專(zhuān)利名稱(chēng)：：新型k04-0144物質(zhì)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對(duì)包括甲氧西林(methicillin)抗性黃色葡萄球菌(MRSA)在內(nèi)的細(xì)菌顯示出抗菌作用的K04-0144A物質(zhì)、K04-0144B物質(zhì)和K04-0144C物質(zhì)，以及通過(guò)與作為抗菌劑使用的P-內(nèi)酰胺抗生物質(zhì)并用來(lái)增強(qiáng)抗MRSA活性的K04-0144D物質(zhì)中的任意一種新型K04-0144物質(zhì)，及其制備方法。
背景技術(shù)：
：黃色葡萄球菌是一種通常存在于人和動(dòng)物的皮膚、消化道內(nèi)等的體表的革蘭氏陽(yáng)性球菌，對(duì)健康人無(wú)害，但在如術(shù)后患者和新生兒、高齡者這樣的免疫力降低的情況下發(fā)病，除了伴隨皮膚的切割和創(chuàng)傷的膿癥等皮膚軟組織傳染病，甚至到肺炎、腹膜炎、敗血癥、髄膜炎等各種重癥感染病之外，還引起由腸道毒和中毒性休克綜合癥毒素-l等毒素產(chǎn)生而導(dǎo)致的食物中毒和休克綜合癥、腸炎等。重癥化的病例并不少，最嚴(yán)重的情況下還存在導(dǎo)致死亡的病例。近年來(lái)，甲氧西林抗性黃色葡萄球菌(MRSA)作為醫(yī)院內(nèi)感染的主要致病菌成為了社會(huì)問(wèn)題。這種病原菌對(duì)P-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素等各種藥物具有抗性，現(xiàn)在在MRSA感染病的治療中，使用糖肽類(lèi)的萬(wàn)古霉素和氨基糖苷類(lèi)的阿貝卡星(Arbekacin)等抗生素。此外，也有近年來(lái)新開(kāi)發(fā)的奎奴普汀/達(dá)福普汀(quinupristin/dalfopristin)合劑和唑烷酮類(lèi)抗生素利奈唑胺(1inezolid)。已知現(xiàn)在作為對(duì)MRSA有效的藥物使用的萬(wàn)古霉素和阿貝卡星具有由于第8腦神經(jīng)損傷而導(dǎo)致的聽(tīng)力損傷等副作用。而且，糖肽類(lèi)抗生素引起休克、腎毒性、紅人綜合癥等副作用，臨床給藥時(shí)需要進(jìn)行血中濃度的檢測(cè)等慎重的給藥。而且，最近，還報(bào)道了MRSA的多藥抗性性化，以及對(duì)主要治療藥萬(wàn)古霉素具有低敏感性的菌。因此，期待新抗生素的出現(xiàn)和新療法的開(kāi)拓。作為實(shí)際的新療法，進(jìn)行了P-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素之間或內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素與其它作用點(diǎn)的不同的抗生素的聯(lián)合療法(長(zhǎng)谷川裕美等，抗菌藥給藥的科學(xué)，264-273，1998年)。而且，報(bào)道了其自身基本沒(méi)顯示出抗菌活性，但具有使P-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的效力恢復(fù)或使之活化的作用的物質(zhì)。例如，可以列舉特表平9-509677號(hào)中公開(kāi)的茶提取物或其活性部分(多酚化合物類(lèi))或思第芬(Stemphone)類(lèi)的化合物(PCT/JP2006/305625)。發(fā)明要解決的問(wèn)題在這種背景下，提供對(duì)MRSA顯示出抗菌活性的具有新結(jié)構(gòu)的新抗生素十分重要。而且，希望增強(qiáng)針對(duì)MRSA的P-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的活性的藥劑通過(guò)使P-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的給藥量減少，縮短給藥時(shí)間從而使得抗性菌出現(xiàn)的頻率降低。與此同時(shí)，還希望通過(guò)聯(lián)合使用作用不同的兩種藥物，克服藥物抗性。本發(fā)明的目的是提供MRSA感染病和包括P-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素抗性在內(nèi)的多藥劑抗性菌導(dǎo)致的感染病的新型治療藥。用于解決問(wèn)題的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明人等對(duì)于以微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物作為對(duì)象顯示出對(duì)MRSA的抗菌活性的化合物或?qū)υ鰪?qiáng)對(duì)MRSA的P-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的活性的化合物進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新從土壤中分離的放線菌K04-0144林的培養(yǎng)液中產(chǎn)生了顯示出目的活性的物質(zhì)。然后，從該培養(yǎng)物中分離純化顯示出目的活性的物質(zhì)，獲得了3種抗MRSA抗生素和l種增強(qiáng)P-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的活性的化合物。由于以往并不了解具有這種化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，因此將抗MRSA抗生素稱(chēng)為K04-0144A物質(zhì)，K04-0144B物質(zhì)和K04-0144C物質(zhì)，并將增強(qiáng)P-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的活性的活性物質(zhì)稱(chēng)為K04-0144D物質(zhì)。