干細胞的mntf分化和生長的制作方法

文檔序號：1126708閱讀：1303來源：國知局

專利名稱：干細胞的mntf分化和生長的制作方法
干細胞的MNTF分化和生長相關申請
本申請要求來自U.S.S.N. 60/735,702、 U. S. S. N. 60/841,766 和美國臨時申請?zhí)?0/XXX， XXX (待指定)的優(yōu)先;f又，所述U. S. S. N. 60/735, 702于2005年11月10日提交，名稱為"MNTF Differentiation and Growth of Stem Cells";所述U. S. S. N. 60/841， 766于2006 年9月1日提交，名稱為"Motoneuron Tropic factor Differentiates Murine Embryonic Stem Cells Into Motor Neurons Independent of the Sonic Hedgehog Receptor",所述美國臨時申請?zhí)?0/XXX, XXX 由Ko, Dorothy Tiu-Yak于2006年11月10日提交，名稱為"Methods of Treating Neuronal Disorders using MNTF peptides and analogues thereof",所述專利整體引入本文作為參考。
背景技術：
下述包括在本發(fā)明理解中可能有用的信息。它并非承認本文提供的任何信息是目前描述或要求保護的發(fā)明的現(xiàn)有技術，或與目前描述或要求保護的發(fā)明相關，或者明確或含蓄地參考的任何出版物或文件是現(xiàn)有技術。
直到最近，神經(jīng)科學的堅持見解是成人腦和脊髓中的神經(jīng)元不能再生。然而，在20世紀90年代中期，神經(jīng)科學家認識到實際上成人腦的某些部分的確產(chǎn)生新的神經(jīng)元。這些新的神經(jīng)元產(chǎn)生于胎兒以及成人腦中的"神經(jīng)干細胞"。成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的再生力的發(fā)現(xiàn)提供了下述希望可能最終能夠修復來自神經(jīng)變性疾病例如肌萎縮側索硬化(ALS，也稱為路-蓋里格氏(Lou Gehrig' s)病)，以及來自起因于中風或創(chuàng)傷的腦和脊髓損傷的損害。然而，從腦中非侵襲性分離和純化大量神經(jīng)干細胞仍是具有挑戰(zhàn)性的。
另一方面，胚胎干(ES)細胞是自我更新并且具有分化成人生物
中的任何細胞類型的能力的多能細胞。它們可以在體外以未分化的狀態(tài)繁殖長時間段，并且因此代表了用于發(fā)育研究和用于人疾病治療的有吸引力的細胞來源。
ES細胞在移植后對環(huán)境引發(fā)物有反應，并且采用適合于移植區(qū)域的細胞命運。然而，依賴環(huán)境引發(fā)物以指導干細胞預先排除了神經(jīng)元在CNS的非神經(jīng)性區(qū)域中的有效產(chǎn)生。
近來，已變得能夠離體指導干細胞的分化，在理論上使得這些細胞能夠較不依賴于或不依賴于體內(nèi)引發(fā)物。例如，通過使小鼠ES細胞暴露于視黃酸(RA)和音猬可以有效產(chǎn)生脊柱運動神經(jīng)元。在這個例子中，RA用于神經(jīng)化并建立關于多能ES細胞的尾部位置鑒定。音猬或猬激動劑(HhAgl.3)進一步指定了腹部位置鑒定，和在應答中大比例的ES細胞起始運動神經(jīng)元特異性轉錄模式，并且獲得成熟神經(jīng)元的免疫組織化學特征。將ES細胞衍生的運動神經(jīng)元移植到雞胚脊髓內(nèi)使軸突延伸到外周內(nèi)并且形成神經(jīng)肌肉結點。[Wichterle，H. ，Lieberam， I., Porter, J.A. & Jessel, T.M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell 110， 385-397 (2002 )〗。
胚胎干(ES)細胞的治療潛能是有希望的，但在許多情況下受到不能促進分化成特異性細胞類型例如運動神經(jīng)元的限制。因此，迫切需要從多能干細胞產(chǎn)生更均質(zhì)的分化細胞群的技術。
來自大鼠肌肉組織的2種運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF1和MNTF2) 的分離和表征以及衍生自人視網(wǎng)膜母細胞瘤cDM文庫的重組 MNTF1-F6基因的隨后克隆在美國專利號6, 309, 877、 6, 759, 389和 6, 841, 531 (以及共同未決的美國專利申請序列號10/858, 144 、 10/858, 286、 10/858, 543和10/858, 545 )中得到描述。如國際申請號PCT/US2004/038651中所述，發(fā)現(xiàn)編碼與MNTF1有關的多肽的核苷酸序列位于人染色體16q22內(nèi)。
MNTF1-F6基因序列編碼33個氨基酸的序列。天然存在的和重組 MNTF 1多肽顯示選擇性增強從大鼠腰脊髄外植體中分離的前角運動神
經(jīng)元的體外存活。處理的培養(yǎng)物的顯微照片顯示有髓鞘的神經(jīng)纖維的神經(jīng)突長出和非神經(jīng)元細胞生長的顯著降低，所述非神經(jīng)元細胞例如
神經(jīng)膠質(zhì)細胞和成纖維細胞。類似地，MNTF1體內(nèi)施用于用手術切斷軸突的大鼠周圍神經(jīng)導致比未處理的對照明顯更高百分比的存活運動神經(jīng)元，這可以通過共施用抗MNTF1單克隆抗體來阻斷。
MNTF1的進一步有利效應在大鼠中得到證實，對大鼠實施脊髓半切除，通過周圍神經(jīng)自體移植修復，并且用包含MNTF1的凝膠段在緊密接近于脊髓與神經(jīng)移植物的結點處植入。MNTF1處理的動物顯示出更多數(shù)目的存活運動神經(jīng)元，運動和感覺功能的改善恢復，在移植位點處減少的炎癥應答(更少的浸潤巨噬細胞和淋巴細胞)和減少的包含膠原的瘢痕組織形成，正常的許旺細胞形態(tài)和正常的有髓鞘的和無髓鞘的神經(jīng)纖維形成。
MNTF在神經(jīng)變性疾病治療中的功效也在搖擺小鼠動物模型中得到證實。搖擺小鼠攜帶導致脊柱和腦干運動神經(jīng)元的進行性變性的常染色體雙隱性基因突變。在斜方肌和菱形肌與脊髓的C7-T3區(qū)域之間植入包含MNTF1的凝膠段延遲了搖擺小鼠中的癥狀進展，導致與對照組比較，生存期、健康、呼吸、體重、前肢力量以及其頸部運動神經(jīng) 元減少的空泡形成和染色質(zhì)溶解的總體改善。
看起來對于MNTF1的已知生物活性足夠的MNTFl-F6分子內(nèi)的2 個重疊結構域得到鑒定。參見，國際申請?zhí)朠CT/US04/01468或美國專利申請序列號10/541， 343。在本文中命名為"程LSAFS"和"FSRYAR" 結構域的這些結構域中的每一個足以刺激運動神經(jīng)元衍生的細胞系增殖，其方式類似于MNTF1-F6 33-聚體。類似地，"FSRYAR"結構域足以在體內(nèi)指導經(jīng)由運動神經(jīng)元的肌肉靶的選擇性神經(jīng)再支配，其方式類似于MNTFl-F6 33-聚體。此外，"FSRYAR"結構域提供了足以產(chǎn)生抗體的抗原表位，所述抗體識別包含"FSRYAR"序列的任何MNTF肽，包括MNTFl-F6 33-聚體。
明顯地，需要更有效和選擇性的方法以指導干細胞特別是ES細胞的增殖和分化，以產(chǎn)生運動神經(jīng)元的均質(zhì)群體。這不僅對于干細胞在
神經(jīng)變性病癥治療中的治療用途可能是重要的，而且還將極大地促進發(fā)育的分子機制研究。
發(fā)明概述
本文描述和要求保護的本發(fā)明具有許多屬性和實施方案，包括但不限于，在這個概述中闡述或描述或參考的那些。本文描述和要求保護的本發(fā)明不限于這個概述中鑒定的特征或實施方案，所述特征和實施方案被包括僅為了舉例說明的目的并且不是限制性的。
顯示成熟運動神經(jīng)元特有的分子標記的細胞。本發(fā)明提供了用于制備和表征適合于用于治療施用和藥物篩選用途的干細胞衍生的運動神經(jīng) 元的組合物、方法和系統(tǒng)。
本發(fā)明還提供了用于治療性干細胞應用或作為細胞培養(yǎng)基的包含
MNTF肽的組合物，所述細胞培養(yǎng)基適合于干細胞衍生的運動神經(jīng)元的分化和維持。關于干細胞的應用包括神經(jīng)元病癥的治療，例如運動功能的改善。
本發(fā)明包括治療神經(jīng)元病癥的方法。在某些實施方案中，這些方法包括給患者施用運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)肽或其類似物，以調(diào) 節(jié)信號途徑來改善或抑制神經(jīng)元病癥的進展。在這種方法的一個優(yōu)選實施方案中，MNTF肽是長度為6 - 35個氨基酸，長度為6 - 33個氨基酸，長度為33個氨基酸(例如SEQ ID NO: 1)，長度為6個氨基酸 (例如SEQ ID NO: 2),長度為7個氨基酸(例如SEQ ID NO: 3)，長度為10個氨基酸(例如SEQ ID NO: 4 )，長度為11個氨基酸(例如SEQ ID NO: 5)或另一種長度的MNTF類似物。在另一個方面，提供了包括施用這樣的肽的方法，所述肽與SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5或本文描述的另一種肽至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少 95%等同。
除了神經(jīng)元病癥的治療外，本發(fā)明進一步包括促進哺乳動物神經(jīng) 元的存活、生長、增殖或維持的方法。在另一個方面，MNTF或涯TF
類似物充當神經(jīng)保護劑。在另一個方面，MNTF或MNTF類似物調(diào)節(jié)細胞的特定分化途徑。在另一個方面，MNTF或MNTF類似物調(diào)節(jié)蛋白激酶途徑或調(diào)節(jié)酪氨酸激酶或生長因子受體的表達或活性。得到調(diào)節(jié)的信號轉導或蛋白激酶途徑可以包括，例如音猬非依賴性途徑，音猬依賴性途徑或這些的組合。
在某些優(yōu)選實施方案中，MNTF或MNTF類似物調(diào)節(jié)不依賴于音猬途徑的途徑。此類途徑一般不依賴于由音猬蛋白與補充受體的結合和猬依賴性信號轉導的相關促進所觸發(fā)的信號轉導事件。在其他實施方案中，MNTF或MNTF類似物調(diào)節(jié)至少部分不依賴于音猬途徑的途徑。此類途徑一般部分不依賴于由音猬蛋白與補充受體的所述結合和猬依賴性信號轉導的相關促進觸發(fā)的信號轉導事件。
盡管不希望被束縛于任何理論或機制，但認為本文提供的MNTF 或MNTF類似物能夠調(diào)節(jié)下述中的一種或多種的表達或活性胰島素受體、IGF-1受體、IGF-2受體、Shh、 Akt、 Bad (bcl-2的細胞死亡拮抗劑)、PI (3,4,5) P3依賴性激酶l (PDK1) 、 Bax、 p53基因產(chǎn)物、 pp60-Src、 JAK2、一氧化氮合酶(N0S )、糖原合酶激酶3 ( GSK )、半胱天冬酶、PI3激酶(磷脂酰肌醇3-激酶)和Ras。在某些實施方案中，MNTF或MNTF類似物調(diào)節(jié)與酪氨酸-磷酸化的IRS-蛋白質(zhì)(例如 IRS-1、 IRS-2、 IRS-3和IRS-4)結合的一種或多種蛋白質(zhì)的表達或活性。在其他實施方案中，下述中的一種或多種的表達或活性得到調(diào)節(jié) PI3激酶、p85、 PllO、 GRB2、 SHP2、 Nck、 Crk和Fyn。
存在可以通過本文提供的組合物和方法進行治療的幾種神經(jīng)元病癥和相關適應癥，所述組合物和方法促進神經(jīng)元的分化、維持或存活。被認為從本文提供的MNTF肽或MNTF類似物的施用獲益的病癥和適應癥包括，例如周圍神經(jīng)的再生、脊髓中的軸突再生、促進某些細胞的分化、靶神經(jīng)元細胞存活的增加、腦血流量的增加、脊髄損傷的治療、神經(jīng)變性疾病的治療、中風或腦缺血癥的治療、亨廷頓氏病的治療、帕金森氏病的治療、多發(fā)性硬化癥的治療、ALS的治療、阿爾茨海默氏的治療、糖尿病神經(jīng)病變的治療。本文提供的組合物和方法的另一
個有利特征是穿透血腦屏障的能力。這些神經(jīng)元病癥的治療在整體引
入本文作為參考的共同未決申請U. S.S.N.(待指定)中進一步描述，所述共同未決申請U. S.S.N.由Ko， Dorothy Tiu-Yak于2006年11月 IO曰提交，名稱為 "Methods of Treating Neuronal Disorders using MNTF peptides and analogues thereof"。本發(fā)明還提供了用于治療與神經(jīng)元病癥相關的病狀和病癥的組合物和方法。
此外，本發(fā)明提供了用于以干細胞衍生的運動神經(jīng)元再駐脊髓的方法和用于治療需要治療的受試者中的神經(jīng)組織變性的方法。
已發(fā)現(xiàn)當多能干細胞在選擇的分化試劑例如單獨或組合的RA和 MNTF肽類似物的存在下進行培養(yǎng)時，獲得含有非常高比例的具有運動神經(jīng)元特有表型的細胞的細胞群。任選地，通過根據(jù)對運動神經(jīng)元特異的分子標記給分化細胞分類可以增加神經(jīng)細胞的比例。因為某些類型的多能干細胞(例如胚胎干細胞)可以在培養(yǎng)中增殖一年或更久，
運動一中經(jīng)元。
本發(fā)明提供了用于誘導胚胎干細胞分化成干細胞后代(例如分化的運動神經(jīng)元)的方法。在一個實施方案中，第一個步驟是獲得或產(chǎn) 生胚胎干細胞的培養(yǎng)物。下一個步驟是使胚胎干細胞的培養(yǎng)物與有效產(chǎn)生神經(jīng)元后代細胞量的視黃酸和有效產(chǎn)生運動神經(jīng)元量的MNTF肽類似物接觸。在另一個實施方案中，本發(fā)明旨在使用MNTF或其類似物作為細胞培養(yǎng)中的生長補充物增強干細胞衍生的運動神經(jīng)元的存活。
本發(fā)明進一步提供了包含干細胞衍生的運動神經(jīng)元的細胞群及其用途。
本發(fā)明進一步指向用于分離干細胞衍生的運動神經(jīng)元的群體的方法。
還提供了將分化的神經(jīng)干細胞后代(例如運動神經(jīng)元)移植到宿主內(nèi)的材料和方法。根據(jù)一個實施方案的方法包括下述步驟i)獲得衍生自哺乳動物神經(jīng)組織(包含至少一種多潛能CNS神經(jīng)干細胞)的細胞群；U)在包含長度為6-35個氨基酸的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子
(MNTF)類似物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)神經(jīng)千細胞，所述MNTF類似物在合適的培養(yǎng)條件下誘導多潛能神經(jīng)干細胞增殖；iii)誘導所述多潛能神經(jīng) 干細胞增殖，以產(chǎn)生包括多潛能神經(jīng)干細胞后代細胞的神經(jīng)干細胞后代；和iv)將所述神經(jīng)干細胞后代移植給宿主。
附圖簡述
通過參考附圖可以更好地理解本發(fā)明及其由相關領域中的技術人員理解的優(yōu)點，其中

圖1顯示了測試的MNTF肽的氨基酸序列；
圖2比較了在運動神經(jīng)元特異性HB9啟動子的控制下，響應視黃酸(RA )、視黃酸和音猬(RA/Shh )、視黃酸和0. 1 ng/ml - 50 ng/ml 的MNTF10-聚體(SEQIDN0: 4) ( MNTF 10/0. 1 - 50 )以及0. 1 jjg/ml -50 ug/ml的MNTF 33-聚體(SEQ ID NO: 1) (MNTF 33/0.1 - 50 ) 的GFP熒光表達；
圖3比較了使用檢測IR或胰島素生長因子-1受體(IGF-1R)在 pTyr 1162/1163 ( 3B )處的自磷酸化的抗體，關于用MNTF 33聚體 (MNTF33， (SEQ ID NO: 1)或MNTF 33聚體和胰島素受體(IR)的非特異性抑制劑HNMPA(AM) 3處理的胚狀體的免疫印跡結果，其作為相對條帶強度進行描繪(3A);
圖4比較了用GDNF、 NT3、 dbcAMP或MNTF肽類似物處理的ES細胞衍生的運動神經(jīng)元的增加存活，其中存活力百分比在第IO天時通過計數(shù)具有現(xiàn)有軸突的細胞總數(shù)目進行計算；
圖5舉例說明了在運動神經(jīng)元特異性HB9啟動子的控制下在分化第5天時，響應對照(A) ， RA (B) ; M/Shh (C);環(huán)杷明-KAAD， RA/Shh ( D ) ; RA和MNTF 33聚體(SEQ ID NO: 1) ( E );環(huán)杷明-KAAD， RA和MNTF 33聚體(SEQ ID NO: 1) (F)的GFP熒光表達的比較；
圖6顯示了如由響應RA/Shh ( A) ; RA/MNTF33 ( B) ; RA/MNTFIO (C ) ; HNMPA ( AM) 3 ( 15yM) /Shh ( D );匪PA ( AM) 3/MNTF33 ( E ); HNMPA (AM) 3/MNTF10 (F) ; PPP (l|jM) ， RA/Shh (G) ; PPP ( lyM)， RA/MNTF33 ( H) ; PPP ( lyM) ， RA/MNTFIO ( I)的第5天胚狀體的GFP
熒光表達指出的，IGF1-R抑制劑picrodophyllin不能有效地阻斷MNTF
誘導分化的活性；
圖7舉例說明了使用針對PI3激酶的p85亞單位的抗體的蛋白質(zhì) 印跡，所述PI3激酶來自用IGF-l( 10nM)(泳道1 )、 Insul in( 100nM ) (泳道2 ) 、 MNTF6 (泳道3 ) 、 MNTF 10 (泳道4 )和MNTF33 (泳道5 ) 處理5分鐘的細胞的ES細胞裂解物。隨后使裂解物與蛋白A珠和抗 IRS-1抗體一起溫育。免疫復合物通過SDS-PAGE (10% )分開，轉移至膜，并且通過蛋白質(zhì)印跡使用針對PI3激酶的p85亞單位的抗體進行分析。
圖8舉例說明了關于MNTF誘導的ES細胞分化的可能途徑。
詳述
定義
在一般而言和就各種非限制性具體實施方案而言進一步描述本發(fā) 明之前，闡述在本發(fā)明描述背景下使用的某些術語。除非另有說明，當在本文和附加權利要求中使用時，下述術語具有下述含義。下文或說明書其他地方中未限定的那些術語應具有其公認含義。
在本文提供的化合物(例如肽和蛋白質(zhì))中使用的氨基酸可以是遺傳編碼的氨基酸，天然存在的非遺傳編碼的氨基酸，或合成氨基酸。上述任何一種的L和D對映體都可以在化合物中使用。下述縮寫可以在本文中用于下述遺傳編碼的氨基酸(及其殘基)丙氨酸(Ala， A); 精氨酸(Arg， R);天冬酰胺(Asn， N);天冬氨酸(Asp， D);半胱氨酸(Cys， C).;甘氨酸(Gly， G);谷氨酸(Glu， E);谷氨酰胺(Gln, Q);組氨酸(His, H);異亮氨酸(Ile, I);亮氨酸(Leu, L);賴氨酸(Lys， K);曱硫氨酸(Met， M);苯丙氨酸(Phe， F); 脯氨酸(Pro， P);絲氨酸(Ser， S);蘇氨酸(Thr， T);色氨酸 (Trp， W);酪氨酸(Tyr， Y);和纈氨酸(Val， V)。
并非遺傳編碼的并且存在于本發(fā)明的化合物中的某些常見氨基酸包括但不限于，p-丙氨酸(b-Ala)和其他w-氨基酸例如3-氨基丙酸(Dap) ， 2，3-二氨基丙酸(Dpr， Z) , 4-氨基丁酸等；a-氨基異
丁酸(Aib); e-氨基己酸(Aha); 5-氨基戊酸(Ava );甲基甘氨酸(MeGly);鳥氨酸(0rn);瓜氨酸(Cit);叔丁基丙氨酸(t-BuA ); 叔丁基甘氨酸(t-BuG); N-曱基異亮氨酸(Melle);苯基甘氨酸(Phg); 環(huán)己基丙氨酸(Cha);正亮氨酸(Nle， J); 2-萘基丙氨酸(2-Nal ); 4-氯苯丙氨酸(Phe (4-CI) ) ; 2-氟苯丙氨酸(Phe (2-F) ) ; 3-氟苯丙氨酸(Phe ( 3-F) ); 4-氟苯丙氨酸(Phe ( 4-F ));青霉胺
(Pen ); 1， 2， 3, 4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic ); P . -2-噻吩丙氨酸(Thi ); 甲硫氨酸亞砜(MSO);高精氨酸(hArg); N-乙酰賴氨酸(AcLys ); 2，3-二氨基丁酸(Dab) ; 2， 3-二氨基丁酸(Dbu ) ; p-氨基苯丙氨酸
(Phe(pNH2)); N-甲基纈氨酸(MeVal );高半胱氨酸(hCys); 3-苯并噻唑-2-基-丙氨酸(BztAla， B); 和高絲氨酸(hSer )。考慮的另外的氨基酸類似物包括磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸、磷酸酪氨酸、羥脯氨酸、y-羧基谷氨酸鹽、馬尿酸、八氫吲哚-2-羧酸、statine、 oc-甲基丙氨酸、對苯曱酰苯丙氨酸、炔丙基甘氨酸和肌氨酸。包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的肽可以具有L或D構型的任何前述氨基酸，或本文描述或本領域已知的任何其他氨基酸，無論是目前還是未來的。
