專利名稱：：疫苗施用方法、新貓杯狀病毒、及抗貓細(xì)小病毒和貓皰疹病毒的動(dòng)物免疫方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及提供新的向各種動(dòng)物施用各種疫苗的方式。本發(fā)明公開(kāi)幾種分離的貓杯狀病毒(felinecaliciviruses，F(xiàn)CV)。還^>開(kāi)將FCV疫苗呈遞給貓的新方法。本發(fā)明還涉及編碼貓杯狀病毒的核酸克隆。涉及FCV衣殼蛋白、活的或死的疫苗、包含衣殼蛋白的亞單位疫苗、核酸疫苗、和包含編碼分離的貓杯狀病毒的衣殼蛋白的核酸的重組病毒載體疫苗。本發(fā)明也涉及鑒定可在疫苗組合物的制備中及在診斷感染貓杯狀病毒的貓的試驗(yàn)中使用的貓杯狀病毒的方法。本發(fā)明也提供將新的和老的FCV疫苗施用給貓的新方式。
背景技術(shù)：
：杯狀病毒據(jù)報(bào)道是貓的一種重要的致病因素?？梢杂^察到多種癥狀，例如發(fā)燒、鼻炎、打噴噢、輕微的結(jié)膜炎、眼屎、在外鼻孔、口腔粘膜中或在舌上出現(xiàn)皰嚢、肺炎、氣管支氣管炎、腹瀉、肌肉疼痛、離子通道閘門僵直(stiffgate)以及感覺(jué)過(guò)敏。機(jī)會(huì)細(xì)菌感染常常伴隨FCV感染，這使得治療和痊愈變得復(fù)雜化。嚴(yán)重的FCV感染可以導(dǎo)致死亡，尤其是在幼貓中。應(yīng)當(dāng)注意，這些征候，盡管據(jù)報(bào)道在天然情況下是常見(jiàn)的，但是在實(shí)驗(yàn)性感染中并不總是顯著的。似乎不同的貓杯狀病毒(FCV)野外毒林在其致病潛力上是不同的，或者與其它病因的共同感染將影響疾病癥狀?？关埍瓲畈《疽呙缫呀?jīng)存在有二十年以上。盡管存在大量的FCV血清型，但是發(fā)現(xiàn)某些毒株，例如F9，可以誘導(dǎo)針對(duì)廣譜FCV毒抹的抗體。見(jiàn)，J.L.Bittle和W.J.Rubic，Am.J.Vet.Res.37:275-78(1976)。因此，最早的抗貓杯狀病毒疫苗使用的是FCV-F9毒林的修飾的或減毒的形式。見(jiàn)J.L.Bittle和W.J.Rubic的美國(guó)專利號(hào)3，937，812,在此將其完整地并入作為參考。盡管來(lái)自FCV-F9的疫苗和其它商業(yè)可獲得的疫苗可以提供對(duì)抗許多野外分離林的保護(hù)作用，但是事實(shí)上這些疫苗并不能阻止所有毒林的感染。而且，由于FCV—直在不斷進(jìn)化，基于FCV-F9的疫苗防衛(wèi)越來(lái)越少的野外分離林(Lauritzen等，1997，VetMicrobiology,56:55-63)。此外，獸醫(yī)從業(yè)者也對(duì)基于單種血清型的疫苗的效力表現(xiàn)出擔(dān)心。實(shí)際上，野外研究提示，來(lái)源于FCV-F9毒林的疫苗對(duì)許多貓杯狀病毒林不能提供充分的免疫力。見(jiàn)例如，N.C.Pederson等，F(xiàn)elinePract.13(1):26-35(1983);S.Dawson等，Vet.Rec.132:346-50(1993)。從業(yè)者也對(duì)在某些情況下可能在原本健康的動(dòng)物中引起疾病的修飾活病毒的施用產(chǎn)生了擔(dān)心。研究者已經(jīng)報(bào)道，因疏忽將皮下施用的FCV疫苗通過(guò)口服途徑給藥導(dǎo)致了急性疾病。見(jiàn)R.C.Povey，F(xiàn)elinePract.7(5):12-16(1977)。因此，對(duì)于單獨(dú)地或者與其它疫苗組合可以在接種貓后提供期望保護(hù)作用的疫苗，一直存在研發(fā)興趣。我們?cè)诖嗣枋鰩追N從貓上分離的分離林，并提供一種在免疫的貓中實(shí)現(xiàn)廣泛保護(hù)作用的手段。資料公開(kāi)美國(guó)專利文獻(xiàn)39378121976年2月Bittle等，39444691976年3月Bittle等44865301984年12月David等，47865891988年11月Rounds等51697891992年12月Bernstein等，52292931993年7月Matsuura等52663131993年11月Esposito等，53386831994年8月Paoletti等54948071996年2月Paoletti等，55590411996年9月Kang等5561064月Feigner月Liscombe55894665656448等5693762月Stewart等5703055月DiCesare571682257258631996年10月Marquet等，55808591996年121996年12月Mond等，55893841996年121996年12月Feigner,56208451997年4月Gould1997年8月Kang等，56937611997年12月Queen1997年12月Queen等，56959281997年121997年12月Feigner,57167841998年21998年2月Wardley，57189011998年2月Wardley1998年3月Daniels等，57285871998年3月Kang1998年9月Acheson等，59773221999年112000年1月Maes等，63552462002年3月5800821月Marks等6010703Kruger等6,534,066Bl2003年3月Poulet等外國(guó)專利文獻(xiàn)04843821995年3月EP，W02004/083390其它出版物Burroughs,J.N和Brown,F.