而且，把全部這類(lèi)物質(zhì)稱(chēng)為K04-0144物質(zhì)。本發(fā)明基于這種發(fā)現(xiàn)而完成，為下式[I]表示的K04-0144A物質(zhì)，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>[I]下式[II]表示的K04-0144B物質(zhì)，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>下式[III]表示的K04-0144C物質(zhì)，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>以及下式[IV]表示的K04-0144D物質(zhì)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>[IV]中的任一種K04-0144物質(zhì)。本發(fā)明還是一種新型K04-0144物質(zhì)的制造方法，該方法在培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于鏈霉菌屬的、具有生產(chǎn)K04-0144物質(zhì)的微生物，使K04-0144物質(zhì)在培養(yǎng)物中積累，從該培養(yǎng)物中收集K04-0144物質(zhì)。本發(fā)明還是微生物-鏈霉菌屬(Streptomycessp.)的種K04-0144(NITEBP-107)。作為用于生產(chǎn)本發(fā)明的前式[I]、[II]、[III]和[IV]表示的新型K04-0144物質(zhì)使用的菌林，作為其中一例，可以列舉由本發(fā)明人等從沖繩縣石垣島的土壤中新分離的鏈霉菌屬(Streptomycessp.)的種K04-0144林。本菌林的菌體學(xué)性狀如下所示。(I)形態(tài)的性質(zhì)營(yíng)養(yǎng)菌絲在各種瓊脂培養(yǎng)基上很發(fā)達(dá)，沒(méi)有觀察到斷裂。氣生菌絲大量著生于酵母麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基和甘油.天冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基中，呈現(xiàn)出白色至灰色的顏色。通過(guò)顯微鏡下的觀察，在氣生菌絲上發(fā)現(xiàn)20個(gè)以上的孢于的連鎖，其形態(tài)為螺旋狀，孢子的大小為約l.Oxi.Ojim的圓柱狀。孢子的表面平滑。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)菌核、孢子和游動(dòng)孢子。(II)各種培養(yǎng)基上的性狀按照E.B.Shirling和D.Gottlieb的方法(InternationaljournalofsystematicalBacteriology,16巻，313頁(yè)，1966年)制備的本生產(chǎn)菌的培養(yǎng)性狀示于下表。使用colourharmonymanual第4版(美國(guó)芝加哥的containercorporation,1958年)作為標(biāo)準(zhǔn)色，確定顏色，色片名和其代碼一起記載括弧內(nèi)。以下只要不是特別提到，就是27。C，第二周時(shí)的各培養(yǎng)基中的觀察結(jié)果。培養(yǎng)性質(zhì)淀粉無(wú)機(jī)鹽瓊脂(ISP)生長(zhǎng)生長(zhǎng)良好，淡象牙色(2ca)背面淡象牙色(2ca)-深藍(lán)灰(2ih)氣生菌絲中度著生，白色(a)-牡蠣白(b)可溶性色素沒(méi)產(chǎn)生酪氨酸瓊脂(ISP)生長(zhǎng)生長(zhǎng)良好，竹(2gc)-深橄欖灰綠(lml)背面竹(2gc)-深橄欖灰綠(lml)氣生菌絲中度著生，白色(a)-淡灰(c)可溶性色素沒(méi)產(chǎn)生麥片瓊脂(ISP)生長(zhǎng)背面氣生菌絲可溶性色素生長(zhǎng)良好，珍珠黃(lca)奶油(172ca)-橄欖灰綠(lig)中度著生，白色(a)-深藍(lán)灰(2ih)沒(méi)產(chǎn)生，酵母麥芽提取物瓊脂(ISP)生長(zhǎng)生長(zhǎng)良好，淡芥末色(2ie)背面淡草綠色(lli)氣生菌絲豐富著生，白色(a)-灰(f)可溶性色素沒(méi)產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)瓊脂生長(zhǎng)背面氣生菌絲可溶性色素生長(zhǎng)良好，淡象牙色(2ca)奶油(172ca)微弱著生，白色(a)沒(méi)產(chǎn)生蛋白胨酵母鐵瓊脂(ISP)硝酸鹽瓊脂中度生長(zhǎng)，象牙色Gdb)象牙色(2db)t微弱著生，白色(a)-深藍(lán)灰(2ih)L素沒(méi)產(chǎn)生糖天冬酰胺瓊脂生長(zhǎng)良好,淡草綠色菌絲微弱著生，性色素沒(méi)產(chǎn)生淡象牙色(2ca)-淡黃色一(lea)(lli)-珍珠黃(lca)白色(a)-深藍(lán)灰(2ih)天冬酰胺瓊脂(ISP)生長(zhǎng)良好，淡芥末色(2ie)淡芥末色:K2ie)-無(wú)名(.7—豐一厶)(24V2ml)豐富著生，白色(a)-珍珠灰(13cb)素沒(méi)產(chǎn)生-菌wi糖長(zhǎng)面生&蔗生背氣可萄長(zhǎng)面生溶葡生背氣T絲色菌性油長(zhǎng)面生&+t背氣^生長(zhǎng)生長(zhǎng)良好，淡象牙色(2ca)背面竹(2gc)氣生菌絲不著生可溶性色素沒(méi)產(chǎn)生_葡萄糖.