥狀。Fasano等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.85242-5246，1991。當(dāng)在兔子回腸粘膜上檢測時(shí)，ZOT通過調(diào)控細(xì)胞間緊密連接的結(jié)構(gòu)來增加腸的滲透性。更常見的是，已發(fā)現(xiàn)ZOT能可逆地打開腸粘膜的緊密連接。據(jù)報(bào)道，ZOT也能可逆地打開鼻粘膜的緊密連接。美國專利第5,908,825號。
在本發(fā)明的方法和組合物中，ZOT和ZOT的不同類似物和模擬物(用作ZOT活性的激動(dòng)劑或拮抗劑)，有用于增強(qiáng)生物活性劑的鼻內(nèi)遞送-通過增強(qiáng)進(jìn)入或跨過鼻粘膜的細(xì)胞旁的吸收。在上下文中，ZOT通常通過引起緊密連接的結(jié)構(gòu)重組而起作用，所述緊密連接由連接蛋白質(zhì)ZO1改變的位置標(biāo)記。在本發(fā)明的這些方面中，ZOT與有效量的生物活性劑協(xié)同施用或組合配制，其通過可逆地增強(qiáng)鼻粘膜滲透性而顯著增加該活性劑的吸收，且沒有實(shí)質(zhì)上的不良副作用。
血管擴(kuò)張劑和方法 然而，另一類吸收促進(jìn)劑在本發(fā)明的協(xié)同施用和組合制劑方法和組合物中顯示有益的用途，其為血管擴(kuò)張的化合物，更具體的是血管擴(kuò)張劑。這些化合物在本發(fā)明中起作用以調(diào)控粘膜下血管的結(jié)構(gòu)和生理學(xué)，并增強(qiáng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽、類似物和模擬物以及其他生物活性劑進(jìn)入或跨過粘膜上皮細(xì)胞和/或至特異性靶組織或室(例如系統(tǒng)性循環(huán)或中樞神經(jīng)系統(tǒng))的轉(zhuǎn)運(yùn)速率。
用于本發(fā)明的血管擴(kuò)張劑通常通過胞漿鈣的減少、一氧化氮(NO)的增加或通過抑制肌球蛋白輕鏈激酶，而引起粘膜下血管的馳豫。它們通常會分為9類鈣拮抗劑、鉀通道開放劑、ACE抑制劑、血管緊張素-II受體拮抗劑、α-腎上腺素能和咪唑類受體拮抗劑、β1-腎上腺素能激動(dòng)劑、磷酸二酯酶抑制劑、類花生酸和NO供體。
盡管化學(xué)差異，鈣拮抗劑的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)很相似。進(jìn)入系統(tǒng)性循環(huán)的吸收較高，因此這些試劑能承受相當(dāng)大的肝首過代謝，導(dǎo)致藥代動(dòng)力學(xué)的個(gè)體差異。除二氫吡啶類型的新藥(氨氯地平、非洛地平、伊拉地平、尼維地平、尼索地平和尼群地平)之外，鈣拮抗劑的半衰期較短。因此，為維持很多這些新藥有效的藥物濃度，需要通過多劑量或控釋制劑遞送，如本文其他地方描述。用鉀通道開放劑米諾地爾(minoxidil)的治療方法也可能由于潛在的不良副作用而受限于施用的方式和水平。
ACE抑制劑防止將血管緊張素-I轉(zhuǎn)變?yōu)檠芫o張素-II，且其當(dāng)腎素產(chǎn)量增加時(shí)最為有效。由于ACE與激肽酶-II相同，所述激肽酶-II使強(qiáng)效的內(nèi)源性血管擴(kuò)張劑緩激肽滅活，所以ACE抑制劑引起緩激肽降解的減少。ACE抑制劑提供增加心肌保護(hù)和心肌修復(fù)作用的優(yōu)勢，通過預(yù)防和逆轉(zhuǎn)在動(dòng)物模型中的心肌纖維化和心室肥厚。大多數(shù)ACE抑制劑主要的消除途徑是通過腎臟排泄。因此，腎臟的損害與減少的消除是相關(guān)的，且對中度至重度腎臟損害的患者推薦的劑量減少25-50％。
關(guān)于NO供體，由于它們對粘膜滲透性有其他的作用，這些化合物特別地有用于本發(fā)明。除上述的NO供體之外，NO與親核試劑的絡(luò)合物(稱為NO/親核試劑或NO-親核復(fù)合體)，當(dāng)在水溶液中生理pH下溶解時(shí)，自發(fā)地且非酶促地釋放NO。相反，硝基血管擴(kuò)張劑如硝酸甘油需要NO釋放的特異性酶活性。NO-親核復(fù)合體以指定的化學(xué)計(jì)量釋放NO且預(yù)測速率的范圍從二乙胺/NO的＜3分鐘至二乙烯三胺/NO(DETANO)的約20個(gè)小時(shí)。
在本發(fā)明的某些方法和組合物中，所選的血管擴(kuò)張劑與有效量的一種或多種葡萄糖調(diào)節(jié)肽、類似物和模擬物、以及其他生物活性劑協(xié)同施用(例如系統(tǒng)性或鼻內(nèi)、同時(shí)地或組合地有效暫時(shí)聯(lián)合(temporal association))或組合配制，以增強(qiáng)該活性劑到達(dá)受治療者的靶組織或室的粘膜吸收(例如肝、肝門靜脈、CNS組織或流體、或血漿)。
選擇性的轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)劑和方法 本發(fā)明的組合物和遞送方法任選地結(jié)合選擇性的轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)劑，所述轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)劑能促進(jìn)一種或多種生物活性劑的轉(zhuǎn)運(yùn)。這些轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)劑可用于與一種或多種葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和本文公開的模擬物組合制劑或協(xié)同施用方案，以協(xié)同增強(qiáng)一種或多種其他的生物活性劑跨過粘膜轉(zhuǎn)運(yùn)屏障的遞送，增強(qiáng)該活性劑到達(dá)受治療者靶組織或室的粘膜遞送(例如粘膜上皮細(xì)胞、肝、CNS組織或流體、或血漿)?；蛘?，轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)劑可用于組合制劑或協(xié)同施用方案以直接增強(qiáng)一種或多種葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物的粘膜遞送，不管是否增強(qiáng)其他生物活性劑的遞送。
示例性的用于本發(fā)明這個(gè)方面的選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)劑包括但不限于糖苷、含糖分子、和結(jié)合劑如凝集素結(jié)合劑，已知所述結(jié)合劑特異性地與上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)屏障組分相互作用。例如，包括不同的植物和細(xì)菌凝集素的特異性“生物粘附”配體通過受體介導(dǎo)的相互作用結(jié)合至細(xì)胞表面糖部分，且可用作增強(qiáng)本發(fā)明生物活性劑的粘膜如鼻遞送的載體或共軛轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)劑。用于本發(fā)明的某些生物粘附配體將介導(dǎo)生物信號的傳輸至上皮靶細(xì)胞，所述靶細(xì)胞通過專門的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過程(胞吞作用或轉(zhuǎn)胞吞作用)觸發(fā)選擇性地?cái)z取該粘附配體。因此，這些轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)劑能用作“載體系統(tǒng)”以刺激或直接選擇性地?cái)z取一種或多種葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物以及其他生物活性劑進(jìn)入和/或通過粘膜的上皮細(xì)胞。這些和其他選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)劑顯著地增強(qiáng)本發(fā)明的大分子生物制劑(特別是肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸和聚核苷酸載體)粘膜遞送。凝集素是結(jié)合至在真核細(xì)胞的糖蛋白和糖脂表面上的特異性糖的植物蛋白質(zhì)。凝集素的濃溶液有“牽引”作用，并且不同的研究證實(shí)凝集素和凝集素共軛物(例如與膠態(tài)金顆粒共軛的伴刀豆球蛋白A)的快速受體介導(dǎo)的胞吞作用(RME)跨過粘膜表面。其他研究已報(bào)道凝集素的攝取機(jī)理可用于體內(nèi)腸的藥物靶向。在某些這類研究中，聚苯乙烯納米顆粒(500nm)共價(jià)耦合至番茄凝集素，且據(jù)報(bào)道在對大鼠口服施用后系統(tǒng)性攝取得到改善。
除植物凝集素之外，微生物粘附和入侵因子提供豐富的候選物來源，所述候選物可用作本發(fā)明的粘膜遞送方法和組合物中的粘附性/選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)載體。兩種組分對細(xì)菌粘附過程是必需的，一種是細(xì)菌“粘附素(adhesin)”(粘附或定居因子(colonization factor))，另一種是在宿主細(xì)胞表面上的受體。引起粘膜感染的細(xì)菌在將它們附著至該上皮細(xì)胞表面之前，需要穿透粘液層。所述附著通常通過細(xì)菌菌毛或纖毛(pilus)結(jié)構(gòu)介導(dǎo)，盡管其他細(xì)胞表面組分也可參與該過程。粘著的細(xì)菌通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理(不管是否有毒素的幫助)借助在該靶細(xì)胞中增殖和觸發(fā)一系列生物化學(xué)反應(yīng)而移居至粘膜上皮細(xì)胞。與這些侵入機(jī)理相關(guān)，最初通過不同細(xì)菌和病毒產(chǎn)生的很多各種生物粘附的蛋白質(zhì)(例如侵襲素(invasin)、內(nèi)化素(internalin))是已知的。這使這些微生物以對宿主種類和甚至特殊的靶組織令人深刻印象的選擇性進(jìn)行細(xì)胞外附著。通過這種受體-配體相互作用傳輸?shù)男盘栍|發(fā)完整的、活微生物進(jìn)入且最終通過胞吞作用和轉(zhuǎn)胞吞過程穿過上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，可以利用(例如通過與粘附素絡(luò)合生物活性劑如葡萄糖調(diào)節(jié)肽)這種天然存在的現(xiàn)象以增強(qiáng)生物活性化合物遞送進(jìn)入或跨過粘膜上皮細(xì)胞和/或至其他指定的藥物作用靶向部位。
以特異性的凝集素樣的方式結(jié)合上皮細(xì)胞表面的不同細(xì)菌和植物毒素也用于本發(fā)明的方法和組合物。例如，白喉毒素(diptheria toxin)(DT)通過RME快速進(jìn)入宿主細(xì)胞。同樣地，大腸桿菌(E.coli)不耐熱毒素的B亞單位以高度特異性的凝集素樣的方式結(jié)合至腸上皮細(xì)胞的刷狀邊緣。體內(nèi)和體外攝取這種毒素以及轉(zhuǎn)胞吞至腸上皮細(xì)胞基底外側(cè)都有報(bào)道。其他研究人員已表示大腸桿菌的白喉毒素的跨膜區(qū)域作為麥芽糖結(jié)合的融合蛋白質(zhì)，且已將它化學(xué)地耦合至高分子量(Mw)的聚L-賴氨酸。所得的絡(luò)合物成功地用于介導(dǎo)體外報(bào)道基因的內(nèi)化。除這些例子之外，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)產(chǎn)生一系列可用作超抗原和毒素的蛋白質(zhì)(例如葡萄球菌腸毒素A(SEA)、SEB、毒性休克綜合征毒素1(TSST-1))。關(guān)于這些蛋白質(zhì)的研究已報(bào)道在Caco-2細(xì)胞中SEB和TSST-1劑量依賴的、易化的轉(zhuǎn)胞吞作用。
病毒血凝素包括促進(jìn)本發(fā)明方法和組合物的生物活性劑粘膜遞送的另一類型轉(zhuǎn)運(yùn)劑。在很多病毒感染中的起始步驟是結(jié)合表面蛋白質(zhì)(血凝素)至粘膜細(xì)胞。已對大多數(shù)病毒鑒別了這些結(jié)合蛋白質(zhì)，包括輪狀病毒(rotaviruses)、水痘-帶狀皰疹病毒(varicella zoster virus)、塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)、腺病毒(adenoviruses)、馬鈴薯卷葉病毒(potatoleafroll virus)和呼腸病毒(reovirus)。這些和其他示例性的病毒血凝素能用于與一種或多種葡萄糖調(diào)節(jié)肽、類似物和本文公開的模擬物組合制劑(例如混合物或共軛制劑)或協(xié)同施用方案，以協(xié)同增強(qiáng)一種或多種其他生物活性劑的粘膜遞送?；蛘撸《狙啬苡糜诮M合制劑或協(xié)同施用方案，以直接增強(qiáng)一種或多種葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物的粘膜遞送，不管是否增強(qiáng)其他生物活性劑的遞送。
各種內(nèi)源性的、選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)因子也可用于本發(fā)明。哺乳動(dòng)物細(xì)胞已形成促進(jìn)特異性底物的內(nèi)化且將這些底物靶向至指定的室中的機(jī)理分類。集中地，這些膜形變的過程稱為“胞吞作用”，其包括吞噬作用、胞飲作用、受體介導(dǎo)的胞吞作用(網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的RME)和細(xì)胞飲液作用(非網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的RME)。RME是高度特異性的細(xì)胞生物過程，通過該過程(如其名稱暗示的)不同的配體結(jié)合至細(xì)胞表面受體，繼而內(nèi)化并在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)(traffick)。在很多細(xì)胞中，胞吞作用的過程如此有活性以至于完整的膜表面被內(nèi)化且在少于半小時(shí)中被代替。建議的兩類受體是基于它們在細(xì)胞膜中的定位；類型I受體的氨基末端位于該膜的細(xì)胞外側(cè)，然而類型II受體在細(xì)胞間的環(huán)境中有相同的蛋白質(zhì)尾。
還有本發(fā)明的其他實(shí)施方案利用轉(zhuǎn)鐵蛋白作為粘膜遞送生物活性劑的RME載體或刺激物。轉(zhuǎn)鐵蛋白是80kDa鐵轉(zhuǎn)運(yùn)糖蛋白，且能通過RME有效地?cái)z取進(jìn)入細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在大多數(shù)增殖細(xì)胞的表面上，并在成紅細(xì)胞和很多種類腫瘤上的數(shù)目增高。轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)和轉(zhuǎn)鐵蛋白共軛物的轉(zhuǎn)胞吞作用據(jù)報(bào)道在真菌的代謝物布雷菲德菌素A(Brefeldin A)(BFA)的存在下增強(qiáng)。在其他研究中，據(jù)報(bào)道BFA治療能快速增加在MDCK細(xì)胞中的蓖麻毒素和HRP的心尖(apical)胞吞作用。因此，BFA和其他刺激受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)的試劑可作為組合配制(例如共軛)和/或協(xié)同施用劑用于本發(fā)明的方法中，以增強(qiáng)包括葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物的生物活性劑的受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)。
聚合物遞送運(yùn)載體和方法 在本發(fā)明的某些方面，一種或多種葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物、本文公開的其他生物活性劑以及上述的遞送增強(qiáng)劑單獨(dú)或組合地結(jié)合至粘膜(例如鼻)施用的制劑，所述制劑包括用作載體或基質(zhì)的生物相容性聚合物。這種聚合物載體包括聚合物粉末、基質(zhì)或微粒遞送運(yùn)載體，以及其他的聚合物形式。所述聚合物可以是植物、動(dòng)物或合成來源。經(jīng)常所述聚合物是交聯(lián)的。此外，在這些遞送系統(tǒng)中，葡萄糖調(diào)節(jié)肽、類似物和模擬物能以下述的方式官能化其中可共價(jià)結(jié)合至該聚合物且通過簡單的洗滌(ishing)不能使其與所述聚合物分離。在其他實(shí)施方案中，該聚合物用酶抑制劑或其他降解或滅活該生物活性劑的試劑和/或遞送增強(qiáng)劑進(jìn)行化學(xué)修飾。在某些制劑中，所述聚合物是部分或完全地水不溶但水溶脹型的聚合物，例如水凝膠。期望用于本發(fā)明的這個(gè)方面的聚合物是與水交互作用的(interactive)和/或本質(zhì)上是親水的以吸收大量的水，且當(dāng)它們與水或水溶性媒介相接觸并放置一段充分達(dá)到水平衡的時(shí)間時(shí)，經(jīng)常形成水凝膠。在更詳細(xì)的實(shí)施方案中，所述聚合物是水凝膠，當(dāng)與過量的水相接觸時(shí)，該聚合物在平衡時(shí)吸收的水是當(dāng)于室溫接觸水達(dá)平衡時(shí)吸收的水的至少兩倍重量。美國專利第6,004,583號。
基于生物可降解的聚合物的藥物遞送系統(tǒng)在很多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中是優(yōu)選的，因?yàn)檫@些系統(tǒng)被水解或酶促反應(yīng)破壞成非毒性分子。降解速率通過操縱該生物可降解的聚合物基質(zhì)的組成來控制。這些類型系統(tǒng)因而可用于生物活性劑的長期釋放的某些裝配。生物可降解聚合物如聚(羥基乙酸)(PGA)、聚(乳酸)(PLA)和聚(D，L-乳酸-羥基乙酸)共聚物(PLGA)作為可能的藥物遞送載體已經(jīng)受到很大的關(guān)注，因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)這些聚合物的降解產(chǎn)物有低毒性。在身體的正常代謝功能期間，這些聚合物降解成二氧化碳和水。這些聚合物也顯示有極佳的生物相容性。
為延長葡萄糖調(diào)節(jié)肽、類似物和模擬物、以及本文公開的其他生物活性劑和任選的遞送增強(qiáng)劑的生物活性，這些試劑可結(jié)合進(jìn)入聚合物基質(zhì)，例如聚原酸酯、聚酐、或聚酯。這產(chǎn)生持續(xù)的活性以及該活性劑的釋放，例如，如通過該聚合物基質(zhì)的降解檢測。盡管在合成的聚合物中包封生物治療藥物分子可使它們在貯存和遞送期間穩(wěn)定，但是基于聚合物的釋放技術(shù)最大的障礙是在制劑加工期間該治療藥物分子活性的喪失，所述制劑加工通常涉及熱、超聲或有機(jī)溶劑。
包括用于本發(fā)明的吸收促進(jìn)聚合物可包括上述類型的聚合物經(jīng)化學(xué)或物理修飾的種類(除其他天然存在或合成的聚合物、膠、樹脂和其他試劑之外)和衍生物、以及這些物質(zhì)相互或與其他聚合物的混合，只要改變、修飾或混合不會不利地影響希望的性質(zhì)，如水吸收、水凝膠形成、和/或有用的應(yīng)用的化學(xué)穩(wěn)定性。在本發(fā)明更詳細(xì)的方面，聚合物如尼龍、腈綸(acrylan)和其他正常疏水的合成聚合物，可通過反應(yīng)充分修飾使在水性媒介中成為水溶脹型的和/或形成穩(wěn)定的凝膠。