可互相替代的氨基酸一般位于相似的種類或亞類內(nèi)。如本領域技術人員已知的，主要取決于氨基酸側鏈的化學和物理性質(zhì)，可以將氨基酸置于不同的種類內(nèi)。例如，某些氨基酸一般被視為親水性或極性氨基酸，和其他的被視為疏水性或非極性氨基酸。極性氨基酸包括具有酸性、堿性或親水性側鏈的氨基酸，和非極性氨基酸包括具有芳香族或疏水性側鏈的氨基酸。非極性氨基酸可以進一步再分成尤其包括脂肪族氨基酸。如本文所使用的，氨基酸種類的定義如下
"非極性氨基酸，，指具有在生理pH下不帶電，非極性和一般被水溶液排斥的側鏈的氨基酸。遺傳編碼的疏水性氨基酸的例子包括Ala、 Ile、 Leu、 Met、 Trp、 Tyr和Val。非遺傳編碼的非極性氨基酸的例子包括t-BuA、 Cha和Nle。
"芳香族氨基酸"指具有這樣的側鏈的非極性氨基酸，所述側鏈包含至少一個具有綴合的TT-電子系統(tǒng)(芳香族基團)的環(huán)。芳香族基
團可以進一步替換為取代基例如烷基、烯基、炔基、羥基、磺?；?、
硝基和氨基以及其他。遺傳編碼的芳香族氨基酸的例子包括苯丙氨酸、
酪氨酸和色氨酸。常見的非遺傳編碼的芳香族氨基酸包括苯基甘氳酸、
2-萘基丙氨酸、P -2-噻吩丙氨酸、3-苯并噻唑-2-基-丙氨酸、1， 2， 3， 4-四氫異喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸和 4-氟苯丙氨酸。
"脂肪族氨基酸"指具有飽和或未飽和的直鏈、分支或環(huán)狀烴側鏈的非極性氨基酸。遺傳編碼的芳香族氨基酸的例子包括Ala、 Leu、 Val和Ile。非編碼的芳香族氨基酸的例子包括Nle。
"極性氨基酸"指具有這樣的側鏈的親水性氨基酸，所述側鏈在生理pH下是帶電的或不帶電的，并且具有其中由2個原子共同分享的電子對通過原子之一保持更緊密的鍵。極性氨基酸一般是親水性的，意指它們具有由水溶液吸引的側鏈的氨基酸。遺傳編碼的極性氨基酸的例子包括天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸和絲氨酸。非遺傳編碼的極性氨基酸的例子包括瓜氨酸、高半胱氨酸、N-乙酰賴氨酸和曱石克氨酸亞砜。
"酸性氨基酸"指具有小于7的側鏈pK值的親水性氨基酸。由于氫離子的喪失，酸性氨基酸在生理pH下一般具有帶負電的側鏈。遺傳編碼的酸性氨基酸的例子包括天冬氨酸(天冬氨酸鹽)和谷氨酸(谷氨酸鹽)。
"堿性氨基酸"指具有大于7的側鏈pK值的親水性氨基酸。由于水合氫離子的喪失，堿性氨基酸在生理pH下一般具有帶正電的側鏈。遺傳編碼的堿性氨基酸的例子包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。非遺傳編碼的堿性氨基酸的例子包括鳥氨酸、2,3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。
"可電離的氨基酸"指在生理pH下可以帶電的氨基酸。此類可電離的氨基酸包括酸性和堿性氨基酸，例如。-天冬氨酸、。-谷氨酸、d-
組氨酸、d-精氨酸、d-賴氨酸、d-羥賴氨酸、d-鳥氨酸、廣天冬氨酸、 l-谷氨酸、f組氨酸、i"精氨酸、l-賴氨酸、廣羥賴氨酸或l-鳥氨酸。
如本領域技術人員應當理解的，上文分類法不是絕對的。幾種氨基酸顯示出超過一種的特征性質(zhì)，并且因此可以包括在超過一種的類別中。例如，酪氨酸具有非極性芳香族環(huán)和極性羥基。因此，酪氨酸具有可以被描述為非極性、芳香族和極性的幾個特征。然而，非極性環(huán)是占優(yōu)勢的并且因此酪氨酸一般被視為非極性的。類似地，除了能夠形成二硫鍵外，半胱氨酸也具有非極性特性。因此，盡管沒有嚴格分類為疏水性或非極性氨基酸，但在許多情況下半胱氨酸可以用于給肽賦予疏水性或非極性。
在某些實施方案中，由本發(fā)明考慮的極性氛基酸包括，例如，精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氛酸、谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、高半胱氨酸、賴氨酸、羥賴氨酸、鳥氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和結構上相關的氨基酸。在一個實施方案中，極性氨基酸是可電離的氨基酸，例如精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、羥賴氨酸、賴氨酸或鳥氨酸。
可以利用的極性或非極性氨基酸殘基的例子包括例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、曱硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等。如本文所使用的，術語"生物活性肽"和"生物活性片段，，指依
照上文描述的運動神經(jīng)元分化因子(MNDF)或運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子 (MNTF)的肽或多肽，其中MNDF使干細胞分化成運動神經(jīng)元，和MNTF 顯示出對干細胞衍生的運動神經(jīng)元的保護或增殖效應。
"細胞"意指適合于所需應用的任何活細胞。細胞包括真核和原核細胞。
術語"互補的" 一般指例如在允許的鹽和溫度條件下，經(jīng)由堿基配對的多核苷酸的天然結合。例如，序列"A-G-T，，與互補序列"T-C-A" 結合。2個單鏈分子之間的互補性可以是"部分的"，從而使得只有某些核酸結合，或它可以是"完全的"，從而使得總體互補性存在于單鏈分子之間。核酸分子之間的互補性程度對它們之間的*交效率和強度具有顯著影響。"可雜交的"和"互補的"是這樣的術語，其用于指出互補性的足夠程度，從而使得足以執(zhí)行預期作用的結合優(yōu)選地
穩(wěn)定的結合例如在核酸之間發(fā)生。應當理解寡核苷酸無需與其可雜交
的靶核酸序列100%互補。
術語"組合物"預期包含含有一種或多種成分的產(chǎn)物。術語"分化的"是相對術語，其中"分化細胞"是比待針對比較的細胞已沿著發(fā)育途徑進一步進展的細胞。如本文進一步所使用的，
"分化的神經(jīng)細胞" 一般指中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS )或周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS ) 的部分分化或完全分化的細胞。祖細胞是在發(fā)育和分化期間通過一系列細胞分裂產(chǎn)生不同的細胞譜系的母細胞。例如，神經(jīng)祖細胞:故定型為最終將發(fā)育成CNS或PNS的完全分化的神經(jīng)細胞的細胞譜系；然而，此類神經(jīng)祖細胞可能尚未獻身于特定類型，或亞類的神經(jīng)細胞。神經(jīng) 祖細胞可能變得定型為這樣的細胞系，其將分化成特定類型的神經(jīng)細胞，并且其后產(chǎn)生完全分化的神經(jīng)細胞。因此，本發(fā)明的部分分化的神經(jīng)細胞可以是具有神經(jīng)標識的細胞，其已獲得定向或定位特性，或已定型為發(fā)育成特定種類的神經(jīng)細胞，但并非完全分化的神經(jīng)細胞。例如，依照本發(fā)明用單獨或與成形素例如RA組合的MNTF肽處理ES 細胞可以產(chǎn)生部分分化的神經(jīng)細胞或神經(jīng)祖細胞。
"病癥"是將從使用本發(fā)明的分子或組合物的治療中獲益的任何病狀，包括本文描述或要求保護的那些。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括使哺乳動物易患所述病癥的那些病理學條件。
"飼養(yǎng)細胞"或"飼養(yǎng)物"包括一種類型的細胞，其與另一種類型的細胞共培養(yǎng)，一般用于提供其中第二種類型的細胞可以生長的環(huán) 境。例如，某些類型的pPS細胞可以由原代小鼠胚胎成纖維細胞、永生化小鼠胚胎成纖維細胞、或由hES細胞分化的人成纖維細胞樣細胞得到支持。
"功能等價物"意指具有基本上類似于M LSAFSRYAR結構域的那種的生物活性的肽，并且預期包括具有此類活性或特征的"片段，，、"變體"、"類似物"、"同系物"或"化學衍生物"。MLS A F S R Y A R結構域的功能等價物隨后可以不共享相同的氨基酸序列，并且常規(guī)或非常規(guī)氨基酸的保守或非保守的氨基酸置換是可能的。
術語"基因產(chǎn)物"指由基因轉錄的RNA分子，或由基因編碼或由 RNA翻譯的多肽。
"生長環(huán)境，，是其中目的細胞在合適的條件下可以在體外增殖、分化或成熟的環(huán)境。此類條件可以包括例如，其中細胞進行培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以存在的任何生長因子或分化誘導因子，和固體表面或支持結構。
如本文所使用的，術語"MLSAFSRYAR結構域"指在本文中證實足以使干細胞分化成運動神經(jīng)元的多肽結構域，并且指能夠模擬其結構和/或功能的肽和/或分子。本發(fā)明的優(yōu)選形式利用包含氨基酸序列MLSAFSRYA R的肽，及其功能等價物。
如本文所使用的，各種形式的術語"調(diào)節(jié)劑"和"調(diào)節(jié)"預期包含特定靶的表達或作用或活性的全部或部分抑制。
如本文所使用的，"運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子，，包括涉及運動神經(jīng)元的營養(yǎng)或維持的那些因子。術語"運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子"、"MNTF"、 "MNTF肽"、"運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子類似物"和"MNTF類似物"可以互換使用，只要它們具有本文限定的功能特性。運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子可以促進定型的神經(jīng)祖細胞的發(fā)育和分化，或者它們可以誘導或增強分化的神經(jīng)細胞的生長(例如神經(jīng)突長出)和存活。本發(fā)明的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子一般以有效產(chǎn)生CNS或PNS的完全分化的神經(jīng)細胞(例如，運動神經(jīng)元)的量提供。關于量的指導在本文中提供，并且可以
由技術人員基于已知操作和本文公開的方法容易地確定。
為了本公開內(nèi)容的目的，術語"神經(jīng)祖細胞"或"神經(jīng)前體細胞"
包括可以產(chǎn)生這樣的后代的細胞，所述后代是神經(jīng)元細胞(例如，神經(jīng)元前體或成熟神經(jīng)元)或膠質(zhì)細胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)前體、成熟星形膠質(zhì)細胞或成熟少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞)。細胞一般表達具有神經(jīng)譜系特征的某些表型標記，并且當在體外單獨進行培養(yǎng)時，它們一般不產(chǎn)生其他胚胎胚層的后代。
"神經(jīng)元祖細胞"或"神經(jīng)元前體細胞，，包括可以產(chǎn)生這樣的后代的細胞，所述后代是成熟神經(jīng)元并且有時還具有產(chǎn)生膠質(zhì)細胞的能
力。
"多潛能神經(jīng)祖細胞群"包括具有產(chǎn)生這樣的后代的能力的細胞群，所述后代是神經(jīng)元細胞，是膠質(zhì)細胞，并且有時是其他類型的細
胞。這個術語不要求群體內(nèi)的個別細胞具有形成2種類型的后代的能力，盡管可以存在是多潛能神經(jīng)前體的個別細胞。
術語"擬肽"和"模擬物"包括可以基本上具有它們模擬的蛋白質(zhì)區(qū)域相同的結構和功能特征的天然存在和合成的化學化合物。
具有類似于模板肽的那些的性質(zhì)的肽類似物可以是非肽藥物。"肽模擬物"或"擬肽"包括基于肽的化合物，還包括此類基于非肽的化合物(Fauchere, /. / rw《15: 29 ( 1986 ) ; Veber和
Freidinger; 77#《392 ( 1985 );和Evans等人，/. #e(/. 30: 1229 ( 1987 ) ; Beeley N. , 7>e/7ds ^/ofec力/7( /. Jun; 12 (6): 213—6 ( 1994 ); Kieber—Emmons T，等人；Cwrr O; /" "/ofec力/20厶Aug; 8 ( 4 ): 435-41 ( 1997 )。在結構上類似于治療上有用的肽的肽模擬物可以用于產(chǎn)生等價的或增強的治療或預防效果。一般而言，擬肽在結構上等同或類似于示例多肽(即，具有生物或藥理學功能或活性的多肽)，但還可以具有任選地被選自下述的鍵替換的一個或多個肽鍵例如，-CH2NH-、 -CH2S-、 -CH-CH「、 -CH=CH-(順式和反式)、-COCH廣、 -CH(0H) CH廠和-CH2S0-。模擬物可以完全由天然氨基酸或氨基酸的非天然類似物組成，或者是部分天然的肽氨基酸和部分氨基酸的非天然類似物的嵌合分子。模擬物還可以包含任何量的天然氨基酸的保守置換，只要此類置換同樣基本上不改變模擬物活性。
短語"同一性百分比(％ )"指在2個或更多序列的比較中發(fā)現(xiàn) 的序列相似性百分比。同一性百分比可以例如使用任何合適的軟件電子地進行測定。同樣地，2個序列(或它們中的任一或兩者的一個或多個部分)之間的"相似性"通過比較一個序列的序列與第二個序列進行測定。
組合物或制劑的"藥學上可接受的"化合物和其他成分，例如載體、稀釋劑或賦形劑是適合于給其受體施用的那些。
一般而言，術語"蛋白質(zhì)"指經(jīng)由肽鍵連接的2個或更多單個氨基酸(無論是不是天然存在的)的任何聚合物，如在下述情況下發(fā)生的一樣，當與l個氨基酸(或氨基酸殘基)的ot-碳鍵合的羧酸基團的羧基碳原子變得和與鄰近氨基酸的cx-碳鍵合的氨基的氨基氣原子共價結合時。這些肽鍵連接，和包含其的原子(即，oc-碳原子、羧基碳原子(及其取代氧原子)，和氨基氮原子(及其取代氫原子)形成蛋白質(zhì)的"多肽主鏈"。此外，如本文所使用的，術語"蛋白質(zhì)"應當理解為包括術語"多肽，，和"肽，，(它們有時可以在本文中互換使用)。類似地，蛋白質(zhì)片段、類似物、衍生物和變體在本文中可以被稱為"蛋白質(zhì)"，并且除非另有說明應被視為"蛋白質(zhì)"。術語蛋白質(zhì)的"片段"指包含少于蛋白質(zhì)的所有氨基酸殘基的多肽。蛋白質(zhì)的"結構域" 也是片段，并且包含通常是賦予活性或功能所需的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基。
術語"嚴格條件"指允許多核苷酸之間雜交的條件。嚴格條件可以由鹽濃度、有機溶劑(例如，曱酰胺)的濃度、溫度和本領域眾所周知的其他條件進行限定。通過減少鹽的濃度、增加有機溶劑(例如，曱酰胺)的濃度、或提高雜交溫度可以增加嚴格性。例如，嚴格鹽濃度通常將小于約750 mMNaCl和75mM檸檬酸三鈉，優(yōu)選地小于約500 mMNaCl和50mM檸檬酸三鈉，和最優(yōu)選地小于約250 mMNaCl和25 mM 檸檬酸三鈉。低嚴格性雜交可以在不存在有機溶劑例如甲酰胺的情況下獲得，而高嚴格性雜交可以在有機溶劑(例如，至少約35%甲酰胺，最優(yōu)選地至少約50%甲酰胺)的存在下獲得。嚴格溫度條件通常將包括至少約30X:，更優(yōu)選地至少約37TC,和最優(yōu)選地至少約421C的溫度。各種附加參數(shù)，例如，雜交時間，去污劑例如十二烷基硫酸鈉(SDS ) 的濃度，以及載體DNA的包括或排除，是本領域技術人員眾所周知的。
各種水平的嚴格性通過使這些各種條件根據(jù)需要進行組合來完成，并且在本領域的技術內(nèi)。嚴格雜交條件還可以由低于乾序列的解鏈溫度 (Tm)約5"C -約20'C或25C中的條件，以及與靶具有精確或接近精確的互補性的探針來限定。如本文所使用的，解鏈溫度是在其下雙鏈
核酸分子群體變得半解離成單鏈的溫度。用于計算核酸的Tm的方法是本^頁i戈眾戶斤周^口的(參見，例^口， Berger和Kimmel， Methods In Enzymology，第152巻6^2'de v)/o/ecw/ar C7o/2/./7g 7^c力/7/力i/e5s San Diego( 1987 ): Academic Press, Inc.和Sambrook等人，Molecular Cloning ( 1989 ) : A Laboratory Manual,第2版，第1-3巻，Cold Spring Harbor Laboratory)。如由標準參考文獻指出的，Tm值的簡單估計可以通過下式進行計算Tm = 81. 5 + 0. 41 ( %G + C)，當核酸在1 M NaCl的水溶液中時(參見例如，Anderson和Young,
"Quantitative Filter Hybridization ，， in Nucleic Acid Hybridization ( 1985 ))。雜合體的解離溫度(和因此關于嚴格雜交的條件)受到各種因素的影響，例如探針的長度和性質(zhì)(DNA、 RNA、堿基組成)和靶的性質(zhì)(DM、 RNA、堿基組成、存在于溶液中或固定的等)，以及鹽和其他組分(例如，曱酰胺的存在或不存在，硫酸葡聚糖、聚乙二醇)的濃度。這些因素的效應是眾所周知的并且在本領域的標準參考文獻中得到討論，參見，例如，Sambrook,同上，和 Ausubel，同上。一般地，嚴格雜交條件是在pH 7.0-8.3下小于約 1.0 M鈉離子、一般約0.01-1.0 M鈉離子的鹽濃度，和對于短探針
(例如，10-50個核苷酸)至少約30x:和對于長探針(例如，大于 50個核苷酸)至少約60"C的溫度。如指出的，嚴格條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來達到，在這種情況下可以使用較低的溫度。在本發(fā)明中，多核苷酸可以是在中至高嚴格性的條件下與靶mRM雜交的多核苷酸，所述條件例如0. 03M氯化鈉和0. 03M檸檬酸鈉在約50 -約60攝氏度下。
如本文所使用的，"受試者"指分類為哺乳動物的任何動物，包括人、馴養(yǎng)和農(nóng)場動物、和動物園、運動或寵物動物，例如，犬、馬、貓、綿羊、豬、牛等。優(yōu)選受試者是人。
術語"治療有效量"意指將引發(fā)所需應答的受試化合物的量，所述所需應答例如由例如研究者、獸醫(yī)、醫(yī)師或其他臨床醫(yī)生尋求的組織、系統(tǒng)、動物或人的生物學或醫(yī)學應答。
"處理"指治療處理和預防性或預防措施。需要處理的那些包括已具有病癥的那些以及其中待預防病癥的那些。
術語"載體"指用于將核酸遞送給細胞的質(zhì)粒、噬菌體、病毒或其他系統(tǒng)(它是天然存在或合成的)形式的核酸分子擴增、復制和/ 或表達媒介物，其中質(zhì)粒、噬菌體或病毒可以與細菌、酵母、無脊推動物和/或哺乳動物宿主細胞一起發(fā)揮作用。載體可以保持獨立于宿主
細胞基因組DNA或可以與基因組DNA全部或部分整合。載體一般將包含但不必包含所有必需元件，以便在它與之相容的任何宿主細胞中起作用。"表達載體"是在合適的條件下能夠指導外源多核苷酸，例如編碼結合結構域融合蛋白的多核苷酸表達的載體。
如本文所描述的，術語"同源性和同系物"包括可以是目的多核苷酸(例如mRNA)中的序列的同系物的多核苷酸。此類多核苷酸一般與相關序列具有至少約70%的同源性，優(yōu)選地至少約80%、 90%、 95 %、 97%或99%的同源性，例如在至少約15、 20、 30、 40、 50、 100 或更多鄰接核苷酸(同源序列的)的區(qū)域上。
同源性可以基于本領域的任何方法進行計算。例如UWGCG Package 提供了 BESTFIT程序，其可以用于計算同源性(例如以其缺省設置使用)(Devereux等人，Nucleic Acids Research 12，第387-395頁
(1984 ) ) 。 PILEUP和BLAST算法可以用于計算同源性或排列序列(一般以其缺省設置)，例如，如Altschul S. F.; / iVo/ 36: 290-300 ( 1993 ); Altschul， S. F.等人;215: 403-10
(1990 )中所述。用于執(zhí)行BLAST分析的軟件是可通過美國國立生物信息中心(http: 〃www. ncbi, nlm. nih. gov/L)公開獲得的。這種算法包括首先通過鑒定查詢序列中長度W的短字來鑒定高得分序列對，當與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字比對時，所述短字匹配或滿足某些正值閾值得分T。 T被稱為鄰近字得分閾值(Altschul等人，同上)。這些起始鄰近字命中充當種子用于起始搜索以找到包含其的HSPs。字命中沿著每個序列在2個方向上進行延伸直至累積比對得分可以得到增加。關于字命中在每個方向上的延伸在下述情況下停止累積比對
得分與其達到的最大值減少量X;由于一個或多個負得分殘基比對的積累，累積得分變成零或以下；或達到任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、 T和X決定比對的敏感性和速度。BLAST程序使用字長(W) 11、BLOSUM62評分矩P車(參見Henikoff和Henikoff P薦.#a〃.