硝酸鹽瓊脂生長(zhǎng)生長(zhǎng)微弱，珍珠粉色(3ca)-竹(2gc)背面淡象牙色(2ca)氣生菌絲微弱著生，白(a)可溶性色素沒(méi)產(chǎn)生_甘油.蘋(píng)果酸鈣瓊脂生長(zhǎng)生長(zhǎng)良好，雪白(13ba)-珍珠黃(lca)背面雪白(13ba)氣生菌絲微弱著生，白(a)可溶性色素沒(méi)產(chǎn)生_葡萄糖.蛋白胨瓊脂生長(zhǎng)中度生長(zhǎng)，淡芥末色(2ie)背面竹(2gc)氣生菌絲不著生可溶性色素沒(méi)產(chǎn)生(III)生理學(xué)的各種性質(zhì)(1)黑色素的生成(a)酪氨酸瓊脂陰性(b)蛋白胨酵母鐵瓊脂陰性(c)胰蛋白胨酵母液陰性(d)單純明膠培養(yǎng)基(21-23。陰性(2)硝酸鹽的還原陰性(3)明膠的液化(21-23"C)(單純明膠培養(yǎng)基)陰性(4)淀粉的加水分解陽(yáng)性(5)脫脂乳的凝固(37X:)陽(yáng)性(6)脫脂乳的蛋白胨化(37TC)陽(yáng)性(7)生長(zhǎng)穩(wěn)定范圍12-4(8)碳源的利用性(Pridh詣一Got11ieb瓊脂培養(yǎng)基)利用D-葡萄糖，蜜二糖，D-甘露醇，L-鼠李糖或利用L-阿拉伯糖，D-木糖，棉子糖，D-果糖，蔗糖(9)纖維素的分解陰性(IV)化學(xué)分類(lèi)學(xué)的性狀細(xì)胞壁的二氨基庚二酸是LL型，主要甲基萘醌類(lèi)是MK-90U和MK-9(H8)。(V)結(jié)論以上，該菌的菌學(xué)性質(zhì)的概況如下所示。細(xì)胞壁中的二氨基庚二酸是LL型，主要甲基萘醌類(lèi)是MK-90U和MK-9(H8)。孢子連鎖的形狀呈螺旋狀，形成長(zhǎng)孢子鏈，孢子的表面平滑。培養(yǎng)上的各種性質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)菌絲呈褐色，氣生菌絲呈白色至灰色系的顏色。不產(chǎn)生黑色素。根據(jù)這些結(jié)果，基于《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》(BERGEY，SMANUALOFSystematicBacteriology)，第4巻，1989年，認(rèn)為其是屬于鏈霉菌屬的菌種。微生物的國(guó)際保藏本菌林，作為鏈霉菌屬K04-0144，根據(jù)專(zhuān)利手續(xù)上的微生物保藏的國(guó)際承認(rèn)的相關(guān)布達(dá)佩斯條約，位于郵政編碼292-0818日本千葉縣目更津市kazusa鐮足2「5-8(2-5-8KazusakamatariKisarazu-shi，Chiba-ken292-0818日本)的獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專(zhuān)利孩吏生物保藏中心(InternationalAdministrativeAgencyNationalInstituteofTechnologyandEvaluationPatentMicroorganismsDepositary(NPMD))。保藏日為2005年6月30日，保藏號(hào)為NITEBP-107。理化的性狀接著，對(duì)本發(fā)明的K04-0144物質(zhì)的理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行說(shuō)明。1.K04-0144A物質(zhì)(1)性狀白色粉末(2)分子式C64H103N4O33PHRNeg.ESI-MS(m/z)[M-Hr計(jì)算值1485.6206,實(shí)測(cè)值1485.6164(3)分子量1487在Neg.ESI-MS(m/z)觀測(cè)[M-H]—1485(4)紫外部吸收光謙在曱醇溶液中測(cè)定的紫外部吸收光譜示于圖1,顯示出末端吸收。(5)紅外部吸收光諳用溴化鉀片劑法測(cè)定的紅外部吸收光傳示于圖2，在vmax3399，2960，1722，1673,1382，1068cn^等出顯示出極大吸收(6)比旋光度[cc]d"+6.7°(c-O.l，甲醇)(7)對(duì)溶劑的溶解性可溶于曱醇和水，不溶于氯仿和已烷(8)質(zhì)子和碳核磁共振光譜重甲醇中，Varian公司制，400MHz核磁共振光鐠儀進(jìn)行測(cè)定。第3圖中表示了質(zhì)子核磁共振光傳，第4圖中表示了碳核磁共振光鐠。氫的化學(xué)位移(ppm)和碳的化學(xué)位移(ppm)如下所示。5h:0.97(6H)，1.26(3H)，1.38(2H)，1.41(3H)，1.60(3H)，1.62(3H),1.67(3H),1.78(3H)，1.90(2H)，2.02(2H)，2.04(3H)，2.05(3H),2.10(4H),2.13(1H)，2.17(1H),2.70(1H)，3.24(1H)，3.31(2H)，3.34(1H)，3.46(1H)，3.51(1H)，3.55(3H),3.60(3H)，3.69(3H)，3.81(1H)，3.90(2H)，4.10(2H)，4.18(3H)，4.29(3H)，4.38(1H),4.43(1H)，4.45(1H)，4.47(2H)，4.67(2H)，5.06(1H)，5.10(1H)，5.14(1H)，5.28(1H)，5.38(1H)，5.45(1H)，5.93(1H)ppm5C:16.1，16.4，17.8，18.0，23.3，23.5，24.0，26.0，27.7，27.9，27.9，32.4，32.7，33.5，35.9，36.5，40.9，42.9，55.7，56.9，62.5，66.9，68.5，69,4，71.6，71.6，72.2，72.6，73.8，73.8，74.0，74.1，74.7，75.0，75.2，75.4，76.4，78.0，78.2，78.3，79.7，82.4，86.1，96.2，103.2,104.3，104.7，105.0，109.3，122.7，123.5，125.4，126.8，132.2，137.4，141.6，142.6，151.1，159.2，173.5，173.8，174.2，174.6，175.lppm對(duì)如上所示的K01-0144A物質(zhì)的各種理化學(xué)性狀和光鐠數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)研究，結(jié)果測(cè)定K0l70144A;物質(zhì)是前述的式[I]表示的化學(xué)結(jié)構(gòu)。