，J.Gen.Virol"22，pp.281-285(1974).Clarke和LambdeninJ.Gen，Virol.78:291-301(1997).Griest，N.R.，1979，Diagnosticmethodsinclinicalvirology(第3版)，pp.84-85，BlackwellJ.L.Bittle&W.J.Rubic,Am.J.Vet.Res.37:275-78(1976).Lauritzen等，VetMicrobiology56:55-63(1997).Maky，BrianW.J.和Kangro，HillarO.1996，Virologymethodsmanual,pp.35—37，AcademicPress,NewYork.Motin等，Infect.Immun.64:4313-4318(1996).N.C.Pederson等，F(xiàn)elinePract.13(1):26-35(1983).Oglesby，A.S.，等，Virology44，pp.329-341(1971).Poulet等，VeterinaryMicrobiology106:17-31(2005).Poulet等，ArchivesofVirology145:243-261(2000).R.C.Povey，F(xiàn)elinePract,7(5):12-16(1977).S.Dawson等，Vet.Rec.132:346-50(1993).ScientificPublishers,Oxford,UK.Soergel，M.E.，等，Intervirology，5，pp239-244(1975).Yokoyama，N.，等，Vaccine,vol.14，No.17/18，pp.1657-1663(1996).發(fā)明概述本發(fā)明提供新的貓杯狀病毒林并涉及幾種分離的貓杯狀病毒(FCV)。本發(fā)明還公開(kāi)將疫苗呈遞給動(dòng)物，尤其是，將FCV呈遞給貓的新方法。本發(fā)明也涉及編碼貓杯狀病毒的核酸克隆。涉及FCV衣殼蛋白、活的或殺死的疫苗、包含衣殼蛋白的亞單位疫苗、核酸疫苗、和包含編碼該分離的貓杯狀病毒的衣殼蛋白的核酸的重組病毒載體疫苗。本發(fā)明也涉及鑒定可在疫苗組合物的生產(chǎn)中以及在診斷感染了貓杯狀病毒的貓的試驗(yàn)中使用的貓杯狀病毒的方法。本發(fā)明也提供將新的和舊的FCV疫苗施用給貓的新方式。在此還描述使用疫苗治療和免疫動(dòng)物，尤其是貓，以抵抗FPV或貓細(xì)小病毒(也稱作全白細(xì)胞減少癥或FPL)以及另一種疾病，F(xiàn)HV或貓皰滲病毒(也稱作貓鼻氣管炎病毒)的方法和材料。以下描述新的疫苗組合，該組合當(dāng)以本文所述方式呈遞給貓時(shí)可以實(shí)現(xiàn)FPV和/或FHV疫苗的有效口服/口服以及皮下(subq)/口服遞送。具體地，本發(fā)明公開(kāi)以下用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗。FCV-21衣殼蛋白或分離的FCV-21衣殼蛋白，(SEQIDN0:13)及具有至少大約91.2%、95%和99%同一性的序列。包含編碼FCV-21衣殼蛋白或分離的FCV-21衣殼蛋白的核酸序列的DNA疫苗，其中所述DNA包括序列(SEQIDNO:12)和具有至少大約78.7%或79.2%序列同一性和允許保護(hù)替代的序列。包含F(xiàn)CV-49衣殼蛋白或分離的FCV-49衣殼蛋白的疫苗，其中所述衣殼蛋白包含來(lái)自FCV-49株的蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:15)或具有至少大約92.7%、95%和99%同一性的序列；其中所述衣殼蛋白以有效的量提供。包含編碼FCV-49衣殼蛋白或分離的FCV-49衣殼蛋白的核酸序列的DNA疫苗，其中所述DNA包括序列(SEQIDN0:14)和具有至少大約78.9%，即79.4%(78.9+0.5)，序列同一性和允許保護(hù)替代的序列。包含F(xiàn)CV-26391-4衣殼蛋白或分離的FCV-26391-4衣殼蛋白的疫苗，其中所述衣殼蛋白包含來(lái)自FCV-26391-4林的蛋白質(zhì)序列。包含F(xiàn)CV-26391-4衣殼蛋白的疫苗，其中所述衣殼蛋白包括蛋白質(zhì)序列(SEQIDN0:17)和具有至少大約91.8%、95%和99%同一性的序列。包含編碼FCV-26391-4衣殼蛋白或分離的FCV-26391-4衣殼蛋白的核酸序列的DNA疫苗，其中所述DNA包括序列(SEQIDN0:16)和具有至少大約78.4%，即78.9%(78.4+0.5)，序列同一性的序列。疫苗，其中所述多核苷酸選自基本上由SEQIDN0:12、14和16組成的組。該疫苗可以是以下單獨(dú)的或者任何組合的形式其中該疫苗含有佐劑，其中該FCV成分是活的，其中該FCV成分是減毒的，其中該FCV成分是滅活的，其中該疫苗可以包括至少一種選自FCV-F9、FCV-LLK、FCV-M8、FCV-255和FCV-228G的其它貓杯狀病毒林。用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗，其包含有效產(chǎn)生免疫應(yīng)答的量的FCV衣殼蛋白核苷酸序列和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述FCV衣殼蛋白選自與SEQIDNO:13、15或17有93%或更大同一性的多肽，其中該FCV分離林不是213-95林，并且其中該核酸序列與異源啟動(dòng)子序列可操作連接。