USA 89: 10915-10919 ( 1992 ))比對(B) 50、期望值(E) 10、 M=5、 N=4和2條鏈的比較作為缺省值。
BLAST算法執(zhí)行2個序列之間的相似性的統(tǒng)計分析；參見，例如， Karlin和Altschul尸roc. iVaW. Jcad. USA 90: 5873-5787
(1993 )。由BLAST算法提供的一種相似性測量是最小總和概率(P (N))，其提供了 2個核苷酸或氨基酸序列之間的匹配將偶然發(fā)生的概率指示。例如，如果在第一個序列的比較中最小總和概率小于約1、優(yōu)選地小于約0. 1、更優(yōu)選地小于約0. 01、和最優(yōu)選地小于約0. 001，那么序列被視為與另一個序列類似。
同源序列一般通過至少(或通過不超過)約1個、2個、5個、10 個、15個或20個或更多突變(它可以是置換、刪除或插入)不同于相關序列。這些突變可以在上文提及的任何區(qū)域上相對于計算的同源性進行測量。同源序列一般在顯著超過背景的水平上與原始序列選擇性雜交。選擇性雜交一般使用中至高嚴格性(例如0. 03M氯化鈉和 0. 03M檸檬酸鈉在約50。C-約60。C下)的條件達到。然而，此類雜交可以在本領域已知的任何合適的條件下進行(參見Sambrook等人， Molecular Cloning: A Laboratory Manual ( 1989 ))。例如，如果需要高嚴格性，那么合適的條件包括0.2 x SSC在60X:下。如果需要低嚴格性，那么合適的條件包括2 x SSC在60t:下。
術語"重組"指在體外合成或以其他方式處理的多核苷酸(例如， "重組多核苷酸")，指使用重組多核苷酸在細胞或其他生物系統(tǒng)中生產(chǎn)基因產(chǎn)物的方法，或指由重組多核苷酸編碼的多肽("重組蛋白質(zhì)")。因此，"重組"多核苷酸由其生產(chǎn)方法或其結構來限定。關于其生產(chǎn)方法，該過程指重組核酸技術的使用，例如，涉及核苷酸序列中的人為干預，一般為選擇或生產(chǎn)。備選地，它可以是通過產(chǎn)生包
含2個或更多片段的融合物的序列制備的多核苷酸，所述片段并非天然地彼此鄰接。因此，包含了例如通過用任何非天然存在的載體轉化細胞制備的產(chǎn)物，如包含使用任何合成寡核苷酸方法衍生的序列的多核苷酸。類似地，"重組"多肽是由重組多核苷酸表達的多肽。
"重組宿主細胞"是包含栽體例如克隆栽體或表達栽體的細胞，或已通過重組技術在其他方面進行處理以表達目的蛋白質(zhì)的細胞。 I.概述
來自大鼠肌肉組織的2種運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF1和MNTF2) 的分離和表征以及衍生自人一見網(wǎng)膜母細胞瘤cDNA文庫的重組 MNTF1-F6基因的隨后克隆在美國專利號6, 309, 877、 6, 759, 389和 6, 841, 531 (以及共同未決的美國專利申請序列號10/858, 144 、 10/858, 286、 10/858, 543和10/858,545 )中得到描述；所述所有專利在此整體引入作為參考。MNTF1-F6基因序列編碼在其中被稱為SEQ ID NO: 4的33個氨基酸的序列。如國際申請?zhí)朠CT/US2004/038651 中所述，發(fā)現(xiàn)編碼MNTF1多肽的核苷酸序列位于人染色體16q22內(nèi)，所述專利在此整體引入作為參考。
看起來對于MNTF1的已知生物活性足夠的MNTF1-F6分子內(nèi)的2 個重疊結構域得到鑒定。參見，國際申請?zhí)朠CT/US04/01468或美國專利申請序列號10/541, 343，所述專利在此整體引入作為參考。在本文中命名為"WMLSAFS"和"FSRYAR"結構域的這些結構域中的每一個足以刺激運動神經(jīng)元衍生的細胞系增殖，其方式類似于MNTF1-F6 33-聚體。類似地，"FSRYAR"結構域足以在體內(nèi)指導經(jīng)由運動神經(jīng)元的肌肉靶的選擇性神經(jīng)再支配，其方式類似于MNTF1-F6 33-聚體。此外， "FSRYAR，，結構域提供了足以產(chǎn)生抗體的抗原表位，所述抗體識別包含"FSRYAR"序列的任何MNTF肽，包括MNTF1-F6 33-聚體。
運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)在人胎兒妊娠期中笫9周時在表達中達到峰值(Di， X.等人，Acta Anatomica Sinica 29: 86-89， 1998 )。基于MNTF在發(fā)育中的人中的表達，推斷MNTF可能促進運動神經(jīng)元的分化和/或存活。為了檢查這點，確定MNTF是否調(diào)節(jié)多能胚胎干細胞
分化成運動神經(jīng)元并且是否增強ES細胞衍生的運動神經(jīng)元的存活。如本文公開的，本發(fā)明人已確定ES細胞暴露于RA和MNTF類似物
指導這些細胞產(chǎn)生運動神經(jīng)元。 II.使用方法
包括但不限于包含MLSAFSRYAR結構域的那些的MNTF和截短的 MNTF分子，所述MLSAFSRYAR結構域在本文中被稱為運動神經(jīng)元分化因子(MDNF),在本文中被證實誘導干細胞或部分分化的神經(jīng)元細胞分化成運動神經(jīng)元。此類試劑提供了用于從干細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生和/或分離運動神經(jīng)元群體的新方法。
本發(fā)明的方法包括使胚胎干細胞與視黃酸(RA)和運動神經(jīng)元分化因子(MNDF)接觸。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，使胚胎干細胞與RA連同運動神經(jīng)元分化因子接觸。備選地，該方法包括使部分分化的神經(jīng)元細胞與運動神經(jīng)元分化因子接觸。因子以有效產(chǎn)生分化的神經(jīng)細胞的量提供。這些量可以由技術人員基于已知操作和本文公開的方法容易地確定。
MNTF1和/或其肽類似物還在體外促進哺乳動物運動神經(jīng)元的存活。因此，本發(fā)明提供了 MNTF肽類似物作為關于神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物的生長因子/補充物的用途，包括通過在體外用有效量的匪TF肽類似物培養(yǎng)干細胞衍生的神經(jīng)元細胞，用于促進干細胞衍生的神經(jīng)元細胞系的存活的方法。
本發(fā)明人也已發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)營養(yǎng)因子的存在下培養(yǎng)的神經(jīng)元存活并產(chǎn)生突起。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括使干細胞衍生的運動神經(jīng)元與至少一種MNTF肽類似物接觸，例如，在與RA和運動神經(jīng)元分化因子例如如本文所描述的MNTF肽類似物或備選地音猬(Shh )接觸后，所述音猬包括Shh激動劑。
分化的運動神經(jīng)元可以例如通過FACS分選進行分離或富集。例如基于GFP的運動神經(jīng)元標記方法的使用允許表征ES細胞衍生的運動神經(jīng)元的純?nèi)后w。已使用這種方案用于從來自胚狀體的細胞混合群體中分離細胞的純運動神經(jīng)元群體。使用膠原酶和分散酶使胚狀體分解成單細胞。這些單細胞隨后對于GFP進行FACS分選，因為由HB9啟動子控制表達GFP的細胞是群體中真正的運動神經(jīng)元。
因此，本發(fā)明的另一個方面指向通過下述用于分離和/或純化分化的神經(jīng)細胞群的方法(a )獲得或產(chǎn)生在運動神經(jīng)元特異性啟動子的控制下表達增強型綠色熒光蛋白(eGFP)的胚胎干細胞培養(yǎng)物；(b) 使胚胎干細胞的培養(yǎng)物與有效產(chǎn)生表達eGFP的分化的神經(jīng)細胞的量的RA和MNTF接觸；(d )檢測分化的神經(jīng)細胞中的eGFP表達；和(f) 分離表達eGFP的分化的神經(jīng)細胞。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)由于其促進哺乳動物神經(jīng)元的存活、生長、增殖和/或維持的能力，MNTF和某些MNTF類似物對于治療神經(jīng)元病癥是有用的。本發(fā)明人已進一步發(fā)現(xiàn)根據(jù)某些實施方案，MNTF肽或MNTF類似物調(diào)節(jié)不依賴于音猬途徑(例如取決于實施方案，部分或完全不依賴)的信號轉導途徑。同樣地，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)MNTF肽和MNTF類似物調(diào)節(jié)某些蛋白激酶途徑，包括某些酪氨酸激酶和生長因子受體的表達或活性。得到調(diào)節(jié)的信號轉導或蛋白激酶途徑包括例如，音猬非依賴性途徑。
音猬(Shh)是負責尾部化的(caudalized)神經(jīng)元腹部化 (ventralization )的關鍵組分，經(jīng)由其跨膜受體組分 /7^cAedi邁oo^e/2ecr發(fā)揮作用。本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示，在視黃酸的存在下鼠類ES細胞在體外分化成運動神經(jīng)元方面，匪TF肽有效代替音猬(實施例5 )。給這些ES培養(yǎng)物添加MNTF導致成熟運動神經(jīng)元轉錄因子(HB9和Islet 1/2)的表達、成熟運動神經(jīng)元標記膽堿乙酰轉移酶(ChAT)的表達、和能夠傳導動作電位的神經(jīng)元的產(chǎn)生。數(shù)據(jù)還顯示在《邁oo^e力eif受體信號的特異性抑制劑(環(huán)杷明-KAAD)的存在下，匪TF肽能夠產(chǎn)生有絲分裂后的成熟運動神經(jīng)元。盡管不希望被束縛于任何具體理論或機制，但本發(fā)明人認為數(shù)據(jù)顯示MNTF通過與Shh 或^700Me/2e(/的下游不同的途徑發(fā)信號。基于本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)，本發(fā) 明人已進一步確定MNTF肽通過本文描述的信號轉導途徑發(fā)揮作用，以促進哺乳動物神經(jīng)元的存活、生長、增殖和/或維持。因此，在本發(fā)明
的另一個方面，施用MNTF因子或MNTF類似物以調(diào)節(jié)某些信號轉導組分的表達或活性。我們的數(shù)據(jù)進一步證實ES細胞的MNTF處理導致胰島素受體(IR)的Tyr972和Tyrl162/1163的自磷酸化(實施例5 )。這些殘基是IR活化的標記。此外，免疫共沉淀研究顯示由于對于ES 細胞的MNTF處理，特異性SH2結構域與IR (關于PI3激酶的p85亞單位)的結合。實施例5還顯示阻斷IGF-1R對MNTF產(chǎn)生運動神經(jīng)元的能力沒有影響，但阻斷IR消除了這種能力。
在某些實施方案中，響應給患者或給靶器官、組織或細胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，胰島素受體底物蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)。胰島素受體底物蛋白質(zhì)(IRS-蛋白質(zhì))是胰島素和 IGF起始信號的效應子。它們共享在其N末端附近的PH和PTB結構域，和在其C末端區(qū)域中的多個Tyr磷酸化基序。與酪氨酸-磷酸化的IRS-蛋白質(zhì)結合的蛋白質(zhì)包括PI3激酶p85、 GRB2、 SHP2、 Nck、 Crk和Fyn。 IRS-1看起來主要涉及IGF信號和細胞支架生長。IRS-2看起來是胰島素信號的重要介質(zhì)，因為遺傳除去導致II型糖尿病。IRS-3主要在脂細胞中表達，并且是PI3激酶的罕有地有效活化劑。IRS-4缺乏在其他IRS-蛋白質(zhì)中與SHP2結合的酪氨酸殘基。
在某些實施方案中，響應給患著或給靶器官、組織或細胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，IGF-1、 IGF-II或任一的受體的蛋白質(zhì)表達或活性得到調(diào)節(jié)。IGF-I和-II通過與胰島素受體同源的 IGF-I受體發(fā)信號。IGF-II受體的高親和力在發(fā)信號中不發(fā)揮直接的作用，但調(diào)節(jié)游離IGF-II的濃度。IGFs涉及骨骼生長，并且對于凋. 亡預防是必需的。游離IGFs的血清水平通過使隔離IGFs的IGF結合蛋白質(zhì)(IGFBPs )的作用保持很低。IGFBPs的過量表達可以誘導凋亡，推測是通過游離IGF的減少；IGFBP水平在某些癌癥中也是被改變的。 IGF-I受體不象某些其他生長因子受體一樣是促有絲分裂的，但其通過胰島素受體底物(IRS )蛋白質(zhì)激活PI3激酶途徑的能力對于調(diào)節(jié)細胞存活是非常重要的。
在某些實施方案中，響應給患者或給靶器官、組織或細胞施用的
運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，磷脂酰肌醇3-激酶蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)。PI3激酶(磷脂酰肌醇3-激酶)負責PI(4，5) P2的肌醇環(huán)的3位的磷酸化和胰島素作用，以產(chǎn)生存活信號所需的有效第二信使PI( 3， 4， 5 )P3。 PI3激酶是由85 kDa調(diào)節(jié)亞單位和110 kDa 催化亞單位組成的異二聚復合物。生長因子受體的酪氨酸磷酸化產(chǎn)生停泊位點用于結合受體上的p85 (通過其SH2結構域)；p85給其帶來 pllO，所述pllO隨后接近于其在膜上的磷脂底物。PI3激酶還通過Ras，和異三聚的G蛋白質(zhì)的P : Y亞單位得到激活。PI3激酶可被渥曼青霉素抑制，所述渥曼青霉素是用于研究PI3激酶信號途徑的有用工具。
在某些實施方案中，響應給患者或給靶器官、組織或細胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，Akt激酶蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)。Akt是PI3激酶途徑的主要已知效應子。PIP3的產(chǎn)生導致使Akt上的Thr308磷酸化的PDK1，和使Akt上的Ser473磷酸化的另一種激酶(預期為PDK2)的活化。這些磷酸化另外激活Akt Ser/Thr 激酶活性，和針對這些位點中任一的磷酸化狀態(tài)特異性抗體的使用能意味著Akt活化。Akt的活化可以通過免疫沉淀隨后為用放射性標記的ATP使已知底物磷酸化進行直接測量。Akt使Bad上的Serl36磷酸化，導致保護不受凋亡。Akt的其他底物包括GLUT4 、心臟PFK2和GSK3 ，其通過這種磷酸化^皮滅活。
在某些實施方案中，響應給患者或給靶器官、組織或細胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，Bad激酶蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)。Bad或"Bcl-2的細胞死亡拮抗劑"是Bcl-2家族的成員和生存對死亡的重要調(diào)節(jié)物。非磷酸化的Bad與Bcl-2和Bcl-XL成為二聚物，使其抗凋亡活性中和。PI3激酶途徑的活化導致Akt的活化，這使Bad上的ser-136磷酸化。MAP激酶途徑使BAD上的ser-112磷酸化，并且近來，PKA已顯示使BAD上的ser-155磷酸化。磷酸化的 Bad結合14-3-3蛋白質(zhì)和可能的其他因子，所述14-3-3蛋白質(zhì)和因子使Bad與其促凋亡作用隔離。使用對這些位點特異的磷酸化狀態(tài)特異性抗體的測定法充當細胞存活途徑活化的記錄。
在某些實施方案中，響應給患者或給靶器官、組織或細胞施用的
運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，PI (3,4,5) P3依賴性激酶蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)。PI (3，4，5)P3依賴性激酶l (PDK1)是具有PH結構域并且受PIP3強烈刺激的Ser/Thr激酶。PDK1的最佳表征的底物是Akt，所述Akt通過PDK1上的Thr308進行磷酸化，促成 Akt活化。PDK1的2種同種型已得到鑒定。PDK1也被認為在p70 S6 激酶的活化中起作用，并且在T細胞活化期間對于從T細胞受體到NF
KB發(fā)信號是重要的。
在某些實施方案中，響應給患者或給靶器官、組織或細胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，Bax蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)。與Bcl-2共享高度保守的結構域的Bax蛋白質(zhì)，可以在線粒體的脂雙層中形成離子傳導通道，這通過將凋亡基因蛋白質(zhì)釋放到細胞溶質(zhì)內(nèi)在許多細胞的凋亡途徑中起必要作用。Bax呈現(xiàn)了關于許多疾病的有趣的治療靼，所述疾病涉及凋亡例如癌癥或神經(jīng)變性病癥。
在某些實施方案中，響應給患者或給靶器官、組織或細胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，p53基因產(chǎn)物的表達或活性得到調(diào)節(jié)。p53具有在大約一半的所有人癌癥中是突變的。它的基因產(chǎn) 物涉及針對細胞毒性應激的細胞應答，并且連同pl9ARF —起誘導 p21Cipl的表達，以引起細胞周期停滯。此外，p53能夠通過轉錄和非轉錄機制誘導凋亡。p53的氨基末端的83個氨基酸包含反式激活結構域，以及涉及轉錄非依賴性生長抑制的區(qū)域。羧基末端區(qū)域包含DNA 結合結構域，其通過3種磷酸化事件，以及潛在地通過乙?；玫秸{(diào)節(jié)。
在某些實施方案中，響應給患者或給靶器官、組織或細胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，一氧化氮合酶蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)。一氧化氮合酶(NOS)是二聚的，含亞鐵血紅素的酶，所述酶產(chǎn)生一氧化氮，并且包含C末端還原酶和N末端氧合酶結構域。 NOS的3個類別包括主要在神經(jīng)元組織中表達的nNOS/NOS 1/N0S1，通過炎癥刺激在巨噬細胞和某些其他細胞中可誘導的iN0S/N0SII/N0S2,和組成性表達的N0S的上皮形式的eN0S/N0S III/N0S3。組成性表達的nNOS和eNOS需要Ca2+用于活性，并且通過Ca2+流進行調(diào) 節(jié)。iNOS不依賴于Ca2+。不同同種型在許多位點上的磷酸化對蛋白質(zhì) 活性具有不同的影響；某些是抑制的和某些是活化的。
在某些實施方案中，響應給患者或給靶器官、組織或細胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，糖原合酶激酶3蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)。糖原合酶激酶3 (GSK)不同于大多數(shù)絲氨酸/蘇氨酸激酶的地方在于它在不存在信號途徑作用的情況下是活性的。存在 2種同種型，GSK3ct和GSK3P。 GSK3的功能是使糖原合酶磷酸化并且從而使其滅活。胰島素作用刺激PI3激酶途徑，導致Akt活化，這使 GSK3磷酸化并且使其滅活。糖原合酶隨后迅速地脫去磷酸并且被活化。其他GSK3底物包括Jun (在抑制位點上)和elF2B。通過GSK3 使Tau磷酸化可能涉及阿爾茨海默氏病的發(fā)展。針對GSK3上的Akt 位點(Ser21 )的磷酸化狀態(tài)特異性抗體適合于代替測定途徑的活化狀態(tài)。