2.KOI-0144B物質(zhì)(1)性狀白色粉末(2)分子式C58H93N402SP肌Neg.ESI-MS(m/z)[M-H]-計(jì)算值1323.5656,實(shí)測(cè)值1323.5636(3)分子量1325在Neg.ESI-MA(m/z)觀測(cè)[M-H〗1323(4)紫外部吸收光語(yǔ)在甲醇溶液中測(cè)定的紫外部吸收光譜示于第5圖，顯示出末端吸收(5)紅外部吸收光語(yǔ)用溴化鉀片劑法測(cè)定的紅外部吸收光譜示于第6圖，在vmax3399，2923，1716,1675,1378，1068cn^等出顯示出極大吸收(6)比旋光度[ct]。"+4.0°(c-0.1，曱醇)(7)對(duì)溶劑的溶解性可溶于水，甲醇和二曱基亞砜，不溶于丙酮，氯仿和n-已烷(8)質(zhì)子和碳核磁共振光譜重甲醇中，Varian公司制，400MHz核磁共振光鐠儀進(jìn)行測(cè)定。第7圖中表示了質(zhì)子核磁共振光譜，第8圖中表示了碳核磁共振光謙。氫的化學(xué)位移(ppm)和碳的化學(xué)位移(ppm)如下所示。5h:0.97(6H)，1.26(3H)，1.38(2H)，1.42(3H)，1.60(3H)，1.61(3H)，1.67(3H)，1..77(3H)，1.91(2H)，2.02(5H)，2.03(3H)，2.10(6H)，2.70(2H)，3.33咖，3.56(3H)，3.58(1H)，3.60(1H)，3.64(3H)，3.84(3H)，4.09(1H)，4.12(1H)，4.15(1H)，4.17(1H)，4.20(2H)，4.28(1H)，4.37(1H)，4.44(1H)，4.45(2H)，4.67(2H)，5.04(1H)，5.10(2H)，5.14(1H)，5.29(1H)，5.38(1H)，5.45(1H)，6.04(1H)ppm5c:16.1，16.3，17.8，18.0，23.1，23.3，24.0，26.0，27.7，27.8,27.9,32.4，32.7，33.4，36.0,36.5，40.9，42.9，55.9,56.760.8，67.0，67.7，71.6，72.1，72.6，73.7，73.8，73.9，74.0，74.675.1，76.0，76.3，77.9，79.9，81.5，86.4，96.5,103.4，104.6，105.2，109.3，122.8，123.5，125.4，126.8，132.2，137.4，141.7，142.4，151.1，159.2，173.2,173.7，174.1，174.7，174.9ppm對(duì)如上所示的K04-0144B物質(zhì)的各種理化學(xué)性狀和光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)研究，結(jié)果測(cè)定K04-0144B物質(zhì)是前述的式[II]表示的化學(xué)結(jié)構(gòu)。3.K04-0144C物質(zhì)(1)性狀白色粉末(2)分子式C58H94N5027PHRNeg.ESI-MS(m/z)[M-H]-計(jì)算值1322.5809，實(shí)測(cè)值1322.5795(3)分子量1324在Neg.ESI-MS(m/z)觀測(cè)[M-H]-1322(4)紫外部吸收光譜在曱醇溶液中測(cè)定的紫外部吸收光譜示于第9圖，顯示出末端吸收(5)紅外部吸收光鐠用溴化鉀片劑法測(cè)定的紅外部吸收光譜示于第10圖，在vmax3400，2925，1677，1648，1400,1066cm丄等出顯示出極大吸收(6)比旋光度[ot]d"+3.7。(c=0.l，曱醇)(7)對(duì)溶劑的溶解性可溶于水，甲醇和二甲基亞砜，不溶于丙酮，氯仿和n-已烷(8)質(zhì)子和碳核磁共振光譜重甲醇中，Varian公司制，400MHz核磁共振光譜儀進(jìn)行測(cè)定。第11圖中表示了質(zhì)子核磁共振光譜，第12圖中表示了碳核磁共振光語(yǔ)。氫的化學(xué)位移(ppm)和碳的化學(xué)位移(ppm)如下所示。5h:0.97(6H)，1.25(3H)，1.38(2H)，1.42(3H)，1.60(3H)，1.61(3H)，1.67(3H)，1.76(3H)，1.91(2H)，2.01(6H)，2.04(2H)，2.11(6H)，2.70(2H)，3.34(2H)，3.56(4H)，3.64(4H)，3.72(1H)，3.84(2H),4.06(1H)，4.11(3H)，4.17(1H)，4.21(2H)，4.42(1H)，4.43(1H)，4.45(1H)，4.53(1H)，4.67(2H)，5.08(1H)，5.12(1H)，5.14(1H)，5.31(1H)，5.35(1H)，5.38(H),5.99(1H)ppm5C:16.1，16.4,17.8，17.9，23.1，23.3,23.9，26.0，27.7，27.9，27.9，32.3，32.6，33.4，36.0，36.5，40.9，42.9，56.5，56.761.0，67.2，67.6，70.7，72.3，72.8，73.5,73.7，73.9，74.0，74.475.7，76.0，76.0，78.3，79.4，81.6，85.1，96.2，103.5,103.9，104.9，109.3，122.6，123.5，125.4，126.8，132.2，137.3，141.6，142.1，151.1，159.2，173.7，173.7，173.7，174.0，174.7ppm對(duì)如上所示的K04-0144C物質(zhì)的各種理化學(xué)性狀和光謙數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)研究，結(jié)果測(cè)定K04-0144C物質(zhì)是前述的式[III]表示的化學(xué)結(jié)構(gòu)。