用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗，其包含選自基本上由SEQIDNO:12、14和16組成的組的FCV衣殼蛋白的核苷酸序列。疫苗，其中所述核苷酸序列為以下任一種形式質(zhì)粒、重組病毒載體或任何其它核苷酸載體。疫苗，其中重組病毒載體選自貓皰瘆病毒、浣熊痘病毒、金絲雀痘病毒、腺病毒、Semliki森林病毒、Sindbis病毒和痘苗病毒。本發(fā)明還描述免疫原性組合物，其包含獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑運(yùn)載體和分離的FCV林，其中所述FCV林可以與選自本文描述為23、26、41、44和56的單克隆抗體的單克隆抗體結(jié)合。在本發(fā)明一些形式中，該免疫原性組合物包含獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑運(yùn)載體和分離的FCV林，其中該FCV株選擇性地與選自本文描述為23、26、41、44和56的單克隆抗體的單克隆抗體結(jié)合。這些免疫原性組合物包括其中所述FCV林是滅活的、其中所述FCV林是疫苗、以及其中該組合物包含佐劑的那些組合物。本文描述的疫苗可以包括至少一種選自貓皰滲病毒、貓白血病病毒、貓免疫缺陷病毒、鸚鵡熱衣原體(Chlamydiapssittaci)和貓細(xì)小病毒、狂犬病毒和支氣管敗血性鮑特菌(Bordetellabronchiseptica)的其它貓病原體。該疫苗也可以另外地包含佐劑或者與佐劑一起施用。發(fā)明詳述本發(fā)明提供可以顯著地降低與貓杯狀病毒(FCV)相關(guān)的死亡率以及增加FCV疫苗的安全語(yǔ)的免疫接種方案。此外，本發(fā)明的免疫接種方案誘導(dǎo)比現(xiàn)有FCV-F9疫苗方案更寬的血清交叉中和譜，由此應(yīng)提供更好的跨不同貓杯狀病毒林的免疫力。本發(fā)明一方面提供使用疫苗免疫動(dòng)物，尤其是貓，以抵抗貓杯狀病毒的方法。本文還描述了另外兩種貓疾病，F(xiàn)PV和FHV，的新療法。所述方法包括將治療有效量的第一疫苗、第二疫苗施用給貓，并且任選地還可以在如上的120天內(nèi)或者更經(jīng)常的是在大約1年后作為每年一次的加強(qiáng)劑給予第三疫苗施用。第一疫苗通過(guò)胃腸外途徑(例如，皮下、肌內(nèi)等)施用。第二疫苗通過(guò)口服或口鼻途徑在第一疫苗施用后大約N天施用，而第三疫苗通過(guò)胃腸外途徑、口服、或口鼻途徑在第一或第二疫苗施用后大約M天施用。在此，N和M獨(dú)立地是3至(包括3和120在內(nèi))的整數(shù)。也優(yōu)選N為大約3周以及大約2-4周。此外，在本發(fā)明一方面中，某些所述疫苗可以以兩個(gè)口服劑量的形式施用而無(wú)需第一次胃腸外施用。也建議使用每年一次的加強(qiáng)劑。序列表簡(jiǎn)述<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>定義和縮寫"大約"，當(dāng)與可測(cè)量的數(shù)值變量聯(lián)用時(shí)，指所給出的該變量的值以及該變量的位于該給出值的實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)(例如，對(duì)于平均值而言在95%置信區(qū)間內(nèi))的所有值或者位于該給出值的百分之十范圍內(nèi)的所有值，以范圍大的為準(zhǔn)，但是"大約"與周為單位的時(shí)間間隔聯(lián)用時(shí)除外，在此"大約3周，，為17至25天，而大約2至4周為10至40天。"自動(dòng)免疫"包括用本發(fā)明疫苗接種貓而誘導(dǎo)的抗貓病毒的體液免疫和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。"抗體，，指因針對(duì)特定抗原的免疫應(yīng)答而導(dǎo)致的、能夠與該特定抗原結(jié)合的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白是血清蛋白質(zhì)，由具有"恒定區(qū)"和"可變區(qū)"的"輕鏈"和"重鏈"多肽鏈組成，并基于恒定區(qū)的組成而分類(例如，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。對(duì)給定抗原具有"特異性"的抗體意味著該抗體的可變區(qū)能夠?qū)Ｒ坏刈R(shí)別和結(jié)合特定抗原——例如，盡管在衣殼蛋白和其它多肽之間存在局部的序列同一性、同源性或相似性，該抗體仍能夠通過(guò)可測(cè)量的結(jié)合親和力差異而將特定衣殼蛋白與其它已知蛋白區(qū)分開(kāi)。特異性抗體也可以與其它蛋白質(zhì)(例如，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)蛋白A或ELISA技術(shù)中的其它抗體)通過(guò)和抗體可變區(qū)外的序列，尤其是，該分子恒定區(qū)中的序列的相互作用而發(fā)生相互作用。確定抗體的結(jié)合特異性的篩選試驗(yàn)是熟知的。對(duì)于此類試驗(yàn)的全面討論，見(jiàn)Harlow等(編)，Antibodies:ALaboratoryManual,第6章(1988)。如果抗體對(duì)FCV衣殼蛋白具有特異性，該抗體也可能識(shí)別和結(jié)合FCV衣殼蛋白的片段?？贵w可以使用本領(lǐng)域已知的方法制備。"