本發(fā)明的吸收促進(jìn)聚合物可包括均聚物和共聚物組的聚合物，所述均聚物和共聚物基于下述乙烯基單體的不同組合丙烯酸和甲基丙烯酸、丙烯酸胺、甲基丙烯酸胺、羥乙基丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯、乙烯基吡咯烷酮、和聚乙烯醇和其共聚物和三聚物、聚乙酸乙烯酯和它的與上述列出的單體的共聚物和三聚物和2-丙烯酰胺-2-甲基-丙磺酸(

)。上述列出的單體與共聚型官能的單體是非常有用的，如丙烯基或甲基丙烯基酰胺丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯，其中酯基團(tuán)是來源于直鏈或支鏈烷基、具有達(dá)4個(gè)芳環(huán)的芳基，所述芳環(huán)可包括1-6個(gè)碳的烷基取代基；甾醇、硫酸鹽、磷酸鹽、或陽離子單體如N，N-二甲氨基烷基(甲基)丙烯酰胺、二甲氨基烷基(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰氧基烷基三甲基氯化銨、(甲基)丙烯酰氧基烷基二甲基芐基氯化銨。
其他的用于本發(fā)明的吸收促進(jìn)聚合物是那些分類為葡聚糖類、糊精類的聚合物，和分類為天然膠和樹脂類的材料類，或這類天然聚合物如經(jīng)處理的膠原、殼多糖、殼聚糖、pullalan、zooglan、海藻酸鹽和經(jīng)修飾的海藻酸鹽如“Kelcoloid”(聚丙二醇修飾的海藻酸鹽)、結(jié)冷膠(gellan gums)如“Kelocogel”、黃原膠如“Keltrol”、estastin、α-羥基丁酸鹽和其共聚物、透明質(zhì)酸和其衍生物、聚乳酸和羥基乙酸。
可用于本發(fā)明的非常有用的一類聚合物是包括至少一個(gè)活化的碳-碳烯系(olefinic)雙鍵和至少一個(gè)羧基的烯系-未飽和羧酸；即酸或官能團(tuán)易轉(zhuǎn)換成含有烯系雙鍵的酸，所述烯系雙鍵因其在該單體分子中存在，在關(guān)于羧基的α-β位置中或作為末端亞甲基基團(tuán)的部分而易起聚合作用。這類烯系-未飽和酸包括如以丙烯酸本身為代表的丙烯酸類材料、α-氰基丙烯酸、β-甲基丙烯酸(巴豆酸)、α-苯基丙烯酸、β-丙烯酰氧基丙酸、肉桂酸、對氯肉桂酸、1-羧基-4-苯基丁二烯-1，3、衣康酸、檸康酸、甲基反丁烯二酸、戊烯二酸、烏頭酸、馬來酸、富馬酸和三羧酸乙烯。如本文所使用的術(shù)語“羧酸”包括聚羧酸和那些酸酐，如馬來酸酐，其中該酸酐基團(tuán)通過位于同一羧酸分子上的兩個(gè)羧基消除一分子的水而形成的。
在本發(fā)明中用作吸收促進(jìn)劑的代表性的丙烯酸酯類包括丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸異丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸異丁酯、甲基丙烯酸甲酯、乙基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸辛酯、丙烯丙烯酸壬酯、丙烯酸己酯、甲基丙烯酸正己酯等。高級烷基丙烯酸酯是丙烯酸癸酯、甲基丙烯酸異癸酯、丙烯酸十二酯、丙烯酸十八酯、丙烯酸二十二酯和丙烯酸三十酯及其甲基丙烯酸酯種類。兩種或三種或更多種長鏈丙烯酸酯的混合物可成功地與一種羧酸單體聚合。其他共聚單體包括烯烴，其包括α烯烴、乙烯醚、乙烯酯及其混合物。
包括丙烯酸腈類的其他亞乙烯基單體也可用作本發(fā)明的方法和組合物中的吸收促進(jìn)劑，以增強(qiáng)一種或多種葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物、以及其他生物活性劑的遞送和吸收，包括增強(qiáng)該活性劑遞送至受治療者的靶組織或室(例如肝、肝門靜脈、CNS組織或流體、或血漿)。有用的α，β-烯系未飽和腈類優(yōu)選含有3至10個(gè)碳原子的單烯系未飽和腈如丙烯腈、甲基丙烯腈等。最優(yōu)選丙烯腈和甲基丙烯腈。也可使用含有3至35個(gè)碳原子的包括單烯系未飽和酰胺的丙烯酰胺。代表性的酰胺包括丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N-叔-丁基丙烯酰胺、N-環(huán)己基丙烯酰胺、在氮上的烷基包括8至32個(gè)碳原子的高級烷基酰胺，包括那些具有4至10個(gè)碳原子的α，β-烯系未飽和羧酸的N-烷醇酰胺的丙烯酰胺，如N-亞甲醇丙烯酰胺、N-丙醇丙烯酰胺、N-亞甲醇甲基丙烯酰胺、N-亞甲醇馬來酰胺、N-亞甲醇馬來酸酯、N-亞甲醇-對-乙烯基苯甲酰胺等。
其他有用的吸收促進(jìn)材料是含有2至18個(gè)碳原子的α-烯烴，更優(yōu)選的是2至8個(gè)碳原子；含有4至10個(gè)碳原子的二烯；乙烯酯和烯丙基酯如乙酸乙烯酯；乙烯芳香烴如苯乙烯、甲基苯乙烯和氯-苯乙烯；乙烯基和烯丙基醚和酮如乙烯基甲基醚和甲基乙烯基酮；氯丙烯酸酯；氰烷基丙烯酸酯如α-氰甲基丙烯酸酯和α-、β-和γ-氰丙基丙烯酸酯；丙烯酸烷氧基酯如丙烯酸甲氧基乙酯；鹵代丙烯酸酯如丙烯酸氯乙酯；乙烯基鹵化物和乙烯基氯化物、亞乙烯基氯化物等；二乙烯、二丙烯酸酯和其他多官能單體如二乙烯基醚、二丙烯酸二甘醇酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、亞甲基-雙-丙烯酰胺、烯丙基季戊四醇等；和雙(β-鹵烷基)烯基磷酸酯，如雙(β-氯乙基)乙烯基磷酸酯等，這些對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。根據(jù)本文公開的方法，容易制備以下共聚物其中包括單體的羧基是次要組成，另一個(gè)亞乙烯基單體為主要組分。
當(dāng)水凝膠用作本發(fā)明的吸收促進(jìn)劑時(shí)，這些可能包括選自下述組的合成共聚物與水相互作用且可溶脹的丙烯酸和甲基丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、羥乙基丙烯酸酯(HEA)或甲基丙烯酸酯(HEMA)和乙烯基吡咯烷酮。有用聚合物(特別用于肽和蛋白質(zhì)的遞送)的具體說明性的例子是下述類型的聚合物(甲基)丙烯酰胺和0.1-99wt％(甲基)丙烯酸；(甲基)丙烯酰胺和0.1-75wt％(甲基)丙烯氧基乙基三甲基氯化銨；(甲基)丙烯酰胺和0.1-75wt％(甲基)丙烯酰胺；丙烯酸和0.1-75wt％烷基(甲基)丙烯酸酯；(甲基)丙烯酰胺和0.1-75wt％AMPS.RTM.(Lubrizol公司的商標(biāo))；(甲基)丙烯酰胺和0-30wt％烷基(甲基)丙烯酰胺和0.1-75wt％AMPS.RTM.；(甲基)丙烯酰胺和0.1-99wt％HEMA；(甲基)丙烯酰胺和0.1-75wt％HEMA和0.1-99％(甲基)丙烯酸；(甲基)丙烯酸和0.1-99wt％HEMA；50摩爾％乙烯基醚和50摩爾％馬來酸酐；(甲基)丙烯酰胺和0.1-75wt％(甲基)丙烯氧基烷基二甲基芐基氯化銨；(甲基)丙烯酰胺和0.1-99wt％乙烯基吡咯烷酮；(甲基)丙烯酰胺和50wt％乙烯基吡咯烷酮和0.1-99.9wt％(甲基)丙烯酸；(甲基)丙烯酸和0.1-75wt％AMPS.RTM.和0.1-75wt％烷基(甲基)丙烯酰胺。在上述的例子中，烷基是指C1-C30，優(yōu)選C1-C22，直鏈和支鏈和C4-C16環(huán)狀；其中所用的(甲基)是指包括有和沒有甲基時(shí)的單體。其他非常有用的水凝膠聚合物是可溶脹的，但是不溶種類的聚(乙烯吡咯烷酮)淀粉、羧甲基纖維素和聚乙烯醇。
其他用于本發(fā)明的聚合物水凝膠材料包括(聚)羥基烷基(甲基)丙烯酸酯；陰離子和陽離子水凝膠；聚(電解質(zhì))絡(luò)合物；含有低級乙酸酯殘基的聚(乙烯醇)；交聯(lián)瓊脂和交聯(lián)羧甲基纖維素的溶脹型混合物；與難溶的交聯(lián)瓊脂混合的包括甲基纖維素的溶脹型組合物；通過分散馬來酸酐與苯乙烯、乙烯、丙烯或異丁烯的精細(xì)分散的共聚物而制備的水溶脹型共聚物；N-乙烯基內(nèi)酰胺的水溶脹型聚合物；溶脹型羧甲基纖維素的鈉鹽等。
其他凝膠化的、吸收和保留液體(fluid imbibing and retaining)的聚合物用于形成本發(fā)明生物活性劑的粘膜遞送的親水性水凝膠，所述聚合物包括果膠；多糖如瓊脂、阿拉伯膠、梧桐樹膠(karaya)、黃芪膠(tragacenth)、褐藻膠(slgins)、瓜爾膠和其交聯(lián)的種類；丙烯酸聚合物、共聚物和鹽衍生物、聚丙烯酰胺；水溶脹型茚馬來酸酐聚合物；淀粉接枝共聚物；具有其原重約2至400倍的水吸收性的丙烯酸酯類型聚合物和共聚物；聚葡聚糖(polyglucan)的二酯；交聯(lián)聚(乙烯醇)和聚(N-乙烯-2-吡咯烷酮)的混合物；聚氧丁烯-聚乙烯嵌段共聚物凝膠；角豆膠(carob gum)；聚酯凝膠；聚脲凝膠；聚醚凝膠、聚酰胺凝膠、聚酰亞胺凝膠、多肽凝膠、聚氨基酸凝膠；聚纖維素凝膠、交聯(lián)茚-馬來酸酐丙烯酸酯聚合物和聚多醣。
用于本發(fā)明的合成的水凝膠聚合物可通過數(shù)種單體以幾種比率無限組合而制備。該水凝膠可被交聯(lián)、并通常具有吸取和吸收液體且溶脹或擴(kuò)脹至擴(kuò)大的平衡狀態(tài)的能力。該水凝膠通常在鼻粘膜表面的遞送中溶脹或擴(kuò)脹，并吸收其重量約2-5、5-10、10-50、多達(dá)50-100或更多倍的水。對不同生物活性劑檢測給定水凝膠的溶脹性的最佳程度，這取決于下述因素，如分子量、大小、溶解度和通過或捕獲或包封于聚合物中加載的活性劑的擴(kuò)散特征、和特定空間以及與每個(gè)單獨(dú)聚合物相關(guān)的合作鏈運(yùn)動(dòng)。
用于本發(fā)明的親水性聚合物是水不溶但水溶脹的。這些水溶脹型的聚合物通常是指水凝膠或凝膠。這些凝膠可通過交聯(lián)該聚合物的方法由合適的交聯(lián)劑從水溶性聚合物方便地制備。然而，穩(wěn)定的水凝膠也可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法通過pH、溫度和/或離子濃度指定的條件下從具體聚合物形成。通常所述聚合物是交聯(lián)的，即交聯(lián)至以下程度該聚合物具有良好的親水性性質(zhì)、已改善的物理整體性(與相同或相似類型的非交聯(lián)聚合物相比)和顯示保留在感興趣生物活性劑和隨其共同施用的其他化合物(如細(xì)胞因子或酶抑制劑)的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(network)中的改善的能力、同時(shí)保留在適當(dāng)位置和時(shí)間釋放該活性劑的能力。
通常用于本發(fā)明的水凝膠聚合物的交聯(lián)是雙官能交聯(lián)，基于形成共聚物的單體的重量，交聯(lián)劑的量是從0.01至25重量百分比，更優(yōu)選從0.1至20重量百分比，特別優(yōu)選從0.1至15重量百分比。交聯(lián)劑的另一個(gè)有用量是0.1至10重量百分比。也可使用三、四或高級多官能交聯(lián)劑。當(dāng)使用這些試劑時(shí)，需要較低的量以維持等量的交聯(lián)密度即交聯(lián)的程度，或網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)性質(zhì)能充分有效地包括該生物活性劑。
該交聯(lián)可以是共價(jià)的、離子的或與聚合物的氫鍵，所述聚合物具有在含有水的流體存在下溶脹的能力。這種交聯(lián)劑和交聯(lián)反應(yīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且在很多情況下取決于該聚合物系統(tǒng)。因此，交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可通過未飽和單體的自由基共聚作用形成。聚合物水凝膠也可通過在該聚合物上存在的官能團(tuán)如醇、酸、胺與這種基團(tuán)如乙二醛、甲醛或戊二醛、二酸酐等反應(yīng)進(jìn)行交聯(lián)而形成。
該聚合物也可與以下物質(zhì)交聯(lián)任何聚烯如癸二烯或三乙烯環(huán)己烷；丙烯酰胺如N，N-亞甲基-雙(丙烯酰胺)；多官能丙烯酸酯如三羥甲基丙烷三丙烯酸酯；或含有至少2個(gè)末端CH2＜基團(tuán)的多官能亞乙烯基單體，包括例如二乙烯基苯、二乙烯基萘、丙烯酸烯丙酯等。在某些實(shí)施方案中，用于制備共聚物的交聯(lián)單體是每個(gè)分子含有超過一個(gè)烯基醚基團(tuán)的聚烯基聚醚，其可任選地含有烯基，該烯基中有烯系雙鍵連接在末端的亞甲基上(例如，通過含有至少2個(gè)碳原子和至少2個(gè)羥基的多元醇的醚化而制備)。這類化合物可通過將烯基鹵化物(如烯丙基氯化物或烯丙基溴化物)與一種或多種多元醇的強(qiáng)堿水溶液反應(yīng)而制備。這種產(chǎn)物可以是具有不同數(shù)目醚基的聚醚的復(fù)雜混合物。聚醚交聯(lián)劑的效力隨分子潛在的聚合基團(tuán)數(shù)目的增加而增加。通常，使用每個(gè)分子平均含有兩個(gè)或更多個(gè)烯醚基團(tuán)的聚醚。其他交聯(lián)單體包括例如二烯丙基酯、二甲代烯丙基(dimethallyl)醚、烯丙基或甲代烯丙基丙烯酸酯和丙烯酰胺、四乙烯基硅烷、聚烯基甲烷、二丙烯酸酯、和二甲基丙烯酸酯、二乙烯基化合物如二乙烯基苯、聚烯丙基磷酸酯、二烯丙基氧基化合物和亞磷酸酯等。典型的試劑是烯丙基季戊四醇、烯丙基蔗糖、三羥甲基丙烷三丙烯酸酯、1，6-已二醇二丙烯酸酯、三羥甲基丙烷二烯丙基醚、季戊四醇三丙烯酸酯、二甲基丙烯酸四亞甲酯、二丙烯酸亞乙酯、二甲基丙烯酸亞乙酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯等。烯丙基季戊四醇、三羥甲基丙烷二烯丙基醚和烯丙基蔗糖提供合適的聚合物。當(dāng)存在交聯(lián)劑時(shí)，聚合物混合物通常包括基于羧酸單體的總重含量為約0.01至20重量百分比之間(如1％、5％或10％或更多)的交聯(lián)單體、以及其他單體。
在本發(fā)明的更詳細(xì)方面，通過以緩慢釋放或酶促或生理保護(hù)性載體或運(yùn)載體的方式保留該生物活性劑(例如水凝膠保護(hù)該活性劑不受降解酶的作用)，來增強(qiáng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽、類似物和模擬物、以及本文公開的其他生物活性劑的粘膜遞送。在某些實(shí)施方案中，該活性劑通過化學(xué)方式結(jié)合至該載體或運(yùn)載體，其中其他試劑如酶抑制劑、細(xì)胞因子等也可以混合或結(jié)合至所述載體或運(yùn)載體。該活性劑可通過在該載體或運(yùn)載體(例如聚合物基質(zhì))內(nèi)充分的物理捕獲而選擇性地固定。
有用于本發(fā)明的聚合物如水凝膠可以結(jié)合官能連接劑如糖苷，所述官能連接劑化學(xué)結(jié)合至聚合物以提高隨其配制的活性劑的鼻內(nèi)生物利用度。這些糖苷的例子有葡萄糖苷、果糖苷、半乳糖苷、阿拉伯糖苷、甘露糖苷及它們烷基取代的衍生物和天然糖苷如熊果苷、根皮苷、苦杏仁苷、毛地黃皂苷、皂角苷和靛苷。典型的糖苷可有數(shù)種方式結(jié)合至聚合物。例如，糖苷或其他類似的碳水化合物的羥基的氫原子可被水凝膠聚合物的烷基代替而形成醚。同時(shí)，糖苷的羥基可以反應(yīng)使聚合物水凝膠的羧基酯化以形成原位聚合物酯。另一種方法是在馬來酸的共聚物上使用乙酰溴葡萄糖與膽甾基-5-烯-3β-醇的縮合。N-取代的聚丙烯酰胺能通過活化的聚合物與γ-氨基烷基糖苷的反應(yīng)合成(1)(碳水化合物-間隔基)(n)-聚丙烯酰胺、假多糖；(2)(碳水化合物間隔基)(n)-磷脂酰乙醇胺(m)-聚丙烯酰胺、新糖脂、磷脂酰乙醇胺的衍生物；和(3)(碳水化合物-間隔基)(n)-生物素(m)-聚丙烯酰胺。這些生物素化的衍生物可粘附至在粘膜表面的凝集素以促進(jìn)生物活性劑的吸收，例如聚合物包封的葡萄糖調(diào)節(jié)肽。
在本發(fā)明的更詳細(xì)方面，一種或多種葡萄糖調(diào)節(jié)肽、類似物和模擬物、和/或本文公開的其他生物活性劑(任選地包括次級(secondary)活性劑如蛋白酶抑制劑、細(xì)胞因子、細(xì)胞間連接生理學(xué)的其他調(diào)控劑等)被修飾且結(jié)合至聚合物載體或基質(zhì)。例如，這通過化學(xué)結(jié)合肽或蛋白質(zhì)活性劑和其他任選的試劑于交聯(lián)的聚合物網(wǎng)絡(luò)中而實(shí)現(xiàn)。分別用相互反應(yīng)的試劑如包括糖苷的分子也可能化學(xué)修飾聚合物。在某些方面，生物活性劑和任選的次級活性劑可被官能化，即其中適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)基團(tuán)被識別或化學(xué)加至活性劑。大多數(shù)時(shí)候加入烯基可聚合的基團(tuán)，繼而使用標(biāo)準(zhǔn)的聚合方法如溶液聚合(通常是水)、乳化、懸浮或分散聚合將該官能化的活性劑與單體和交聯(lián)劑共聚。通常，所述官能化的活性劑提供充分高濃度的官能或可聚合的基團(tuán)，以確保在活性劑的一些位點(diǎn)官能化。例如，含有16個(gè)氨基位點(diǎn)的多肽中，通常希望將至少2個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、7個(gè)和多達(dá)8個(gè)或更多個(gè)的位點(diǎn)官能化。
官能化后，該官能化的活性劑與單體和包括形成感興趣的聚合物的試劑的交聯(lián)劑混合。然后在這種媒介中誘導(dǎo)聚合以生成含有結(jié)合的活性劑的聚合物。隨后該聚合物用水或其他適當(dāng)?shù)娜軇┫礈?ish)，另外純化以去除微量的未反應(yīng)雜質(zhì)，且如有必要，通過物理方式如攪拌、推壓使其通過篩孔、超聲或其他合適的方式磨碎或破壞該聚合物至希望的顆粒大小。然后以使該活性劑不變性或者另外不降解的方式去除溶劑(通常是水)。一個(gè)希望的方法是凍干(冷凍干燥)，但是其他方法(例如真空干燥、空氣干燥、噴霧干燥等)是可獲得且可使用的。
為將可聚合的基團(tuán)引入至肽、蛋白質(zhì)和本發(fā)明的其他活性劑，將可用的氨基、羥基、硫醇和其他反應(yīng)性基團(tuán)與含有未飽和基團(tuán)的親電試劑反應(yīng)是可能的。例如，未飽和單體包括含有N-羥基琥珀酰亞胺基團(tuán)、活性碳酸酯(如對硝基苯基碳酸酯、三氯苯基碳酸酯)、三氟乙基磺酸酯(tresylate)、氧基羰基咪唑、環(huán)氧化物、異氰酸酯和醛的未飽和單體、以及屬于這類試劑的未飽和的羧甲基疊氮化物和未飽和的鄰位吡啶基-二硫化物。未飽和試劑的說明性例子是烯丙基縮水甘油基醚、烯丙基氯化物、烯丙基溴化物、烯丙基碘化物、丙烯酰氯化物、烯丙基異氰酸酯、烯丙基磺酰氯、馬來酸酐、馬來酸酐與烯丙基醚的共聚物等。
如果局部的環(huán)境使這些基團(tuán)的親核性增加，那么所有這些賴氨酸活性衍生物(除醛之外)通常能與其他氨基酸如組氨酸的咪唑基和酪氨酸的羥基和半胱氨酸的巰基反應(yīng)。含有醛官能化的試劑對賴氨酸有特異性。與賴氨酸、半胱氨酸、酪氨酸的可用基團(tuán)反應(yīng)的這些類型已廣泛地記載于文獻(xiàn)中，且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
在包括氨基的生物活性劑的情況下，這種基團(tuán)與烯酰(acyloyl)氯化物如丙烯酰氯化物反應(yīng)以及將可聚合的丙烯?；胫猎摲磻?yīng)的試劑是很方便的。然后在制備聚合物期間如在丙烯酰胺和丙烯酸的共聚物的交聯(lián)期間，該官能化的活性劑通過丙烯基連接至聚合物并結(jié)合至那里。