4.K04-0144D物質(zhì)(1)性狀白色粉末(2)融點(diǎn)138°C(3)分子式C25H"N05SHRFAB-MS(m/z)[M-H+2Na]+計(jì)算值512.2423，實(shí)測(cè)值512.2416(4)分子量467在FAB-MS(m/z)觀測(cè)[M-H+2Na]+512(5)紫外部吸收光譜在曱醇溶液中測(cè)定的紫外部吸收光譜示于第13圖，在232nm顯示出末端吸收(6)紅外部吸收光鐠用溴化鉀片劑法測(cè)定的紅外部吸收光鐠示于第14圖，在vmax3427，2927，2864，1641，1604，1398,1124、1078cn^等出顯示出極大吸收(7)比旋光度[oc]。25+26.8。(c-O.l，甲醇)(8)對(duì)溶劑的溶解性可溶于曱醇和水，不溶于氯仿和已烷(9)質(zhì)子和碳核磁共,振光譜重甲醇中，Varian公司制，400MHz核磁共振光譜儀進(jìn)行測(cè)定。第15圖中表示了質(zhì)子核磁共振光鐠，第16圖中表示了碳核磁共振光鐠。氫的化學(xué)位移(ppm)和碳的化學(xué)位移(ppm)如下所示。5h:0.84(5H)，0.91(4H)，1.00(3H)，1.14(1H)，1.20(1H)，1.35(2H)，1.63(4H)，1.75(3H)，1.98(3H)，2.13(1H)，2.42(1H)，2.63(1H)，2.77(1H),2.82(1H)，3.02(1H)，3.82(1H)，4.41(1H)，4.86(1H)，5.03(1H)，5.55(2H)，6.35(1H)ppm5C:12.0，16.0，19.3，22.3，22.8，24.4，27.8，34.0，34.1,37.7，39.2，39.8，41.1，43.0，53.7，55.2，55.8，72.3，78.8，110.1，133.2，137.6，143.1，172.5，177.4ppm對(duì)如上所示的K04-0144D物質(zhì)的各種理化學(xué)性狀和光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)研究，結(jié)果測(cè)定K04-0144D物質(zhì)是前述的式[IV]表示的化學(xué)結(jié)構(gòu)。生物學(xué)性狀下面，對(duì)本發(fā)明的K04-0144物質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。K04-0144A、B和C物質(zhì)的抗菌活性最小發(fā)育抑制濃度(MIC)的測(cè)定按照瓊脂平板稀釋法(日本化學(xué)療法標(biāo)準(zhǔn)法，CHEMOTHERAPY第29巻76-79頁(yè)1981年)進(jìn)行。作為試菌，使用包括臨床分離的曱氧西林抗性金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)林在內(nèi)的27種菌林。各個(gè)待驗(yàn)菌在Mueller-Hinton肉湯(2.l%w/v)(DIFC0)培養(yǎng)基中在37匸培養(yǎng)20小時(shí)后，在相同培養(yǎng)基中以相當(dāng)于約107ml的菌數(shù)懸浮，作為接種用菌液使用。用微量接種儀(microplanter)將制成的菌液由128ng/ml稀釋兩倍，涂布于含有各濃度階段的K04-0144A、B和C物質(zhì)的MHA培養(yǎng)基(Mueller-Hintonbroth2.1%(w/v)，瓊脂1.5%)上，37。C培養(yǎng)20小時(shí)后，通過(guò)用肉眼確認(rèn)菌生長(zhǎng)的有無(wú)，計(jì)算MIC。而且，使用萬(wàn)古霉素、阿貝卡星，利奈唑胺作為比較對(duì)象。其結(jié)果匯總于下表l。表1對(duì)K04-0144A、B和C物質(zhì)的對(duì)臨床分離林的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)的結(jié)果(MIC)(jig/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>由上可知K04-0144A、B和C物質(zhì)對(duì)含有MRSA的革蘭氏陽(yáng)性菌，以與已有藥物(萬(wàn)古霉素、阿貝卡星和利奈唑胺)同等或其之上的強(qiáng)度抑制其生長(zhǎng)。使用蠶在MRSA感染模型中的活性評(píng)價(jià)報(bào)道了使用蠶的感染系統(tǒng)作為使用動(dòng)物的體內(nèi)MRSA感染模型的替代法(Kaito等人，MicrobialPathogenesis.32巻，183-190頁(yè)，2002年)。按照該方法測(cè)定K04-0144A物質(zhì)的效果。作為試驗(yàn)菌，使用臨床分離的MRSA(K24林)。將MRSA在LB-10培養(yǎng)基(DIFC0)中于37C靜置培養(yǎng)18小時(shí)，將50|i1接種于5只2天大的蠶(約2g、愛(ài)媛蠶種社，日本)的背脈管中。將K04-0144A物質(zhì)調(diào)整為lmg/ml，用注射器從5只MRSA感染蠶的背脈管給藥50ji1(25mg/kg)。接種后飼養(yǎng)72小時(shí)，比較這期間觀察的試樣給藥和非給藥組的存活率，進(jìn)行判定。