抗原"或"免疫原，，指含有一個(gè)或多個(gè)表位(線性的、構(gòu)象的或兩者)的分子，在該分子接觸個(gè)體后將誘導(dǎo)特異于該抗原的免疫應(yīng)答。表位是抗原中可以與T細(xì)胞受體或特異性抗體結(jié)合的特定位置，典型地包含大約3個(gè)氨基酸殘基至大約20個(gè)氨基酸殘基。術(shù)語(yǔ)"抗原"指亞單位抗原一一來(lái)自與抗原天然聯(lián)系的整個(gè)生物體的分離和離散的抗原——以及死的、減毒的或滅活的細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲(chóng)或其它微生物。術(shù)語(yǔ)抗原也指抗體，例如抗獨(dú)特型抗體或其片段，以及能夠模擬抗原或抗原決定簇(表位)的合成肽4莫擬表位(mimotope)。術(shù)語(yǔ)抗原也指在體內(nèi)表達(dá)抗原或抗原決定簇的寡核苷酸或多核苷酸，例如在DNA免疫應(yīng)用中。"賦形劑"指疫苗中非抗原的任何成分。FELOCELL3是無(wú)鸚鷸熱衣原體(Chlamydiapsittaci)的FELOCELL4。FELOCELL4含有修飾的活貓鼻氣管炎(rhiotracheitis)病毒[FHV]、杯狀病毒[FCV-F9]、全白細(xì)胞減少癥病毒[FPV]和鷚鷸熱衣原體[FCp]。FELOCELL4A含有修飾的活貓鼻氣管炎病毒[FHV]、杯狀病毒[FCV-21]、全白細(xì)胞減少癥病毒[FPV]和鸚鵡熱衣原體[FCp]。FELOCELL4A是無(wú)FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL4。FELOCELL3A是無(wú)FCV-F9但具有FCV-21的FEU)CEIX3。Felocel1⑧4、Felocel14或FELOCELL4或后面有數(shù)字"3"或"4"的這些詞是Felocel1的變體疫苗，Pfizer擁有名稱Felocell的任何變體疫苗。"第一疫苗"、"第二疫苗"、"第三疫苗"等指可分開(kāi)施用的疫苗，它們可以相同或不同，并且一般可以以任何順序施用。因此，第三疫苗可以在第二疫苗之前或之后施用給個(gè)體。與多肽有關(guān)的氨基酸序列"同一性"百分?jǐn)?shù)中，"同一性"在本文中定義為為達(dá)到最大序列同一性百分?jǐn)?shù)而將候選序列與靶序列比對(duì)并在必要時(shí)引入缺口之后，在候選序列中與靶標(biāo)序列中的殘基相同的氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)。序列同一性百分?jǐn)?shù)通過(guò)常規(guī)方法確定。簡(jiǎn)而言之，兩個(gè)氨基酸序列使用ClustalW算法(Thompson等，Nuc.Ac.Res.22:4673-4680，1994)和PAM250;f又重矩陣(Dayhoff等，"AtlasofProteinSequenceandStructure.，，NationalBiomedicalResearchFoundation.Washington,DC5:345-358(1978)和程序MegAlign提供的默認(rèn)參數(shù)(DNASTAR,Inc.;Madison,WI)進(jìn)行比對(duì)以優(yōu)化比對(duì)分?jǐn)?shù)。表1-1給出該P(yáng)AM250權(quán)重矩陣表(氨基酸以標(biāo)準(zhǔn)單字母代碼表示)。表1-1CSTPAGNDEQHRKMILVFYWC12S02T-213P-3106A-21112G-310-l1N-410-1002D-500-10124E-500-100134Q-5-1-100-11224H-3_1-10-1-22136R40-10-2-30-1-1126K-500-l-1-21001035M-5-2-1-2-1-3-2-3-2-1-2006I-2-l0-2-1-3-2-2-2-2-2-2-225L-6-3-2-3-2-34-3-2_2-3-3426V-2-l0-10-1-2-2-2-2-2-2-22424F4-3-3-5-5■4-6-5-5-2-5,012-19Y0-3-3-5-3-5-2■4■440■44-2-1-1-27W-8-2-5-6-6-74-7-7-5-32-3■4-5-2-60然后按如下計(jì)算同一性百分?jǐn)?shù)相同匹配的總數(shù)/[較長(zhǎng)序列的長(zhǎng)度+為比對(duì)兩個(gè)序列而引入該較長(zhǎng)序列中的缺口數(shù)目]x100個(gè)體中的"免疫應(yīng)答"指響應(yīng)于抗原出現(xiàn)的體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答、或體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答。"體液免疫應(yīng)答"指由抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。"細(xì)胞免疫應(yīng)答"是由T淋巴細(xì)胞或其它白細(xì)胞或這兩者所介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，包括細(xì)胞因子、趨化因子及由活化的T細(xì)胞、白細(xì)胞或這兩者產(chǎn)生的類似分子的生成。免疫應(yīng)答可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)免疫試驗(yàn)和中和試驗(yàn)確定?？