在本發(fā)明的其他方面，生物活性劑(包括肽、蛋白質(zhì)、核苷酸和體內(nèi)有生物活性的其他分子)通過將一種或多種活性劑共價(jià)鍵合至聚合物而共軛穩(wěn)定，所述聚合物含有作為其整體部分的兩個(gè)部分親水性部分(例如直鏈聚亞烷基二醇)和親脂性部分(參見如美國專利第5,681,811號)。在一個(gè)方面，生物活性劑與含有下述部分的聚合物共價(jià)耦合(i)直鏈聚亞烷基二醇部分、和(ii)親脂性部分，其中該活性劑、直鏈聚亞烷基二醇部分和親脂性部分彼此相關(guān)地構(gòu)象排列以使活性治療劑增加對酶降解(即，與它在類似的條件下以避免聚合物耦合在那里的未共軛的形式的能力有關(guān))在體內(nèi)的抵抗。在另一個(gè)方面，共軛穩(wěn)定的制劑有包括生物活性劑與聚山梨酯絡(luò)合物共價(jià)耦合的三維構(gòu)象，所述聚山梨酯絡(luò)合物包括(i)直鏈聚亞烷基二醇部分、和(ii)親脂性部分，其中該活性劑、直鏈聚亞烷基二醇部分和親脂性部分彼此相關(guān)地構(gòu)象排列以使(a)該親脂性部分從外部可用于該三維構(gòu)象、和(b)在該組合物中的活性劑增加對酶降解在體內(nèi)的抵抗。
在另一個(gè)相關(guān)的方面，提供了多配體共軛的絡(luò)合物，其包括與甘油三酯骨架部分共價(jià)耦合的生物活性劑(這是通過聚亞烷基二醇間隔基基團(tuán)鍵合在甘油三酯骨架部分的碳原子上)和至少一種的脂肪酸部分，所述脂肪酸部分直接共價(jià)連接在甘油三酯骨架部分的碳原子上或通過聚亞烷基二醇間隔基部分共價(jià)結(jié)合(參見例如美國專利第5,681,811號)。在這樣一個(gè)多配體共軛的治療劑絡(luò)合物中，該甘油三酯生物活性部分的α’位和β位碳原子可含有脂肪酸部分，該脂肪酸部分通過直接共價(jià)鍵合在甘油三酯生物活性部分或通過聚亞烷基二醇間隔基部分間接共價(jià)鍵合在甘油三酯生物活性部分而連接?；蛘撸舅岵糠挚芍苯踊蛲ㄟ^聚亞烷基二醇間隔基部分與甘油三酯骨架部分的α和α’碳共價(jià)連接，其中生物活性治療劑與甘油三酯骨架部分的γ碳共價(jià)耦合，其耦合是直接共價(jià)鍵合至其中或通過聚亞烷基間隔基部分間接鍵合至其中。應(yīng)認(rèn)識到，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，對于包括該甘油三酯骨架部分的多配體共軛的治療劑絡(luò)合物，各種結(jié)構(gòu)的、組合物的、和構(gòu)象的形式是可能的。進(jìn)一步認(rèn)識到，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，這樣的多配體共軛治療劑絡(luò)合物中，生物活性劑通過烷基間隔基基團(tuán)或者其他可接受的間隔基基團(tuán)，有利地與甘油三酯修飾的骨架部分共價(jià)耦合。如在本文所用，該間隔基基團(tuán)的可接受性是指的空間、組合物的和最終使用的具體可接受性特征。
在本發(fā)明的其他方面，提供了共軛穩(wěn)定的絡(luò)合物，其包括含有聚山梨酯部分的聚山梨酯絡(luò)合物，所述聚山梨酯部分包括含有共價(jià)耦合至其α、α’和β碳原子的官能化基團(tuán)的甘油三酯骨架，所述官能化基團(tuán)包括(i)脂肪酸基團(tuán)；和(ii)含有生物活性劑或共價(jià)鍵合在那里的部分的聚乙二醇基團(tuán)，例如鍵合至該聚乙二醇基團(tuán)適當(dāng)?shù)墓倌芏取＿@種共價(jià)鍵合可直接例如至該聚乙二醇基團(tuán)的羥基末端官能度，或者這種共價(jià)鍵合可間接例如通過反應(yīng)性地用末端羧基官能度間隔基基團(tuán)封端該聚乙二醇基團(tuán)的羥基末端，以使形成的經(jīng)封端的聚乙二醇基團(tuán)含有末端羧基官能度，其中該生物活性劑或部分可共價(jià)鍵合至所述末端羧基官能度。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了穩(wěn)定的、水溶性的、共軛穩(wěn)定的絡(luò)合物，其包括共價(jià)耦合至生理上相容的聚乙二醇(PEG)修飾的糖脂部分的一種或多種葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物、和/或本文公開的其他生物活性劑。在這種絡(luò)合物中，該生物活性劑可通過在該活性劑的游離氨基酸基團(tuán)上不穩(wěn)定的共價(jià)鍵，共價(jià)耦合至該生理上相容的PEG修飾的糖脂部分，其中所述不穩(wěn)定的共價(jià)鍵通過生物化學(xué)水解和/或蛋白水解在體內(nèi)可切斷的。該生理上相容的PEG修飾的糖脂部分有利地包括聚山梨酯聚合物，例如包括脂肪酸酯基團(tuán)的聚山梨酯聚合物，所述的脂肪酸酯基團(tuán)選自單棕櫚酸酯、二棕櫚酸酯、單月桂酸酯、二月桂酸酯、三月桂酸酯、單油酸酯、二油酸酯、三油酸酯、單硬脂酸酯、二硬脂酸酯和三硬脂酸酯組成的組。在這種絡(luò)合物中，該生理上相容的PEG修飾的糖脂部分可合適地包括選自脂肪酸聚乙二醇醚和脂肪酸聚乙二醇酯組成的組的聚合物，其中所述脂肪酸例如包括選自月桂酸、棕櫚酸、油酸和硬脂酸組成的組的脂肪酸。
材料的貯存和制備 在本發(fā)明的某些方面，本文的組合制劑和/或協(xié)同施用方法結(jié)合有效量的肽和蛋白質(zhì)，所述肽和蛋白質(zhì)可粘附至荷電玻璃上因而減少在容器中的有效濃度。硅烷化容器如硅烷化玻璃容器用于貯存制成品以減少多肽或蛋白質(zhì)吸收至玻璃容器。
在本發(fā)明的其他方面，用于治療哺乳動(dòng)物受治療者的試劑盒包括一種或多種為哺乳動(dòng)物受治療者粘膜遞送而配制的葡萄糖調(diào)節(jié)肽化合物的穩(wěn)定的藥物組合物，其中所述組合物有效地減輕在所述受治療者中下述的一種或多種癥狀而沒有不可接受的不良副作用肥胖、癌癥或營養(yǎng)不良或與癌癥相關(guān)的isting。這種試劑盒進(jìn)一步包括含有一種或多種葡萄糖調(diào)節(jié)肽化合物的藥物試劑瓶。該藥物試劑瓶由藥物級別的聚合物、玻璃或其他合適的材料構(gòu)成。例如，該藥物試劑瓶是硅烷化的玻璃瓶。該試劑盒進(jìn)一步包括用于遞送組合物至受治療者鼻粘膜表面的孔。該遞送孔由藥物級別的聚合物、玻璃或其他合適的材料構(gòu)成。該遞送孔是，例如硅烷化玻璃。硅烷化技術(shù)結(jié)合專用的表面清潔技術(shù)以硅烷化方法于低壓下硅烷化。該硅烷在氣相中并在升高溫度的表面硅烷化。該方法提供可再生的表面，所述表面具有穩(wěn)定的、均勻的和功能化的硅烷層，其中所述硅烷層具有單層的特征。該硅烷化的表面防止多肽或本發(fā)明的粘膜遞送增強(qiáng)劑與玻璃的結(jié)合。
該程序有用于制備容納本發(fā)明葡萄糖調(diào)節(jié)肽組合物的硅烷化的藥物試劑瓶。玻璃盤在使用之前通過用雙蒸水(ddH2O)漂洗而清潔。然后硅烷盤用95％乙醇漂洗，且丙酮盤用丙酮漂洗。藥物試劑瓶在丙酮中聲處理10分鐘。經(jīng)丙酮聲處理后，試劑瓶在ddH2O盤至少洗滌兩次。試劑瓶在0.1M NaOH中聲處理10分鐘。當(dāng)該試劑瓶在NaOH中聲處理時(shí)，在罩(hood)下制備硅烷溶液(硅烷溶液800mL 95％乙醇；96L冰乙酸；25mL縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷)。經(jīng)NaOH聲處理后，試劑瓶在ddH2O盤至少洗滌兩次。該試劑瓶在硅烷溶液中聲處理3-5分鐘。該試劑瓶在100％EtOH盤中洗滌(ished)。該試劑瓶用預(yù)純化N2氣干燥，并在使用前于100℃烘箱貯存至少2小時(shí)。
鼻噴霧劑產(chǎn)品生產(chǎn)過程可包括制備鼻噴霧劑的稀釋液，該稀釋液包括約85％的水和鼻噴霧劑組分而沒有葡萄糖調(diào)節(jié)肽。然后測量該稀釋液的pH，如有必要用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)整至pH 4.0±0.3。該鼻噴霧劑通過非無菌轉(zhuǎn)移該稀釋液約85％的最終目標(biāo)體積至螺帽瓶而制備。加入適當(dāng)量的葡萄糖調(diào)節(jié)肽并混合直至完全溶解。測量pH，如有必要用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)整至pH 7.0±0.3。加入足夠量的稀釋液以達(dá)到最終目標(biāo)體積。填充螺帽瓶并固定帽。上文描述的生產(chǎn)過程提出了用于制備初始臨床批次的藥物產(chǎn)品的方法。這種方法可在優(yōu)化生產(chǎn)過程的開發(fā)過程期間調(diào)整。
目前上市的可注射葡萄糖調(diào)節(jié)肽需要依從FDA法規(guī)的無菌生產(chǎn)條件。腸道外施用(包括注射用或輸注用胰島素)需要無菌的(無菌)生產(chǎn)過程。無菌藥物生產(chǎn)的現(xiàn)行藥品優(yōu)良生產(chǎn)規(guī)范(GMP)包括設(shè)計(jì)和構(gòu)建特征的標(biāo)準(zhǔn)(21 CFR§211.42(2005年4月1日))；試驗(yàn)和批準(zhǔn)或注射組分、藥物產(chǎn)品容器和閉合(closures)的標(biāo)準(zhǔn)(§211.84)；控制微生物污染的標(biāo)準(zhǔn)(§211.113)；以及其他專門的試驗(yàn)要求(§211.167)。非腸道外(非無菌)產(chǎn)品如本發(fā)明的鼻內(nèi)產(chǎn)品，不需要這些專門的無菌生產(chǎn)條件。如應(yīng)理解，無菌生產(chǎn)過程的要求基本上比那些需要非無菌的產(chǎn)品生產(chǎn)過程更高，并且相應(yīng)地花費(fèi)更多。這些花費(fèi)包括更多的設(shè)備資金費(fèi)用以及更多的生產(chǎn)費(fèi)用無菌生產(chǎn)的額外設(shè)備包括額外的廠房和通風(fēng)；與無菌生產(chǎn)有關(guān)的額外費(fèi)用包括更多的人力、廣泛的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證、以及行政支持。因此，鼻內(nèi)葡萄糖調(diào)節(jié)肽產(chǎn)品的生產(chǎn)費(fèi)用，如本發(fā)明的鼻內(nèi)葡萄糖調(diào)節(jié)肽產(chǎn)品的費(fèi)用，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于腸道外施用的葡萄糖調(diào)節(jié)肽產(chǎn)品的費(fèi)用。本發(fā)明滿足葡萄糖調(diào)節(jié)肽的非無菌生產(chǎn)過程的需要。
可通過將活性化合物以需要的量在適當(dāng)?shù)娜軇┲信c上文列舉的一種成分或成分的組合結(jié)合，來制備無菌溶液。通常，通過結(jié)合活性化合物至無菌運(yùn)載體來制備分散體，所述無菌運(yùn)載體包括堿性的分散媒介物和從上文列舉的成分中需要的其他成分。在無菌粉末的情況下，制備的方法包括真空干燥和凍干，所述凍干產(chǎn)生活性成分和來自最初其無菌過濾的溶液中任何其他希望的成分的粉末。預(yù)防微生物的作用可通過不同的抗細(xì)菌和抗真菌劑來實(shí)現(xiàn)，例如尼泊金酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。
根據(jù)本發(fā)明粘膜施用允許患者進(jìn)行治療的有效自我施用，只要有充分的保障來適當(dāng)控制和監(jiān)控給藥及副作用。粘膜施用也克服其他施用形式的某些缺點(diǎn)，例如注射劑是疼痛的并使患者接觸可能的感染、以及可能存在藥物生物利用度的問題。
生物粘附的遞送運(yùn)載體和方法 在本發(fā)明的某些方面，本文的組合制劑和/或協(xié)同施用方法結(jié)合有效量的非毒性生物粘附劑作為輔助的化合物或載體以增強(qiáng)一種或多種生物活性劑的粘膜遞送。本文的生物粘附劑顯示對靶粘膜的一種或多種組分或表面有一般或特異性的粘附。該生物粘附使所述生物活性劑以希望的濃度梯度保持進(jìn)入或跨過粘膜以確保甚至大分子(如肽和蛋白質(zhì))的滲透進(jìn)入或通過該粘膜上皮細(xì)胞。通常，在本發(fā)明的方法和組合物中使用生物粘附劑使肽和蛋白質(zhì)進(jìn)入或通過該粘膜上皮細(xì)胞的滲透性增強(qiáng)兩倍至五倍、通常五倍至十倍。這種上皮細(xì)胞滲透的增強(qiáng)通常允許大分子有效的跨粘膜遞送，例如遞送至鼻上皮細(xì)胞的基部或進(jìn)入鄰近的細(xì)胞外室或血漿或CNS組織或流體。
這種增強(qiáng)的遞送大大提高了生物活性肽、蛋白質(zhì)和其他大分子治療藥物類遞送的有效性。這些結(jié)果將部分取決于化合物的親水性，因而與水不溶性化合物相比親水性藥物類將實(shí)現(xiàn)更多的滲透。除這些作用之外，使用生物粘附劑以增強(qiáng)藥物在粘膜表面的持久性(persistence)能得出延長的藥物遞送的蓄積(reservoir)機(jī)理，因而一旦在表面的材料耗盡，則化合物不僅能滲透跨過粘膜組織而且可反擴(kuò)散至粘膜表面。
各種用于本發(fā)明的新型方法和組合物的合適的口服施用生物粘附劑在本領(lǐng)域中公開，美國專利第3,972,995、4,259,314、4,680,323、4,740,365、4,573,996、4,292,299、4,715,369、4,876,092、4,855,142、4,250,163、4,226,848、4,948,580號和美國再公告專利第33,093號。通過檢測它們保留和釋放葡萄糖調(diào)節(jié)肽的能力以及通過它們在結(jié)合本文活性劑后與粘膜表面相互作用的能力，能容易地評價(jià)本發(fā)明的方法和組合物中不同生物粘附聚合物作為粘膜(如鼻)遞送平臺的潛力。此外，應(yīng)用公眾已知的方法以檢測在粘膜施用的位點(diǎn)上所選的聚合物與組織的生物相容性。當(dāng)靶粘膜被粘液覆蓋時(shí)(即在沒有粘液溶解或粘液清除處理時(shí))，其能用作連接至底層粘膜上皮細(xì)胞的連接物(connecting)。因此，本文所用的術(shù)語“生物粘附劑”也包括用于增強(qiáng)本發(fā)明的生物活性劑粘膜遞送的粘膜粘附化合物。然而，通過在粘液層和底層組織(特別在發(fā)生快速粘液清除的鼻表面上)之間不完全或短暫的粘著，可以限制通過對粘液凝膠層的粘附介導(dǎo)的與粘膜組織的接觸粘附。在這個(gè)方面，連續(xù)地分泌粘液糖蛋白，且它們從細(xì)胞或腺體釋放后，立即形成粘彈性的凝膠。然而，通過機(jī)械的、酶促的和/或纖毛作用連續(xù)地溶蝕該粘附凝膠層的腔表面。在這些添加劑更突出或希望更長粘附時(shí)間的地方，本發(fā)明的協(xié)同施用方法和組合制劑方法可進(jìn)一步結(jié)合上文公開的粘液溶解劑和/或纖毛停滯方法或纖毛停滯劑。
通常，用于本發(fā)明的粘膜粘附聚合物是天然或合成的大分子，其通過絡(luò)合物機(jī)理但是非特異性地粘附在潤濕的粘膜組織表面。除這些粘膜粘附聚合物之外，本發(fā)明也提供結(jié)合生物粘附劑的方法和組合物，所述生物粘附劑借助于特異性的包括受體介導(dǎo)的相互作用直接粘附在細(xì)胞表面而不是粘液。以這種特異性方式起作用的生物粘附劑的一個(gè)例子是已知為凝集素的化合物的組。這些糖蛋白具有特異性識別并結(jié)合至糖分子(例如糖蛋白或糖脂)的能力，所述糖分子形成鼻內(nèi)上皮細(xì)胞膜的部分，且可被認(rèn)為是“凝集素受體”。
在本發(fā)明的某些方面，用于增強(qiáng)生物活性劑鼻內(nèi)遞送的生物粘附材料包括親水性基質(zhì)，例如能粘附在潤濕的粘液表面的水溶性或溶脹性的聚合物或聚合物混合物。這些粘附劑可以配制成軟膏、水凝膠(參見上文)薄膜、和其他應(yīng)用形式。經(jīng)常，這些粘附劑與生物活性劑一起混合以實(shí)現(xiàn)該活性劑緩慢釋放或局部遞送。一些與其他成分配制以促進(jìn)該活性劑通過鼻粘膜的滲透，例如進(jìn)入個(gè)體的循環(huán)系統(tǒng)。
不同的聚合物(天然和合成的聚合物)在生理的條件下顯示有效地結(jié)合至粘液和/或粘膜上皮細(xì)胞表面。通過機(jī)械桿或剪切試驗(yàn)?zāi)苋菀椎販y量這種相互作用的強(qiáng)度。當(dāng)用于潤濕的粘膜表面時(shí)，很多干燥的材料自發(fā)地粘附，至少輕微地。這種最初的接觸后，一些親水性材料開始通過吸收、溶脹或毛細(xì)力(capillary force)吸引水，且如果從底層的底物或聚合物組織界面吸收水，那么這種粘附可充分地實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)生物活性劑的粘膜吸收的目的。這種“通過水合的粘附作用”非常堅(jiān)牢，但適于使用這種機(jī)理的制劑必須解決當(dāng)該劑型轉(zhuǎn)變?yōu)樗险骋簳r(shí)所繼續(xù)的溶脹。這是為很多有用于本發(fā)明的水狀膠體特別是一些纖維素衍生物設(shè)計(jì)的，所述水狀膠體當(dāng)其用于預(yù)水合的狀態(tài)時(shí)通常為非粘附的。然而，當(dāng)這種材料以干聚合物粉末、微球或膜類型遞送的形式應(yīng)用時(shí)，粘膜施用的生物粘附藥物遞送系統(tǒng)在本發(fā)明中是有效的。
其他聚合物粘附于粘膜表面，不僅在其以干燥狀態(tài)而且在其以完全水合的狀態(tài)，以及在過量水存在下時(shí)。粘膜粘附劑的選擇因此需要考慮這些條件(生理以及物理-化學(xué)的)，在所述的條件下與組織的接觸將形成并保持。特別是，通常存在于預(yù)期粘附位點(diǎn)的水分或水的量以及主要(prevailing)的pH值已知將嚴(yán)重影響不同聚合物的粘膜粘附的結(jié)合強(qiáng)度。
在過去的20年間已建立并研究一些聚合物生物粘附藥物遞送系統(tǒng)，但并不是總成功。然而，目前用于臨床應(yīng)用的各種載體涉及牙科、骨科、眼科和外科用途。例如，基于丙烯酸的水凝膠已廣泛地用于生物粘附裝置。由于在部分溶脹態(tài)下柔性和非研磨的特征(這將減少對接觸的組織引起損害的磨損)，基于丙烯酸的水凝膠很好地適用于生物粘附。此外，它們在溶脹態(tài)中的高滲透性使未反應(yīng)的單體、未交聯(lián)的聚合物鏈和引發(fā)劑在聚合后從基質(zhì)洗出(washed out)，這是一個(gè)選擇用于本發(fā)明的生物粘附材料重要的特征。基于丙烯酸的聚合物裝置顯示非常高的粘附鍵合強(qiáng)度。為控制肽和蛋白質(zhì)藥物的粘膜遞送，本發(fā)明的方法和組合物任選地包括載體(例如起部分保護(hù)生物活性劑不受蛋白水解破壞作用的聚合物遞送運(yùn)載體)的使用，而同時(shí)提供增強(qiáng)肽或蛋白質(zhì)滲透進(jìn)入或通過該鼻粘膜。在本文中，生物粘附的聚合物證實(shí)有增強(qiáng)口服藥物遞送的巨大潛力。例如，對大鼠與粘膜粘附聚(丙烯酸)衍生物聚卡波菲的1％(w/v)鹽水分散體一起十二指腸施用的9-脫甘氨酰胺、8-精氨酸加壓素(DGAVP)的生物利用度，與不括這種聚合物的肽類藥物的水溶液相比增加3-5倍。
聚(丙烯酸)類型的粘膜粘附聚合物是一些腸蛋白酶的強(qiáng)效抑制劑。通過這類聚合物對二價(jià)陽離子(如鈣離子或鋅離子)的強(qiáng)親和性來解釋這種酶抑制的機(jī)理，所述二價(jià)陽離子是金屬蛋白酶(如胰蛋白酶和靡蛋白酶)的必要的輔助因子。據(jù)報(bào)道，聚(丙烯酸)使蛋白酶失去其輔助因子，這誘導(dǎo)該酶蛋白的不可逆轉(zhuǎn)的結(jié)構(gòu)變化，所述酶蛋白伴有酶活性的喪失。同時(shí)，其他粘膜粘附聚合物(例如一些纖維素衍生物和殼聚糖)在某些條件下不會抑制蛋白水解酶。與包括的用于本發(fā)明的其他酶抑制劑(都是相對較小的分子，例如抑肽酶、抑氨肽酶B素)對比，根據(jù)這些分子的大小抑制性聚合物的經(jīng)鼻吸收有可能很少，因而消除可能的不良副作用。因此，粘膜粘附聚合物特別是聚(丙烯酸)類型可用作吸收促進(jìn)粘附劑和酶保護(hù)劑以增強(qiáng)肽和蛋白質(zhì)藥物的控制遞送，特別當(dāng)考慮到安全性時(shí)。