任何沒(méi)有接種的蠶(對(duì)照)和只給藥了25mg/kgK04-0144A物質(zhì)至少存活至72小時(shí)后，由此確認(rèn)這種條件下K(M-0144A物質(zhì)對(duì)蠶完全沒(méi)有毒性。而且，接種了50ji1MRSA菌液的蠶在接種72小時(shí)后全部死亡。這種條件下，以25mg/kg給藥了K04-0144A物質(zhì)的蠶即使在接種MRSA72小時(shí)后也全部存活。同樣，以25mg/kg給藥了萬(wàn)古霉素的蠶即使在接種MRSA72小時(shí)后也全部存活。這樣，使用蠶的MRSA感染實(shí)驗(yàn)中顯示出K04-0144A物質(zhì)的有效性。K04-0144D物質(zhì)的亞胺培南活性增強(qiáng)作用1.用紙盤(pán)(paperdisc)法評(píng)價(jià)亞胺培南(imipenem)活性增強(qiáng)作用的方法使用臨床分離的甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)K24抹作為試驗(yàn)菌。MRSAK-24林在Mueller-Hintonbroth(2.l°/。w/v)(DIFCO)37度培養(yǎng)20小時(shí)后，以相當(dāng)于0.5McFARAND(約108CFU/mL)懸浮于相同培養(yǎng)基中，在MHA培養(yǎng)基(Mueller-Hintonbroth2.1。"w/v)，瓊脂1.5W和相同組成的培養(yǎng)基中以不影響試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的濃度即10"g/ml的終濃度添加亞胺培南(日本，萬(wàn)有制藥社，Tien詣肌注用效價(jià)0.5)，在該培養(yǎng)基中涂抹上迷;菌液。按照美國(guó)臨床檢查標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NationalCommitteeforLaboratoryStandard,NCCLS)法，用滅菌棉簽進(jìn)行涂布。對(duì)試驗(yàn)菌的各培養(yǎng)基上的抗菌活性，按照紙盤(pán)法(薄為6mm:ADVANTECH公司)，以mm單位記錄37C20小時(shí)后的抑制圏徑的直徑。其結(jié)果，如表2所示的，lMg紙盤(pán)條件下，K04-0144D物質(zhì)其本身也沒(méi)有測(cè)定出抑制圏，與之相對(duì)，在亞胺培南存在下，測(cè)定出15mm的抑制圏，確認(rèn)了亞胺培南活性增強(qiáng)作用。表2通過(guò)紙盤(pán)法獲得的K64-0144D物質(zhì)亞胺培南活性增強(qiáng)作用的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>2.通過(guò)微量液體稀釋法對(duì)各種抗菌劑的活性增強(qiáng)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法對(duì)于通過(guò)用紙盤(pán)法進(jìn)行的評(píng)價(jià)顯示出強(qiáng)亞胺培南活性增強(qiáng)作用的K04-0144D物質(zhì)，按照微量液體稀釋法評(píng)價(jià)亞胺培南和其它抗菌劑的活性增強(qiáng)。作為其它藥劑；使用萬(wàn)古霉素(日本，和光純藥社)，鏈霉素(日本，明治制果社)和環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)(日本，和光純藥社)。評(píng)價(jià)，對(duì)日本化學(xué)療法學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)法(CHEMOTHERAPY38巻，103-105頁(yè)，1990年)進(jìn)行部分改變來(lái)進(jìn)行。在96孔板(美國(guó)，Corning公司制)的各孔中，添加85n1Mueller-Hintonbroth(2.1Xw/v)后，將5^1預(yù)先用無(wú)菌水分段稀釋的亞胺培南以4.8xl0"至256ug/ml的終濃度添加到各孔中。進(jìn)而，在各孔中，以不影響生長(zhǎng)的終濃度16pg/ml在5m1水溶液中添加K04-0144D物質(zhì)本身。充分混合后，與上述方式同樣，將試驗(yàn)菌MRSA以相當(dāng)于0.5McFARAND(約108CFU/mL)懸浮,將其在相同培養(yǎng)基中稀釋至10倍，在每孔中接種5Ml該稀釋的菌液。37C培養(yǎng)20小時(shí)后，以肉眼沒(méi)有發(fā)現(xiàn)孔中的菌的生長(zhǎng)的最小藥劑濃度作為MIC。各種抗菌劑單獨(dú)時(shí)的MIC以及各種抗菌劑和K04-0144D物質(zhì)聯(lián)合使用時(shí)的MIC示于表3，32yg/mL至0.03ng/mL亞胺培南，確認(rèn)了1024倍的活性增強(qiáng)。另一方面，在萬(wàn)古霉素，鏈霉素和環(huán)丙沙星中沒(méi)有確認(rèn)活性增強(qiáng)作用，因此清楚了K04-0144D物質(zhì)的活性增強(qiáng)作用特異性作用于3-內(nèi)酰胺抗生素。表3:通過(guò)微量液體稀釋法獲得的K04-0144D物質(zhì)的亞胺培南活性增強(qiáng)作用的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>檢測(cè)菌MRSA(日本，北里醫(yī)院分離林)K04-0144D物質(zhì)(16Mg/mL):最小發(fā)育抑制濃度的1/4濃度附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1:是表示本發(fā)明的K04-0144A物質(zhì)的紫外部吸收光語(yǔ)(甲醇溶液中)的圖。圖2:是表示本發(fā)明的K04-0144A物質(zhì)的紅外部吸收光譖(溴化鉀法)的圖。