在某些實施方案中，響應給患者或給靶器官、組織或細胞施用的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，半胱天冬酶蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)。涉及線蟲(C. elegans) CED-3死亡蛋白質(zhì)的半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶包含半胱天冬酶家族。所有作為通過蛋白質(zhì)水解活化的酶原被表達。就其在凋亡中的作用而言，取決于它們是通過受體群集(起始)還是通過線粒體通透性轉變(效應)得到活化，可以將半胱天冬酶再分成起始(半胱天冬酶8、 9、 10 )和效應(半胱天冬酶3、 6、 7)半胱天冬酶。效應半胱天冬酶，最特別地半胱天冬酶3，切割眾多底物以實現(xiàn)與凋亡相關的形態(tài)學變化。在半胱天冬酶3的底物中有DFF45/ICAD，其釋放DFF的DNA酶亞單位以引起染色質(zhì)降解，以及凝溶膠蛋白、PAK2、 D4GDI，所有這些都涉及細胞支架組構，核層纖蛋白和PARP。 PARP切割的意義仍不明了，但它是關于半胱天冬酶活化的極佳標記和正在進行的凋亡的推測。
在某些實施方案中，響應給患者或給靶器官、組織或細胞施用的
運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，RAS基因產(chǎn)物的表達或活性得到調(diào)節(jié)。Ras蛋白質(zhì)是小GTP結合蛋白，其與異三聚的G蛋白質(zhì)不同，在單個多肽內(nèi)包含所有GTP酶和效應子作用。存在Ras的至少3種同種型，Ki-Ras、 Ha-Ras和N-Ras,具有不同的表達模式但相似的信號活性。Ras在羧基末端處進行棕櫚?；头峄蛊溴^定在膜上。在靜止細胞中，Ras裝載GDP，并且在受體的生長受體刺激之后被活化，這將Ras鳥嘌呤核苷酸交換因子召募至膜的平面。交換因子與Ras蛋白質(zhì)的接近引起GDP的釋放，以及其的GTP替換。在其GTP結合形式中，Ras結合幾種蛋白質(zhì)，包括Raf、 RalGDS和PI3激酶。Ras的滅活通過GTP水解發(fā)生，這極大地受到RasGAP或NF-1這2種已知的Ras GTP 酶活化蛋白的促進。通過使裂解物與Raf-1的Ras結合結構域一起溫育可以測定Ras活化，所述Raf-l與Ras: GTP選擇性結合。 III.干細胞培養(yǎng)
胚胎干(ES)細胞是培養(yǎng)的細胞，衍生自能夠無限復制的胚泡期胚胎的多能內(nèi)細胞群。一般而言，ES細胞具有分化成其他細胞的潛能 (即，它們是多能的)；因此，它們可以充當新細胞的持續(xù)來源。用于在本發(fā)明中使用的胚胎干細胞可以得自任何動物，但優(yōu)選得自哺乳動物(例如，人、馴養(yǎng)動物或商業(yè)動物)。在本發(fā)明的一個實施方案中，胚胎干細胞是鼠類胚胎干細胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中，胚胎干細胞得自人。
用于培養(yǎng)哺乳動物干細胞的合適方法是本領域已知的，例如，如
美國專利申請?zhí)?0/362, 437、 10/789, 266、 10/789, 308、 10/928,805 和美國專利號6, 833, 269中所述，所述專利全部整體引入本文。除非另有明確說明，本發(fā)明的方面可以使用任何脊推動物種類的干細胞(例如，來自人；以及非人靈長類動物、馴養(yǎng)動物、家畜和其他非人哺乳動物的干細胞)進行實踐。在適合于在本發(fā)明中使用的干細胞中包括了衍生自在妊娠后形成的組織例如胚泡，或在妊娠期間的任何時候獲取的胎兒或胚胎組織的多能干(pPS)細胞。非限制性例子是胚胎干細胞或胚胎生殖細胞的原代培養(yǎng)物或建立的系。
在某些實施方案中，使用原型"靈長類多能千細胞(pPS細胞)。 pPS細胞包括衍生自在受精后任何時候的胚胎前、胚胎或胎兒組織的
多能細胞。在合適的條件下，它們能夠產(chǎn)生三個胚層(內(nèi)胚層、中胚
層和外胚層)衍生物的幾種不同細胞類型的后代。pPS細胞包含各種類型的胚胎細胞，包括如由Thomson等人，iWe腳282: 1145 ( 1998 ) 描述的人胚胎干(hES)細胞；來自其他靈長類動物的胚胎干細胞，例如恒河猴干細胞(Thomson等人，/Voc.A"a〃. Jc/. USA
92: 7844， ( 1995 ))、絨猴干細胞(Thomson等人，y e/ rocT. 55: 254 ( 1996 )和人胚胎生殖(hEG)細胞(Shamblott等人，尸roc.
Jcat/. 5^/. USA 95: 13726 ( 1998 )，以及本領域已知的其他類型的多能細胞。包括能夠產(chǎn)生所有三個胚層衍生物的后代的靈長類動物起源的任何細胞，不管它們是衍生自胚胎組織、胎兒組織還是其他來源。pPS細胞一般不衍生自惡性來源，并且優(yōu)選細胞是核型正常的。
當群體中大比例的干細胞及其衍生物顯示未分化細胞的形態(tài)特征時，pPS細胞培養(yǎng)物被描述為"未分化的"，當與胚胎或成人起源的分化細胞比較時，所述未分化細胞是顯而易見的。未分化的pPS細胞由本領域技術人員容易地識別，并且一般在具有高核/質(zhì)比和明顯核仁的細胞集落的顯微鏡視野的2個平面中出現(xiàn)。群體內(nèi)未分化細胞的集落通常由分化的鄰近細胞圍繞這是常見的。
IV.分化的神經(jīng)細胞
用于培養(yǎng)前體、部分分化和完全分化的神經(jīng)細胞的合適方法是本領域已知的，例如，如美國專利申請?zhí)?0/362, 437、 10/789, 266、 10/789, 308、 10/928, 805和美國專利號6， 833， 269中所述的，所述專利全部整體引入本文。
此外，如本文所使用的，"神經(jīng)元細胞"或"神經(jīng)元"是神經(jīng)系統(tǒng)的傳導或神經(jīng)細胞，其一般由下述組成包含核和周圍細胞質(zhì)的細胞體(核周體)；幾個短的、照射狀突起(樹突)；以及于終止細枝樣分支(終樹突)，和可以具有沿著其路線伸出的分支(側突)的一
個長突起(軸突)。神經(jīng)元的例子包括運動神經(jīng)元。
V. 分化的神經(jīng)細胞的表征
通過已知的細胞和分子操作以及本文公開的測定法和方法可以檢
測分化成部分或完全分化的神經(jīng)細胞的ES細胞。例如，可以就神經(jīng)元標記例如NeuN(神經(jīng)元標記)和/或特異性運動神經(jīng)元標記如HB9或ChAT 探測細胞培養(yǎng)物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，如本文所描述的，分化的神經(jīng)細胞是遺傳標記的，因為它表達增強型綠色熒光蛋白(eGFP)。 eGFP遺傳標記在用于分離和/或純化分化的神經(jīng)細胞群的方法中，或在用于監(jiān) 控脊髓再駐的方法中可以是特別有用的。
VI. 視黃酸
視黃酸或維生素A是被認為是成形素的醛分子。RA是容易獲得的；它可以例如得自Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.)。用終濃度約o. 0. G01-1 ijM的ra處理導致干細胞有效分化成神經(jīng)前體。
VII. MNTF和MNDF肽
如本領域和本發(fā)明的技術人員應當理解的，包含M L S A F S R Y A R 10聚體和33聚體的序列提供了用于在體外和體內(nèi)使千細胞選擇性分化成運動神經(jīng)元中使用的MNTF肽類似物。本發(fā)明的運動神經(jīng)元分化因子可以合成或重組生產(chǎn)，或從天然細胞中分離。
包含本發(fā)明的MDNF和MNTF肽類似物的蛋白質(zhì)或肽中的氨基酸殘基序列在本文中通過使用其常用的三字母命名法或通過其單字母命名
法進行命名。這些三字母和單字母命名法的列表可以在教科書例如 Biochemistry,第2版，Lehninger， A. ， Worth Publishers, New York, N.Y. ( 1975 )中找到。當氨基酸序列橫向列出時，氨基末端預期位于左端，而羧基末端預期位于右端。
技術人員應當理解包含各種MDNF和MNTF肽類似物的肽的精確化學結構將依許多因素而變。例如，給定多肽可以作為酸性或堿性鹽或以中性形式獲得，因為在分子中發(fā)現(xiàn)可電離的羧基和氨基。因此，為了本發(fā)明的目的，保留MNTF1 33聚體肽的生物活性，包含WMLSAFS、
FSRYAR或M LSAFSRYA R結構域的任何形式的肽，預期在本發(fā) 明的范圍內(nèi)。方案。
A. MNTFl-F6 33-聚體
在美國專利號6,309,877中，提供了具有下述氨基酸序列的多肽 (在本文中被稱為SEQ ID NO: 4):
LGT兩DTLNC TO，5RYARCLAEGHDGPTQ [SEQ ID NO: 1]
包含這種序列的重組蛋白質(zhì)與針對MNTF-1的單克隆抗體反應，維持運動神經(jīng)元的生存力，增加神經(jīng)突的長出，減少運動神經(jīng)元細胞死亡/凋亡，并且支持運動神經(jīng)元生長和"擴展"到具有延伸的含生長錐軸突的巨大的、活性神經(jīng)元內(nèi)。
MNTFl 33聚體通過用于在下文實施例中使用的固相合成進行合成。這種MNTF-1分子在下文中將被稱為"33聚體"。當與低濃度的 RA結合使用時，線性33-聚體誘導ES細胞分化成運動神經(jīng)元(參見圖
2) 。此外，MNTF1誘導的ES細胞分化不受音猬信號轉導途徑抑制劑的阻斷。如圖3中所示，用MNTF1 33-聚體處理胚狀體與胰島素受體
(IR)和/或胰島素樣生長因子受體(IGF-R)的自磷酸化相關，這意味著MNTF通過IR/IGF-R介導的信號轉導途徑起作用。
本發(fā)明包括了 MNTF1的肽類似物的使用，所述腦TF1的肽類似物保留了 MNTF1使干細胞分化成運動神經(jīng)元和/或促進干細胞衍生的運動神經(jīng)元的存活和維持的能力。依照本發(fā)明的MNTF肽類似物長度一般為6-33個氨基酸，并且包含2個氨基酸序列中的至少一個，即對應 SEQ ID NO: 1的氨基酸殘基12 - 18的WMLSAFS結構域(SEQ ID NO:
3) ，或對應SEQ ID NO: 1的氨基酸殘基17-22的FSRYAR結構域(SEQ ID NO: 2) 。 MNTF肽類似物的優(yōu)選實施方案包括SEQ ID NO: l的10 -33個連續(xù)氨基酸殘基的片段，所述片段包含M LSAFSRYAR 結構域(SEQ ID NO: 4)。
在備選的實施方案中，如通過BLAST分析測定的，運動神經(jīng)元營
養(yǎng)因子肽類似物的氨基酸序列與SEQ ID NO: 1的9 - 32個連續(xù)氨基酸殘基至少70%等同，與SEQ ID NO: 1的8 - 32個連續(xù)氨基酸殘基至少80%等同，和最優(yōu)選地，與SEQ ID NO: 1的7 - 32個連續(xù)氨基酸殘基至少9()Q/。等同。
為了比較多肽序列與相應的SEQ IDNO: 1片段，可以使用可通過美國國立生物信息中心(在萬維網(wǎng)上ncbi.nlm.nih. gov處)公開獲得的BLAST程序進行序列的總體比對。在進行總體比對前，可以將SEQ ID NO: l提交給GenBank。對于總體比對可以使用由美國國立生物信息中心提供的缺省參數(shù)。
B. lQ-聚體
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，提供了具有對應SEQ ID NO: l的氨基酸殘基13- 22的下述氨基酸序列的肽
MLSAFSRYAR [SEQ ID NO: 4〗
Met Leu Ser Ala Phe Ser Arg Tyr Ala Arg
這種MNTF片段包括大部分WMLSAFS結構域以及整個FSRYAR結構域。MNTF IO聚體在低至0.01 jag/ml的濃度時在體外刺激胚胎干細胞分化成運動神經(jīng)元方面至少與全長MNTF 33聚體一樣有效(參見圖 2)。此外，MNTF 10聚體在增強干細胞衍生的運動神經(jīng)元的存活方面幾乎與MNTF 33聚體一樣有效(參見圖4) 。 MNTF-l分子的這個部分在下文中將被稱為"IO聚體"。
C. 6-聚體
在另一個實施方案中，提供了具有對應SEQ ID NO: l的氨基酸殘基17 - 22的下述氨基酸序列的肽 FSRYAR鵬ID NO: 2] Phe-Ser-Arg-Tyr-Ala-Arg
發(fā)現(xiàn)其足以增強干細胞衍生的運動神經(jīng)元的存活(參見圖4)。 MNTF-1分子的這個部分在下文中將被稱為"6聚體"。
D. 7-聚體
在另一個優(yōu)選實施方案中，提供了具有對應SEQ ID NO: l的氨基
酸殘基12 - 18的下述氨基酸序列的肽 W M L S A F S [SEQ ID NO: 3] Trp Met Leu Ser Ala Phe Ser
MNTF1的這種7氨基酸片段與FSRYAR結構域的FS殘基重疊。還發(fā)現(xiàn)該肽足以增強干細胞衍生的運動神經(jīng)元的存活(參見圖4)。 MNTF-1分子的這個部分在下文中將被稱為"7聚體，，。
E. ll-聚體
在另一個優(yōu)選實施方案中，提供了具有對應SEQ ID NO: l的氨基酸殘基17- 27的下述氨基酸序列的肽
FSRYARCLAEG [SEQ ID NO; 5]
Phe-Ser-Arg-Tyr-Ala-Arg-Cys-Leu-Ala-Glu-Gly。
MNTF1 11-聚體包含F(xiàn)SRYAR結構域，并且也發(fā)現(xiàn)足以增強干細胞衍生的運動神經(jīng)元的存活(參見圖4) 。 MNTF-1分子的這個部分在下文中將被稱為"11聚體"。
F. 21-聚體
在另一個優(yōu)選實施方案中，提供了具有對應SEQ ID NO: l的氨基酸殘基13- 33的下述氨基酸序列的肽
MLSAFSRYARCLAEGHDGPTQ [SEQ ID NO: 6]
Met Leu Ser Ala Phe Ser Arg Tyr Ala Arg Cys，Leu Ala Glu Gly His Asp Gly Pro Thr Gin
MNTF1 21-聚體包含大部分"WMLSAFS"結構域以及整個FSRYAR 結構域，并且也發(fā)現(xiàn)足以增強干細胞衍生的運動神經(jīng)元的存活(參見圖4) 。 MNTF-1分子的這個部分在下文中將被稱為"21聚體"。
VIII. MNTF肽類似物
應當理解其中一個或多個氨基酸替換為其他氨基酸的如本文所述和鑒定的肽類似物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個優(yōu)選的備選方案中，運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子肽類似物包含針對SEQ ID NO: 1的7- 32個連續(xù)氨基酸殘基的片段的一個或多個保守氨基酸置換。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)的MNTF肽類似物可以是MNTF1肽的改變形式，條
件當然一般是該肽的必需活性基本上保持不變。如本文所使用的，術語"改變的形式"指已進行處理以改變其天然存在的結構的肽。改變
的形式可以通過下述進行制備，例如通過MNTF1肽片段的共價修飾，通過使MNTF 1肽片段與不溶性支持基質(zhì)交聯(lián)，或通過使匪TF 1肽片段與載體蛋白交聯(lián)。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)的MNTF1肽類似物可以是在抗原上與MNTF1肽片段相關的肽片段。在抗原上相關的2種肽顯示免疫交叉反應性。例如，針對第一種肽的抗體同樣識別第二種肽。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)的MNTF1肽類似物可以是包含與異源蛋白附著的MNTF1肽片段的融合蛋白。異源蛋白具有與MNTF1肽片段基本上不相似的氨基酸序列。異源蛋白可以與MNTF1肽片段的N末端或C末端融合。融合蛋白可以包括但不限于，聚-His融合物、MYC-標記的融合物、Ig 融合物和酶促融合蛋白例如p-半乳糖苷酶融合物。此類融合蛋白，特別地聚-H i s融合物可以促進重組MNTF 1肽片段的純化。
本發(fā)明還提供了MNTF肽的擬肽，并且可以充當藥物用于調(diào)節(jié)神經(jīng) 元細胞的生存力和生長，通過例如阻斷包含WMLSAFS和/或FSRYAR結構域的蛋白質(zhì)的功能。擬肽在制藥工業(yè)中通常理解為包括具有與模擬的肽的那些類似性質(zhì)的非肽藥物。擬肽設計的原則和實踐是本領域已知的，并且在例如Fauchere J. ， Jc^. Z rwg Z es. 15: 29 ( 1986 );和 Evans等人，/. 30: 1229 ( 1987 )中得到描述。
具有對于治療上有用的肽的結構相似性的擬肽可以用于產(chǎn)生等價的治療或預防效果。一般地，此類擬肽具有任選地被鍵替換的一個或多個肽鍵，這可以改變所需性質(zhì)例如對體內(nèi)化學破壞的抵抗力。此類鍵可以包括 CH2NH—、一CH2S—、一CH2—CH2—、一CH-CH--、 --C0CH2—、 —CH (OH) CH2—和一CH2S0—。擬肽可以顯示出增強的藥理性質(zhì)(生物半衰期、吸收率等)，不同的特異性，增加的穩(wěn)定性，生產(chǎn)經(jīng)濟，減少抗原性等，這使得它們能夠作為特別需要的治療劑使用。
基\于建模(例如在實驗上測定的)肽結構，使用推理性藥物設計的已知方法，可以由技術人員進行WMLSAFS和/或FSRYAR結構域模擬物
或結合分子的推理性設計。推理性藥物設計的目的是生產(chǎn)生物活性多肽或耙化合物的結構類似物。通過制備此類類似物，可以形成藥物，所述藥物比天然分子更有活性或穩(wěn)定，具有針對改變的不同敏感性，或可以影響各種其他分子的功能。在一種方法中，將產(chǎn)生關于靶分子
或其片段的三維結構。這可以通過x射線晶體學，計算機建?；蛲ㄟ^2 種方法的組合來完成。 IX.制備方法
來制備，包括但不限于，通過固相合成的化學合成和通過HPLC純化使其不含化學反應的其他產(chǎn)物，或通過在體外翻譯系統(tǒng)或在活細胞中表達編碼包含本發(fā)明的MNTF肽的肽或多肽的核酸序列(例如，DNA序列) 生產(chǎn)。優(yōu)選地組合物的MNTF肽得到分離并進行廣泛透析，以去除一種或多種不希望有的小分子量分子，和/或進行凍干以更容易配制到所需媒介物內(nèi)。應進一步理解在MNTF肽組分中制備的存在的任何另外的氨基酸、突變、化學修飾等，將優(yōu)選地基本上不干擾MNTF停泊序列的受體識別。
對應本發(fā)明的MNTF1的一種或多種片段的肽或多肽長度一般應為至少5-6個氨基酸殘基，并且可以包含高達約7個、約8個、約9個、約 10個、約11個、約12個、約13個、約15個、約20個或約30個殘基左右。肽序列可以通過本領域普通技術人員已知的方法進行合成，例如，使用自動化肽合成才幾器的肽合成，例如可從Applied Biosystems( Foster City, CA)獲得的那些。本發(fā)明進一步提供了環(huán)狀肽的合成和使用，例如如下表l中所示衍生自(SEQIDNO: 1)和(SEQ ID NO: 6)的那些。
通過使靶向氨基酸殘基與有機衍生劑反應可以將共價修飾引入肽內(nèi)，所述有機衍生劑能夠與選擇的側鏈或末端殘基反應。使用有機衍生劑的多肽共價修飾是本領域技術人員眾所周知的。例如，可以使半胱氨酰殘基與ot-卣乙酸鹽(haloacetates)(和相應的胺)，例如氯乙酸或氯乙酰胺反應，以產(chǎn)生羧曱基或羧氨基曱基