除保護(hù)不受酶降解之外，用于本發(fā)明的生物粘附劑和其他聚合或非聚合吸收促進(jìn)劑可直接增強(qiáng)粘膜對生物活性劑的滲透性。為促進(jìn)大的親水性分子(例如肽和蛋白質(zhì))的轉(zhuǎn)運(yùn)跨過鼻上皮細(xì)胞屏障，已假設(shè)粘膜粘附聚合物和其他試劑產(chǎn)生增強(qiáng)滲透的作用，超過通過延長遞送系統(tǒng)粘膜前停留時(shí)間而產(chǎn)生的滲透作用。據(jù)報(bào)道藥物血漿濃度的時(shí)程表明生物粘附微球引起胰島素跨過鼻粘膜的滲透性有個(gè)急但短暫的增加。據(jù)報(bào)道，用于本發(fā)明的其他粘膜粘附聚合物(例如殼聚糖)甚至當(dāng)其用作水溶液或凝膠時(shí)，增強(qiáng)某些粘膜上皮細(xì)胞的滲透性。報(bào)道的另一個(gè)直接影響上皮細(xì)胞滲透性的粘膜粘附聚合物是透明質(zhì)酸和其酯衍生物。在本發(fā)明的協(xié)同施用和/或組合制劑方法和組合物中特別有用的生物粘附劑是殼聚糖、以及它的類似物和衍生物。殼聚糖是非毒性、生物相容的和生物可降解的聚合物，由于它的低毒和良好的生物相容性這些有利的性質(zhì)，可廣泛地用于藥物和醫(yī)療用途。殼聚糖是用堿將甲殼素N-脫乙?；苽涞奶烊痪郯被薄Ｈ缭诒景l(fā)明的方法和組合物中使用的，殼聚糖延長了葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物以及本文公開的其他生物活性劑在應(yīng)用的粘膜位點(diǎn)的停留。這種施用的方式也能提高患者順從性和接受性。如本文進(jìn)一步提供，本發(fā)明的方法和組合物將任選地包括新型殼聚糖衍生物或殼聚糖化學(xué)修飾的形式。一種用于本發(fā)明的新型衍生物稱為β-[1→4]-2-胍基-2-脫氧-D-葡萄糖聚合物(聚-GuD)。殼聚糖是甲殼素的N-脫乙?；a(chǎn)物，該天然存在的聚合物已經(jīng)廣泛地用于制備口服和鼻內(nèi)制劑的微球。也已建議將該殼聚糖聚合物用作腸道外藥物遞送的可溶性載體。在本發(fā)明的一個(gè)方面，環(huán)-甲基異脲用于將殼聚糖胺轉(zhuǎn)化為它的胍鹽部分。例如，通過在pH高于8.0時(shí)殼聚糖和環(huán)-甲基異脲的平衡-標(biāo)準(zhǔn)溶液之間的反應(yīng)制備該胍鹽化合物。
分類為用于本發(fā)明的生物粘附劑的其他化合物通過介導(dǎo)特異性的相互作用而作用，且通常分類為在生物粘附化合物和粘膜上皮細(xì)胞表面的組分的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)之間的“受體-配體相互作用”。很多天然的例子說明這種特異性結(jié)合的生物粘附的形式，例如通過凝集素-糖相互作用舉例說明。凝集素是與多糖或復(fù)合糖結(jié)合的非免疫來源的(糖)蛋白。
已研究一些植物凝集素作為可能的藥物吸收促進(jìn)劑。一個(gè)植物凝集素 -菜豆血凝素(Phaseolus vulgaris hemagglutinin)(PHA)顯示在對大鼠喂食后高口服生物利用度超過10％。番茄(Lycopersicon esculeutum)凝集素(TL)顯示對不同方式的施用是安全的。
總之，上述的生物粘附劑在本發(fā)明的組合制劑和協(xié)同施用方法中是有用的，其任選地結(jié)合有效量和形式的生物粘附劑以延長持久性或另外增強(qiáng)一種或多種葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物、以及其他生物活性劑的粘膜吸收。該生物粘附劑可在本發(fā)明的組合制劑中作為輔助的化合物或添加劑協(xié)同施用。在某些實(shí)施方案中，該生物粘附劑用作“藥物膠(glue)”，而在其他實(shí)施方案中該生物粘附劑的輔助遞送或組合配制有助于增強(qiáng)該生物活性劑與鼻粘膜的接觸，在一些例子中通過促進(jìn)與上皮細(xì)胞“受體”的特異性受體-配體相互作用，以及在其他例子中通過增強(qiáng)上皮細(xì)胞的滲透性以顯著增加在遞送的靶位點(diǎn)(例如肝、血漿或CNS組織或流體)測量的藥物濃度梯度。用于本發(fā)明的其他生物粘附劑用作酶(例如蛋白酶)抑制劑以增強(qiáng)粘膜施用的生物治療藥物的穩(wěn)定性，所述生物治療藥物協(xié)同或在與該生物粘附劑組合的制劑中遞送。
脂質(zhì)體和膠束遞送運(yùn)載體 本發(fā)明的協(xié)同施用方法和組合制劑任選地結(jié)合有效的基于脂質(zhì)或脂肪酸的載體、處理劑或遞送運(yùn)載體，以提供用于葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物以及其他生物活性劑的粘膜遞送的改進(jìn)制劑。例如，提供用于粘膜遞送的各種制劑和方法，其包括一種或多種這些活性劑(例如肽或蛋白質(zhì))，所述活性劑通過(或與其協(xié)同施用)脂質(zhì)體、混合的膠束載體或乳劑而進(jìn)行混合或包封，以提高化學(xué)和物理的穩(wěn)定性和延長通過粘膜遞送的該生物活性劑的半衰期(例如通過減少對蛋白水解、化學(xué)修飾和/變性的敏感性)。
在本發(fā)明的某些方面，用于生物活性劑的專門遞送系統(tǒng)包括稱為脂質(zhì)體的小的脂質(zhì)運(yùn)載體。這些脂質(zhì)體通常由天然的、生物可降解的、非毒性的和非免疫原性的脂質(zhì)分子制備，且能有效地捕獲或結(jié)合藥物分子(包括肽和蛋白質(zhì))進(jìn)入它們的膜或在膜的上面。通過下述事實(shí)增加脂質(zhì)體作為本發(fā)明的肽和蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)的吸引力-包封的蛋白質(zhì)可在囊泡(vesicles)內(nèi)它們優(yōu)選的水環(huán)境中保持，同時(shí)所述脂質(zhì)體膜保護(hù)它們不受蛋白水解和其他影響穩(wěn)定性因素的干擾。盡管并不是所有已知的脂質(zhì)體制備方法在肽和蛋白質(zhì)的包封中可行(由于它們獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì))，但是一些方法允許這些大分子的包封，而該大分子基本上沒有失活。
各種方法可用于制備用于本發(fā)明的脂質(zhì)體，美國專利第4,235,871、4,501,728和4,837,028號。為在脂質(zhì)體遞送中使用，該生物活性劑通?？杀徊东@至該脂質(zhì)體中或脂質(zhì)體囊泡中、或結(jié)合至該囊泡的外部。
像脂質(zhì)體一樣，未飽和的長鏈脂肪酸也具有增強(qiáng)粘膜吸收的活性，且能形成閉合的具有雙層樣結(jié)構(gòu)的囊泡(所謂的“ufasomes”)。例如，使用油酸捕獲用于本發(fā)明粘膜(例如鼻內(nèi))遞送的生物活性肽和蛋白質(zhì)，可以形成這些囊泡。
用于本發(fā)明的其他遞送系統(tǒng)將聚合物和脂質(zhì)體組合使用以聯(lián)合運(yùn)載體(如包封在該天然聚合物纖維蛋白中)有利的性質(zhì)。此外，通過使用共價(jià)交聯(lián)劑和將抗纖維蛋白溶解劑加至該纖維蛋白聚合物，來控制生物治療化合物從這種遞送系統(tǒng)的釋放。
用于本發(fā)明的更簡單化的遞送系統(tǒng)包括使用陽離子脂質(zhì)作為遞送運(yùn)載體或載體，其能有效地使用以提供在該脂質(zhì)載體和荷電的生物活性劑(如蛋白質(zhì)和聚陰離子核酸)之間的靜電相互作用。這允許將藥物有效地包裝成某種形式，所述形式適于粘膜施用和/或隨后遞送至系統(tǒng)性的室。
用于本發(fā)明的其他遞送運(yùn)載體包括長鏈和中鏈脂肪酸，以及表面活性劑與脂肪酸相混合的膠束?？紤]到它們自己轉(zhuǎn)運(yùn)跨過粘膜表面，大多數(shù)天然的以酯形式存在的脂質(zhì)具有重要的意義。已證實(shí)連接有極性基團(tuán)的游離脂肪酸和它們的單甘油酯以混合膠束的形式在腸內(nèi)的屏障上用作滲透增強(qiáng)劑。游離脂肪酸(具有鏈長從12至20個(gè)碳原子的羧酸)和其極性衍生物的屏障修飾作用的這個(gè)發(fā)現(xiàn)已激發(fā)對這些物質(zhì)作為粘膜吸收增強(qiáng)劑的應(yīng)用的廣泛研究。
為在本發(fā)明的方法中使用，長鏈脂肪酸特別是膜融合(fusogenic)脂質(zhì)(未飽和脂肪酸和單甘油酯如油酸、亞油酸、亞油酸、甘油單油酸酯等)提供有用的載體以增強(qiáng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽、類似物和模擬物、以及本文公開的其他生物活性劑的粘膜遞送。也已顯示中鏈脂肪酸(C6至C12)和單甘油酯具有增強(qiáng)藥物在腸內(nèi)吸收的活性，且其能適用于本發(fā)明粘膜遞送制劑和方法。而且，中鏈和長鏈脂肪酸的鈉鹽是有效的遞送運(yùn)載體和用于本發(fā)明生物活性劑粘膜遞送的吸收增強(qiáng)劑。因此，脂肪酸可以用于鈉鹽的可溶形式或通過添加非毒性的表面活性劑(例如聚氧乙烯氫化蓖麻油、?；悄懰徕c等)使用。在本發(fā)明中有用的其他脂肪酸和混合的膠束制品包括但不限于辛酸鈉(C8)、癸酸鈉(C10)、月桂酸鈉(C12)或油酸鈉(C18)，任選地與膽汁鹽如甘膽酸鹽和牛磺膽酸鹽組合。
聚乙二醇化 本發(fā)明提供的其他方法和組合物涉及通過共價(jià)連接聚合物材料(例如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、糖肽、聚乙二醇和聚氨基酸)而化學(xué)修飾生物活性肽和蛋白質(zhì)。所得的共軛肽和蛋白質(zhì)保持它們粘膜施用的生物活性和溶解度。在選擇性的實(shí)施方案中，葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物、以及其他生物活性肽和蛋白質(zhì)共軛至聚亞烷基氧化物聚合物，特別是聚乙二醇(PEG)。美國專利第4,179,337號。
用于本發(fā)明的胺類反應(yīng)性PEG聚合物包括具有2000、5000、10000、12000和20000分子量的SC-PEG；U-PEG-10000、NHS-PEG-3400-生物素；T-PEG-5000、T-PEG-12000和TPC-PEG-5000。生物活性肽和蛋白質(zhì)PEG化可通過羧基位點(diǎn)(例如除羧基末端之外的天冬氨酸或谷氨酸基團(tuán))的修飾來實(shí)現(xiàn)。已描述PEG-酰肼用于在酸性條件下選擇性地修飾碳二亞胺活化的蛋白質(zhì)羧基?；蛘?，可以使用生物活性肽和蛋白質(zhì)的雙官能PEG修飾。在一些程序中，荷電的氨基酸殘基(包括賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)具有在蛋白質(zhì)表面成為溶劑可接近的顯著性趨向。
活性劑的其他穩(wěn)定性修飾 除PEG化之外，通過經(jīng)由共軛至其他已知的保護(hù)化合物或穩(wěn)定化合物(例如通過用連接至一種或多種載體蛋白質(zhì)(如一種或多種免疫球蛋白鏈)的活性肽、蛋白質(zhì)、類似物或模擬物創(chuàng)建融合蛋白)保護(hù)該活性劑，可以修飾用于本發(fā)明的生物活性劑如肽和蛋白質(zhì)以增加循環(huán)半衰期。
制劑和施用 本發(fā)明的粘膜遞送制劑包括通常與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和任選的其他治療成分一起組合的葡萄糖調(diào)節(jié)肽、類似物和模擬物。該載體必須是“藥學(xué)上可接受的”，是指與該制劑的其他成分可相容的且對受治療者沒有引起不可接受的有害的作用。這種載體如上文所描述，或者另外為藥理學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知。希望，該制劑不應(yīng)該包括例如酶或氧化劑的物質(zhì)，所述物質(zhì)與待施用的生物活性劑已知為不相容的。該制劑可通過藥學(xué)領(lǐng)域眾所周知的任何方法來制備。
在本發(fā)明的組合物和方法中，通過各種粘膜施用方式(包括口服、直腸、陰道、鼻內(nèi)、肺內(nèi)或透皮遞送)，或通過局部遞送至眼睛、耳朵、皮膚或其他粘膜表面，可以對受治療者施用葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物、以及本文公開的其他生物活性劑。任選地，通過非粘膜路徑(包括肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、房內(nèi)、骨關(guān)節(jié)內(nèi)、腹腔內(nèi)或胃腸外路徑)，葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物和模擬物、以及本文公開的其他生物活性劑可協(xié)同施用或輔助施用。在其他選擇性的實(shí)施方案中，通過直接與來源于哺乳動(dòng)物受治療者的細(xì)胞、組織或器官相接觸(例如作為活體外組織或器官治療制劑的組分，所述制劑包括在合適的、液體或固體載體中的生物活性劑)，該生物活性劑可在活體外施用。
可在水溶液中作為鼻或肺噴霧施用根據(jù)本發(fā)明的組合物，且可以噴霧的形式通過各種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法分散所述組合物。用于分散液體作為鼻噴霧的優(yōu)選的系統(tǒng)在美國專利第4,511,069號中公開。該制劑可存在于多劑量容器中，例如在美國專利第4,511,069號公開的密封的分散系統(tǒng)中。其他氣溶膠遞送形式可包括例如壓縮空氣噴霧器、射流噴霧器、超聲噴霧器、壓電噴霧器，其遞送溶解或懸浮于藥物溶劑(例如水、乙醇或其混合物)的生物活性劑。本發(fā)明的氣溶膠制劑可具有直徑為1至700微米大小的液滴。
本發(fā)明的組合物和制劑可具有從50至350mOsm/L，或從50至300mOsm/L的同滲濃度。張力調(diào)節(jié)劑(tonicifier)可用于調(diào)整制劑的同滲濃度、滲透壓或張力。
本發(fā)明的鼻和肺噴霧溶液通常包括藥物或待遞送的藥物，其任選地與表面活性劑如非離子表面活性劑(如聚山梨酯-80)和一種或多種緩沖劑一起配制。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，鼻噴霧溶液進(jìn)一步包括推進(jìn)劑。該鼻噴霧溶液的pH任選地介于約pH 3.0到9之間，優(yōu)選為7.0±0.5。用于這些組合物的合適的緩沖劑如上文所述、或以其他方式為本領(lǐng)域已知。其他組分可加入以提高或保持化學(xué)穩(wěn)定性，包括防腐劑、表面活性劑、分散劑或氣體。合適的防腐劑包括但不限于苯酚、尼泊金甲酯、尼泊金酯、間甲酚、硫柳汞、氯代丁醇、苯扎氯銨(benzylalkonimum chloride)、苯甲酸鈉等。合適的表面活性劑包括但不限于油酸、脫水山梨醇三油酸酯、聚山梨酯、卵磷脂、磷脂酰膽堿以及各種長鏈二甘油酯和磷脂。合適的分散劑包括但不限于乙二胺四乙酸等。合適的氣體包括但不限于氮?dú)?、氦氣、括氯氟烴(CFC)、氫氟烷(HFC)、二氧化碳、空氣等。
在選擇性的實(shí)施方案中，將粘膜制劑作為干粉制劑施用，所述干粉制劑包括以適當(dāng)顆粒大小或者在適當(dāng)?shù)念w粒大小范圍內(nèi)的干燥(通常凍干)的形式用于鼻內(nèi)遞送的生物活性劑。適于在鼻或肺通道中沉積的最小顆粒大小經(jīng)常為約0.5μ質(zhì)量中位當(dāng)量氣動(dòng)直徑(mass median equivalentaerodynamic diameter)(MMEAD)，通常為約1μMMEAD，更通常為約2μMMEAD。適于在鼻通道中沉積的最大顆粒大小經(jīng)常為約10μMMEAD，通常為約8μMMEAD，更通常為約4μMMEAD。在這些大小范圍中的鼻內(nèi)可呼吸的粉末可通過各種常規(guī)技術(shù)例如氣流粉碎、噴霧干燥、溶劑沉淀、超臨界流體冷凝等制備。這些適當(dāng)MMEAD的干燥粉末可以經(jīng)由常規(guī)的干燥粉末吸入器(DPI)對患者施用，所述干燥粉末吸入器依賴于該患者的呼吸(經(jīng)肺或鼻吸入)以分散該粉末至霧化的量?；蛘?，經(jīng)由使用外部電源分散該粉末至霧化量的空氣輔助裝置例如柱塞泵，可施用該干燥粉末。
干燥粉末裝置通常需要在從約1mg至20mg范圍內(nèi)的粉末量以產(chǎn)生單一霧化劑量(“噴”)。如果生物活性劑需要或希望的劑量低于所述量，則粉末狀活性劑通常與藥物干燥增量劑粉末組合以提供需要的總粉末量。優(yōu)選的干燥增量劑粉末包括蔗糖、乳糖、右旋糖、甘露醇、甘氨酸、海藻糖、人血清白蛋白(HSA)和淀粉。其他合適的干燥增量劑粉末包括纖維二糖、葡聚糖、麥芽三糖、果膠、檸檬酸鈉、抗壞血酸鈉等。
為配制用于本發(fā)明的粘膜遞送組合物，生物活性劑可以與不同藥學(xué)上可接受的添加劑組合，以及用于該活性劑分散的基質(zhì)或載體。希望的添加劑包括但不限于pH控制劑如精氨酸、氫氧化鈉、甘氨酸、鹽酸、檸檬酸、乙酸等。而且，可以包括局部麻醉劑(例如苯甲醇)、等滲劑(例如氯化鈉、甘露醇、山梨醇)、吸收抑制劑(例如吐溫80)、增溶劑(例如環(huán)糊精及其衍生物)、穩(wěn)定劑(例如血清白蛋白)和還原劑(例如谷胱甘肽)。當(dāng)用于粘膜遞送的組合物是液體時(shí)，該制劑的張力(與所用的0.9％(w/v)生理鹽水溶液的張力測量一致)通?？烧{(diào)整至一定值，在所述值時(shí)沒有實(shí)質(zhì)上不可逆轉(zhuǎn)的組織損害在施用位點(diǎn)的鼻粘膜中發(fā)生。通常，該溶液的張力被調(diào)整至為約1/3至3的值，更通常為1/2至2，且最通常為3/4至1.7。
生物活性劑可分散于基質(zhì)或運(yùn)載體中，所述基質(zhì)或運(yùn)載體包括具有分散該活性劑和任何希望的添加劑的能力的親水性化合物。該基質(zhì)可選自范圍廣泛的合適載體，包括但不限于聚羧酸的共聚物或其鹽、含有其他單體(例如甲基(甲基)丙烯酸酯、丙烯酸等)的羧酸酐(如馬來酸酐)、親水性乙烯基聚合物(如聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮)、纖維素衍生物(如羥甲基纖維素、羥丙基纖維素等)和天然聚合物(如殼聚糖、膠原、海藻酸鈉、明膠、透明質(zhì)酸和其非毒性金屬鹽)。通常，生物可降解聚合物選擇作為基質(zhì)或載體，例如聚乳酸、聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物、聚羥丁酸、聚(羥基丁酸-羥基乙酸)共聚物和其混合物?？蛇x地或此外，合成的脂肪酸酯如聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯等可以用作載體。親水性聚合物和其他載體可單獨(dú)或組合使用，且增強(qiáng)的結(jié)構(gòu)整體性可通過部分結(jié)晶、離子鍵合、交聯(lián)等賦予該載體。所述載體可以各種形式提供，包括直接應(yīng)用至鼻粘膜的流體或粘性溶液、凝膠、糊劑、粉末、微球和膜。所選的載體在本文中的使用可導(dǎo)致促進(jìn)該生物活性劑的吸收。
該生物活性劑可根據(jù)各種方法與基質(zhì)或載體組合，且該活性劑的釋放可通過擴(kuò)散、載體的崩解、水通道的相關(guān)制劑。在一些環(huán)境下，該活性劑分散于由合適的聚合物如2-氰基丙烯酸異丁酯制備的微囊(微球)或納米膠囊(納米球)中，并分散于應(yīng)用至該鼻粘膜的生物相容性分散介質(zhì)中，所述分散介質(zhì)在延長的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生持續(xù)的遞送和生物活性。