乖?免疫學(xué)保護(hù)量"或"有效產(chǎn)生免疫應(yīng)答的量"是可以有效地在受體中誘導(dǎo)足以預(yù)防或改善因病因(尤其是貓杯狀病毒)感染應(yīng)答的量?？梢哉T導(dǎo)體液免疫或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫或兩者。動(dòng)物對(duì)疫苗組合物的免疫原性應(yīng)答可以例如間接地通過(guò)測(cè)量抗體滴度、淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，或者直接地通過(guò)監(jiān)測(cè)野生型毒林攻擊后的征候和癥狀來(lái)評(píng)價(jià)。疫苗所賦予的保護(hù)性免疫可以通過(guò)測(cè)量，例如臨床征候例如，死亡率、發(fā)病率、個(gè)體的溫度數(shù)值以及整體身體情況及整體健康和表現(xiàn)的減少而評(píng)價(jià)。該免疫應(yīng)答可以包含，但不限于，細(xì)胞和/或體液免疫的誘導(dǎo)。治療有效的疫苗量可以隨著所用的具體病毒或者貓的情況而改變，并且可以由獸醫(yī)從業(yè)者確定。"鼻內(nèi)"施用指通過(guò)或者經(jīng)由鼻將物質(zhì)例如疫苗引入個(gè)體體內(nèi)，并涉及物質(zhì)主要通過(guò)鼻粘膜的運(yùn)輸。"分離的"，當(dāng)用于描述任何具體限定的物質(zhì)，例如，多核苷酸或多肽時(shí)，指所迷物質(zhì)與正常發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)例如多肽或核酸所在的最初細(xì)胞環(huán)境相分離。因此正如本文中所用，僅僅作為例子，使用本發(fā)明多核脊酸構(gòu)建的重組細(xì)胞系利用了該"分離的"核酸。備選地，F(xiàn)CV衣殼蛋白或特異的免疫原性片段可以用作疫苗，因此其將被認(rèn)為是分離的，因?yàn)槠湟呀?jīng)得以鑒定、分離并且相對(duì)于其天然可能存在的狀況在一定程度上是純化的。如果該衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段在可以產(chǎn)生該抗原的重組細(xì)菌或真核表達(dá)栽體中產(chǎn)生，則其纟皮認(rèn)為以分離的蛋白質(zhì)或核酸形式存在。例如，用多核苷酸構(gòu)建的重組細(xì)胞系利用了"分離的"核酸。"單克隆抗體"指由單個(gè)雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體，這些抗體均指向特定抗原上的一個(gè)表位。用于制備單克隆抗體的抗原可以以分離的病原體蛋白質(zhì)的形式或者以整個(gè)病原體的形式提供。雜交瘤是由雜種細(xì)胞組成的克隆細(xì)胞系，該雜種細(xì)胞通過(guò)骨髓瘤細(xì)胞和特定的抗體生產(chǎn)細(xì)胞融合而形成。一般地，單克隆抗體是小鼠來(lái)源的；然而，單克隆抗體也指通過(guò)噬菌體展示技術(shù)或者等同于噬菌體展示技術(shù)的方法產(chǎn)生的或者由非小鼠來(lái)源的雜種細(xì)胞產(chǎn)生的、抗抗原的特定表位而形成的克隆抗體群。"N天，，，"N"時(shí)間間隔或時(shí)間段或"M天"位于一個(gè)事件之后分別指該事件之后第N天或第M天上的任何時(shí)間。例如，在第一疫苗施用后3天用第二疫苗接種個(gè)體意味著第二疫苗在第一疫苗施用之后第3天的任何時(shí)間施用。該描述常常應(yīng)用于第一和第二免疫接種之間的時(shí)間間隔。典型地，優(yōu)選的N時(shí)間間隔是大約3周，或者17-25天，但大約2-4周或10-40天也是常見(jiàn)的，并且本發(fā)明采用3至120天的"N"時(shí)間段是有效的。"口服"或"經(jīng)口"施用指通過(guò)或經(jīng)由口將物質(zhì)例如疫苗引入個(gè)體體內(nèi)，涉及吞咽或通過(guò)口腔粘膜的運(yùn)輸(例如，舌下或口頰吸收)或這兩者。"口鼻"施用指通過(guò)或經(jīng)由鼻和口將物質(zhì)例如疫苗引入個(gè)體體內(nèi)，例如將一滴或多滴滴劑置于鼻內(nèi)時(shí)所發(fā)生的。口鼻施用涉及與口服和鼻內(nèi)施用相關(guān)的運(yùn)輸過(guò)程。"胃腸外施用，，指通過(guò)或經(jīng)由不包括消化道的途徑將物質(zhì)例如疫苗引入個(gè)體體內(nèi)。胃腸外施用包括皮下施用、肌內(nèi)施用、經(jīng)皮施用、皮內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用、眼內(nèi)施用和靜脈內(nèi)施用。為了本7>開(kāi)的目的，胃腸外施用不包括主要涉及通過(guò)口、鼻、氣管和肺中的粘膜組織運(yùn)輸物質(zhì)的施用途徑。"被動(dòng)免疫"指通過(guò)使用包含抗FCV林或其免疫原性成分或成分的片段的抗體的疫苗免疫接種貓而向貓?zhí)峁┑目关埍瓲畈《颈Ｗo(hù)作用。"藥學(xué)上可接受的"指屬于合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)的物質(zhì)，該物質(zhì)適于與個(gè)體組織接觸而不引起過(guò)度毒性、激惹、過(guò)敏反應(yīng)等、與合理的收益風(fēng)險(xiǎn)比相稱、并對(duì)于其預(yù)期用途而言是有效的。"