(carboxyamidomethyl )衍生物。組氨酰殘基可以通過在pH 5. 5 - 7. 0 下與焦碳酸二乙酯反應，或在pH6下在l M二曱基胂酸鈉中與對溴苯酰甲基溴反應進行衍生。賴氨酰和氨基末端殘基可以與琥珀酸或其他羧酸酐進行反應。精氨酰殘基可以通過與一種或幾種常規(guī)試劑反應進行修飾，在所述常規(guī)試劑中有苯曱酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-環(huán)己胺二酮和茚三酮。通過與芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反應可以將光譜標記引入酪氨酰殘基內(nèi)；最常見地，使用N-乙酰咪唑(原文為 acetylimidizol,疑為acetylimidazol )和四硝基曱烷以分別形成O-乙酰酪氨酰種類和3-硝基衍生物。羧基側基(天冬氨?；蚬劝滨?可以通過與碳化二亞胺(R， -N-C-N-R，)反應進行選擇性修飾，例如l-環(huán)己基-3- ( 2-嗎啉基-(4-乙基)碳化二亞胺或l-乙基-3 ( 4氮鑰4， 4-二曱基戊基)碳化二亞胺。此外，通過與銨離子反應將天冬氨酰和谷氨酰殘基轉變成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰殘基。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基可以脫去酰胺基為相應的谷氨酰和天冬氨酰殘基。其他修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨酰或蘇氨酰殘基的羥基的磷酸化, 賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈的oc-氨基的曱基化(T. E. Creighton， 1983， Proteins: Structure和Molecule Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco,第79-86頁，N末端胺的乙?；驮谀承?情況下C末端羧基的酰胺化。
本發(fā)明進一步提供了用于在測定法和關于測定法的試劑盒中使用的MNTF肽類似物，其為游離形式或與載體分子例如蛋白質(zhì)或固體顆粒連接，以及與標記或示蹤物例如生物素或異硫氰酸熒光素連接的經(jīng)修飾的肽。
使MNTFl肽片段與水不溶性支持基質(zhì)交聯(lián)可以用本領域眾所周知的雙功能劑來進行，包括l，l二 (重氮乙?；?2苯乙烷，戊二醛，N-羥基琥珀酰亞胺酯，例如，與4-疊氮水楊酸的酯，同雙功能酰亞胺酯，包括二琥珀酰亞胺酯例如3， 3， -二巰基二 (琥珀酰亞胺基丙酸酯)，和雙功能馬來酰亞胺例如二-N-馬來酰亞胺-l， 8-辛烷。雙功能劑例如甲基-3-[(對疊氮苯基)二硫代]亞胺丙酯產(chǎn)生在光的存在下能夠形成
交聯(lián)的光可激活的中間產(chǎn)物。備選地，可以使用反應性水不溶性基質(zhì) 例如溴化氰活化的碳水化合物用于蛋白質(zhì)固定化。
MNTF1肽片段與第二種蛋白質(zhì)包括第二種MNTF1肽片段的交聯(lián)可以使用本文描述的雙功能試劑來進行。在另一種備選方案中，插入間隔物，例如二巰基或二氨基或多個氨基酸殘基，例如甘氨酸。間隔物也可以是同或異雙功能交聯(lián)劑，例如異雙功能交聯(lián)劑N- ( 4-羧基-環(huán)己基 -甲基)-馬來酰亞胺。
較長的肽或多肽例如融合蛋白可以通過標準重組DNA技術來生產(chǎn)。例如，編碼MNTF1肽片段的DM片段可以在已包含異源蛋白的商購可得的表達載體中進行克隆，而結果是在框內(nèi)與異源蛋白融合的MNTF1肽片段。
在某些實施方案中，編碼本文描述的MNTFl肽和/或組分的核酸可以例如，用于在體外或體內(nèi)生產(chǎn)肽用于本發(fā)明的各種組合物和方法。例如，在某些實施方案中，編碼MNTF1肽的核酸是例如重組細胞中的載體的組分?？梢员磉_核酸以生產(chǎn)包含MNTF1肽序列的肽或多肽。肽或多肽可以從細胞中分泌出來，或作為細胞的部分，或在細胞內(nèi)。
X.化合物篩選
在另一個實施方案中，鑒定了改變MNTF肽或涉及MNTF肽細胞內(nèi)信號轉導途徑的蛋白質(zhì)的表達水平的化合物。在某些實施方案中，這些化合物被靼向用于治療本文描述的各種神經(jīng)病癥。
通過本文描述和本領域已知的使用神經(jīng)元細胞的后續(xù)測試，可以區(qū)別神經(jīng)保護的激動劑和拮抗劑，并且可以評估化合物的功效。
基于其在領域公認的動物細胞培養(yǎng)疾病和病癥模型系統(tǒng)中治療神經(jīng)元病癥的能力，所述模型系統(tǒng)包括在整體引入本文作為參考的共同未決的申請U. S. S.N.(待指定)中描述的，所述共同未決的申請于2006 年11月10日提交，名稱為"Methods of Treating Neuronal Disorders using MNTF peptides and analogues thereof"，可以進一步區(qū)另寸通過本文描述的篩選操作鑒定的化合物，并且可以評估化合物的功效。
在測試化合物和天然提取物文庫的許多藥物篩選測定法中，高流
通量測定法是希望的，以便使給定時間段內(nèi)檢查的化合物數(shù)目達到最大。在無細胞系統(tǒng)中進行，例如可以用純化或部分純化的蛋白質(zhì)獲得的測定法，作為"初步"篩選通常是優(yōu)選的，因為它們可以被產(chǎn)生以允許快速發(fā)展和相對容易的檢測由測試化合物介導的分子靶中的改變。此外，測試化合物的細胞毒性和/或生物利用度的效應在體外系統(tǒng) 中一般是可以被忽略的，相反該測定法主要集中于藥物對分子靶的影響，如可以在與受體蛋白質(zhì)的結合親和力的改變中表現(xiàn)的。
因此在另一個方面，提供了鑒定用于促進運動神經(jīng)元的生長或存
活的化合物的方法。在一個實施方案中，該方法包括下述步驟i)制備包含候選化合物的樣品，ii)使細胞與所述樣品接觸，iii)測定涉及信號轉導途徑的化合物的表達或活性是否得到調(diào)節(jié)，和iv)測定樣品是否能夠促進運動神經(jīng)元的生長或存活。在某些實施方案中，該方法進一步包括測定包含后續(xù)化合物的樣品是否在體外或體內(nèi)刺激胰島素受體的Tyr972和Tyrll62/1163的自磷酸化。在其他實施方案中，該方法進一步包括測定包含候選化合物的樣品是否調(diào)節(jié)MNTF信號轉導途徑。在其他實施方案中，該方法進一步包括測定包含候選化合物的樣品是否調(diào)節(jié)選自下述的一種或多種蛋白質(zhì)的表達或活性胰島素受體、 IGF-1受體、IGF-2受體、Shh、 Akt、 Bad ( bcl-2的細胞死亡拮抗劑)、 PI (3，4，5) P3依賴性激酶l (PDK1) 、 Bax、 p53基因產(chǎn)物、pp60-Src、 JAK2、一氧化氮合酶(NOS)、糖原合酶激酶3 (GSK)、半胱天冬酶、 PI3激酶(磷脂酰肌醇3-激酶)和Ras。在其他實施方案中，該方法進一步包括測定包含候選化合物的樣品是否受MNTF類似物調(diào)節(jié)，或備選地調(diào)節(jié)MNTF類似物(例如活性、表達等)。在另一個方面，本發(fā)明提供了通過施用由本文描述的篩選操作鑒定的化合物促進運動神經(jīng)元生長或存活或用于治療神經(jīng)元病癥的方法。
在示例性篩選測定法中，目的化合物在其中一般能夠結合MNTF肽的條件下與包括匪TF結合蛋白質(zhì)(例如，表達MNTF肽受體的細胞)和 MNTF肽的混合物接觸。隨后向混合物中加入包含測試化合物的組合物。受體/MNTF肽復合物的檢測和量化提供了用于測定測試化合物在抑制
(或加強)受體蛋白質(zhì)和MNTF肽之間的復合物形成方面的功效的方法。還可以執(zhí)行對照測定法以提供用于比較的基線，其中向受體蛋白質(zhì)中添加分離的和純化的MNTF肽，并且在不存在測試化合物的情況下定量受體/MNTF肽復合物的形成。
MNTF肽和MNTF肽之間的復合物形成可以通過各種技術進行檢測。例如，復合物形成的調(diào)節(jié)可以使用例如可檢測標記的蛋白質(zhì)例如放射性標記、熒光標記或酶促標記的MNTF肽，通過免疫測定法或通過色語檢測進行定量。對于無細胞測定法，一般將希望使MNTF肽或MNTF肽結合蛋白固定，以促進受體/MNTF肽復合物與未復合形式的蛋白質(zhì)之一的分離，以及調(diào)節(jié)測定法的自動化。例如可以提供添加允許蛋白質(zhì)與基質(zhì)結合的結構域的融合蛋白。例如，谷胱甘肽-S-轉移酶/受體(GST/ 受體)融合蛋白可以吸附在谷胱甘肽瓊脂糖珠(Sigma Chemical, St. Louis， Mo.)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，其隨后與MNTF肽例如 "S標記的MNTF肽和測試化合物組合，并且在有助于復合物形成的條件下進行溫育，例如在關于鹽和pH的生理條件下，盡管略微更嚴格的條件可以是希望的。溫育后，洗滌珠以去除任何未結合的MNTF肽，并且直接地或在受體/猬復合物解離后的上清液中測定基質(zhì)珠結合的放射性標記(例如，置于閃爍體中的珠)。備選地，復合物可以與珠解離，通過SDS-PAGE凝膠分開，并且使用標準電泳技術定量來自凝膠的在珠中發(fā)現(xiàn)的MNTF肽水平。
用于使蛋白質(zhì)固定在基質(zhì)上的其他技術也可用于在受試測定法中使用。例如，MNTF肽的可溶性部分可以使用生物素和鏈霉親和素的綴合進行固定。例如，使用本領域眾所周知的技術(例如，生物素化試劑盒，Pierce Chemicals, Rockford， 111.)生物素化的受體可以從生物素-NHS (N-羥基-琥珀酰亞胺)進行制備，并且固定在鏈霉親和素包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。備選地，與腦TF肽反應但不干擾猬結合的抗體可以衍生至平板的孔，并且受體通過抗體綴合捕獲在孔中。如上所述，匪TF肽和測試化合物的制劑在平板的受體呈遞孔中進行溫育，并且可以定量孔中捕獲的受體/猬復合物的量。用于檢
測此類復合物的示例性方法，除了上文描述的關于GST-固定復合物的那些外，包括使用與MNTF肽反應，或與受體蛋白質(zhì)反應并且竟爭結合 MNTF肽的抗體的復合物的免疫檢測；以及依賴于與MNTF肽相關的酶促活性檢測的酶聯(lián)測定法。在后者的情況下，酶可以與MNTF肽進行化學綴合或作為含MNTF肽的融合蛋白提供。為了舉例說明，匪TF肽可以與堿性磷酸酶進行化學交聯(lián)或遺傳融合，并且復合物中捕獲的MNTF肽的量可以使用酶的生色底物例如對硝基磷酸苯酯進行評估。同樣地，可以提供包含MNTF肽和谷胱甘肽-S-轉移酶的融合蛋白，并且通過使用l-氯-2，4二硝基苯檢測GST活性定量復合物形成(Habig等人，/》/o/ C力e/z ， 249: 7130 ( 1974 ))。對于用于定量復合物中捕獲的抗體之一的免疫檢測，可以使用針對蛋白質(zhì)的抗體，例如抗MNTF肽抗體。備選地，復合物中待檢測的蛋白質(zhì)可以以融合蛋白的形式"附加表位"，除了 MNTF肽或MNTF肽序列外，所述融合蛋白還包括對于其可容易獲得抗體的第二種多肽(例如，來自商業(yè)來源)。例如，使用針對GST部分的抗體，上文描述的GST融合蛋白也可以用于結合的定量。其他有用的附加表位包括myc-表位(例如，參見Ellison等人，/5/o/C力e邁266: 21150-21157 ( 1991 )),其包括來自c-myc的IO殘基序列，以及pFLAG 系統(tǒng)(International Biotechnologies, Inc.)或pEZZ-蛋白A系統(tǒng) (Pharamacia， N. J.)。 XI.組合物
用于依照本發(fā)明使用的藥物組合物優(yōu)選包含本發(fā)明的一種或多種 MNTF肽類似物，連同藥.學上可接受的稀釋劑和/或栽體。合適的載體/ 稀釋劑是本領域眾所周知的，并且包括鹽水或其他無菌水介質(zhì)，任選地包括另外組分例如緩沖鹽和防腐劑、或糖、淀粉、鹽或其混合物。
可以提供包含依照本發(fā)明的匪TF肽的組合物，用于以適合于施用方案和/或患者需要的任何合適的形式使用。例如，就本發(fā)明而言，一種或多種活性成分可以在移植前在體外應用，或在體內(nèi)移植的干細胞或其衍生物部位處或附近內(nèi)部應用。
本發(fā)明進一步提供了對于建立和繁殖干細胞、神經(jīng)祖細胞、分化
的神經(jīng)細胞和干細胞衍生的運動神經(jīng)元有用的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基特別適合于干細胞的分化和干細胞衍生的運動神經(jīng)元的長期培養(yǎng)。
本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基理想地補充有成形素和/或生長因子，并且根據(jù)需要培養(yǎng)的個別細胞類型進行優(yōu)化。此類補充和優(yōu)化在本領域的普
通技術內(nèi)。在某些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明是可以補充有下述近似水平(或在l個有效數(shù)字內(nèi))的任何或所有下述成形素和/或生長因子的
細胞培養(yǎng)基0.001-1 uM RA， 0.001-1 yM Shh或Shh激動劑，和/ 或O. 01 - 250 ug/ml的一種或多種MNTF肽類似物。
作為任選成分，本發(fā)明的藥物制劑可以包括藥學上可接受的載體、稀釋劑、穩(wěn)定或乳化劑、和本領域可獲得的類型的鹽。此類物質(zhì)的例子包括標準鹽水溶液例如生理學緩沖鹽水溶液和水。在本發(fā)明的藥物
可接受的緩沖鹽水溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水溶液pH 7.0-8.0。合適的藥學載體包括但不限于，無菌水，鹽溶液(例如林格氏溶液)，醇，
聚乙烯二醇，明膠，碳水化合物例如乳糖、直鏈淀粉或淀粉，硬脂酸鎂，滑石，硅酸，粘性石蠟，脂肪酸酯，羥甲基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮等。藥物制劑可以進行滅菌并且需要時和不與活性化合物有害地反應的助劑混合，所述助劑例如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、用于影響滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑和/或芳香族物質(zhì)等。需要時它們還可以與其他活性物質(zhì)例如酶抑制劑組合，以減少代謝性
本文提供的化合物可以在藥物組合物中進行配制，除了肽外所述藥物組合物還可以包括藥學上可接受的載體、增稠劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑、中性或陽離子脂質(zhì)、脂質(zhì)復合物、脂質(zhì)體、滲透增強劑、載體化合物和其他藥學上可接受的載體或賦形劑等。
藥物組合物一般配制用于治療用途施用。藥物組合物還可以包括一種或多種活性成分例如干擾素、抗微生物劑、抗炎劑、麻醉劑等。用于腸胃外施用的制劑可以包括無菌水溶液，所述無菌水溶液還可以包含緩沖劑、脂質(zhì)體、稀釋劑和其他合適的添加劑。包含本文提供的肽的藥物組合物可以包括滲透增強劑，以便增強肽的消化遞送。穿透
增強劑可以分類為屬于5個廣泛類別之一，即，脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑、表面活性劑和非表面活性劑(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 8， 91-192 ( 1991 ) ， Muranishi， Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 7， 1一33 (1990 ))。可以包括來自這些廣泛類別中的一個或多個的一種或多種滲透增強劑。
充當滲透增強劑的各種脂肪酸及其衍生物包括例如，油酸、月桂酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、蓖麻油酸酯(recinleate)、甘油單油酸酯(a k. a. 1-單油?；?rac-甘油)、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生四烯酸、甘油基 l-單癸酸酯、1-十二烷基環(huán)庚烷-2-酮、酰基肉毒堿、?；憠A、單和雙甘油酯及其生理學可接受的鹽(即油酸鹽、月桂酸鹽、癸酸鹽、肉豆蔻酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、亞油酸鹽等)。Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems第92頁(1991); Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 7， l( 1990 ); El-Hariri等人，J. Pharm. Pharmacol. 44， 651-654 (1992 ))
膽汁的生理學作用包括促進脂質(zhì)和脂溶性維生素的分散和吸收 (Brunton， Chapter 38 In: Goodman & Gi lman， s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 笫9版，Hardman等人McGraw-Hill， New York, N. Y.，第934-935頁(1996 ))。各種天然膽汁鹽及其合成衍生物充當滲透增強劑。因此，術語"膽汁鹽"包括膽汁的任何天然存在的組分及其任何合成衍生物。
可以使用包含一種或多種滲透增強劑的復合制劑。例如，膽汁鹽可以與脂肪酸組合使用以制備復合制劑。螯合劑包括但不限于，乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸、水楊酸鹽(例如，水楊酸鈉、5-甲氧基水楊酸鹽和同香蘭草鹽)、膠原的N-?；苌?、月桂醇聚醚和P-二酮的N氨基?；苌?烯胺)[Lee等人，Critical Reviews in
Therapeutic Drug Carrier Systems第92頁(1991) ; Muranishi， Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 7, 1-33 (1990 ) ; Buur等人，J. Control Rel. 14， 43-51 ( 1990 ))。螯合劑還具有充當DM酶抑制劑的另外優(yōu)點。
表面活性劑包括例如月桂硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂醚和聚氧乙烯 -20-鯨蠟醚(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems第92頁(1991));和全氟化合物乳狀液，例如 FC-43(Takahashi等人，/. 戶力ar邁.尸力a則co/. 40, 252-257( 1988 ))。非表面活性劑包括例如，未飽和的環(huán)狀脲、1-烷基-和1-烯基氮雜環(huán)-坑酉同4汙生物(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems第92頁(1991));和非甾體抗炎劑例如雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和保泰松(Yamashita等人，/.戶AaiTZ7. 尸力ar邁aco入 39， 621-626 (1987))。