為進(jìn)一步增強(qiáng)本發(fā)明藥物制劑的粘膜遞送，包括該活性劑的制劑也可包括親水性低分子量化合物作為基質(zhì)或賦形劑。這種親水性低分子量化合物提供通道介質(zhì)，通過所述通道介質(zhì)水溶性活性劑如生理活性肽或蛋白質(zhì)可通過該基質(zhì)擴(kuò)散至吸收該活性劑的身體表面。該親水性低分子量化合物任選地從粘膜或施用環(huán)境中吸收水分且溶解該水溶性活性肽。親水性低分子量化合物的分子量通常不超過10000，且優(yōu)選不超過3000。示例性的親水性低分子量化合物包括多元醇化合物，例如低聚糖、二糖和單糖如蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、L-阿拉伯糖、D-赤蘚糖、D-核糖、D-木糖、D-甘露糖、海藻糖、D-半乳糖、乳果糖、纖維二糖、龍膽二糖(gentibiose)、丙三醇和聚乙二醇。用作本發(fā)明載體的親水性低分子量化合物的其他例子包括N-甲基吡咯烷酮和醇(如低聚乙烯醇、乙醇、乙二醇、丙二醇等)。這些親水性低分子量化合物可以單獨(dú)使用、或與另一種或鼻內(nèi)制劑的其他活性或惰性組分組合使用。
本發(fā)明的組合物可選擇性地包括藥學(xué)上可接受的如達(dá)到近似生理?xiàng)l件所需的載體物質(zhì)，例如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、潤濕劑等，如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。對固體組合物來說，可以使用常規(guī)的非毒性藥學(xué)上可接受載體，包括例如藥用級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。
施用生物活性劑的治療組合物也可以配制成溶液、微乳或其他適于高濃度活性成分的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包括例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液體聚乙二醇等)、以及其合適的混合物。例如通過使用包衣料如卵磷脂、通過保持在分散制劑的例子中希望的顆粒大小、以及通過使用表面活性劑，可以保持溶液適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在很多例子中，期望在組合物中包括等滲劑如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。該生物活性劑的延長吸收可以通過在該組合物中包括延緩吸收的試劑如單硬脂酸鹽和明膠來實(shí)現(xiàn)。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，以擇時(shí)釋放的制劑施用該生物活性劑，例如在包括緩慢釋放的聚合物的組合物中。該活性劑可以與保護(hù)抵抗快速釋放的載體一起制備，例如控釋運(yùn)載體如聚合物、微囊化遞送系統(tǒng)或生物粘附凝膠。在本發(fā)明的不同組合物中，該活性劑的延長遞送可以通過在該組合物中包括延緩吸收的試劑如單硬脂酸鋁水凝膠和明膠來實(shí)現(xiàn)。當(dāng)需要該生物活性劑的控釋制劑時(shí)，適合根據(jù)本發(fā)明使用的控釋粘合劑包括任何對該活性劑惰性且能結(jié)合該生物活性劑的生物相容性控釋材料。很多這種材料在本領(lǐng)域是已知的。有用的控釋粘合劑是在經(jīng)鼻內(nèi)遞送后的生理?xiàng)l件下(例如在鼻粘膜表面或經(jīng)粘膜遞送后在體液的存在下)緩慢代謝的材料。適當(dāng)?shù)恼澈蟿┌ǖ幌抻谧畛踉诒绢I(lǐng)域的持續(xù)釋放制劑中使用的生物相容性聚合物和共聚物。這種生物相容性化合物是非毒性且對周圍組織惰性，并不會觸發(fā)顯著的不良副作用如鼻刺激性、免疫反應(yīng)、發(fā)炎等。它們代謝成也是生物相容的且易從體內(nèi)清除的代謝產(chǎn)物。
示例性的用于本文的聚合物材料包括但不限于由具有可水解的酯鍵的共聚和均聚的聚酯獲得的聚合物基質(zhì)。很多這些聚合物是本領(lǐng)域已知的生物可降解的且生成沒有毒性或低毒的降解產(chǎn)物。示例性的聚合物包括聚羥基乙酸(PGA)和聚乳酸(PLA)、聚(DL-乳酸-羥基乙酸)共聚物(DLPLGA)、聚(D-乳酸-羥基乙酸)共聚物(D PLGA)和聚(L-乳酸-羥基乙酸)共聚物(L PLGA)。其他有用的生物可降解或生物可溶蝕的聚合物包括但不限于這類聚合物如聚(ε-己內(nèi)酯)、聚(ε-己內(nèi)酯(aprolactone)-乳酸)共聚物、聚(ε-己內(nèi)酯(aprolactone)-羥基乙酸)共聚物、聚(β-羥丁酸)、聚(烷基-2-氰基丙烯酸酯(acrilate))；水凝膠(如聚(甲基丙烯酸羥乙酯))、聚酰胺、聚(氨基酸)(即L-亮氨酸、谷氨酸、L-天冬氨酸等)、聚(酯脲)、聚(2-羥乙基DL-天冬酰胺)、聚縮醛聚合物、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚馬來酰亞胺、多糖和其共聚物。制備這種制劑的很多方法通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。其他有用的制劑包括控釋組合物，例如微囊，美國專利第4,652,441和4,917,893號；在制備微囊和其他制劑中有用的乳酸-羥基乙酸共聚物，美國專利第4,677,191和4,728,721號；水溶性肽的持續(xù)釋放組合物，美國專利第4,675,189號。
對于鼻和肺遞送，用于控制治療性液體的氣溶膠分散為噴霧的系統(tǒng)是公眾已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，借助專門構(gòu)建的機(jī)械泵閥門遞送計(jì)量劑量的活性劑，美國專利第4,511,069號。
劑量 出于預(yù)防和治療的目的，本文公開的生物活性劑可以單一推注(bolus)遞送對受治療者施用，在延長的時(shí)間期間經(jīng)由連續(xù)的遞送(例如連續(xù)的透皮、粘膜或靜脈內(nèi)遞送)，或在重復(fù)施用的方案中(例如通過每小時(shí)、每天、每周的重復(fù)施用方案)。在本文中，葡萄糖調(diào)節(jié)肽的有效治療量可以包括在延長的預(yù)防或治療方案中的重復(fù)劑量，所述方案能產(chǎn)生臨床有效的結(jié)果以減緩與如上文列出的靶疾病或病癥相關(guān)的一種或多種癥狀或可檢測的病癥。檢測本文中有效的劑量通?；趧?dòng)物模型研究(后進(jìn)行人臨床試驗(yàn))，并通過檢測能顯著減少受治療者的靶疾病癥狀或病癥的發(fā)生率或嚴(yán)重性的有效劑量和施用方案來指導(dǎo)。在這個(gè)方面，合適的模型包括例如小鼠、大鼠、豬、貓、非人靈長類以及本領(lǐng)域已知的其他可接受的動(dòng)物模型受治療者?；蛘撸行У膭┝靠梢允褂皿w外模型來檢測(例如免疫學(xué)分析測定和組織病理學(xué)分析測定)。使用這些模型，通常僅需要普通的計(jì)算和調(diào)整來檢測施用治療有效量(例如，鼻內(nèi)有效、透皮有效、靜脈內(nèi)有效、或肌內(nèi)有效以引起希望的反映的量)的生物活性劑的適當(dāng)濃度和劑量。
在選擇性的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于葡萄糖調(diào)節(jié)肽鼻內(nèi)遞送的組合物和方法，其中通過鼻內(nèi)有效的劑量方案重復(fù)施用所述葡萄糖調(diào)節(jié)肽化合物，所述劑量方案涉及在每天或每周時(shí)間表期間對受治療者的多次施用該葡萄糖調(diào)節(jié)肽，以保持在延長的給藥期間葡萄糖調(diào)節(jié)肽治療性有效升高的和降低的脈動(dòng)(pulsatile)水平。該組合物和方法提供葡萄糖調(diào)節(jié)肽化合物，其中受治療者每天1至6次自己施用在鼻制劑中的所述葡萄糖調(diào)節(jié)肽化合物，以保持在8小時(shí)至24小時(shí)延長的給藥期間葡萄糖調(diào)節(jié)肽治療有效升高的和降低的脈動(dòng)水平。
試劑盒 本發(fā)明也包括試劑盒、包裝和多容器單元，其中包括用于預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物受治療者的疾病和其他病癥的上述藥物組合物、活性成分、和/或其施用的工具。簡要來說，這些試劑盒包括容器或制劑，其含有與本文公開的粘膜遞送增強(qiáng)劑組合配制在用于粘膜遞送的藥物制品中的一種或多種葡萄糖調(diào)節(jié)肽蛋白質(zhì)、類似物或模擬物和/或其他生物活性劑。
本發(fā)明的鼻內(nèi)制劑可以使用任何噴霧瓶或注射器、或通過滴注而施用。鼻噴霧瓶的一個(gè)例子是“Nasal Spray Pump w/Safety Clip(有安全夾的鼻噴霧泵w)”Pfeiffer SAP # 60548，其每次噴射(squirt)遞送0.1mL的劑量且其汲取管(diptube)長度為36.05mm。這從美國Princeton，NJ.的Pfeiffer公司購得。
氣溶膠鼻施用葡萄糖調(diào)節(jié)肽 我們已發(fā)現(xiàn)使用鼻噴霧劑或氣溶膠可以鼻內(nèi)施用GRP。令人驚奇的是，因?yàn)橐扬@示由于在制備該噴霧劑或氣溶膠中致動(dòng)器(actuator)產(chǎn)生的機(jī)械力，很多蛋白質(zhì)和肽被剪切或變性。在這個(gè)領(lǐng)域中下述的定義是有用的。
1.氣溶膠-在壓力下包裝且包含通過啟動(dòng)(activation)適當(dāng)?shù)拈y門系統(tǒng)而釋放的治療活性成分的產(chǎn)品。
2.計(jì)量氣溶膠-由計(jì)量劑量閥門構(gòu)成的加壓劑型，所述計(jì)量劑量閥門通過每次啟動(dòng)可遞送均勻量噴霧。
3.粉末氣溶膠-在壓力下包裝且包含粉末形式的治療活性成分的產(chǎn)品，所述粉末通過啟動(dòng)適當(dāng)?shù)拈y門系統(tǒng)釋放。
4.噴霧氣溶膠-利用壓縮的氣體作為推進(jìn)劑以提供將產(chǎn)品作為濕噴霧驅(qū)出所需的力量的產(chǎn)品；它通常應(yīng)用于在含水溶劑中的藥物溶液。
5.噴霧劑-通過空氣或流的噴射精細(xì)分開的液體。鼻噴霧藥物產(chǎn)品包含溶解或懸浮于非加壓分配器的賦形劑溶液或混合物中的治療活性成分。
6.計(jì)量噴霧劑-由通過每次啟動(dòng)可分配特定量噴霧的閥門組成的非加壓劑型。
7.懸浮噴霧劑-包含以過程(course)液滴或作為精細(xì)分開固體的形式分散于液體運(yùn)載體中的固體顆粒的液體制品。
通過將計(jì)量的鼻噴霧泵作為藥物遞送裝置(“DDD”)來表達(dá)氣溶膠噴霧的流體動(dòng)力學(xué)特征。噴霧特征是美國食品藥物管理局“FDA”批準(zhǔn)新型和已有的鼻噴霧泵的研究和開發(fā)、質(zhì)量確保和穩(wěn)定性試驗(yàn)程序的規(guī)章所要求遞交的主要部分。
已發(fā)現(xiàn)該噴霧的幾何結(jié)構(gòu)的完全表征是鼻噴霧泵的全面性能最好的指標(biāo)。特別是，該噴霧離開裝置時(shí)的發(fā)散角測量值(柱幾何形狀)；該噴霧的橫截面橢圓率、均勻性和顆粒/液滴分布(噴流型(spray pattern))；已發(fā)現(xiàn)顯示噴霧的時(shí)間進(jìn)展是在鼻噴霧泵的表征中最具代表性的性能量。在質(zhì)量保證和穩(wěn)定性試驗(yàn)期間，柱幾何形狀和噴流型測量值是用于驗(yàn)證與批準(zhǔn)的鼻噴霧泵數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)一致性和均勻性的主要指標(biāo)。
定義 柱高-從該致動(dòng)器頂端至柱角度成為非線性(因破壞線性流)所在的點(diǎn)的測量值。基于數(shù)字圖像的視覺檢測，以及為建立與噴流型的最遠(yuǎn)測量點(diǎn)一致的寬度的測量點(diǎn)，本研究限定30mm的高度。
長軸-在以基礎(chǔ)單位(mm)跨過COMw的擬合噴流型中可拉出的最大的弦。
短軸-在以基礎(chǔ)單位(mm)跨過COMw的擬合噴流型中可拉出的最小的弦。
橢圓率-長軸與短軸的比率，優(yōu)選在1.0和1.5之間，更優(yōu)選在1.0和1.3之間。
D10-樣品總液體體積的10％由更小直徑(μm)液滴組成的液滴的直徑。
D50-樣品總液體體積的50％由更小直徑(μm)液滴組成的液滴的直徑，也稱為質(zhì)量中位直徑。
D90-樣品總液體體積的90％由更小直徑(μm)液滴組成的液滴的直徑。
跨徑-分布寬度的測量值，該數(shù)值越小，分布的范圍越窄?？鐝接?jì)算如下(D90-D10)/D50。
％RSD-百分比相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，標(biāo)準(zhǔn)偏差除以該系列的平均值再乘以100，也稱為％CV。
容積-通過每次啟動(dòng)由遞送裝置排出的液體或粉末的體積，優(yōu)選在0.01mL和約2.5mL之間，最優(yōu)選0.02mL和0.25mL之間。
由此通過引用分別將本文引證的所有公開物、參考文獻(xiàn)、專利、專利公開物和專利申請的全部內(nèi)容具體地結(jié)合至本文。
盡管本發(fā)明已就某些實(shí)施方案進(jìn)行了描述，并且為示例的目的列出了很多細(xì)節(jié)，但是對技術(shù)人員來說顯而易見的是，本發(fā)明包括其他的實(shí)施方案，并且在沒有偏離本發(fā)明的情況下本文描述的一些細(xì)節(jié)可有相當(dāng)大的改變。本發(fā)明包括這種其他的實(shí)施方案、調(diào)整和等同物。特別地，本發(fā)明包括不同示例性的組分和實(shí)施例的特征、術(shù)語或要素的任何組合。
本文術(shù)語“一種”、“這種”以及類似的術(shù)語在描述本發(fā)明和在權(quán)利要求中的使用可解釋為包括單數(shù)和復(fù)數(shù)。術(shù)語“包含”、“具有”、“包括”、“含有”可解釋為開放式的術(shù)語，其是指，例如“包括但不限于”。本發(fā)明數(shù)值范圍的引用是單獨(dú)地指每個(gè)離散數(shù)值落在該范圍內(nèi)(如果它在本文單獨(dú)地引用)，不管在該范圍中一些數(shù)值是否清楚地引用。本文使用的具體數(shù)值應(yīng)理解為示例性的，并不是限制本發(fā)明的范圍。
本文所給出的實(shí)施例以及本文所用的示例性語言只是用于說明的目的，并不是用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例 實(shí)施例1 門冬胰島素制劑 表1描述12種門冬胰島素制劑，在體外使用用于跨上皮電阻測定(TER)、細(xì)胞存活率測定(MTT)、乳酸脫氫酶細(xì)胞死亡測定(LDH)和組織滲透測定的EpiAirway Model System進(jìn)行測試。結(jié)果用于確定哪種制劑能達(dá)到最大程度的組織滲透和TER減少，而沒有顯著的細(xì)胞毒性。
門冬胰島素是胰島素類似物，其與常規(guī)人胰島素同源，除在B28位點(diǎn)門冬氨酸單取代脯氨酸之外。NovoLog(NovoLogTM；Novo NordiskPharmaceuticals)是無菌的、水性、澄清的且無色的溶液，其包含門冬胰島素(B28門冬常規(guī)人胰島素類似物)100單位/mL、甘油16mg/mL、苯酚1.50mg/mL、間甲酚1.72mg/mL、鋅19.6μg/mL、二水合磷酸氫二鈉1.25mg/mL和氯化鈉0.58mg/mL。NovoLog pH為7.2-7.6。產(chǎn)生新型門冬胰島素制劑。所制造的每個(gè)制劑的總體積為0.5mL。該制劑包含不同濃度的門冬胰島素、NovoLog稀釋液和賦形劑甲基-β-環(huán)糊精M-β-CD)、二癸?；鵏-α-磷脂酰膽堿以及依地酸二鈉(EDTA)，單獨(dú)或其組合。不含賦形劑的對照也包括在本研究中。如有必要，將少量2N HCl或NaOH加至該制劑中直至達(dá)到期望的pH。用于制備制劑的試劑如表2所示。
表1體外研究的門冬胰島素制劑 表2門冬胰島素制劑試劑 實(shí)施例2 鼻粘膜遞送-滲透動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞毒性 下述的方法通常用于評價(jià)在本發(fā)明制劑和方法中的胰島素鼻粘膜遞送參數(shù)、動(dòng)力學(xué)和副作用，以及測定本文公開的用于與門冬胰島素組合制劑或協(xié)同施用的不同粘膜遞送增強(qiáng)劑的效力和特征。在一個(gè)示例性的實(shí)驗(yàn)方案中，證明了如上文公開的與生物活性治療劑(以門冬胰島素為例)組合的鼻內(nèi)遞送增強(qiáng)劑的滲透動(dòng)力學(xué)和不具備不可接受的細(xì)胞毒性。
細(xì)胞培養(yǎng) MatTek公司(Ashland，MA)開發(fā)了作為襯砌呼吸道的假復(fù)層上皮模型的EpiAirway系統(tǒng)。該上皮細(xì)胞在多孔膜底的細(xì)胞培養(yǎng)插入物(cell cultureinsert)上在氣-液表面生長，這導(dǎo)致細(xì)胞分化至高度極化的形態(tài)。頂面(apicalsurface)是具有微絨毛的超微結(jié)構(gòu)的纖毛，且該上皮細(xì)胞產(chǎn)生粘液(通過免疫印跡法已經(jīng)證實(shí)粘蛋白的存在)。該插入物直徑為0.875cm，其表面積為0.6cm2。在運(yùn)送(shipping)前大約3個(gè)星期在制造場所將所述細(xì)胞平鋪在插入物上。
試驗(yàn)開始的前一天收到EpiAirwayTM培養(yǎng)膜。它們在不含酚紅和氫化可的松的Dulbecco′s Modified Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)中輸送。將每個(gè)組織插入物(tissue insert)放至含有0.9mL不含血清的DMEM的6孔板的孔中。然后將該膜在37℃/5％CO2下培養(yǎng)24小時(shí)使組織達(dá)到平衡。供給插入物(insert)用于每天的回收。基于DMEM的培養(yǎng)基不含血清，但補(bǔ)充表皮生長因子和其他因子。測試培養(yǎng)基中被認(rèn)為用于鼻內(nèi)遞送的任何細(xì)胞因子或生長因子的內(nèi)源性水平，培養(yǎng)基不含所有研究至今的細(xì)胞因子和因子，除胰島素之外。該體積足夠提供與它們支架上單元底部的接觸，但是上皮細(xì)胞的頂面被允許保持與空氣的直接接觸。在這個(gè)步驟中和所有隨后涉及將單元轉(zhuǎn)移至含有液體的孔的步驟中使用無菌的鑷子，以確保在單元的底部和培養(yǎng)基之間沒有空氣包埋。
EpiAirwayTM模型系統(tǒng)用于評價(jià)每個(gè)含有NovoLog制劑的對TER、細(xì)胞存活率(MTT)、細(xì)胞毒性(LDH)和滲透率的影響。這些測定下面將詳細(xì)描述。在所有的試驗(yàn)中，將待研究的鼻粘膜遞送制劑應(yīng)用于每個(gè)單元的頂面，體積為100μL，其足夠覆蓋整個(gè)頂面。留出適當(dāng)體積的具有應(yīng)用于頂面的濃度的測試制劑(通常需要的不超過100μL)，用于隨后通過ELISA或其他指定的測定法測定活性物質(zhì)的濃度。