多克隆抗體"指針對(duì)特定病原體或抗原產(chǎn)生的混合的抗體群。一般地，該群體含有多組抗體，每一組均針對(duì)病原體或抗原的一個(gè)特定表位。為了制備多克隆抗體，可以通過(guò)接種或感染將整個(gè)病原體或分離的抗原引入宿主中，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗該病原體或抗原的抗體。"呼吸，，施用指通過(guò)或經(jīng)由吸入霧化的(噴霧化的)物質(zhì)而將物質(zhì)例如疫苗引入個(gè)體體內(nèi)。在呼吸施用中，主要的運(yùn)輸機(jī)制涉及通過(guò)氣管、支氣管和肺的粘膜吸收霧化的物質(zhì)，因此其不同于鼻內(nèi)或經(jīng)口施用。"單施用劑量"指于同一天或大約同一天施用，即，所有成分在大約l天內(nèi)施用。這些成分可以在或者可以不在單——個(gè)容器中。"特異于"，當(dāng)用于描述本發(fā)明抗體時(shí)，指本發(fā)明抗體的可變區(qū)專一地識(shí)別和結(jié)合特定的病毒林(即，能夠借助于可測(cè)量的結(jié)合親和力差異而區(qū)分特定的FCV衣殼蛋白和其它已知的蛋白質(zhì)，即使FCV衣殼蛋白和這些多肽之間存在局部的序列同一性、同源性或相似性)?？梢岳斫?，特異性抗體也可以與其它蛋白質(zhì)(例如，金黃色葡萄球菌蛋白A或ELISA技術(shù)中的其它抗體)通過(guò)和抗體可變區(qū)外的序列，尤其是該分子恒定區(qū)中的序列相互作用而發(fā)生相互作用。確定本發(fā)明抗體的結(jié)合特異性的篩選試驗(yàn)是本領(lǐng)域熟知和常規(guī)實(shí)踐的。對(duì)于此類試驗(yàn)的全面討論，見(jiàn)Harlow等(編)Antibodies:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratory;ColdSpringHarbor,NY(1988)，第6章。也可以考慮識(shí)別和結(jié)合本發(fā)明FCV衣殼蛋白片段的抗體，條件是這些抗體對(duì)FCV衣殼蛋白具有特異性。本發(fā)明抗體可以使用本領(lǐng)域熟知和常規(guī)實(shí)踐的任何方法制備。"特異的免疫原性片段"指可以由特異于該序列的抗體識(shí)別的序列的部分，見(jiàn)下面的詳細(xì)定義。"個(gè)體"指具有免疫系統(tǒng)的任何動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物例如貓。"亞單位疫苗"指包括一個(gè)或多個(gè)抗原但不是所有抗原的一類疫苗，其中所述的抗原來(lái)源于目的病原體(例如，病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)或真菌)的抗原或者與目的病原體的抗原同源。此類組合物基本上無(wú)完整的病原體細(xì)胞或者致病顆粒或者該細(xì)胞或顆粒的裂解物。因此，亞單位疫苗可以從自病原體至少部分純化的、或者基本上純化的免疫原性多肽或者其類似物制備。獲得亞單位疫苗中的抗原(一種或多種)的方法包括標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)、重組生產(chǎn)或者化學(xué)合成。"TCID5。"指"組織培養(yǎng)物感染劑量"，并定義為感染50%的給定批次的接種的細(xì)胞培養(yǎng)物所需的病毒稀釋度。可以使用各種方法計(jì)算TCID5。，包括本說(shuō)明書中使用的Spearman-Karber法。對(duì)于Spea簡(jiǎn)n-Karber法的描述，見(jiàn)B.W.Mahy&H.0.Kangro，VirologyMethodsManual25-46(1996)。"治療有效量"在本公開(kāi)的上下文中指在接受抗原或疫苗的個(gè)體(例如貓)中誘導(dǎo)足以預(yù)防或改善因病原體(例如病毒，如FCV、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)或真菌)感染所致的疾病征候或癥狀(包括不良健康影響)或其并發(fā)癥的免疫應(yīng)答的抗原或疫苗量。可以誘導(dǎo)體液免疫或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫或者體液及細(xì)胞免疫兩者。動(dòng)物對(duì)疫苗的免疫原性應(yīng)答可以例如間接地通過(guò)測(cè)量抗體滴度、淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，或者直接地通過(guò)監(jiān)測(cè)野生型毒株攻擊后的征候和癥狀而評(píng)價(jià)。疫苗所賦予的保護(hù)性免疫可以通過(guò)測(cè)量，例如臨床征候(例如死亡率、發(fā)病率、個(gè)體的溫度數(shù)值和整體身體情況及整體健康和表現(xiàn))的減少來(lái)評(píng)價(jià)。治療上有效的疫苗量可以隨著所用的具體病毒或者個(gè)體的情況而變，并且可以由醫(yī)師確定。"治療"指逆轉(zhuǎn)、減輕、抑制該術(shù)語(yǔ)所應(yīng)用的病癥、狀況或疾病的進(jìn)程，或者預(yù)防該病癥、狀況或疾病、或者預(yù)防該病癥、狀況或疾病的一個(gè)或多個(gè)癥狀。"療法"指緊上面定義的"治療"的行為。"疫苗，，指包含抗原的組合物，并且包括以下定義的所謂"亞單位疫苗"。將疫苗施用給個(gè)體導(dǎo)致免疫應(yīng)答。