一般的藥學上可接受的載體包括但不限于，結合劑(例如，預膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基曱基纖維素等)；填充劑(例如，乳糖和其他糖、微晶纖維素、膠質(zhì)、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鉤等)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石、硅石、二氧化硅膠體、硬脂酸、硬脂酸金屬鹽、氫化植物油、玉米淀粉、聚乙烯二醇、苯甲酸鈉、乙酸鈉等)；崩解劑(例如，淀粉、淀粉羥乙酸拿等)；或濕潤劑(例如，月桂磷酸鈉等)。
本文提供的組合物可以另外包含以其領域確定的使用水平的，在藥物組合物中通常發(fā)現(xiàn)的其他附屬組分。因此，例如，組合物可以包含另外的相容性藥學活性材料，例如止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑，或可以包含在本發(fā)明的組合物的各種劑型物理學配制中有用的另外材料，例如染料、調(diào)味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩(wěn)定劑。然而，當添加時此類材料不應不適當?shù)馗蓴_本文提供的組合物組分的生物活性。
不管化合物通過其引入患者內(nèi)的方法，膠態(tài)分散系統(tǒng)可以用作遞送媒介物，以增強肽的體內(nèi)穩(wěn)定性和/或使肽靶向特定器官、組織或細胞類型。膠態(tài)分散系統(tǒng)包括但不限于，大分子復合物、納米膠嚢、微球體、珠和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)包括水包油乳狀液、微膠粒、混合微膠粒、
脂質(zhì)體和未表征結構的脂質(zhì)肽復合物。優(yōu)選的膠態(tài)分散系統(tǒng)是多個脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是由脂質(zhì)構成以雙層構型排列的，具有由一個或多個外層圍繞的水核心的微觀球體(一般參見，Chonn等人，Current Op. Biotech.6, 698-708 (1995))。
在某些實施方案中，MNTF肽和MNTF類似物可以摻入生物分布導向部分內(nèi)，或與生物分布導向部分結合使用，所述生物分布導向部分包括一種或多種聚合物，以指導MNTF肽或MNTF類似物或本文提供的其他化合物的生物分布至所需靶的附近，或允許其持續(xù)釋放?；钚詣?包括例如，用于增加治療功效、用于優(yōu)化生物分布和生物利用度、用于減少組織損傷、用于促進愈合、或用于增加患者舒適的化合物；示例性活性劑包括血管活性劑、麻醉劑、用于缺血的治療劑、生長因子和細胞因子。備選地，微顆?；蚣{米顆粒聚合珠劑型可以在本文提供的組合物中使用。本文提供的化合物可以與活性劑組合使用，或連同與其附著的許多配體或抗配體分子一起包裹在顆粒劑型中。
以這種方式，單獨地或與其他活性劑組合的MNTF肽和MNTF類似物以及本文提供的其他化合物隨著時間過去在那個位點處釋放，以提供持續(xù)的治療利益。相對于本發(fā)明實踐中有用的其他活性劑，例如生長因子、細胞因子等，持續(xù)釋放劑型也是有用的?；钚詣谋景l(fā)明的顆粒劑型中的釋放可以由于擴散和顆粒基質(zhì)腐蝕而發(fā)生。生物降解率直接影響活性劑釋放動力學。
在某些實施方案中，本發(fā)明的MNTF肽、MNTF類似物和化合物的控制釋放腸胃外制劑可以制備為植入劑、油性注射劑或作為顆粒系統(tǒng)。顆粒系統(tǒng)包括微球體、微粒、微膠嚢、納米膠嚢、納米球和納米微粒。微膠嚢包含治療蛋白質(zhì)作為中央核心。在微球體中，治療劑分散在顆粒各處。脂質(zhì)體可以用于控制釋放以及誘陷藥物的藥物靶向。
在某些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物，包括MNTF肽和MNTF 類似物可以地方性地、局部地、經(jīng)鼻、經(jīng)口、胃腸道、支氣管內(nèi)、膀
胱內(nèi)、陰道內(nèi)施用到子宮內(nèi)，皮下、肌內(nèi)、關節(jié)周、關節(jié)內(nèi)施用到腦
脊髓液(ICSF)內(nèi)、腦組織內(nèi)(例如顱內(nèi)施用)、脊髓內(nèi)、創(chuàng)傷內(nèi)、腹膜內(nèi)或胸膜內(nèi)，或全身地，例如靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肝門內(nèi)或直接施用到器官內(nèi)。
如本領域已知的，各種導管和遞送途徑可以用于達到冠狀動脈內(nèi) 遞送。例如，適合于在本發(fā)明中使用的各種通用導管以及改良導管可從商業(yè)供應商例如Advanced Cardiovascular Systems ( ACS ) 、 Target Therapeutics和Cordis獲得。同樣地，當給心肌的遞送通過直接注射到冠狀動脈內(nèi)(這是目前最優(yōu)選的)來達到時，如本領域已知的，許多方法可用于將導管引入冠狀動脈內(nèi)。作為舉例說明，導管可以方
內(nèi)。備選地，導管可以首先引入臂或頸動脈內(nèi)并且向后穿過至冠狀動脈。這些和其他技術的詳細描述可以在本領域中找到(參見，例如， Topol， E J (編輯)，The Textbook of Interventional Cardiology, 笫2版(W. B. Saunders Co. 1994 ) ; Rutherford, R B, Vascular Surgery,第3版(W. B. Saunders Co. 1989 ) ; Wyngaarden J B等人(編輯)，The Cecil Textbook of Medicine,第19版(W. B. Saunders, 1992 )',和Sabiston, D， The Textbook of Surgery,第 14版(W. B. Saunders Co. 1991))。
本文提供的化合物可以腸胃外(parentally)施用。有時優(yōu)選某些化合物與藥學上可接受的載體或賦形劑組合，以產(chǎn)生藥物組合物。合適的載體和稀釋劑包括等滲鹽水溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水。組合物可以配制用于腸胃外、肌內(nèi)、大腦內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或經(jīng)皮施用。施用的制劑可以包含此類試劑。這些試劑的例子包括陽離子試劑(例如磷酸釣和DEAE-葡聚糖)和lipofectants (例如lipofectamTM和 transfectam TM)。
用于局部施用的制劑可以包括經(jīng)皮貼劑、軟骨、洗劑、乳貪、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉劑。常規(guī)藥學載體，水、粉末或油基，增稠劑等可能是必需或希望的。包被手套、避孕套等也可能是
有用的。用于口部施用的組合物包括粉劑或顆粒劑、在水或非水介質(zhì) 中的懸浮液或溶液、膠嚢、嚢劑或片劑。增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可能是希望的。用于腸胃外施用的組合物可以包括無菌水溶液，其還可以包含緩沖劑、稀釋劑和其他合適的添加劑。在某些情況下，用肽與其他常規(guī)治療形式結合治療患者可能是更有效的，以便增加治療方案的功效。如本文所使用的，術語"治療方案，，意欲包含治療、姑息和預防形式。
給藥劑量可以取決于許多因素，包括待治療疾病狀態(tài)的嚴重度和應答性，并且療程從數(shù)天持續(xù)至數(shù)月，或直至實現(xiàn)治愈或達到疾病狀態(tài)減少。本文提供的化合物的毒性和治療功效可以通過標準藥學操作
在細胞培養(yǎng)或實驗動物中進行確定。例如，為了確定LDs。(對50%群體致死的劑量)和EDs。(在50%群體中治療上有效的劑量)。毒性和療效之間的劑量比是治療指數(shù)，并且它可以表示為比LD5。/EDs。。顯示出大治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的。盡管可以使用顯示出有毒副作用的化合物，但應慎重設計使此類化合物靶向受累組織位點的遞送系統(tǒng)，以便使對未感染細胞的潛在損害降到最低，并且從而減少副作用。
得自細胞培養(yǎng)測定法和動物研究的數(shù)據(jù)可以在用于在人中使用的劑量范圍配制中使用。此類化合物的劑量優(yōu)選地位于循環(huán)濃度范圍內(nèi)，所述循環(huán)濃度范圍包括具有很少毒性或沒有毒性的ED50。取決于使用的劑型和利用的施用途徑，劑量可以在這個范圍內(nèi)變化。對于在本發(fā) 明的方法中使用的任何化合物，治療有效劑量可以最初由細胞培養(yǎng)測定法進行評估。劑量可以在動物模型中進行配制，以達到包括如在細胞培養(yǎng)中確定的ICs。(即，達到癥狀的半最大抑制的測試化合物的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。此類信息可以用于更精確地確定在人中的有用劑量。在血漿中的水平可以例如通過高效液相層析進行測量。給藥方案可以由患者體內(nèi)的藥物蓄積測量進行計算。劑量可以依單個化合物包括MNTF肽和MNTF類似物的相對功效而變，并且一般可以基于發(fā)現(xiàn)在體外和體內(nèi)動物模型中有效的EC50進行評估。本領域技術人員將認識到，優(yōu)選劑量將以MNTF肽如何和何處施用(例如體外、體內(nèi)、
局部地、全身地等)而變。
例如，在一個方面，可以施用mntf肽和mntf類似物，以在靼位點處(例如在ES干細胞的細胞培養(yǎng)中)達到終濃度約0. 01微克/ml (ju g/ml ) -約1 mg/ml、約0. 1 ju g/raL -約50 m g/mL、約0. 1 ju g/mL -約150 lug/niL、約ljug/mL-約200 ju g/mL、和約0. 1 |j g/mL -約 500 jag/mL,包括在這些范圍內(nèi)的任何范圍。
取決于施用途徑，備選的合適劑量可以例如從約0. lug到高達約 1克的總劑量不同。關于具體劑量和遞送方法的指導在文獻中提供并且對于本領域從業(yè)者一般是可用的。本領域技術人員將利用對于核苷酸與對于蛋白質(zhì)或其抑制劑不同的制劑。類似地，本文提供的多核苷酸、多肽和化合物的遞送將對具體細胞、條件和位置特異。一般而言，劑量一般為0.01 mg/kg- 1000 mg/kg體重，和更一般地，例如，約 0. 1 mg/kg- 300 mg/kg體重，并且可以每天、每周、每月或每年給予一次或多次，或甚至在2-20年的時間間隔期間給予一次或多次。在某些實施方案中，劑量可以從手術后緊接著到24小時給予，在另一個實施方案中；劑量從2小時到高達24小時給予。取決于具體制劑的半衰期和清除率，長效組合物可以每3-4天、每周或每2周進行施用。基于在體液或組織中測量的藥物停留時間和濃度，本領域普通技術人員可以容易地估計用于給藥的重復率。成功治療后，可能希望使患者經(jīng)歷維持療法以預防疾病狀態(tài)的復發(fā)，其中所選化合物以0. 01mg/kg -IOO mg/kg體重的維持劑量施用，每天一次或多次至每20年一次。在某些病狀的治療或預防中，合適的劑量水平一般為約0.001-100 mg/kg患者體重/天，其可以以單次或多次劑量施用。合適的劑量水平可以為約1-約40mg/kg/天。在某些實施方案中，本文提供的化合物，包括MNTF肽和MNTF肽類似物以這樣的量施用以達到下述體內(nèi)濃度在損害位點上約l微摩爾-約l毫摩爾、約IO微摩爾-約500微摩爾、或約30微摩爾-約300微摩爾、和約25微摩爾-約300微摩爾終濃度，并且包括在損害位點上約25微摩爾、或約160微摩爾、或約300 微摩爾終濃度，并且更一般地約l微摩爾-約IOO微摩爾。
本文描述的化合物可以在診斷、治療、預防中、以及作為研究試
劑和在試劑盒中使用。用于檢測目的化合物(例如MNTF肽和MNTF類似物)的方法供應可以常規(guī)地完成。此類供應可以包括酶綴合物、放射性標記或任何其他合適的檢測系統(tǒng)。還可以制備用于檢測目的化合物存在或不存在的試劑盒。
本發(fā)明的化合物還可以用于研究目的。因此，由肽顯示出的特異性雜交可以用于測定法、純化、細胞產(chǎn)物制備和通過本領域普通技術人員可以理解的其他方法中。
除非另有說明，本文使用的技術和科學術語具有本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常理解的含義。本文參考本領域技術人員已知的各種方法?？梢詤⒖嫉年U述此類已知方法的出版物和其他材料整體引入本文作為參考，如詳細闡述一樣。闡述重組DNA技術的一般原理的標準參考著作包括Sambrook, J.，等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press， Planview, N丄(1989 )和Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第3版
(Sambrook和Russel ， 2001 )，在本文中共同和單獨地稱為
"Sambrook，，； McPherson, M. J. ， Ed. ， Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford ( 1991 ) ; Jones, J. ， Amino Acid and Peptide Synthesis, 0xford Science Publications, Oxford
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道了從胚胎前腦獲得并用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞的美國專利號
5,968,829，所述培養(yǎng)基包含葡萄糖、轉鐵蛋白、胰島素、硒、孕酮和幾種其他的生長因子。
盡管在本發(fā)明的執(zhí)行中可以利用技術人員已知的任何合適的材料和/或方法；然而，本文還是描述了非限制性優(yōu)選的材料和/或方法。
本發(fā)明在某些方面可以參考下述實施例進行理解，所述實施例為了舉例說明而不是為了限制而提供。除非另有說明，下述實施例中參考的材料、試劑等可從商業(yè)來源獲得。
實施例l ES細胞分化成運動神經(jīng)元
A.材料與方法
1. 胚胎千(ES)細胞培養(yǎng)
ES細胞從HB9-GFP轉基因小鼠中獲得，并且在采取運動神經(jīng)元表型后發(fā)綠色熒光[Wichterle， H.等人(2000 ) Cel 1 110， 385-397，引入本文作為參考]。在鼠類LIF (Chemicon)的存在下使小鼠ES細胞維持在增殖和未分化的狀態(tài)中。ES細胞在絲裂霉素處理的原代小鼠胚胎成纖維細胞的飼養(yǎng)層上進行培養(yǎng)。
2. 材料
視黃酸(RA)得自Sigma (R-2625 )。音猬(Shh )激動劑Hh-Agl. 3 得自Curis， Inc. (Cambridge, Mass. ) 。 MNTF 6-聚體、7-聚體、10-聚體、11-聚體、21-聚體和33-聚體肽得自CS Bio Company( Menlo Park, CA)，所述CS Bio Company依照由Genervon BiopharmaceuUcals LLC (Montebello， CA )提供的氨基酸序列信息通過固相合成生產(chǎn)肽。
3. 分化方案
使小鼠ES細胞與成纖維細胞的飼養(yǎng)層分離。這通過受胰蛋白酶作用和將細胞混合物鋪板在包被有O. 1%明膠的細胞培養(yǎng)瓶上完成。成纖維細胞特異地附著在明膠上，留下漂浮的ES細胞的純?nèi)后w。收集漂浮的ES細胞并重懸浮于分化培養(yǎng)基中。這個階段被稱為"d-1" 。 ES細胞形成胚狀體(EBs)并且在2U、時后("d0")暴露于RA(1mM)+MNTF
或RA (1mM) +31111激動劑(ljuM) 。 MNTF肽(所有6種形式)以O. 1ju g/ml - 150 n g/ml的終濃度范圍進行測試。分化測定法從"d-r階段起進行6天。
B. 結果
圖2中的顯微照片顯示了在HB9啟動子控制下的eGFP表達。HB9表達是完全分化的運動神經(jīng)元的標記。如圖2中所示，用RA和MNTF 10-聚體或33-聚體處理的EBs表達eGFP并且發(fā)綠色熒光，其程度與用RA和Shh 激動劑處理的EBs相同或更大。數(shù)據(jù)顯示本文提供的MNTF 10-聚體或33 聚體肽在分化過程中是成功的。升高的熒光在MNTF 10-聚體或33聚體低至O. lng/ml的濃度下是可檢測的，并且在這個實驗中，在約10ji g/ml下看起來是最佳的。
C. 結論
在低濃度RA的存在下，MNTF 10-聚體和33-聚體能夠誘導ES細胞分化成分化的運動神經(jīng)元。這些發(fā)現(xiàn)意味著在體外或體內(nèi)用MNTF 10-聚體或33-聚體處理ES、神經(jīng)前體或部分分化的神經(jīng)細胞，可以引導干細胞或干細胞衍生的移植物朝向運動神經(jīng)元表型分化。
實施例2
在Shh抑制劑的存在下MNTF誘導的分化下述實施例證實MNTFi秀導的分化與Shh途徑獨立。 A.材料和方法
1. 材料
環(huán)杷明-KAAD在^oo^ e/3ei/受體處抑制Shh途徑的[3-酮1-.(氨乙基(aminoethy)-氨己?；?二苯丙?；?環(huán)杷明]得自Calbiochem。
2. 實驗方案
ES細胞如上所述進行分化并且在第0天時它們用下述進行處理 RA+Shh-激動劑；RA+Shh激動劑+環(huán)杷明-KAAD ( 5 p M) ; RA + MNTF (33聚體10/jg/ul);和RA +環(huán)杷明-KAAD (5yM) + MNTF ( 33聚體 10Mg/ul)。在添加其他組分前抑制劑進行l(wèi)小時預處理。
3. 測定法
在分化第5天時，就GFP熒光檢查胚狀體，所述GFP焚光指示ES細胞分化成運動神經(jīng)元表型。
B. 結果
環(huán)杷明-KAAD (5uM)阻斷Shh-激動劑對小鼠ES細胞的GFP熒光影響，但不阻斷MNTF誘導的ES細胞分化。
C. 結論
這些結果顯示MNTF1通過與音猬信號轉導途徑獨立的途徑誘導ES 細胞分化成運動神經(jīng)元。
實施例3
響應MNTF的胰島素受體自磷酸化 A.材料和方法
1. 材料
胰島素受體UR)的非特異性抑制劑HNMPA- (AM) 3 (羥基-2-萘甲基磷酸(naphthalenylmethylphosponic acid)三乙酰氧基甲酉旨) 得自Alexis Biochemicals。兔(多克隆)抗-胰島素/胰島素生長因子 -l受體(IR/IGF1R ) [pYpY1162/1163]磷特異性抗體得自Biosource International (Camarillo, CA)。
2. 實驗方案
使胚狀體(EBs)暴露于RA (ljuM) + MNTF 33聚體(lOpg/ml) 或RA (1 u M) + MNTF 33聚體(10 ju g/ml) +/-匪PA- ( AM) 3 ( 50nM)。在0、 15分鐘、30分鐘、l小時、2小時和4小時的時間點上收獲細胞。
3. 蛋白質(zhì)印跡
如前所述收獲細胞[Barber, A. J.等人，(2001 ) L Biol. Chem. 276, 32814-32821]。用Pierce BCA試劑測量蛋白質(zhì)濃度，并且在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳前針對相等蛋白質(zhì)調(diào)整所有樣品.