跨上皮電阻(TER) 通過使用與具有電極的上皮Voltohmeter連接的組織電阻測量室(Tissue Resistance Measurement Chamber(都由World Precision Instruments提供)讀取TER測量值。首先，在試驗(yàn)開始的那天讀取每個(gè)插入物的背景TER。在讀取TER后，將1mL新鮮的培養(yǎng)基放置于6孔板中每個(gè)孔的底部。插入物由紙巾紙吸干，且放入具有新鮮培養(yǎng)基的新孔中，同時(shí)保持編號的插入物以與背景TER測量值相互關(guān)聯(lián)。向每個(gè)插入物中加入100μL試驗(yàn)制劑。在37℃將插入物在振蕩的培養(yǎng)箱中以100rpm放置1小時(shí)。
在檢查校正之前關(guān)掉電源，在新鮮培養(yǎng)基中平衡電極和組織培養(yǎng)空白插入物至少20分鐘。用在Endohm組織室中的1.5mL培養(yǎng)基和在空白Millicell-CM插入物中的300μL培養(yǎng)基測量背景電阻。調(diào)整上電極以使其浸沒于培養(yǎng)基中，但是沒有與插入物膜的上表面相接觸?？瞻撞迦胛锏谋尘半娮铻?-20ohms。對于每次TER測定，向插入物中加入300μL培養(yǎng)基，然后在放置于Endohm室中讀取TER之前于室溫下培養(yǎng)20分鐘。電阻表示為(測得的電阻-空白)x0.6cm2。所有TER值報(bào)道記錄為組織表面積的函數(shù)。
TER按下述計(jì)算TER＝(R1-Rb)xA 其中R1為具有膜的插入物的電阻，Rb為該空白插入物的電阻，A為該膜的面積(0.6cm2)。相對于對照值(對照＝約1000ohms-cm2，標(biāo)準(zhǔn)化為100)TER值的減少表明細(xì)胞膜電阻的減少和粘膜上皮細(xì)胞滲透率的增加。完成1小時(shí)培養(yǎng)后，將組織插入物從培養(yǎng)箱中移去。將200μL新鮮的培養(yǎng)基置于24孔板的各孔中，并將組織插入物轉(zhuǎn)移至24孔板中。將200μL新鮮的培養(yǎng)基小心地加至每個(gè)組織插入物。再次測量每個(gè)插入物的TER。
在將組織培養(yǎng)插入物從6孔板轉(zhuǎn)移至24孔板后，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基細(xì)分成三個(gè)部分，并貯存于微量離心管中。所有三個(gè)細(xì)分部分放置于-80℃直至使用。
乳酸脫氫酶(LDH)測定 通過使用CytoTox 96細(xì)胞毒性測定試劑盒(得自Promega公司)測量LDH從細(xì)胞的釋放來測定細(xì)胞死亡的量。研究中的每個(gè)組織培養(yǎng)插入物進(jìn)行三份樣品的測定。在96孔板中添加50μL收獲的培養(yǎng)基(在4℃貯存)，共三份。使用新鮮的、無細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白。將50μL底物溶液(根據(jù)試劑盒制備，將12mL分析緩沖液加至新鮮的混合底物的瓶中)加至每個(gè)孔中，所述板于室溫下避光孵育30分鐘。孵育后，將50μL終止溶液加至每個(gè)孔中，且使用KCJr軟件于490nm在μQuant光密度平板讀數(shù)儀上讀取所述板。
MTT測定 通過測試線粒體還原酶活性的MTT測定(MTT-100、MatTek試劑盒)來測試每個(gè)組織培養(yǎng)插入物的細(xì)胞存活率。這種試劑盒測量四唑鹽的吸收和轉(zhuǎn)化為甲蠟染料。將MTT濃縮物融化并使用培養(yǎng)基以2mL MTT∶8mL培養(yǎng)基的比率進(jìn)行且稀釋。吸取稀釋的MTT濃縮物(300μL)至24孔板。小心地干燥組織插入物，將其放置在該板上的孔中，于37℃避光孵育3小時(shí)。孵育后，從該板上移去每個(gè)插入物，小心地進(jìn)行印跡，放置在24孔萃取板中。然后將該細(xì)胞培養(yǎng)插入物浸沒于每孔2.0mL萃取溶液中(完全覆蓋樣品)。該萃取板被覆蓋且被密封以減少萃取劑的蒸發(fā)。在室溫下避光過夜孵育后，將每個(gè)插入物中的液體倒回至所取自的孔中，棄去插入物。吸取每個(gè)孔的萃取溶液(50μL)三份至96孔微孔板中，與萃取空白一起，并加入150μL新鮮的萃取劑溶液進(jìn)行稀釋。使用KCJr軟件于550nm在μQuant光密度平板讀數(shù)儀上測量該樣品的光密度。
TER結(jié)果 將試驗(yàn)制劑于37℃孵育1小時(shí)之前或之后的TER測量值(ohms x cm2)與對照組比較。結(jié)果顯示除#7和#8之外含有增強(qiáng)劑的制劑在孵育1小時(shí)后TER顯著減少。
MTT結(jié)果 與對照組比較，幾乎所有制劑都顯示從正常到良好的細(xì)胞存活率。大多數(shù)制劑的％MTT都高于80％(除#1、#6和#12之外)。
LDH結(jié)果 大多數(shù)測試制劑幾乎沒有顯示LDH，這表示細(xì)胞毒性很低。
總結(jié) TER、MTT和LDH測定的結(jié)果表明制劑#2、#6、#9、#10和#11都顯示TER顯著地減少，而毒性沒有增加。
實(shí)施例3 門冬胰島素滲透率 ELISA用于定量滲透過插入物頂端至底外側(cè)的胰島素或胰島素類似物的量。胰島素存在于MaTtek培養(yǎng)基中，故通過從所有其他樣品中減去存在于培養(yǎng)基樣品的平均濃度來校正原始數(shù)據(jù)。
同工胰島素ELISA試劑盒購自Alpco Diagnostics，(Windham，NH，目錄號#08-10-1128-01)。樣品用隨該試劑盒提供的測定緩沖液稀釋。通過小心地顛倒，將稀釋液混合至具有Teflon涂布覆蓋物的透明硅烷化的HPLC瓶中。使用KCJr軟件于450nm(如實(shí)驗(yàn)方案中所示)在μQuant光密度平板讀數(shù)儀上測量樣品的光密度。
每個(gè)插入物的負(fù)載容積(loading volume)為100μL且滲透樣品時(shí)間為60分鐘。使用n＝3的插入物測試每個(gè)制劑以及對照。本研究的對照包括MatTek基礎(chǔ)培養(yǎng)基和9％Triton X-100。將每個(gè)組織插入物放置于含有0.95mL MatTek基礎(chǔ)培養(yǎng)基的單個(gè)孔中。在該插入物的頂面上，根據(jù)研究設(shè)計(jì)，應(yīng)用100μL測試制劑，且將樣品放置于振蕩器(～100rpm)在37℃下1小時(shí)。在孵育期間的最后階段，將50μL約20,000KIUnits的aprotnin加至每個(gè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基樣品中，且在2-8℃貯存用于ELISA分析。
表3顯示通過ELISA測定的底外側(cè)樣品的滲透率結(jié)果。通過從試驗(yàn)樣品中減去單獨(dú)存在于培養(yǎng)基的胰島素的平均量來校正平均值。
表3測試門冬胰島素制劑的％滲透率結(jié)果
這些滲透率結(jié)果顯示通過鼻內(nèi)制劑可以使用滲透增強(qiáng)劑來遞送門冬胰島素。含有增強(qiáng)劑的所有制劑與不含增強(qiáng)劑的制劑比較至少產(chǎn)生9％(～9-21％)的滲透，后者滲透最多為～1-2％。滲透率增加最多的樣品包括#1、#2、#9、#10、#11和#12。當(dāng)其與TER、MTT、和LDH結(jié)果聯(lián)系在一起時(shí)，樣品#2(5U/mL門冬胰島素、45mg/mL Me-β-CD、1mg/mLDDPC、1mg/mL EDTA、5％Novolog稀釋液、pH 4)；#9(20U/mL門冬胰島素45mg/mL Me-β-CD、1mg/mL DDPC、1mg/mL EDTA、20％Novolog稀釋液、pH 4)；#10(20U/mL門冬胰島素、45mg/mL Me-β-CD、1mg/mLDDPC、1mg/mL EDTA、20％Novolog稀釋液、pH 3)；和#11(5U/mL門冬胰島素、0mg/mL Me-β-CD、0mg/mL DDPC、10mg/mL EDTA、5％Novolog稀釋液、pH 4)滲透率增加最多，且細(xì)胞毒性最小。
實(shí)施例4 NPG和PN159對胰島素滲透率的作用 進(jìn)行體外試驗(yàn)評價(jià)小分子和基于肽的滲透增強(qiáng)劑對胰島素滲透率的作用。在37℃下將7個(gè)不同的處理組應(yīng)用于EpiAirway 96孔板1小時(shí)，將0.1U胰島素應(yīng)用于頂側(cè)上。標(biāo)準(zhǔn)曲線和高的低對照如希望一樣，在底外側(cè)培養(yǎng)基中的胰島素尖峰(spike)顯示回收率接近100％。處理包括PBS+胰島素0.1U；25μM PN159+胰島素0.1U；50μM PN159+胰島素0.1U；PDF+胰島素0.1U；PBS+胰島素0.1U+NPG 150mM；25uM PN159+胰島素0.1U+NPG 150mM和PDF+胰島素0.1U+NPG 150mM。
用于本研究的胰島素是Sigma重組(酵母獲得)人胰島素天然序列。這種重組人胰島素從胰島素原(pro-insulin)獲得，且化學(xué)上、物理上和生物上等同于胰腺人胰島素。PBS是磷酸緩沖鹽。PDF是由45mg/mL甲基-β-環(huán)糊精、1mg/mL乙二胺四乙酸鹽、1mg/mL二癸?；字Ｄ憠A和10mM乙酸鹽組成的混合物，pH 5.5。單體(monmomeric)穩(wěn)定劑(NPG)是N-特戊酰氨基葡萄糖。PN159是肽，如在共同待決的美國專利申請第11/233,239號中描述。這些結(jié)果如表4所示，如下 表4含有PDF、PN159和NPG制劑的滲透率結(jié)果 PN159增加胰島素的滲透率25μM PN159產(chǎn)生0.8％滲透率、而50μMPN159增加滲透率至2.5％。與NPG組合，25μM PN159產(chǎn)生1.8％滲透率。該結(jié)果顯示PDF單獨(dú)產(chǎn)生3％滲透率，比PBS單獨(dú)大約12倍。當(dāng)PDF與NPG組合時(shí)，滲透率增加至7.6％，比PBS增加30倍。
進(jìn)行進(jìn)一步的研究以測試如表5所示，包括含有PN159的制劑的TER、LDH、MTT以及滲透率。用n＝3的插入物在EpiAirway模型中測試所有制劑。常規(guī)胰島素約為28U/mg(即200U/mL＝～7.14mg/mL)。
表5制劑
縮略語Arg＝精氨酸、Me-β-CD＝甲基-β-環(huán)糊精、EDTA＝依地酸二鈉、NACl＝氯化鈉、MP＝尼泊金甲酯鈉、PP＝尼泊金丙酯鈉、PG＝丙二醇 將試驗(yàn)制劑在37℃下孵育1小時(shí)之前和之后的TER測量值(ohms xcm2)與對照比較。結(jié)果顯示含有增強(qiáng)劑的制劑在孵育1小時(shí)后TER顯著地減少。制劑#5、#6和#8顯示細(xì)胞存活率，所有制劑(除#7之外)具有最小的細(xì)胞毒性，與PBS對照相類似。滲透率結(jié)果如表6所示。
表6滲透結(jié)果 制劑#1(4.47％)和#7(4.66％)具有最高的滲透率百分?jǐn)?shù)。這些數(shù)據(jù)顯示在體外加入PN159并沒有相對于PDF(Me-β-CD、DDPC和EDTA)制劑顯著增強(qiáng)胰島素的滲透。
實(shí)施例5 選擇性緩沖液對胰島素滲透率的影響 進(jìn)行滲透率研究以比較與PDF制劑(Me-β-CD、DDPC和EDTA)組合的選擇性緩沖液。通過ELISA(得自LINCO Research，Inc.目錄#EZHI-14K)在60分鐘孵育和使用50μL負(fù)載容積后，產(chǎn)生這些滲透率數(shù)據(jù)。在表7中列出的所有制劑具有良好的細(xì)胞存活率和低細(xì)胞毒性，如通過MTT和LDH測定所測量的。
表7選擇性緩沖液的滲透率結(jié)果
精氨酸緩沖液是表現(xiàn)適度的緩沖液，其胰島素的百分比滲透率為3％至6％。乙酸鹽緩沖液制劑獲得的％滲透率為7％至12％。磷酸鹽緩沖液制劑的％滲透率范圍為5％至28％。用10mM磷酸鹽緩沖液、45mg/mLMe-β-CD、1mg/mL DDPC、1mg/mL EDTA、280U/mL胰島素在pH 7(#4)獲得最高的％滲透率28％。
實(shí)施例6 最佳的鼻內(nèi)胰島素制劑的體外篩選研究 以不同的組分濃度和pH范圍對280U/mL和840U/mL胰島素制劑進(jìn)行了初步的體外篩選?；A(chǔ)1X PDF制劑包括45mg/mL Me-β-CD、1mg/mL DDPC、1mg/mL EDTA、10mM乙酸鹽、10mM磷酸酶和220mOsm/kg NaCl。體外研究1的制劑組分如表8中所示。
表8 體外研究1的制劑組分
第一次體外試驗(yàn)的測試時(shí)間過程包括30、60以及120分鐘孵育。在含有Ca++和Mg++的PBS中完成所述孵育。測定條件包括在37℃下以100rpm旋轉(zhuǎn)以及應(yīng)用50μL測試制劑。所有制劑中都觀察到TER顯著地減少。MTT測定觀察高毒性，LDH測定觀察低細(xì)胞存活率。
在30和60分鐘記錄280U/mL胰島素濃度的滲透率數(shù)據(jù)，并與1XPDF、pH 3；2X PDF、pH 3；1X PDF、pH 4和0.5X PDF、pH 3比較。1XPDF、pH 3；1X PDF、pH 4和0.5X PDF、pH 3在60分鐘獲得約10％滲透率。2X PDF、pH 3產(chǎn)生2％滲透率。不含增強(qiáng)劑的對照組則顯示少于1％滲透率。
在2X PDF、pH3制劑中于30和60分鐘比較280U/mL胰島素和840U/mL胰島素濃度的滲透率數(shù)據(jù)。由于在高胰島素濃度下沉淀可能導(dǎo)致高變異性，沒有觀察到顯著的滲透率差異。
將在1X PDF、pH 3中于30和60分鐘記錄的280U/mL胰島素濃度的滲透率數(shù)據(jù)與1X PDF、pH 7比較。結(jié)果顯示制劑在pH7時(shí)表現(xiàn)好于pH 3。1X PDF、pH 3的％滲透率為10％，而1X PDF、pH 7的滲透率為35％。
體外研究1的總結(jié) 在PBS(含有Ca++和Mg++)中30、60和120分鐘孵育的滲透率研究產(chǎn)生高的細(xì)胞毒性和低的細(xì)胞存活率。1X和0.5X PDF產(chǎn)生比2X PDF更好的滲透率。PDF能增溶10mg/mL(即280U/mL)但是不能增溶30mg/mL(即840U/mL)。pH 7的百分比滲透率結(jié)果高于pH 3。
使用1X PDF(45mg/mL Me-β-CD、1mg/mL DDPC、1mg/mL EDTA、10mM乙酸鹽、10mM磷酸酶和220mOsm/kg NaCl)作為基礎(chǔ)制劑進(jìn)行第二項(xiàng)研究。體外研究2制劑組分如表9所示。
表9 體外研究2的制劑組分
第二項(xiàng)體外試驗(yàn)的時(shí)間過程包括60分鐘孵育。在含有Ca++和Mg++的PBS中完成孵育。測定條件包括在37℃以100rpm旋轉(zhuǎn)并應(yīng)用50μL測試制劑。所有制劑中都觀察到TER顯著地減少。用MTT測定觀察高毒性，并用LDH測定，甚至不含增溶劑觀察低細(xì)胞存活率。
在60分鐘記錄280U/mL胰島素濃度的滲透率數(shù)據(jù)，并與1X PDF、pH 3.5；1X PDF、pH 7；1X PDF+0.5％CEL、pH 3.5；1X PDF+1％CEL、pH 3.5；1X PDF+0.1％吐溫80、pH 3.5和1X PDF+1％吐溫80、pH 3.5比較。所有制劑在pH 3.5時(shí)獲得至少10％滲透率。制劑在pH 7時(shí)滲透率增加可與pH 3.5相比較。
將60分鐘時(shí)的280U/mL和840U/mL胰島素濃度的滲透率數(shù)據(jù)與1XPDF、pH 7；1X PDF+0.5％CEL、pH 3.5；1X PDF+0.5％CEL、pH 7；1X PDF+1％CEL、pH 3.5；1X PDF+0.1％吐溫80、pH 3.5和1X PDF+1％吐溫80、pH 3.5的制劑相比較。當(dāng)含有增溶劑時(shí)，840U/mL胰島素制劑在視覺上在插入物表面上是可溶的。所有制劑具有類似的滲透率，除了pH 7的制劑比pH 3.5的制劑具有更高的滲透率。
體外研究2的總結(jié) 在另外的表面活性劑(即吐溫或Cremophor)存在的情況下，成功地穩(wěn)定了高濃度胰島素制劑(840U/mL)(和增溶)。甚至在60分鐘孵育時(shí)，在體外觀察到所有制劑細(xì)胞毒性增加及細(xì)胞活性減少。
進(jìn)行第三項(xiàng)研究以測定使用280U/mL和840U/mL 1X PDF在pH 7時(shí)，三種不同表面活性劑(吐溫80、吐溫20和普朗尼克F68)對滲透的體外影響。體外研究3的制劑組分如表10所示。
表10 體外研究3的制劑組分
第三項(xiàng)體外試驗(yàn)的時(shí)間過程包括60分鐘孵育。在含有Ca++和Mg++的PBS中完成孵育。測定條件包括在37℃下以100rpm旋轉(zhuǎn)并且應(yīng)用50μL測試制劑。所有制劑中都觀察到TER顯著地減少。用MTT測定觀察高毒性，用LDH測定觀察低細(xì)胞存活率。
在60分鐘記錄280U/mL和840U/mL胰島素濃度的滲透率數(shù)據(jù)，并與1X PDF+1％吐溫80、pH 7；1X PDF+0.01％普朗尼克F68、pH 7和1XPDF+0.1％普朗尼克F68、pH 7制劑比較。數(shù)據(jù)顯示普朗尼克F68沒有有效地增溶胰島素而提高滲透率。
測試在1X PDF制劑(胰島素濃度280U/mL和840U/mL)中吐溫80和吐溫20對胰島素滲透率的影響。將1X PDF+1％吐溫80、pH 7；1XPDF+0.1％吐溫80、pH 7；1X PDF(不含DDPC)+1％吐溫80、pH 7；1X PDF(不含DDPC)+0.1％吐溫80、pH 7；1X PDF+1％吐溫20、pH 7；1X PDF+0.1％吐溫20、pH 7和1X PDF+1％吐溫80、pH 7(低滲)的制劑中在60分鐘時(shí)的百分比滲透率數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。結(jié)果顯示1％吐溫(吐溫80和吐溫20)比0.1％吐溫提供了更高的滲透率。吐溫20的滲透率結(jié)果與吐溫80相同。除去DDPC對這些制劑的％滲透率沒有影響。
測試吐溫80的增加量(0.01％、0.1％、0.5％和1％)對pH 7的1X PDF制劑中的280U/mL胰島素滲透率的影響。在該制劑中吐溫80的量影響了％滲透率。滲透率隨吐溫80濃度的增加而增加。在含有1％、2％和5％吐溫80的1X PDF制劑中進(jìn)一步測定吐溫濃度對滲透率的影響。另外，使用1％和2％吐溫80測試2X PDF制劑的滲透率。結(jié)果顯示當(dāng)1X PDF或2XPDF制劑中吐溫80濃度高于1％時(shí)，體外滲透率沒有進(jìn)一步的增加。
使用含有0.1％吐溫和1％吐溫的制劑(含有1mg/mL和10mg/mLEDTA)測試去除Me-β-CD對滲透率的影響。從制劑中去除Me-β-CD導(dǎo)致滲透率的急劇降低。280U/mL和840U/mL的制劑中都觀察到該結(jié)果。
體外研究3的總結(jié) 吐溫80和吐溫20當(dāng)與1X PDF制劑組合使用時(shí)，在體外都產(chǎn)生良好的滲透率。普朗尼克F68并沒有增加滲透率。在體外吐溫80或吐溫20單獨(dú)并不足以獲得胰島素滲透率的增加。從制劑中去除Me-β-CD引起胰島素滲透率的顯著降低。增加吐溫不超過1％能增加滲透率，但高于1％沒有觀察到其他的益處。1％吐溫制劑的滲透率比一些已上市的含有吐溫的鼻用產(chǎn)品的滲透率要低。
實(shí)施例7 胰島素制劑穩(wěn)定性數(shù)據(jù) 對1X PDF(45mg/mL Me-β-CD、1mg/mL DDPC、1mg/mL EDTA、10mM乙酸鹽、10mM磷酸酶和220mOsm/kg NaCl)胰島素噴霧制劑于5℃、25℃、40℃、50℃下進(jìn)行高達(dá)28天的使用穩(wěn)定性研究。使用HPLC測定％肽回收率。研究中評價(jià)的制劑參數(shù)如表11所示。
表11 初步胰島素穩(wěn)定性研究的制劑參數(shù)