疫苗可以直接地通過(guò)任何已知施用途徑，包括胃腸外、經(jīng)口等，引入個(gè)體。第一部分本發(fā)明疫苗、病毒林、衣殼蛋白和抗體本發(fā)明提供基于活的或死的選自FCV-21、FCV-49和FCV26391-4的FCV林的疫苗。本發(fā)明還提供編碼來(lái)自本發(fā)明FCV林的FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的核酸疫苗。本發(fā)明還提供來(lái)源于本發(fā)明FCV林的分離的衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段。對(duì)于FCV林，產(chǎn)生自衣殼蛋白的抗原決定簇可以誘導(dǎo)良好的免疫應(yīng)答。在此我們描述和要求保護(hù)幾種FCV林，包括密切相關(guān)的衣殼蛋白及其變體。具體地，我們描述FCV-21林和蛋白質(zhì)序列(SEQIDN0:13)及具有91.2%、95%和99%或更高同一性的序列；FCV-49抹和蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:15)及具有92.7%、95%和99°/。或更高同一性的序列;FCV-26391-4林和蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:17)及具有91.8%、95%和99%或更高同一性的序列。本發(fā)明疫苗一般旨在是免疫貓以抵抗因貓杯狀病毒的毒性林導(dǎo)致的疾病的預(yù)防性療法。然而，疫苗也旨在用于治療已經(jīng)感染了貓杯狀病毒的毒性林的貓。例如，包含通過(guò)使用FCV衣殼或其免疫原性成分免疫異源宿主而產(chǎn)生的抗體的疫苗，可用于治療被貓杯狀病毒感染的貓。然而，甚至是提供自動(dòng)免疫的疫苗，即，包含選自FCV-21、FCV-49和FCV26391-4或其突變體的FCV林或者源于本發(fā)明FCV林的衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的疫苗，當(dāng)作為抵抗各種疾病的治療性療法給予時(shí)也預(yù)期有效。因此，通過(guò)本發(fā)明提供的免疫可以是自動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫，而疫苗的預(yù)期用途可以是預(yù)防性的或治療性的。對(duì)于本發(fā)明疫苗的任一種實(shí)施方案，施用途徑包括，但不限于，口鼻、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、眼內(nèi)、和口服以及經(jīng)皮、或者通過(guò)吸入或者栓劑。優(yōu)選的施用途徑包括口鼻、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)和皮下注射。疫苗可以通過(guò)任何手段施用，包括但不限于注射器、霧化器、噴霧器、無(wú)針頭注射裝置、或微粒轟擊基因槍(生物轟擊)。對(duì)于本發(fā)明任一實(shí)施方案，疫苗根據(jù)待使用的施用模式在藥學(xué)上可接受的載體中進(jìn)行配制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地配制包含如下成分的疫苗活的或死的FCV-21、FCV-49或FCV26391-4、源于本發(fā)明任何FCV林的衣殼蛋白或其免疫原性片段、編碼FCV-21、FCV-49或FCV26391-4衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的重組病毒栽體、或編碼源于FCV-21、FCV-49或FCV26391-4的衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的DNA分子。在優(yōu)選肌內(nèi)注射的情況下，優(yōu)選等滲制劑。一般地，用于等滲的添加劑可以包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在特定的情況下，優(yōu)選等滲溶液例如磷酸鹽緩沖的鹽水。所述配制也可以提供穩(wěn)定劑，例如明膠和白蛋白。在一些實(shí)施方案中，向制劑添加血管收縮劑。根據(jù)本發(fā)明的藥物制品以無(wú)菌及無(wú)致熱原的形式提供。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，對(duì)于包含本發(fā)明疫苗的藥學(xué)上可接受的載體，優(yōu)選的制劑是獲得美國(guó)農(nóng)業(yè)部或者等同的外國(guó)(例如加拿大或墨西哥或任——個(gè)歐洲國(guó)家)政府機(jī)構(gòu)所頒布的條例批準(zhǔn)用于活貓杯狀病毒疫苗、死貓杯狀病毒疫苗、多肽(抗原)亞單位疫苗、重組病毒載體疫苗、抗體疫苗和DNA疫苗的那些藥學(xué)載體。因此，用于商業(yè)生產(chǎn)本發(fā)明疫苗的藥學(xué)上可接受的載體是已經(jīng)或?qū)⒁玫矫绹?guó)或外國(guó)的適當(dāng)政府機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的載體。疫苗還可以與藥學(xué)上可接受的佐劑混合。在本發(fā)明疫苗的某些制劑中，疫苗與其它貓疫苗聯(lián)合以產(chǎn)生多價(jià)疫苗產(chǎn)品，該產(chǎn)品可以針對(duì)由其它貓病原體引起的種類廣泛的疾病向貓?zhí)峁┍Ｗo(hù)作用。