細胞裂解物用針對磷酸酪氨酸1162-1163 IR/IGFR1的的多克隆抗體根據(jù)制造商的指導或標準技術進行免疫印跡。蛋白質(zhì)條帶通過增強的化學熒光進行檢測。增強的化學熒光免疫印跡的密度計分析用 ImageQuant (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)來進行。
B. 結果
圖3顯示了在用MNTF 33聚體處理并且在IR抑制劑處理的15分鐘內(nèi) 減少自磷酸化的細胞中的IR/IGF-R自磷酸化。
C. 結論
MNTF1處理起始IR/IGF-R介導的信號轉導途徑的活化。
實施例4
MNTF類似物增強干細胞衍生的運動神經(jīng)元的存活 ES衍生的運動神經(jīng)元的存活已通過其他人顯示依賴于神經(jīng)營養(yǎng) 因子，例如NT3、 BDNF、 CNTF和GDNF。例如，參見引入本文作為參考的美國專利申請?zhí)?0/196,882。下述實施例公開了 MNTF肽如何可以用于增強干細胞衍生的運動神經(jīng)元的存活。 A.材料和方法
1. 材料
視黃酸(RA)得自Sigma (R-2625 )。音猬(Shh )激動劑Hh-Agl. 3 得自Curis， Inc. (Cambridge, Mass. ) 。 MNTF 6-聚體、7-聚體、10-聚體、11-聚體、21-聚體和33-聚體肽得自CS Bio Company( Menlo Park, CA ), 所述CS Bio Company依照由Genervon Biopharmaceuticals LLC (Montebello， CA )提供的氨基酸序列信息通過固相合成生產(chǎn)肽。GDNF 和NT3可以得自R&D Systems (Minneapolis, Minnesota),并且dbcAMP 可從Roche Molecular Biochemicals (Indianapolis, IN)獲得。 G,， dbcAMP， NT3。
2. 實驗方案
小鼠胚胎干(ES)細胞在RA和Hg-激動劑(Curis， Inc.)的存在下進行分化。在第4天時，分化的胚狀體用O. 05%胰蛋白酶或膠原酶和分散酶(在PBS中l(wèi) rag/ml)進行部分解離，并且在包被有PLL-層粘連蛋白和基質(zhì)膠的蓋玻片上進行鋪板。
解離的培養(yǎng)物隨后在第5天時用GDNF (10ng/ml)，不同劑量的 (0. 1 ng/ml、 1 ug/ml、 10 ng/ml和50 pg/ml) MNTF (所有7種形式)、和dbcAMP (1 ijM) ， NT3 (10 pg/ml )進行處理。
3.測定法
軸突。在第6、 8和10天時可以如前所述[Harper， J.M.等人(2004 )PNAS 101， 7123-7128，引入本文作為參考]定量神經(jīng)突長出。在第10天時通過計數(shù)具有現(xiàn)有軸突的細胞總數(shù)目計算生存性百分比。
B. 結果
MNTF 10和33聚體在使解離培養(yǎng)物維持培養(yǎng)高達10天方面是有效的。如在圖4中所見，MNTF1肽可與有效的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子如GDNF 比較，并且當與NT3和dbcAMP比較時在增強存活方面可能甚至更佳。
C. 結論
MNTF肽類似物提供了用于ES細胞衍生的運動神經(jīng)元細胞培養(yǎng)的另外生長補充物，并且可以增強移植的ES細胞在體內(nèi)的存活。
實施例5 干細胞制備和維持 A.人胚胎干細胞的制備
胚胎干細胞從靈長類動物種類成員的胚泡中進行分離(參見 Thomson等人，iVa〃. Sc/.USA 92: 7844( 1995 ))。
使用由Thomson等人描述的技術(參見美國專利號5， 843， 780; 5^'e/2ce 282: 1145( 1998 ); CTb/ .紋 38: 133 ff. ( 1998 )
和Reubinoff等人，^ 'o^c力.18: 399 ( 2000 )),可以由人胚泡細胞制備人胚胎干(hES)細胞。例如，人胚泡可以得自人體內(nèi) 植入前胚胎。備選地，可以使用體外受精的(IVF)胚胎，或可以使單細胞人胚胎擴展至胚泡期(Bongso等人，A/邁Aeproif4: 706 ( 1989 )。在一種合適的方法中，在Gl. 2和G2. 2培養(yǎng)基中將胚胎培養(yǎng)至胚泡期 (Gardner等人，,er〃厶 WeW厶 69: 84 ( 1998 )。通過短暫暴露于鏈霉蛋白酶(Sigma )從發(fā)育的胚泡中去除透明帶。內(nèi)細胞群通過免疫外科進行分離，其中使胚泡暴露于l: 50稀釋的兔抗人脾細胞抗血清30分鐘，隨后在DMEM中洗滌3次5分鐘，并且暴露于l: 5稀釋的豚鼠補體(Gibco)3分鐘(Solter等人，"cad Sc/.
72: 5099 ( 1975 )。在DMEM中2次進一步洗滌后通過溫和吸液從內(nèi)細胞群(ICM)中取出細胞，使滋養(yǎng)外胚層裂解，并且將ICM鋪板在mEF飼養(yǎng) 層上。
在約9-15天后使內(nèi)細胞群衍生的長出解離成塊。這可以通過下述來進行，暴露于無鈣和鎂的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)與1 mM EDTA，或暴露于分散酶或胰蛋白酶，或用微量吸管機械解離并隨后在新鮮培養(yǎng)基中在mEF上重新鋪板。顯示出未分化形態(tài)的生長集落通過微量吸管進行個別選擇，機械解離成塊，并重新鋪板。ES樣形態(tài)的特征在于具有明顯地高核質(zhì)比和明顯核仁的緊密集落。所得到的ES細胞隨后通過短暫胰蛋白酶消化，隨后暴露于Dulbecco， s PBS(包含2 mM EDTA )，暴露于IV型膠原酶(約200 U/mL; Gibco )或通過經(jīng)由孩i量吸管選擇單個集落每1 - 2周進行常規(guī)分離。約50- IOO個細胞的塊大小是最佳的。
B.人胚胎生殖細胞的制備
人胚胎生殖(hEG )細胞可以從人胎兒材料中存在的原生殖細胞制備，所述胎兒材料在末次月經(jīng)日期后約8-11周獲取。合適的制備方法在Shamblott等人，尸roc.iV"/.JcacT.Sc/. 95: 13726
(1998 )和美國專利號6, 090, 622中得到描述。
生殖嵴用等滲緩沖液進行漂洗，隨后置于0.1 mL 0. 05%胰蛋白酶/0. 53mM鈉EDTA溶液(BRL)內(nèi)并切成<1鵬3的厚塊。隨后通過100 liL吸頭(Up)吸取組織以使細胞進一步分解。它于37t:溫育約5 分鐘，隨后加入約3. 5 mL EG生長培養(yǎng)基。EG生長培養(yǎng)基可以包含下述DMEM， 4500 mg/L D-葡萄糖，2200 mg/L mM Na跳；15MES合格的胎牛血清(BRL); 2mM谷氨酰胺(BRL) ; 1 mM丙酮酸鈉(BRL ); 1000 - 2000 U/mL人重組白血病抑制因子(LIF， Genzyme); 1 - 2 ng/ml 人重組bFGF ( Genzyme );和10 yM福司柯林(在10。/。 DMSO中)。
備選地，使用透明質(zhì)酸酶/膠原酶/DNA酶分離EG細胞。從胎兒材料中切下生殖腺原基或生殖嵴與腸系膜，在PBS中漂洗生殖嵴，隨后置于0. 1 ml HCD消化溶液(0. 01%透明質(zhì)酸酶V型，0. 002 。/。DNA酶I,0.1。/。膠原酶IV型，全部得自Sigma并且在EG生長培養(yǎng)基中制備)。將組織切碎，于37。C溫育1小時或過夜，重懸浮于1-3 mL EG生長培養(yǎng)基，并且鋪板在飼養(yǎng)層上。
隨后用亞匯合的飼養(yǎng)細胞層(例如，STO細胞，ATCC號CRL 1503 ) 制備96孔組織培養(yǎng)平板，其一般在用5000拉德y-照射滅活的，不含 LIF、 bFGF或福司柯林的改良EG生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天。向每個孔中加入約0. 2mL原生殖細胞(PGC)懸浮液。在7-10天后在EG生長培養(yǎng)基中完成第一次傳代，將每個孔轉移至先前用受照射的STO小鼠成纖維細胞制備的24孔培養(yǎng)皿的1個孔。培養(yǎng)細胞，每天更換培養(yǎng)基，直至觀察到與EG細胞一致的細胞形態(tài)，一般在7 - 30天或1 - 4代后。
C.未分化狀態(tài)的pPS細胞的繁殖
在促進增殖而不促進分化的條件下，pPS細胞可以在培養(yǎng)中連續(xù)繁殖。示例性含血清ES培養(yǎng)基含有80。/。DMEM (例如Knock-Out DMEM， Gibco) , 20%限定的胎牛血清(FBS, Hyclone)或血清替代物(WO 98/30679 )， 1%非必需氨基酸，lmML-谷氨酰胺，和O.lmMp-巰基乙醇。緊在使用前，加入人bFGF至4 ng/mL(WO 99/20741, Geron Corp.)。
一般地，ES細胞在飼養(yǎng)細胞層(例如衍生自胚胎或胎兒組織的成纖維細胞)上進行培養(yǎng)。在妊娠13天后從CF1小鼠中收獲胚胎，轉移至2mL胰蛋白酶/EDTA，切碎，并于37"C溫育5分鐘。加入10% FBS，允許碎片沉降，并且使細胞在90% DMEM、 10% FBS和2 mM谷氨酰胺中進行繁殖。為了制備飼養(yǎng)細胞層，照射細胞以抑制增殖但允許合成支持es細胞的因子(約4000拉德y -照射)。培養(yǎng)平板用0. 5 %明膠包被過夜，用375， 000受照射的mEFs/孔進行鋪板，并且在鋪板后5 小時-4天之間使用。緊在種植pPS細胞前將培養(yǎng)基替換為新鮮的hES 培養(yǎng)基。
無飼養(yǎng)者的培養(yǎng)物在營養(yǎng)培養(yǎng)基中得到支持，并且一般通過培養(yǎng) 受照射的原代小鼠胚胎成纖維細胞、端?；?telomerized)小鼠成纖維細胞、或衍生自pPS細胞的成纖維細胞樣細胞進行適應。培養(yǎng)基可以通過使飼養(yǎng)者以約5-6xl04 cm2的密度在無血清培養(yǎng)基例如KODMEM中鋪板進行適應，所述K0 DMEM補充有20 %血清替代物和4 ng/mL bFGF。已適應1-2天的培養(yǎng)基補充有進一步的bFGF，并且用于支持 pPS細胞培養(yǎng)物1 - 2天。
ES細胞出現(xiàn)高核/質(zhì)比，明顯核仁，和具有弱可辨別細胞連接的緊密集落形成。靈長類動物ES細胞表達階段特異性的胚胎抗原(SSEA3 和SSEA4)，和使用命名為Tra-1-60和Tra-1-81的抗體可檢測的標記(Thomson等人，Science 282: 1145， 1998 )。小鼠ES細胞可以用作關于SSEA-1的陽性對照，和關于SSEA-4、 Tra-1-60和Tra-1-81 的陰性對照。SSEA-4始終存在于人胚胎性癌(hEC)細胞上。pPS細胞的體外分化導致SSEA-4、 Tra-1-60和Tra-1-81表達的喪失，以及 SSEA-1表達的增加。SSEA-1也在hEG細胞上發(fā)現(xiàn)。
D.制備神經(jīng)前體和終末分化細胞
本文提供的某些神經(jīng)前體細胞通過在特定的培養(yǎng)環(huán)境中使干細胞培養(yǎng)、分化或編程來獲得，所述培養(yǎng)環(huán)境富集具有所需表型的細胞。這些方法可應用于許多類型的干細胞，包括本文描述的靈長類動物多能干(pPS)細胞。神經(jīng)元細胞分化一般在包含合適底物的培養(yǎng)環(huán)境中發(fā)生，并且添加包含分化試劑的營養(yǎng)培養(yǎng)基。合適的基質(zhì)包括用正電荷包被的固體表面，例如堿性氨基酸，由聚-L-賴氨酸和多鳥氨酸示例。底物可以用細胞外基質(zhì)組分包被，由纖連蛋白示例。其他允許的細胞外基質(zhì)包括Matrigel. RTM (來自Engelbreth-Holm-Swarm腫瘤細胞的細胞外基質(zhì))、層粘連蛋白和組合底物，例如與纖連蛋白、層粘連蛋白或兩者組合的聚-L-賴氨酸。
分化細胞可以基于表型特征進行分選以富集某些群體。細胞分選可以通過下述進行使群體中的細胞和與神經(jīng)細胞特有的標記結合的抗體或配體接觸，隨后分離特異性識別的細胞與群體中的其他細胞。一種方法是其中特異性抗體與固體表面偶聯(lián)的免疫淘選。使細胞與表面接觸，并且洗掉不表達標記的細胞。結合細胞隨后通過更劇烈的洗脫進行回收。這種的變體是親和層析和抗體介導的磁性細胞分選。在一般的分選操作中，使細胞與特異性初級抗體接觸，并且隨后用與磁
珠接觸的次級抗免疫球蛋白試劑捕獲，可以對所述磁珠實施磁場以回收粘著細胞。
另一種合適的分離方法是熒光激活細胞分選，其中表達標記的細胞用特異性抗體(例如經(jīng)由熒光標記的次級抗免疫球蛋白)進行標記，并且使用合適的分選儀器根據(jù)結合標記的量進行分離。這些方法中的任何一種都是合適的，以允許分化和回收具有目的標記的陽性選擇的細胞群，和沒有被陽性選擇的足夠密度或易接近性的特定標記的陰性
選擇的細胞群。陰性選擇還可以通過下述來進行使細胞順次與特異性抗體溫育以產(chǎn)生群體細胞，當抗體在補體制劑的存在下已結合時，所述群體細胞將裂解。分化細胞群的分選可以在任何時候發(fā)生，但優(yōu) 選地在分化過程起始后不久。
細胞可以根據(jù)許多表型標準進行表征。該標準包括但不限于，形態(tài)特征的顯微鏡觀察，表達的細胞標記的檢測或定量，酶促活性，或神經(jīng)遞質(zhì)及其受體，和電生理功能。
本發(fā)明中包含的某些細胞具有神經(jīng)元細胞或膠質(zhì)細胞特有的形態(tài) 特征。在此類細胞存在的評估中該特征由技術人員容易地理解。例如，神經(jīng)元的特征是小細胞體，和暗示軸突和樹突的多個突起。本發(fā)明的細胞還可以根據(jù)其是否表達各種種類的神經(jīng)細胞特有的表型標記進行表征。
合適的標記包括但不限于，神經(jīng)元特有的p-微管蛋白III，微管相關蛋白2 (MAP-2)或神經(jīng)纖絲；星形膠質(zhì)細胞中存在的神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì)(GFAP);少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞特有的半乳糖腦苷酯
(GaIC)或髓磷脂堿蛋白(MBP);未分化的hES細胞特有的Oct-4; 神經(jīng)群體及其他細胞特有的巢蛋白；以及A2B5和聚唾液酸化的NCAM
(這些標記有時可以顯示在其他細胞類型上，例如肝或肌細胞)。P-微管蛋白111先前被認為對神經(jīng)細胞特異，但已發(fā)現(xiàn)hES細胞的亞群也是p-微管蛋白III陽性的。MAP-2是關于各種類型的完全分化的神經(jīng)元更嚴格的標記。
本文描述的或本領域已知的組織特異性標記可以使用已知的免疫
學技術進行檢測，包括例如用于細胞表面標記的流式免疫細胞化學，用于細胞內(nèi)或細胞表面標記的免疫組織化學(例如，固定細胞或組織切片的)，細胞提取物的蛋白質(zhì)印跡分析，和用于細胞提取物或分泌到培養(yǎng)基內(nèi)的產(chǎn)物的酶聯(lián)免疫測定法(例如酶聯(lián)免疫吸附測定法
(ELISA))。由細胞表達的抗原被說成是"抗體-可檢測的"，如果顯著可檢測量的抗體在標準免疫細胞化學或流式細胞計量測定法中將與抗原結合，包括在細胞固定后，并且任選地使用標記的次級抗體或其他綴合物(例如生物素-抗生物素蛋白綴合物)以擴增標記。
組織特異性基因產(chǎn)物表達也可以在mRNA水平上進行檢測，例如通過RM印跡分析、斑點印跡雜交分析、或通過逆轉錄酶起始的聚合酶鏈式反應(RT-PCR)(參見美國專利號5， 843， 780 )。本發(fā)明的特定神經(jīng)前體細胞群的分化(例如使用運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)或MNTF 類似物)可以產(chǎn)生至少20% 、 30%、 40%或超過50%MAP-2陽性的細胞群。大比例，如5%、 10%、 25%、或更多的NCAM或MAP-2陽性細胞將能夠合成神經(jīng)遞質(zhì)，例如乙酰膽堿、甘氨酸、谷氨酸鹽、去曱腎上腺素、血清素或GABA。某些細胞群包含0.1%和可能1%、 3%、或 5%或更多(在細胞計數(shù)基礎上)的NCAM或MAP-2陽性細胞，通過免疫細胞化學或mRNA表達測量的，所述陽性細胞對于酪氨酸羥化酶(TH ) 是陽性的。這一般在本領域中被視為關于多巴胺合成細胞的標記。
實施例6
鼠類胚胎干細胞通過MNTF分化成運動神經(jīng)元在這個實施例中，此處顯示在視黃酸的存在下，在鼠類ES細胞體外分化成運動神經(jīng)元方面，合成的33聚體MNTF肽(SEQ ID NO: 1) 和10聚體MNTF肽(SEQ ID NO: 4 )有效替代音猬。
受體激酶研究用于測量匪TF對于胰島素受體(IR )的親和力。結果顯示MNTF具有對于胰島素受體(IR)和胰島素樣生長因子受體 (IGF-1R)的親和力。隨后測試通過這些途徑中任一的信號在運動神經(jīng)元產(chǎn)生中是否是可能的。圖5顯示^^oMe/2^/受體信號的特異性抑制劑環(huán)杷明-KAAD (5uM)阻斷Shh對小鼠ES細胞的影響，但不阻斷 MNTF誘導ES細胞分化的活性。因此，MNTF仍能夠產(chǎn)生有絲分裂后的
成熟運動神經(jīng)元。
圖5舉例說明在分化第5天時在運動神經(jīng)元特異性HB9啟動子的
控制下，響應對照(A)， RA(B); RA/Shh(C);環(huán)杷明-KAAD, RA/Shh (D) ; RA和MNTF 33聚體(E);環(huán)杷明-KAAD, RA和MNTF 33聚體 (F)的GFP熒光表達比較。這個數(shù)據(jù)指出MNTF i)通過與Shh完全
不同的途徑發(fā)信號，或ii) 2種途徑會聚于s/z700^ e/2ecT的下游。
圖6顯示胰島素受體特異性酪氨酸激酶抑制劑HNMPA( AM) 3阻斷
MNTF對小鼠ES細胞的影響，但不阻斷Shh誘導ES細胞分化的活性。
如通過第5天胚狀體響應下述的GFP熒光表達指示的，IGF1-R抑制劑
picrodophyllin不能有效阻斷MNTF誘導分化的活性RA/Shh(A);
RA/MNTF33 (B) ; RA/MNTF10 ( C );醒PA ( AM) 3 (15yM) /Shh ( D );
■PA ( AM) 3/MNTF33 (E);匪PA ( AM) 3細TF10 ( F ) ; PPP(luM)，
RA/Shh(G); PPP(lyM)， RA/MNTF33 ( h ) ; PPP(1ijM)， RA/MNTF10 (I )。 ES細胞的MNTF處理導致Tyr972和Tyrl162/1163的自磷酸化，
這是IR活化的標記。免疫沉淀
還執(zhí)行免疫共沉淀研究。來自胰島素刺激的、IGF-I刺激的、或 MNTF-33聚體(10ug/ml )第0天ES細胞的核后上清液對于總蛋白質(zhì) 的量(8 mg)進行標準化。使裂解物與5-jag抗IRS-1抗體一起于4 'C溫育4小時，并且通過添加30 jal 50%蛋白A瓊脂糖漿捕獲免疫復合物。用冷裂解緩沖液洗滌4次后，將團塊重懸浮于SDS-PAGE樣品緩沖液中并煮沸5分鐘。蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE (10% )進行分離并且通過電印跡轉移到PVDF膜上。使膜在阻斷溶液(TBST， 3%奶粉)中在室溫下溫育1小時，隨后與下述抗體之一溫育抗PI-3激酶p85 亞單位(在TBST中1 jug/ml, 3%乳，于41c過夜)。將蛋白質(zhì)轉移至在20%曱醇轉移緩沖液中的Immobilon-P轉移膜(Millipore， Bedford, MA)。蛋白質(zhì)印跡用SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce, Rockford， IL)顯色，并且用Fuji