1X PDF胰島素噴霧制劑較僅含有鹽和緩沖液的胰島素保持得更穩(wěn)定。吐溫的存在沒有影響1X PDF制劑的穩(wěn)定性。pH 7.0的制劑比pH 3.5的制劑穩(wěn)定性更好。在5℃、25℃、40℃和50℃下高達(dá)28天，1X PDF中的貯存胰島素的穩(wěn)定性非常良好，且280U/mL和840U/mL胰島素濃度都觀察到約100％的標(biāo)稱回收率(label claim recovery)。
進(jìn)行進(jìn)一步的使用測定(單位劑量和8天)以評價(jià)1X PDF胰島素噴霧制劑的穩(wěn)定性。使用“單位劑量”評價(jià)在起動(dòng)(priming)和一次啟動(dòng)后胰島素噴霧劑的穩(wěn)定性。8天使用研究的條件包括8天、每天3次(TID)啟動(dòng)，在5℃和30℃下貯存。研究測定了肽的含量。使用的肽含量研究的結(jié)果顯示PDF胰島素噴霧制劑對于單位劑量和8天使用均顯示良好的穩(wěn)定性。在本研究中，貯存溫度30℃時(shí)的穩(wěn)定性似乎與5℃貯存溫度的穩(wěn)定性一樣穩(wěn)定。
實(shí)施例8 在兔子中鼻內(nèi)施用胰島素的藥物動(dòng)力學(xué)結(jié)果 在特定的時(shí)間點(diǎn)至高達(dá)240分鐘測量胰島素治療的新西蘭白兔的藥物動(dòng)力學(xué)(PK；即胰島素測量)值。產(chǎn)生生物利用度數(shù)據(jù)的這項(xiàng)研究中包括4個(gè)鼻內(nèi)(IN)組、一個(gè)皮下(SC)組和一個(gè)(靜脈內(nèi))組。每組包括5只雄兔。所有數(shù)據(jù)計(jì)算進(jìn)行劑量標(biāo)準(zhǔn)化，且PK數(shù)據(jù)是基線校正的。PK研究1的治療和劑量詳情如表12所示。
表12 兔子PK(和PD)研究1的治療和劑量詳情 PK研究1的結(jié)果如表13和圖1所示。IN施用胰島素比常規(guī)SC胰島素導(dǎo)致更快的Tmax。含有1％吐溫的IN1X PDF制劑(劑量6IU/kg)，#3顯示鼻內(nèi)制劑的最大峰值。對于含有1％吐溫的IN 1X PDF制劑，#2和#3，胰島素的百分比生物利用度(BA)都為～3-5％(相對于SC)。SC的絕對％BA為30％，而IN為1％。基于AUC，IN的％CV為50％，而SC為20％。
表13 兔子PK研究1結(jié)果 進(jìn)行第二個(gè)PK研究來比較鼻內(nèi)PDF+吐溫制劑與Novolog速效制劑(Novolog稀釋液由16mg/mL甘油、1.5mg/mL苯酚、1.72mg/mL間甲酚、19.6μg/mL鋅、1.25mg/mL二水合磷酸氫二鈉和0.58mg/mL NaCl組成，pH 7.2-7.6)。PK研究2的參數(shù)如表14所示。
表14 PK(和PD)研究2的制劑參數(shù)
表15所示的是相對于減去PK基線的研究2的SC-Novolog結(jié)果的Tmax、％Cmax、AUClast、AUCinf和％BA；也包括IN/1X PDF 1％吐溫(#3)和SC-常規(guī)(#5)制劑的研究1結(jié)果。PK研究2結(jié)果如圖2所示。研究2的PK曲線與研究1的曲線類似，顯示IN/1X PDF產(chǎn)生速效的PK特征。在一些IN治療的動(dòng)物中觀察到胰島素的第二個(gè)峰值。
表15 兔子PK研究2結(jié)果 *PK研究1的結(jié)果 PK研究2的結(jié)果顯示IN/1X PDF 2％吐溫具有測試鼻內(nèi)制劑中最高的％BA、Cmax和AUClast。當(dāng)去除DDPC時(shí)，％BA、Cmax和AUClast減少。研究2的IN/1X PDF 1％吐溫結(jié)果與研究1的結(jié)果一致。SC-常規(guī)、SC-Novolog和SC-PDF胰島素產(chǎn)生類似的生物利用度。對于％BA，鼻內(nèi)制劑產(chǎn)生約2-5％生物利用度。IN/1X PDF 2％吐溫顯示最高的生物利用度為5％。
實(shí)施例9 兔子中鼻內(nèi)施用胰島素的藥效學(xué)數(shù)據(jù) 在特定的時(shí)間點(diǎn)至高達(dá)240分鐘測量胰島素治療的新西蘭白兔的藥效學(xué)(PD；即葡萄糖測量)值。用Glucometer(One-Touch Ultra)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測量葡萄糖兩次。PD研究1的結(jié)果(測試組如上述實(shí)施例8、表12中所示)在表16和圖3中顯示。所有數(shù)據(jù)計(jì)算進(jìn)行劑量標(biāo)準(zhǔn)化，且％BA基于測試制品的標(biāo)稱的測定值。
表16 PD研究1結(jié)果 在研究1中，IN/PDF-吐溫(#2和#3)、SC(#5)和IV(#6)胰島素制劑的％Cmin約為40％。IN/PDF-吐溫(30-45分鐘)比SC(120分鐘)Tmin更快。含1％吐溫的IN/PDF的BA葡萄糖為～8％(相對于SC)。
進(jìn)行第二個(gè)PD研究來比較鼻內(nèi)PDF制劑與Novolog速效制劑(Novolog稀釋液由16mg/mL甘油、1.5mg/mL苯酚、1.72mg/mL間甲酚、19.6μg/mL鋅、1.25mg/mL二水合磷酸氫二鈉、0.58mg/mL NaCl組成，pH 7.2-7.6)。PD研究2的參數(shù)在上述實(shí)施例8、表14顯示。PD研究2的Cmin和Tmin結(jié)果在表17中顯示。
表17 PD研究2的Cmin和Tmin結(jié)果 *PK研究1的結(jié)果 圖4中，將研究2的PD結(jié)果與研究1比較。IN/1X PDF 5％吐溫、IN/2XPDF 1％吐溫、SC NOvolog的Tmin約為30分鐘。SC-常規(guī)*的Tmin約為40分鐘。其他制劑的Tmin約為45分鐘。PD研究2的結(jié)果顯示在所有鼻內(nèi)制劑中2X PDF 1％吐溫對PD有最大的影響。在制劑中存在DDPC不影響PD的結(jié)果。
在IN施用的兔子中不存在或沒有記載到鼻內(nèi)刺激。所述的PD數(shù)據(jù)支持遞送胰島素具有速效特征的鼻內(nèi)制劑。表現(xiàn)最好的制劑包含增溶劑和表面活性劑。對進(jìn)一步體內(nèi)施用的IN胰島素制劑的描述在表18中顯示。
表18 體內(nèi)研究的制劑 實(shí)施例10 臨床前研究3對兔子靜脈內(nèi)、皮下和鼻內(nèi) 施用胰島素后的PK和PD結(jié)果 表19顯示研究3中的劑量組。使用下述的縮略語PDF＝加入45mg/mLMe-β-CD、1mg/mL DDPC、1mg/mL EDTA、10mM精氨酸pH 7.0與NaCl達(dá)到約220mOsm/kg；2X PDF＝90mg/mL Me-β-CD、2mg/mL DDPC、2mg/mL EDTA(其他組分與PDF中保持一樣)；防腐劑(Pre)，在該情況下是10mg/mL丙二醇、0.33mg/mL尼泊金甲酯和0.17mg/mL尼泊金丙酯的組合。將聚山梨酯80(吐溫)以所示的1％或2％(10或20mg/mL)加至不同的制劑。給藥兩個(gè)SC組，一個(gè)組用不含增強(qiáng)劑的常規(guī)胰島素，而另一個(gè)組用存在PDF的常規(guī)胰島素。
表19 臨床前研究3中給藥組的描述 臨床前研究3中給藥組的PD數(shù)據(jù)在表20和圖5顯示。
表20 臨床前研究3中給藥組的PD數(shù)據(jù) 所有鼻內(nèi)組呈現(xiàn)大約相同的PD效應(yīng)(Tmin和％Cmin)。皮下遞送的常規(guī)胰島素在沒有PDF和有PDF的情況下，具有相同的PD效應(yīng)(更慢的Tmin和更高的％Cmin，如同所預(yù)期的)。數(shù)據(jù)顯示在PDF制劑(SC為45分鐘；鼻內(nèi)為30分鐘)中常規(guī)胰島素與對照制劑比較(SC為60分鐘)起效更快(通過Tmin顯示)。數(shù)據(jù)顯示在鼻內(nèi)PDF制劑中常規(guī)胰島素與速效胰島素特征一致。
臨床前研究3中給藥組的PK數(shù)據(jù)在圖6和表21、表22、表23顯示。
表21 臨床前研究3中給藥組的PK參數(shù) 表22 臨床前研究3中給藥組的PK數(shù)據(jù)(生物利用度) 表23 臨床前研究3中給藥組的PK參數(shù)的％CV 不同組的不同PK參數(shù)的％CV類似。含有吐溫的制劑與SC常規(guī)胰島素對照組比較，PDF的％F(相對于SC對照組的生物利用度)約為2-6％，Tmax在12-36分鐘的范圍內(nèi)。具有最高％生物利用度的IN制劑是不含DDPC的1X PDF/2％吐溫(5.8％)。這些PD數(shù)據(jù)提示PDF制劑中的DDPC對于達(dá)到提高的生物利用度并不是必需的。
實(shí)施例11 臨床前研究4對兔子口服和鼻內(nèi)施用胰島素后的PK和PD結(jié)果 表24描述了研究4中的劑量組。使用下述的縮略語PDF＝加入45mg/mL Me-β-CD、1mg/mL DDPC、1mg/rnL EDTA、10mM精氨酸pH 7.0與NaCl達(dá)到約220mOsm/kg；2X PDF＝90mg/mL Me-β-CD、2mg/mLDDPC、2mg/mL EDTA(其他組分與PDF中保持一樣)；TDM＝2.5mg/mL四癸基麥芽糖苷。將聚山梨酯80(吐溫)以所示的1％(10mg/mL)加至不同的制劑。將丙二醇(PG)以1％或2.5％(10或25mg/mL)加至不同的制劑。測試0.2％明膠對IN制劑的影響。給藥三個(gè)口服組，一個(gè)組用不含增強(qiáng)劑的常規(guī)胰島素(#8)，一個(gè)用存在PDF的常規(guī)胰島素(#9)，另一個(gè)組用存在PDF而不含DDPC的常規(guī)胰島素(#7)。
表24 臨床前研究4中給藥組的描述 臨床前研究4中給藥組的PD數(shù)據(jù)在圖7顯示。所有鼻內(nèi)制劑之間PD數(shù)據(jù)都類似，但SC施用較鼻內(nèi)有延長的PD效應(yīng)?？诜o藥組沒有觀察到PD效應(yīng)。在沒有PDF和PDF存在的情況下，皮下遞送常規(guī)胰島素具有類似的PD效應(yīng)(更慢的Tmin和更高的％Cmin，如同預(yù)期)。這些數(shù)據(jù)顯示在PDF制劑中常規(guī)胰島素起效更快(通過Tmin顯示)。
臨床前研究4中給藥組的PK數(shù)據(jù)在圖8和表25、表26、表27中顯示。
表25 臨床前研究4中給藥組的PK參數(shù) 表26 臨床前研究4中給藥組的PK數(shù)據(jù)(生物利用度) 表27 臨床前研究4中給藥組PK參數(shù)的％CV 對于有或沒有PG的含有PDF的鼻內(nèi)組以及含有TDM的組，PK數(shù)據(jù)類似，且％F(與SC常規(guī)胰島素比較的生物利用度)在約5.4-10.6％，Tmax在18-59分鐘的范圍內(nèi)。含有1％吐溫存在0.2％明膠的1X PDF生物利用度增加，約為14.9％。對于有或沒有PG的含有PDF的鼻內(nèi)組以及含有TDM的組，Cmax和AUC的％CV在50-200％之間。相反，對于含有1％吐溫存在0.2％明膠的1X PDF，Cmax和AUC分別減少21.3％和35.3％。需要注意的是，含有1％吐溫存在0.2％明膠的1X PDF制劑的Cmax和AUC的％CV低于SC注射觀察到的那些。
這些數(shù)據(jù)顯示PDF制劑中的常規(guī)胰島素比SC制劑起效更快(通過Tmin顯示)，因此該胰島素具有速效胰島素的特征。加入明膠增強(qiáng)了PDF制劑的PD和PK(相對于SC對照組14.9％生物利用度)影響。
實(shí)施例12 含有增粘劑的制劑的PK和PD結(jié)果 評價(jià)使用含有不同增粘劑的鼻內(nèi)胰島素制劑給藥的兔子的PK和PD。增粘劑包括明膠、HPMC、MC和卡波姆?？ú肥欠Q為“

的聚合物家族的通用名稱。選取的時(shí)間點(diǎn)在5、10、15、20、25、30、45、60、120和240分鐘。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)用Glucometer(One-Touch Ultra)測量葡萄糖。將少量2N HCl或NaOH加至所述制劑中，當(dāng)需要獲得期望的pH時(shí)。用于本研究的胰島素濃度約為28U/mg。表28顯示用于本研究的制劑。
表28 包含增粘劑的胰島素制劑 縮略語Me-β-CD＝甲基-β-環(huán)糊精、EDTA＝依地酸二鈉、HPMC＝羥丙基甲基纖維素(100cps)、MC＝甲基纖維素(15cps)、CMC＝羧甲基纖維素鈉(低粘度)、MP＝尼泊金甲酯鈉、PP＝尼泊金丙酯鈉、PG＝丙二醇、NaCl＝氯化鈉 制備每種制劑15mL，貯存在3cc透明的非硅烷化的玻璃瓶中。所有測試的胰島素制劑貯存于2-8℃。所有制劑以6.0IU/kg給藥。表29描述了用于本研究的劑量組。
表29 增粘劑劑量組 初始％葡萄糖的PD結(jié)果在圖9顯示。圖9顯示在測試的8個(gè)組中％葡萄糖隨時(shí)間的平均變化。組6(1X PDF/1％吐溫/(0.25％卡波普))與所有其他組相比顯示由初始％葡萄糖減少最多。8個(gè)組的葡萄糖波谷發(fā)生在90分鐘以內(nèi)，如圖9所示。組8(含有張度劑)與其他明膠制劑比較，由初始％葡萄糖減少最多。含有卡波姆(0.25％卡波普)和CMC的制劑與其他非明膠制劑比較，由初始％葡萄糖減少最多。
每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平均數(shù)據(jù)的PK結(jié)果在圖10中顯示。在圖10中，顯示測試的8個(gè)組的胰島素隨時(shí)間的平均濃度(μlU/mL)。與其他制劑比較，圖10顯示組6，1XPDF/1％吐溫/(0.25％卡波普)的Cmax最大。8個(gè)組的峰值血清胰島素水平發(fā)生在60分鐘以內(nèi)，如圖10所示。PK參數(shù)總結(jié)于表30中。
表30 兔子中的增粘劑PK參數(shù) ％CV結(jié)果如表31所示。
表31 兔子中的增粘劑的％CV結(jié)果 ％F(生物利用度)結(jié)果顯示于表32中。
表32 兔子中的增粘劑的％F結(jié)果 總結(jié) PK和PD結(jié)果顯示測試的鼻內(nèi)胰島素制劑有速效胰島素的特征，其中峰值血清胰島素水平在60分鐘以內(nèi)，波谷在90分鐘以內(nèi)。當(dāng)增粘劑加至PDF鼻內(nèi)胰島素制劑中時(shí)，生物利用度增加。增加的張力提高了含有明膠的制劑中的生物利用度。含有明膠的制劑顯示將等滲條件(組#8包括NaCl的0.2％明膠)與低滲條件(組#2不含NaCl的0.2％明膠)比較，性能得到改進(jìn)。對于鼻內(nèi)胰島素制劑，含有卡波姆和CMC的制劑顯示PK和PD結(jié)果的最大增加?？ú泛虲MC通過％F所示的生物利用度分別為19.7％和17.8％。將增粘劑如卡波姆和CMC加到鼻內(nèi)胰島素制劑中，改善了由初始％葡萄糖所示的PD效應(yīng)。
兔子的PK和PD數(shù)據(jù)證實(shí)了在體外，在制劑增強(qiáng)劑存在的情況下，透過鼻內(nèi)上皮細(xì)胞的胰島素增加的結(jié)果。對于鼻內(nèi)胰島素制劑，體外藥物滲透數(shù)據(jù)和體內(nèi)PK兔子數(shù)據(jù)顯示明顯的相關(guān)性。使用代表性的鼻內(nèi)制劑，X-軸為AUClast(min*μU/mL)和Y-軸為％滲透率的XY圖分析顯示R2＝0.8994、y＝0.0007x+0.4191。
實(shí)施例13 AET研究1-8抗微生物效力測試(AET) AET研究1 進(jìn)行AET研究1以確定具有尼泊金甲酯鈉、尼泊金丙酯鈉和丙二醇的胰島素鼻內(nèi)噴霧安慰劑的抗微生物效力(AET)。此外，AET研究1檢測了單獨(dú)增加EDTA的AET。AET研究1中評價(jià)的制劑顯示于表33。每種制劑制備約120mL，測試兩次(每個(gè)樣品n＝2分析)。
表33 AET研究1中評價(jià)的制劑
縮略語Me-β-CD＝甲基-β-環(huán)糊精、DDPC＝Lα二癸?；字Ｄ憠A、EDTA＝依地酸二鈉、MP＝尼泊金甲酯鈉、PP＝尼泊金丙酯鈉、PG＝丙二醇、NaCl＝氯化鈉 所使用的AET方法遵照美國藥典(USP)和歐洲藥典(EP)AET的要求，分別在表34和35中進(jìn)行了描述。同時(shí)測試所述制劑的pH(每SOP403)、外觀(視覺)和同滲濃度(每SOP 4000)。
表34 USP AET要求(USP<51>)
表35 EP AET要求(EP<51.3>)
0.33mg/mL尼泊金甲酯鈉、0.17mg/mL尼泊金丙酯鈉和至少25mg/mL丙二醇的組合是有效的防腐劑組合，且符合USP標(biāo)準(zhǔn)。這些制劑全部通過USP要求，但沒有通過EP(對于金黃色葡萄糖球菌和黑霉菌)。單獨(dú)增加EDTA看來對USP或EP要求無效。
AET研究2 進(jìn)行AET研究2以確定當(dāng)尼泊金甲酯鈉和尼泊金丙酯鈉用作防腐劑時(shí)，保濕劑(丙二醇)是否改善了抗微生物效力。還評價(jià)了其他的防腐劑，如苯扎氯銨(BAK)、苯甲醇和苯甲酸鈉。測試了500U/mL或1000U/mL水平的兩個(gè)胰島素組。AET研究2中評價(jià)的制劑列于表36。
表36 AET研究2中評價(jià)的制劑
縮略語Me-β-CD＝甲基-β-環(huán)糊精 DDPC＝Lα二癸?；字Ｄ憠A EDTA＝依地酸二鈉 MP＝尼泊金甲酯鈉 PP＝尼泊金丙酯鈉 BAK＝苯扎氯銨 NaCl＝氯化鈉 如AET研究1所述，實(shí)施AET研究2的方法。此外，包括陽性對照(含有5mg/mL苯甲酸鈉的PBS)和陰性對照(PBS單獨(dú))。AET研究2的結(jié)果顯示在制劑中不含保濕劑(如丙二醇)時(shí)，尼泊金甲酯鈉和尼泊金丙酯鈉并不是有效的防腐劑。就USP和EP抗微生物效力測試而論，苯扎氯銨是優(yōu)良的防腐劑，但是發(fā)現(xiàn)其與胰島素不相容(即，它在制劑中存在導(dǎo)致胰島素的沉淀)。苯扎氯銨和苯甲酸鈉在中性pH時(shí)也不是有效的防腐劑，因此也不適合用于胰島素鼻內(nèi)噴霧制劑。
AET研究3 AET研究3的目的是評價(jià)其他防腐劑，如苯扎氯銨(BAK)、苯甲醇和苯甲酸鈉。測試了500U/mL或1000U/mL水平的兩個(gè)含有胰島素的組。AET研究3的制劑列于表37。
表37 AET研究3中評價(jià)的制劑
縮略語Me-β-CD＝甲基-β-環(huán)糊精 DDPC＝Lα二癸?；字Ｄ憠A EDTA＝依地酸二鈉 MP＝尼泊金甲酯鈉 PP＝尼泊金丙酯鈉 BAK＝苯扎氯銨 NaCl＝氯化鈉 如AET研究1所述，進(jìn)行AET研究3的分析。AET研究3結(jié)果顯示苯扎氯銨與胰島素不相容(引起沉淀)，但是保持最好的抗微生物性能。本研究中苯甲醇和苯甲醇/尼泊金甲酯鈉/尼泊金丙酯鈉作為抗菌試劑是無效的。
AET研究4 AET研究4的目的是確定當(dāng)與尼泊金甲酯鈉和尼泊金丙酯鈉一起使用時(shí)，低濃度的保濕劑(丙二醇)能否獲得符合要求的USP和EP AET結(jié)果。此外，評價(jià)了選擇性的防腐劑間甲酚和苯甲醇。AET研究4的制劑列于表38。
表38 AET研究4中評價(jià)的制劑
縮略語Me-β-CD＝甲基-β-環(huán)糊精 EDTA＝依地酸二鈉 MP＝尼泊金甲酯鈉 PP＝尼泊金丙酯鈉 PG＝丙二醇 如AET研究1所述，實(shí)施AET研究4的方法。含有尼泊金甲酯鈉和尼泊金丙酯鈉與低濃度的保濕劑(即丙二醇)的制劑不能獲得抗微生物效力。對于含有丙二醇的尼泊金甲酯鈉和尼泊金丙酯鈉，最佳濃度是1-25mg/mL之間的丙二醇。此外，苯甲醇和間甲酚對于胰島素鼻內(nèi)噴霧制劑并不是有效的防腐劑。
AET研究5 AET研究5的目的是進(jìn)行胰島素噴霧制劑(安慰劑和活性劑)的抗微生物效力測試(AET)以確定對最佳的防腐劑效力是否需要尼泊金甲酯鈉和尼泊金丙酯鈉二者，以及是否一個(gè)比另一個(gè)更有效。此外，評價(jià)了尼泊金甲酯鈉和尼泊金丙酯鈉增加的水平以確定是否增加它們在制劑中的含量就能增加抗微生物效力。AET研究5使用的制劑列于表39。