圖3:是表示本發(fā)明的K04-0144A物質(zhì)的質(zhì)子核磁共振光鐠(重甲醇中)的圖。圖4:是表示本發(fā)明的K04-0144A物質(zhì)的碳核磁共振光譜(重甲醇中)的圖。圖5:是表示本發(fā)明的K04-0144B物質(zhì)的紫外部吸收光鐠(甲醇溶液中)的圖。圖6:是表示本發(fā)明的K04-0144B物質(zhì)的紅外部吸收光譜(溴化鉀法)的圖。圖7:是表示本發(fā)明的K04-0144B物質(zhì)的質(zhì)子核磁共振光i普(重甲醇中)的圖。圖8:是表示本發(fā)明的K04-0144B物質(zhì)的碳核磁共振光譜(重甲醇中)的圖。圖9:是表示本發(fā)明的K04-0144C物質(zhì)的紫外部吸收光譜(曱醇溶液中)的圖。圖10:是表示本發(fā)明的K04-0144C物質(zhì)的紅外部吸收光i普(溴化鉀法)的圖。圖11:是表示本發(fā)明的K04-0144C物質(zhì)的質(zhì)子核磁共振光鐠(重曱醇中)的圖。圖12:是表示本發(fā)明的K04-0144C物質(zhì)的碳核磁共振光鐠(重甲醇中)的圖。圖I3:是表示本發(fā)明的K04-0144D物質(zhì)的紫外部吸收光語(yǔ)(曱醇溶液中)的圖。圖I4:是表示本發(fā)明的K04-0144D物質(zhì)的紅外部吸收光i普(溴化鉀法)的圖。圖15:是表示本發(fā)明的K04-0144D物質(zhì)的質(zhì)子核磁共振光鐠(重曱醇中)的圖。圖16:是表示本發(fā)明的K04-0144D物質(zhì)的碳核磁共振光語(yǔ)(重甲醇中)的圖。用于實(shí)施發(fā)明的最佳方式以下列舉本發(fā)明的實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。K04-0144物質(zhì)的制備法1)K04-0144A、B和C物質(zhì)的制備法在瓊脂斜面培養(yǎng)基(淀粉1.0%(日本，關(guān)東化學(xué)社)、0.3。/。N-Z胺(日本，和光純藥社)、0.02%酵母提取物(日本，東方酵母社)、0.1%肉提取物(日本，極東制藥工業(yè)社)、0.3%碳酸鉀(日本，關(guān)東化學(xué)社)、1.2%瓊脂(日本，清水食品社)，調(diào)整成pH7.0)中培養(yǎng)的K04-0144林用接種環(huán)接種于分注了100ml的種培養(yǎng)基(2.4%淀粉(日本，關(guān)東化學(xué)社)、0.1%葡萄糖(日本，和光純藥社)、0.3%蛋白胨(日本，極東制藥工業(yè)社)、0.5%酵母提取物(日本，東方酵母社)、0.4。/nCaC0J日本，關(guān)東化學(xué)社)調(diào)整成pH6.O)的容積為500mL三角燒瓶中，27匸在旋轉(zhuǎn)搖床(210rpm)中培養(yǎng)3天后，1%接種于加入了50L生產(chǎn)培養(yǎng)基(0.5%葡萄糖(日本，和光純藥社)、0.5%玉米漿粉(日本，Maruko社)、1.0%麥片(日本，日本食品制造社)、1.0%棉子提取物(Pharaianiedia)(日本、Iwaki公司)、0.5。綜P0J日本，關(guān)東化學(xué)社)、0.5%MgS04.7H20(日本，和光純藥社)、0.l%Tris鹽溶液、0.l%FeS04*7H20(E1本，關(guān)東化學(xué)社)、0.1%MnCl2.4H2O(0本，關(guān)東化學(xué)社)、0.l%ZnS04.7H20(日本，關(guān)東化學(xué)社)、0.1%CuS04.5H20(日本,關(guān)東化學(xué)社)、0.1%CoC126H20(E1本，關(guān)東化學(xué)社)、調(diào)整成pH7.O)的溶劑為90L的缸發(fā)酵桶中，于27。C培養(yǎng)6天。培養(yǎng)終止后，通過(guò)將50L該培養(yǎng)液用Sharpless離心才幾離心，將上清與菌體分開(kāi)。將上清上樣于HP-20柱((J)10x20cm、三菱化學(xué)社、日本)，用1.5L的水清洗后，用100%甲醇洗脫活性成分，減壓濃縮，冷凍干燥。將獲得的粗物質(zhì)27g中的15g溶于少量水中，用ODS柱((J)5x28cm、Senshu科學(xué)、日本)進(jìn)行純化。用40%曱醇的溶液清洗ODS柱后，以甲醇純化水(2:3、3:2、4:1、100:0)的各混合溶液作為洗脫劑進(jìn)行色譜，對(duì)4L各洗脫液以100邁Lx40本分餾。通過(guò)濃縮干燥活性級(jí)分(100:0級(jí)分編號(hào)4至級(jí)分編號(hào)9)，獲得了450mg褐色粉末物質(zhì)。將其溶解于少量的甲醇中，通過(guò)分取HPLC(柱PEGASILODS、20^x"Omm、Senshu科學(xué)、日麥)進(jìn)行純化。以50%乙腈水溶液(10mM醋酸銨pH3，用蟻酸調(diào)制)作為流動(dòng)相，在8mL/分的流速中，監(jiān)控UV210nm的吸收。觀察保持時(shí)間21分、23分和38分時(shí)呈現(xiàn)活性的峰，分取這些峰。分取液用氨水調(diào)整成pH7，減壓濃縮。進(jìn)而，對(duì)殘?jiān)芤耗康男悦擕}，吸附于ODS柱上，水洗后用曱醇溶液洗脫，通過(guò)濃縮干燥，分離K04-0144A物質(zhì)和K04-0144B物質(zhì)作為部分純化級(jí)分，并且，分離產(chǎn)量為19.4mg的K04-0144C物質(zhì)作為活性級(jí)分。再采用分取HPLC(柱PEGASILODS、20-x250mm、Senshu科學(xué)、日本)對(duì)作為部分純化級(jí)分獲得的K04-0144A物質(zhì)和K04-0144B物質(zhì)進(jìn)行最終純化。以46。/。乙腈水溶液(10mM磷酸二氫鉀p!H.7)作為流動(dòng)相，在8mL/分的流速中，監(jiān)控UV210mm的吸收。