Luminescent Image Analyzer ( LAS-1000plus camera; Fuji, Tokyo, Japan)顯現(xiàn)。每個條帶的強度通過Image Gauge軟件(版本3. 4 )進行測定。
免疫共沉淀研究顯示特異性SH2結構域與IR(關于PI3激酶的p85 亞單位)的結合起因于對ES細胞的MNTF處理。
本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)進一步顯示阻斷IGF-1R對MNTF產(chǎn)生運動神經(jīng)元的能力沒有影響，但阻斷IR消除了這種能力。這些結果支持下述想法 MNTF是能夠通過Shh非依賴性、IR依賴性途徑產(chǎn)生并支持運動神經(jīng)元的新因子。
MNTF的信號轉導-生物化學方法
這個實驗的目的是證實MNTF通過胰島素受體發(fā)信號。圖7顯示其中 ES細胞用IGF-1 U0nM)(泳道l)、胰島素(lOOnM)(泳道2 ) 、 MNTF6 (泳道3) 、 MNTF 10 (泳道4)和MNTF33 (泳道5 )處理5分鐘的實驗結果。隨后使裂解物與蛋白A珠和抗IRS-1抗體一起溫育。免疫復合物通過SDS-PAGE (10% )進行分離，轉移至膜，并且通過蛋白質(zhì)印跡使用針對PI3激酶的p85亞單位的抗體進行分析。隨后使裂解物與蛋白A珠和抗IRS-1抗體一起溫育。免疫復合物通過SDS-PAGE (10% )進行分離，轉移至膜，并且通過蛋白質(zhì)印跡使用針對PI3激酶的p85亞單位的抗體進行分析。
就召募至IRS-1的含SH2蛋白質(zhì)的補充而言，在IR和IGF-IR受體之間存在差異。特別地，IGF-IR看起來偶聯(lián)IRS-l優(yōu)先于Grb2，而相比之下，IR看起來偶聯(lián)IRS-1優(yōu)先于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3激酶) 的p85亞單位和Nck。 2種受體偶聯(lián)IRS-1與酪氨酸激酶SHP2相等。在IRS-1上存在3個重要的酪氨酸磷酸化位點(pY608、 pY895和 pY1172 )。在pY608的情況下，Amoui等人顯示關于IRS-1通過2種受體差異磷酸化的證據(jù)，即Y608在IGF1-R刺激的細胞中更多磷酸化。 Amoui等人，/. f油cr/加/o^F. ， 171 ( 1 ): 153-62 ( 2001 )。
這些結果支持下述想法IR和IGF-IR的胞漿結構域在其固有信號潛能方面具有差異。記住這點，ES細胞在無血清環(huán)境中用MNTF進
行誘導，并且使裂解物與抗IRS-1及其相應的SH2結構域，例如分別地PI3K和Grb2的p85亞單位一起進行免疫共沉淀。 A， Shh和MNTF途徑的共同會聚。
這個實驗的目的是確定Shh和MNTF信號的共同下游效應子。近來注意到在雞神經(jīng)外植體、10Tl-2細胞的軟骨形成分化、和NIH3T3細胞中的Gli活化中神經(jīng)元命運的指定中，磷酸肌醇3-激酶(PI3激酶)依賴性Akt活化對于音猬(Shh)信號是必需的。RioboNA，等人，P. N. A. S. U S A， 103 ( 12 ) : 4505-10 ( 2006 )。通過胰島素樣生長因子I刺激 PI3激酶-Akt使得能夠通過低水平的Shh誘導Gli活化；然而，胰島素樣生長因子I單獨不足以誘導Gli依賴性轉錄。通過突變鑒定的，蛋白激酶A (PKA)和糖原合酶激酶3-在多個位點上順次使Gli2磷酸化，因此導致其轉錄活性降低。其中主要的PKA和糖原合酶激酶3-磷酸化位點被突變?yōu)楸彼岬腉li2突變蛋白保持完全轉錄活性；然而，PKA-突變體 Gli2不依賴于Akt信號起作用，指出Akt通過控制PKA介導的Gli滅活正向調(diào)節(jié)Shh信號。圖8舉例說明關于MNTF誘導的ES細胞分化的可能途徑。
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本文描述的具體方法和組合物是優(yōu)選實施方案的代表，并且是示例性的而不意欲作為對本發(fā)明范圍的限制。考慮本說明書后，其他目的、方面和實施方案將被本領域技術人員想到，并且包含在如由權利要求范圍限定的本發(fā)明的精神內(nèi)。對于本領域技術人員顯而易見的是，無需背離本發(fā)明的范圍和精神，可以進行本文公開的本發(fā)明的各種替代和修改。本文舉例說明性描述的本發(fā)明適當?shù)乜梢栽诓淮嬖诒疚奈?具體公開為必需的任何一種或多種元件，或一種或多種限制的情況下進行實踐。因此，例如，在本文的每種情況下，在本發(fā)明的實施方案或實施例中，術語"包含"、"基本上由……組成"和"由……組成"
中的任何一個在說明書中都可以替換為其他2個術語中的任一。同樣地，術語"包含"、"包括"、"含有"等應被廣泛而且沒有限制地
序進行實踐，并且它們不必限制于本文或權利要求中指出的步驟順序。同樣如本文和附加權利要求中所使用的，除非上下文另有明確說明，單數(shù)形式"一種"、"一個"和"所述"等包括復數(shù)參考。該專利決不能被解釋為限制于本文具體公開的具體實施例或實施方案或方法。該專利決不能被解釋為受由專利商標局的任何審查者或任何其他官員或雇員進行的任何陳述限制，除非此類陳述由申請人以回答的書面形式特別地而沒有限定或保留明確地采用。
已使用的術語和表達作為描述性而非選擇性的術語使用，并且在
其部分，但應認識到在如要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)的各種修改是可能的。因此，應當理解盡管本發(fā)明已通過優(yōu)選實施方案和任選特征具體公開，但本領域技術人員可以采用公開的本文概念的修改和變化，并且此類修改和變化被視為在如由附加權利要求限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明已在本文中得到廣泛和一般地描述。屬于一般公開內(nèi)容的更窄的種類和亞一般分類中的每一種也可形成本發(fā)明的部分。這包括本發(fā)明的一般描述，條件或負面限制是從種類中去除任何主題，不管刪除的材料是否在本文中具體引用。
其他實施方案在下述權利要求內(nèi)。此外，當本發(fā)明的特征或方面按照Markush組進行描述時，本領域技術人員將認識到本發(fā)明因此也按照Markush組的任何個別成員或成員亞組進行描迷。
權利要求
1.治療神經(jīng)元病癥的方法，其包括施用運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，從而調(diào)節(jié)不依賴于音猬途徑的信號轉導途徑，其中所述運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物以足以治療神經(jīng)元病癥的量施用。
2. 權利要求l的方法，其中所述MNTF類似物長度為6"" 35個氨基酸。
3. 權利要求l的方法，其中所述MNTF類似物長度為6-33個氨基酸。
4. 權利要求l的方法，其中所述MNTF類似物長度為33個氨基酸。
5. 權利要求3的方法，其中所述MNTF類似物具有根據(jù)SEQ ID NO: 1 的序列。
6. 權利要求l的方法，其中所述匪TF類似物長度為10個氨基酸。
7. 權利要求5的方法，其中所述MNTF類似物具有根據(jù)SEQ ID N0: 4 的序列。
8. 權利要求l的方法，其中所述MNTF類似物長度為6個氨基酸。
9. 權利要求7的方法，其中所述MNTF類似物具有根據(jù)SEQ ID N0: 2 的序列。
10. 權利要求l的方法，其包括促進哺乳動物神經(jīng)元的存活、生長、增殖或維持。
11. 權利要求l的方法，其中所述MNTF類似物的施用充當神經(jīng)保護劑。
12. 權利要求l的方法，其中所述MNTF類似物的所述施用改善或抑制神經(jīng)元病癥的進展。
13. 權利要求l的方法，其中所述方法調(diào)節(jié)細胞的特定分化途徑。
14. 權利要求l的方法，其中蛋白激酶途徑通過音猬非依賴性途徑進行調(diào)節(jié)，以改善或抑制所述神經(jīng)元病癥的所述進展。
15. 權利要求l的方法，其中所述MNTF類似物能夠在體外刺激胰島素受體的Tyr972和Tyrll62/1163的自磷酸化。
16. 權利要求l的方法，其中分化途徑得到調(diào)節(jié)，其中所述途徑不依賴于由音猬蛋白與patched受體的結合和猬依賴性信號轉導的相關促進觸發(fā)的信號轉導事件。
17. 權利要求l的方法，其中分化途徑得到調(diào)節(jié)，其中所述途徑部分不依賴于由音猬蛋白與patched受體的結合和猬依賴性信號轉導的相關促進觸發(fā)的信號轉導事件。
18. 權利要求l的方法，其中除了主要分化途徑外，猬途徑也得到調(diào)節(jié)。
19. 權利要求l的方法，其中所述方法通過音猬非依賴性途徑促進神經(jīng)元的分化、維持或存活。
20. 權利要求l的方法，其中所述方法通過音猬非依賴性途徑促進運動神經(jīng)元的分化、維持或存活。
21. 權利要求l的方法，其中所述MNTF類似物調(diào)節(jié)酪氨酸激酶或生長因子受體的表達或活性。
22. 權利要求l的方法，其中所述MNTF類似物調(diào)節(jié)選自下述的一種或多種蛋白質(zhì)的表達或活性胰島素受體、IGF-1受體、IGF-2受體、Shh、 Akt、 Bad( bcl-2的細胞死亡拮抗劑)、PI( 3， 4， 5 )P3依賴性激酶l( PDK1 )、 Bax、 p53基因產(chǎn)物、pp60-Src、 JAK2、一氧化氮合酶(NOS)、糖原合酶激酶3 (GSK)、半胱天冬酶、PI3激酶(磷脂酰肌醇3-激酶)和Ras。
23. 權利要求l的方法，其中所述運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物調(diào)節(jié)與酪氨酸-磷酸化的IRS-蛋白質(zhì)結合的一種或多種蛋白質(zhì)的表達或活性。
24. 權利要求23的方法，其中一種或多種下述蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)IRS-1、 IRS-2、 IRS-3和IRS-4。
25. 權利要求23的方法，其中一種或多種下述蛋白質(zhì)的表達或活性得到調(diào)節(jié)PI3激酶、p85、 PllO、 GRB2、 SHP2、 Nck、 Crk和Fyn。
26. 權利要求23的方法，其中所述胰島素受體的表達或活性得到調(diào)節(jié)。
27. 權利要求23的方法，其中IGF-1受體的所述表達或活性得到調(diào)節(jié)。
28. 權利要求23的方法，其中IGF-2受體的表達或活性得到調(diào)節(jié)。
29. 權利要求l的方法，其中所述MNTF類似物調(diào)節(jié)PI3激酶的表達或活性。
30. 權利要求l的方法，其中所述MNTF類似物的施用使周圍神經(jīng)再生。
31. 權利要求l的方法，其中所述MNTF類似物的施用使脊髓中的軸突再生。
32. 權利要求l的方法，其中所述MNTF類似物的施用穿透血腦屏障。
33. 權利要求l的方法，其中所述MNTF類似物的施用促進細胞的分化。
34. 權利要求l的方法，其中所述MNTF類似物的施用增強耙神經(jīng)元細胞的存活。
35.權利要求l的方法，其中所述MNTF類似物的施用增強腦血流量。
36.權利要求l的方法，其中脊髓損傷得到治療。
37.權利要求l的方法，其中神經(jīng)變性疾病得到治療。
38.權利要求l的方法，其中中風或腦缺血癥得到治療。
39.權利要求l的方法，其中亨廷頓氏病得到治療。
40.權利要求l的方法，其中帕金森氏病得到治療。
41.權利要求l的方法，其中多發(fā)性硬化癥得到治療。
42.權利要求l的方法，其中ALS得到治療。
43.權利要求l的方法，其中阿爾茨海默氏得到治療。
44.權利要求l的方法，其中糖尿病神經(jīng)病變得到治療。
45.用于促進神經(jīng)元的生長、維持或分化的藥物組合物，所述組合物包含長度為6-35個氨基酸的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，其中所述運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(匪TF)類似物在體外或體內(nèi)刺激所述胰島素受體的Tyr972和Tyrll62/1163的自磷酸化。
46. 根據(jù)權利要求45的組合物，其進一步包含至少一種生長因子。
47. 根據(jù)權利要求45的組合物，其中所述生長因子選自胰島素受體、 IGF-1受體、IGF-2受體、Shh、 Akt、 Bad ( bcl-2的細胞死亡拮抗劑)、 PI (3， 4， 5) P3依賴性激酶l (PDK1) 、 Bax、 p53基因產(chǎn)物、pp60-Src、 JAK2、一氧化氮合酶(N0S)、糖原合酶激酶3 (GSK)、半胱天冬酶、 PI3激酶(磷脂酰肌醇3-激酶)和Ras。
48. 用于促進神經(jīng)元的生長、維持或分化的藥物組合物，所述組合物包含與抗抑郁化合物組合的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子類似物。
49. 從干細胞群誘導星形膠質(zhì)細胞的方法，其包括給所述千細胞群施用長度為6-35個氨基酸的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物。
50. 治療神經(jīng)元病癥的方法，其包括給患者施用長度為6-32個氨基酸的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，其量有效調(diào)節(jié)音猬非依賴性途徑以改善或抑制所述神經(jīng)元病癥的進展。
51. 使神經(jīng)干細胞后代分化并移植給宿主的方法，其包括i)獲得衍生自哺乳動物神經(jīng)組織、包含至少一種多潛能CNS神經(jīng)干細胞的細胞群；ii)在包含長度為6-35個氨基酸的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF) 類似物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述神經(jīng)干細胞，所述MNTF類似物在合適的培養(yǎng) 條件下誘導多潛能神經(jīng)干細胞增殖；iii)誘導所述多潛能神經(jīng)干細胞增殖，以產(chǎn)生包括多潛能神經(jīng)干細胞后代細胞的神經(jīng)干細胞后代；和iv) 將所述神經(jīng)干細胞后代移植給所述宿主。
52. 用于誘導培養(yǎng)中的干細胞的方法，其通過以足以誘導所述細胞分化成神經(jīng)元細胞表型的量提供6- 35個氨基酸的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物。
53. 治療神經(jīng)元病癥的方法，其包括給患者施用長度為6-35個氨基酸的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物，其中所述MNTF類似物在體外激活所述胰島素受體UP)，由此抑制所述神經(jīng)元病癥的進展。
54. 治療神經(jīng)元病癥的方法，其包括給患者施用長度為6-35個氨基酸的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(腦TF)類似物，其中在體外用所述MNTF類似物處理ES細胞導致所述胰島素受體(IP)的自磷酸化，由此抑制所述神經(jīng)元病癥的所述進展。
55. 用于從人胚胎干細胞(hES)生產(chǎn)神經(jīng)干細胞群的方法，其包括在包含長度為6-35個氨基酸的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)類似物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)hES細胞，從而產(chǎn)生其中至少50%的所述細胞表達神經(jīng)元細胞標記的群體。
56. 權利要求55的方法，其中所述群體中表達神經(jīng)元細胞標記的所述細胞包含至少5 5 %的所述細胞。
57. 權利要求55的方法，其中所述群體中表達神經(jīng)元細胞標記的所述細胞包含至少60%的所述細胞。
58. 權利要求55的方法，其中所述群體中表達神經(jīng)元細胞標記的所述細胞包含至少65 %的所述細胞。
59. 權利要求55的方法，其中所述群體中表達神經(jīng)元細胞標記的所述細胞包含至少70%的所述細胞。
60. 權利要求55的方法，其中所述群體中表達神經(jīng)元細胞標記的所述細胞包含至少80%的所述細胞。
61. 權利要求55的方法，其中所述群體中表達神經(jīng)元細胞標記的所述細胞包含至少90%的所述細胞。
62. 權利要求55 - 62中任一項的方法，其中所述神經(jīng)元細胞標記或控制標記選自NCam、 NeuN、 HB9、 ChAT、 p-微管蛋白III、微管相關蛋白2 (MAP-2)、神經(jīng)纖絲蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì)(GFAP)、半乳糖腦苷酯(GaIC)、髓磷脂堿蛋白(MBP) 、 0ct-4、未分化的hES 細胞的特征、巢蛋白、A2B5和聚唾液酸化的NCAM。
63. 鑒定對于促進運動神經(jīng)元的生長或存活有用的化合物的方法，所述方法包括i)制備包含候選化合物的樣品，ii)使細胞與所述樣品接觸，iii)測定涉及信號轉導途徑的化合物的表達或活性是否得到調(diào) 節(jié)，和iv)測定所述樣品是否能夠促進運動神經(jīng)元的所述生長或存活。
64. 根據(jù)權利要求63的方法，其中步驟iii)包括測定所述樣品是否在體外或體內(nèi)刺激所述胰島素受體的Tyr972和Tyrll62/1163的自磷酸化。
65. 根據(jù)權利要求63的方法，其進一步包括測定所述樣品是否調(diào)節(jié) MNTF信號轉導途徑。
66. 根據(jù)權利要求63的方法，其進一步包括測定所述樣品是否調(diào)節(jié) 選自下述的一種或多種蛋白質(zhì)的表達或活性胰島素受體、IGF-1受體、 IGF-2受體、Shh、 Akt、 Bad ( bcl-2的細胞死亡拮抗劑)、PI ( 3， 4， 5 ) P3依賴性激酶l (PDK1) 、 Bax、 p53基因產(chǎn)物、pp60-Src、 JAK2、一氧化氮合酶(NOS)、糖原合酶激酶3 (GSK)、半胱天冬酶、PI3激酶(磷脂酰肌醇3-激酶)和Ras。
67. 根據(jù)權利要求63的方法，其進一步包括測定所述候選化合物是否受MNTF類似物調(diào)節(jié)。
68. 促進運動神經(jīng)元的生長或存活的方法，其包括施用通過權利要求63的方法鑒定的化合物。
69. 治療神經(jīng)元病癥的方法，其包括施用通過4又利要求63的方法鑒定的化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了使用運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子(MNTF)或其肽類似物用于誘導胚胎干細胞分化成運動神經(jīng)元的方法。本發(fā)明進一步提供了用于分離干細胞衍生的運動神經(jīng)元的群體和包含分化的神經(jīng)細胞的細胞群的方法。此外，本發(fā)明指向增強分化的神經(jīng)細胞在長期細胞培養(yǎng)中的存活的方法。最后，本發(fā)明提供了與干細胞結合用于治療用途的包含MNTF或其肽類似物的組合物。
文檔編號A61K38/00GK101374537SQ200680041827
公開日2009年2月25日申請日期2006年11月10日優(yōu)先權日2005年11月10日
發(fā)明者D·A·科爾, D·M·德施潘德, P-Y·D·寇申請人:健能萬生物制藥公司

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