表39 AET研究5中評價(jià)的制劑
縮略語Me-β-CD＝甲基-β-環(huán)糊精 DDPC＝Lα二癸?；字Ｄ憠A EDTA＝依地酸二鈉 MP＝尼泊金甲酯鈉 PP＝尼泊金丙酯鈉 PG＝丙二醇 NaCl＝氯化鈉 如AET研究1所述，實(shí)施AET研究5的方法。AET研究5的結(jié)果顯示增加尼泊金甲酯鈉和尼泊金丙酯鈉水平達(dá)到0.33mg/mL尼泊金甲酯鈉和0.17mg/mL尼泊金丙酯鈉的至少10倍能增加抗微生物效力。此外，明顯可得出單獨(dú)0.33mg/mL尼泊金甲酯鈉與單獨(dú)0.17mg/mL尼泊金丙酯鈉有相同的抗微生物效力，其中該組合也有相同的抗微生物效力。
AET研究6 AET研究6的目的是進(jìn)行胰島素噴霧制劑(安慰劑)的抗微生物效力測試(AET)以確定與尼泊金甲酯鈉和尼泊金丙酯鈉一起使用需要的丙二醇最佳濃度。此外，使用固定濃度的丙二醇評價(jià)尼泊金甲酯鈉和尼泊金丙酯鈉增加的水平以確定是否增加它們在制劑中的含量就能增加抗微生物效力。最后，也評價(jià)了作為潛在防腐劑的乙醇。AET研究6中評價(jià)的制劑列于表40。
表40 AET研究6中評價(jià)的制劑
縮略語Me-β-CD＝甲基-β-環(huán)糊精 DDPC＝Lα二癸?；字Ｄ憠A EDTA＝依地酸二鈉 EtOH＝乙醇 MP＝尼泊金甲酯鈉 PP＝尼泊金丙酯鈉 PG＝丙二醇 NaCl＝氯化鈉 如AET研究1所述，實(shí)施AET研究6的方法。AET研究6的結(jié)果顯示丙二醇的最佳濃度為10mg/mL。含有10、15、20和25mg/mL丙二醇的胰島素鼻內(nèi)噴霧制劑的AET結(jié)果非常類似；但是當(dāng)丙二醇水平少于10mg/mL時(shí)，AET結(jié)果不太理想。所有制劑都通過了USP AET要求，除綠膿桿菌要求之外。相對于這個(gè)種類，這些制劑都是抑菌的(即沒有微生物生長的跡象)。對于每種要求的生物的最早時(shí)間點(diǎn)，所有制劑都未達(dá)到EP要求。單獨(dú)乙醇(在1％或2％時(shí))看來具有與尼泊金甲酯鈉/尼泊金丙酯鈉/丙二醇有類似的抗微生物活性。
AET研究7 AET研究7的目的是進(jìn)行含有20mg/mL吐溫80的胰島素噴霧制劑(安慰劑)的抗微生物效力測試(AET)。體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)研究表明吐溫80含量增至20mg/mL可有助于增加生物利用度，但是同時(shí)已知吐溫80膠束與防腐劑(特別與尼泊金酯)相互作用。另外，進(jìn)行AET研究7以確定與尼泊金甲酯鈉和尼泊金丙酯鈉一起使用需要的丙二醇最佳水平。固定丙二醇的水平評價(jià)了尼泊金甲酯鈉和尼泊金丙酯鈉增加的水平以確定是否增加它們在制劑中的含量就能增加抗微生物效力。最后，還評價(jià)了作為潛在防腐劑的乙醇。AET研究7中評價(jià)的制劑列于表41。
表41 AET研究7中評價(jià)的制劑
縮略語Mc-β-CD＝甲基-β-環(huán)糊精 DDPC＝Lα二癸?；字Ｄ憠A EDTA＝依地酸二鈉 EtoH＝乙醇 MP＝尼泊金甲酯鈉 PP＝尼泊金丙酯鈉 PG＝丙二醇 NaCl＝氯化鈉 如AET研究1所述，實(shí)施AET研究7的方法。AET研究7的結(jié)果顯示吐溫80含量從10mg/mL增至20mg/mL使抗微生物活性減少，甚至當(dāng)加入丙二醇的最高水平(即25mg/mL)。當(dāng)與20mg/mL吐溫80組合使用時(shí)，乙醇并不是有效的防腐劑(在1％時(shí))。
AET研究8 進(jìn)行AET研究8以測試含有1、5、10和25mg/mL丙二醇配方的胰島素噴霧制劑(活性劑)的抗微生物效力測試(AET)。此外，測試了胰島素鼻內(nèi)噴霧劑的三種濃度250、500和1000U/mL。AET研究8中評價(jià)的制劑列于表42中。
表42 AET研究8中評價(jià)的制劑
縮略語Me-β-CD＝甲基-β-環(huán)糊精 DDPC＝Lα二癸酰基磷脂酰膽堿 EDTA＝依地酸二鈉 MP＝尼泊金甲酯鈉 PP＝尼泊金丙酯鈉 PG＝丙二醇 NaCl＝氯化鈉 分析使用的方法如AET研究1所述。AET研究8的結(jié)果顯示將胰島素加至制劑能提高AET的性能。此外，當(dāng)丙二醇水平高時(shí)(即25mg/mL或10mg/mL)，具有尼泊金甲酯鈉和尼泊金丙酯鈉的含有胰島素的制劑通過USP AET的要求。但是，不符合EP的要求。
AET研究1-8總結(jié) 研究1-8的數(shù)據(jù)顯示就AET而言，尼泊金甲酯鈉、尼泊金丙酯鈉和保濕劑丙二醇的組合與單獨(dú)的尼泊金甲酯鈉和尼泊金丙酯鈉比較，可使防腐劑效力增加。此外，在這些研究的過程，評價(jià)了一些其他的防腐劑，如苯扎氯銨、苯甲酸鈉、苯甲醇、乙醇、增加的EDTA、芐索氯銨和間甲酚；然而，用尼泊金甲酯鈉/尼泊金丙酯鈉/丙二醇獲得最好的結(jié)果。每種其他防腐劑或是與胰島素不相容(如苯扎氯銨的例子，其導(dǎo)致胰島素沉淀)，或是因與甲基-β-環(huán)糊精和/或聚山梨酯80的相互作用而可能致此無效。雖然尼泊金甲酯鈉和尼泊金丙酯鈉也與甲基-β-環(huán)糊精和/或聚山梨酯80相互作用，但是保濕劑丙二醇的加入阻礙了這種相互作用，因而使尼泊金酯抗微生物活性更有效。這些結(jié)果顯示將10mg/mL保溫劑加至0.17mg/mL尼泊金丙酯鈉和0.33mg/mL尼泊金甲酯鈉制劑中產(chǎn)生良好的抗微生物活性。
本文中本發(fā)明的一個(gè)方面包含用于胰島素鼻內(nèi)噴霧制劑的防腐劑組合，所述防腐劑組合當(dāng)按美國藥典和歐洲藥典抗微生物效力測試(AET)處理時(shí)，提供抑菌效應(yīng)。AET表現(xiàn)最好的制劑包含水、增溶劑、表面活性劑、緩沖液、螯合劑、張力調(diào)節(jié)劑和防腐劑。優(yōu)選的增溶劑是Me-β-CD。優(yōu)選的表面活性劑是DDPC和聚山梨酯(例如吐溫80)的組合或單獨(dú)的聚山梨酯。優(yōu)選的螯合劑是EDTA。優(yōu)選的張力調(diào)節(jié)劑是氯化鈉。優(yōu)選的防腐劑是尼泊金甲酯鈉和尼泊金丙酯鈉。該制劑也包含保濕劑如丙二醇，提供最優(yōu)的AET性能。
實(shí)施例14 胰島素制劑穩(wěn)定性 通過在5℃/環(huán)境濕度(常規(guī)貯存)、25℃/60％RH(加速貯存)、伴有攪拌的加速貯存、以及與每天三次(TID)氣霧劑化(模擬患者使用)組合的常規(guī)或加速貯存，測試鼻內(nèi)胰島素制劑的穩(wěn)定性。貯存三個(gè)月(84天)后，HPLC結(jié)果顯示在5℃/環(huán)境濕度(99.2％胰島素回收率)時(shí)胰島素含量沒有顯著的變化，并且在25℃/60％RH(96.3％胰島素回收率)時(shí)觀察到胰島素含量有微小的損失。當(dāng)用含有250U/mL、500U/mL或1000U/mL的制劑，TID氣霧劑化短暫孵育時(shí)間(11天)時(shí)，胰島素沒有顯著的損失。在加速溫度100rpm下攪拌24小時(shí)后，沒有觀察到穩(wěn)定性的顯著減少，相反，市售的胰島素產(chǎn)品在相同的條件下顯示胰島素含量至少減少20％。
實(shí)施例15 人PD臨床研究 在鼻內(nèi)施用含有增強(qiáng)劑的胰島素制劑后，測量藥效學(xué)(PD)數(shù)據(jù)，與施用目前上市的葡萄糖調(diào)節(jié)藥物，Novolog和Exubera的數(shù)據(jù)比較，完成人研究。Glucometer用于測量葡萄糖水平。每個(gè)治療組葡萄糖百分比減少的總結(jié)顯示于表43。每個(gè)治療組葡萄糖百分比減少30％、20％和10％的發(fā)生率顯示于表44。
表43 治療組的葡萄糖百分比減少 表44 人受治療者葡萄糖減少30％、20％和10％的發(fā)生率

初始PD研究的結(jié)果顯示鼻內(nèi)施用胰島素有效減少患者葡萄糖百分比。鼻內(nèi)施用50IU和100IU產(chǎn)生與Exubera(目前上市的葡萄糖調(diào)節(jié)藥物)類似的葡萄糖減少。
雖然為了清楚地理解已經(jīng)通過實(shí)施例對本發(fā)明前述進(jìn)行了詳細(xì)描述，但是對技術(shù)人員來說顯而易見的是，某些變化和修改為本文公開內(nèi)容所包括，并且在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)無需過度試驗(yàn)即可實(shí)施，提出其的目的是為了解釋而不是限制。
權(quán)利要求
1.一種用于對患者鼻內(nèi)遞送胰島素的藥物制劑，其包括單體胰島素、增溶劑和表面活性劑的含水混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述胰島素是人胰島素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述胰島素是速效人胰島素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述胰島素選自由天然人胰島素、人胰島素(LysB3、GluB29)、人胰島素(LysB3、IleB28)、人胰島素(GlyA21、HisB31、HisB32)、人胰島素(AspB28)、人胰島素(AspB10)、人胰島素(LysB28、ProB29)及其混合物組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制劑，其中所述胰島素是人胰島素(AspB28)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述增溶劑選自由環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精、磺丁基醚-β-環(huán)糊精、甲基-β-環(huán)糊精及其混合物組成的組。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制劑，其中所述增溶劑是甲基-β-環(huán)糊精。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述表面活性劑選自由非離子型聚氧乙烯醚、梭鏈孢酸及其衍生物、?；嵌渌箧滄咚徕c、二癸?；鵏-α-磷脂酰膽堿、聚山梨酯80、聚山梨酯20、聚乙二醇、十六醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羊毛脂醇、脫水山梨糖醇單油酸酯及其混合物組成的組。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制劑，其中所述表面活性劑是二癸?；鵏-α-磷脂酰膽堿。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制劑，其中所述表面活性劑是聚山梨酯80。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其進(jìn)一步包括螯合劑，所述螯合劑選自乙二胺四乙酸、乙二醇四乙酸及其混合物組成的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其進(jìn)一步包括一種或多種多元醇。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的制劑，其中所述多元醇選自由蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、L-阿拉伯糖、D-赤蘚糖、D-核糖、D-木糖、D-甘露糖、海藻糖、D-半乳糖、乳果糖、纖維二糖、龍膽二糖、丙三醇、聚乙二醇及其混合物組成的組。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的制劑，其中所述多元醇是乳糖和山梨醇。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其進(jìn)一步包括防腐劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制劑，其中所述防腐劑選自由氯代丁醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、苯扎氯銨、芐索氯銨、苯甲酸鈉、山梨酸、苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚及其混合物組成的組。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制劑，其中所述防腐劑是尼泊金甲酯和尼泊金丙酯。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其進(jìn)一步包括具有直徑為1微米至700微米大小的液滴的氣溶膠。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的制劑，其進(jìn)一步包括保濕劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的制劑，其中所述保濕劑選自由丙二醇、甘油、三乙酸甘油酯、多元醇、聚合多元醇、乳酸、脲及其混合物組成的組。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的制劑，其中所述保濕劑是丙二醇。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其進(jìn)一步包括緩沖劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的制劑，其中所述緩沖劑選自由谷氨酸鹽、乙酸鹽、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、乳酸鹽、甲酸鹽、乙醇酸鹽及其混合物組成的組。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的制劑，其中所述緩沖劑是精氨酸。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的制劑，其中所述緩沖劑pKa為5至9。
26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的制劑，其中所述緩沖劑pKa為6至8。
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其進(jìn)一步包括增粘劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的制劑，其中所述增粘劑選自由明膠、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、卡波姆、羧甲基纖維素及其混合物組成的組。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的制劑，其中所述增粘劑是卡波姆。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的制劑，其中所述增粘劑是羧甲基纖維素。
31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的制劑，其中所述增粘劑是明膠。
32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其pH為7.0±0.5。
33.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其進(jìn)一步包括張力調(diào)節(jié)劑。
34.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其同滲濃度為50mOsm/L至350mOsm/L。
35.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于生物利用度大于約15％。
36.一種藥物制劑，其包括人胰島素、甲基-β-環(huán)糊精、二癸?；鵏-α-磷脂酰膽堿、依地酸二鈉、聚山梨酯80、精氨酸緩沖劑和卡波姆的含水溶液。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的制劑，其中所述人胰島素是速效人胰島素。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的制劑，其中所述人胰島素是人胰島素(AspB28)。
39.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的制劑在制備治療人疾病或病癥的體征和癥狀的藥物中的用途，所述的疾病或病癥包括糖尿病、高血糖、血脂異常、誘導(dǎo)個(gè)體的飽腹感、促進(jìn)個(gè)體的體重減輕、肥胖癥、癌癥、結(jié)腸癌和前列腺癌。
40.包括單體胰島素、增溶劑和表面活性劑的含水混合物的藥物制劑在制備治療人疾病或病癥的體征或癥狀的藥物中的用途，所述的疾病或病癥包括糖尿病、高血糖、血脂異常、誘導(dǎo)個(gè)體的飽腹感、促進(jìn)個(gè)體的體重減輕、肥胖癥、癌癥、結(jié)腸癌和前列腺癌。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的用途，其中所述胰島素選自由天然人胰島素、人胰島素(LysB3、GluB29)、人胰島素(LysB3、IleB28)、人胰島素(GlyA21、HisB31、HisB32)、人胰島素(AspB28)、人胰島素(AspB10)、人胰島素(LysB28、ProB29)及其混合物組成的組。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的用途，其中所述胰島素是人胰島素(AspB28)。
43.根據(jù)權(quán)利要求40所述的用途，其中所述疾病是糖尿病。
44.根據(jù)權(quán)利要求40所述的用途，其中所述疾病是糖尿病，且所述藥物作為具有直徑為1微米至700微米大小的液滴的氣溶膠施用。
45.根據(jù)權(quán)利要求40所述的用途，其中所述增溶劑是甲基-β-環(huán)糊精，且所述表面活性劑是二癸?；鵏-α-磷脂酰膽堿。
46.根據(jù)權(quán)利要求40所述的用途，其中所述藥物制劑進(jìn)一步包括增粘劑、防腐劑、緩沖劑和張力調(diào)節(jié)劑。
47.根據(jù)權(quán)利要求40所述的用途，其中所述藥物提高了施用后至少約6小時(shí)人體中胰島素的血液水平。
48.根據(jù)權(quán)利要求40所述的用途，其中所述藥物使人體中葡萄糖百分比減少超過約10％。
49.根據(jù)權(quán)利要求40所述的用途，其中所述藥物作為具有直徑為1微米至700微米大小的液滴的氣溶膠施用。
50.包括人胰島素、甲基-β-環(huán)糊精、二癸酰基L-α-磷脂酰膽堿、依地酸二鈉和聚山梨酯80的含水溶液的藥物組合物在制備治療人糖尿病或高血糖的藥物中的用途。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的用途，其中所述人胰島素是速效人胰島素。
52.根據(jù)權(quán)利要求50所述的用途，其中所述人胰島素是人胰島素(AspB28)。
全文摘要
本文公開了用于對患者鼻內(nèi)遞送胰島素藥物的藥物組合物、制劑和其用途，所述藥物包括人胰島素、增溶劑和表面活性劑的含水混合物，其中人胰島素可以是速效胰島素。
文檔編號A61K9/00GK101340893SQ200680047851
公開日2009年1月7日 申請日期2006年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者史蒂文·C·夸伊, 安瑪麗·史都德特·科恩, 亨利·R·康斯坦丁諾, 書奇·陳·夸伊, 安東尼·P·西來諾, M·S·克勒佩 申請人:納斯泰克制藥公司