在保持時(shí)間20分時(shí)觀察K04-0144A物質(zhì)、26分時(shí)K04-0144B物質(zhì)，分取這些峰。分取液用氨10mM的磷酸二氬鉀水調(diào)整成pH7，減壓濃縮。進(jìn)而對(duì)殘?jiān)芤耗康男悦擕}，吸附于ODS柱上，水洗后用曱醇溶液洗脫，通過(guò)濃縮干燥，分別分離產(chǎn)量為15.7mg和5.8mg的K04-0144A物質(zhì)和K04-0144B物質(zhì)作為活性級(jí)分。2)K04-0144D的制備方法將K04-0144林1°/。接種于裝入了50L與K04-0H4A-C物質(zhì)的制造相同的生產(chǎn)培養(yǎng)基的容積為90L的缸發(fā)酵桶中，于271C培養(yǎng)6天。培養(yǎng)終止后，通過(guò)將50L該培養(yǎng)液用Sharpless離心機(jī)離心，將上清與菌體分開(kāi)。將上清上樣于HP-20柱(d)l()x2()cm、三菱化學(xué)社、日本)，用1.5L的水清洗后，用100%甲醇洗脫活性成分，減壓濃縮，冷凍干燥。將獲得的粗物質(zhì)27g中的15g溶于少量水中，用ODS柱(d)5x28c邁、Senshu科學(xué)、日本)進(jìn)行純化。用40%甲醇的溶液清洗ODS柱后，以甲醇純化水(2:3、3:2、4:1、100:0)的各混合溶液作為洗脫劑進(jìn)行層析，以4L各洗脫液進(jìn)行分級(jí)。通過(guò)濃縮干燥活性級(jí)分(4:1級(jí)分)，獲得了131mg褐色粉末物質(zhì)。將其溶解于少量的曱醇中，通過(guò)分取HPLC(柱PEGASILODS、20^x250mm、Senshu科學(xué)、日本)進(jìn)行純化。以60%乙腈水溶液(含0.05%磷酸)作為流動(dòng)相，在8mL/分的流速中，監(jiān)控UV210nm的吸收。觀察保持時(shí)間32分時(shí)呈現(xiàn)活性的峰，分取該峰。分取液用1N氫氧化鈉調(diào)整成pH7，減壓濃縮。進(jìn)而，對(duì)殘?jiān)芤耗康男悦擕}，吸附于ODS柱上，水洗后用甲醇溶液洗脫，通過(guò)濃縮干燥，分離產(chǎn)量為17.lmg的K04-0144D物質(zhì)作為活性級(jí)分。產(chǎn)業(yè)上的利用領(lǐng)域如上所述，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)K04-0144物質(zhì)能力的以屬于鏈霉菌屬的K04-0144林作為代表的微生物，從其培養(yǎng)物中收集的K04-0144A、B和C物質(zhì)具有對(duì)甲氧西林抗性黃色葡萄球菌(MRSA)為代表的革蘭氏陽(yáng)性菌具有強(qiáng)抗菌活性，因此作為MRSA傳染病和，由包括p-內(nèi)酰胺抗生物質(zhì)抗性在內(nèi)的多種藥物抗性菌引起的傳染病的治療藥物是有用的。而且，同樣從其培養(yǎng)液中收集的新的K04-0144D物質(zhì)與作為抗菌劑使用的P-內(nèi)酰胺抗生物質(zhì)一起使用具有增強(qiáng)其效果的作用，因此期待其作為甲氧西林抗性黃色葡萄球菌(MRSA)傳染病和，由包括P-內(nèi)酰胺抗生物質(zhì)抗性在內(nèi)的多種藥物抗性菌引起的傳染病的治療藥物是有用的。權(quán)利要求1.K04-0144物質(zhì)，其為由下式[I]表示的K04-0144A物質(zhì)，下式[II]表示的K04-0144B物質(zhì)，下式[III]表示的K04-0144C物質(zhì)，以及下式[IV]表示的K04-0144D物質(zhì)中的任一種。2.K04-0144物質(zhì)的制備方法，其特征在于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于鏈霉菌屬(Streptomycessp.)的種的、具有生產(chǎn)K04-0144物質(zhì)的能力的微生物，使K04-0144物質(zhì)在培養(yǎng)物中積累，從該培養(yǎng)物中收集K04-0144物質(zhì)。3.權(quán)利要求2記載的制備方法，屬于鏈霉菌屬(Streptomycessp.)的種的、具有生產(chǎn)K04-0144物質(zhì)的能力的微生物為鏈霉菌K04-0144(Streptomycessp.K04-0144)(NITEBP-107)。4.鏈霉菌屬(Streptomycessp.)的種K04-0144(NITEBP-107)。全文摘要本發(fā)明，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)以屬于具有生產(chǎn)K04-0144物質(zhì)的能力的鏈霉菌屬的K04-0144株為代表的微生物，從其培養(yǎng)液中收集的K04-0144A、B和C物質(zhì)由于具有對(duì)甲氧西林抗性黃色葡萄球菌(MRSA)為代表的革蘭氏陽(yáng)性菌具有強(qiáng)抗菌活性，因此可用作MRSA傳染病和由包括β-內(nèi)酰胺抗生物質(zhì)抗性在內(nèi)的多種藥物抗性菌引起的傳染病的治療藥物。而且，同樣從其培養(yǎng)液中收集的新的K04-0144D物質(zhì)與作為抗菌劑使用的β-內(nèi)酰胺抗生物質(zhì)一起使用具有增強(qiáng)其效果的作用，因此可用作甲氧西林抗性黃色葡萄球菌(MRSA)傳染病和由包括β-內(nèi)酰胺抗生物質(zhì)抗性在內(nèi)的多種藥物抗性菌引起的傳染病的治療藥物。文檔編號(hào)A61P31/00GK101365798SQ200680047679公開(kāi)日2009年2月11日申請(qǐng)日期2006年5月16日優(yōu)先權(quán)日2006年5月16日發(fā)明者供田洋,大村智,松本厚子,花木秀明,金容必,高橋洋子申請(qǐng)人:社團(tuán)法人北里研究所