目前，貓疫苗的商業(yè)生產(chǎn)者以及最終用戶偏愛(ài)多價(jià)疫苗產(chǎn)品。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供可以免疫貓以抵抗貓杯狀病毒以及至少一種其它的貓病原體的多價(jià)疫苗，其中所述其它貓病原體優(yōu)選選自貓皰滲病毒、貓白血病病毒、貓免疫缺陷病毒、貓衣原體和貓全白細(xì)胞減少癥病毒。接種貓:在本i明另一實(shí)施方案中，給予3苗一系^免疫接種以產(chǎn)生完全而廣泛的免疫應(yīng)答。當(dāng)提供一系列免疫接種時(shí)，這些免疫接種的提供可以間隔大約1天至4周或更長(zhǎng)的時(shí)間。在特定實(shí)施方案中，給貓?jiān)诓煌恢猛瑫r(shí)進(jìn)行接種。關(guān)于途徑和施用的其它細(xì)節(jié)見(jiàn)下面題為"免疫貓以抵抗杯狀病毒的方法，，的章節(jié)。疫苗組合物任選地可以包括與疫苗相容的、藥學(xué)上可接受的(即，無(wú)菌的和無(wú)毒性的)液體、半固體或固體稀釋劑，這些稀釋劑可以充當(dāng)藥學(xué)運(yùn)載體(vehicle)、賦形劑或介質(zhì)。稀釋劑可以包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等滲劑可以包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖等等。穩(wěn)定劑包括白蛋白等。本領(lǐng)域已知的任何佐劑均可以用于疫苗組合物中，包括基于油的佐劑，例如，弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，基于霉菌酸的佐劑(例如，海藻糖二霹菌酸酯)，細(xì)菌脂多糖(LPS)、肽聚糖(即，胞壁質(zhì)、粘肽或糖蛋白例如N-Opaca、胞壁酰二肽[MDP]或MDP類似物)、蛋白聚糖(例如，提取自肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiellapneumoniae))、鏈球菌制品(例如OK432)、Biostim(例如,01K2)、EP109942、EP180564和EP231039的"Iscoms"、氬氧化鋁、皂苷、DEAE-葡聚糖、中性油(例如，miglyol)、植物油(例如花生油)、脂質(zhì)體、？111!>011^@多元醇類。佐劑包括，但不限于，RIBI佐劑系統(tǒng)(RibiInc.)、明鞏、氫氧化鋁凝膠、膽固醇、水包油乳劑、油包水乳劑，例如，弗氏完全和不完全佐劑、嵌段共聚物(CytRx，AtlantaGA)、SAF-M(Chiron，Emeryvi1leCA)、AMPHIGEN佐劑、急脊、QuilA、QS—21(CambridgeBiotechInc.，CambridgeMA)、GPI-OIOO(GalenicaPharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)或其它皂苷級(jí)分、單磷酰脂A、Avridine脂-胺佐劑、來(lái)自大腸桿菌(E.coli)的熱不穩(wěn)定性腸毒素(重組的或者其它形式)、霍亂毒素、或胞壁酰二肽等等。該免疫原性組合物還可以包括一種或多種其它免疫調(diào)制劑，例如，白介素、干擾素或其它細(xì)胞因子。該免疫原性組合物還可以包括慶大霉素和石克柳汞。盡管可用于本發(fā)明上下文的佐劑和添加劑的量和濃度可以容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，但本發(fā)明考慮組合物包含大約50jug至大約2000jug佐劑以及優(yōu)選地大約500mg/2ml劑量的疫苗組合物。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮疫苗組合物包含大約1|ig/ml至大約60jig/ml抗生素，更優(yōu)選地小于大約30|ag/ml的抗生素。本發(fā)明免疫原性組合物可以根據(jù)施用途徑制備為各種形式。例如，可以將免疫原性組合物制備成適于注射使用的無(wú)菌水溶液或分散體，或者使用冷凍干燥技術(shù)制備成凍干形式。凍干的免疫原性組合物典型地在大約4。C下維持，并且可以在帶有或不帶有佐劑的穩(wěn)定化溶液，例如，鹽水或/和HEPES中重構(gòu)(reconstitute)。此外，本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗組合物可以包括一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。本文中，"藥學(xué)上可接受的載體"包括任何及所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、佐劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑、吸收延遲劑等。載體必須在與本發(fā)明成分相容并且無(wú)害于待免疫的個(gè)體這個(gè)意義上是"可接受的"。典型地，載體將是無(wú)菌的且無(wú)致熱原?；钜呙绫景l(fā)明疫苗的一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗包含活的FCV疫苗，其中該FCV成分選自FCV-21、FCV-49和FCV26391-4。由于這些病毒林以無(wú)毒性形式分離，故尤其優(yōu)選用于制備可以刺激貓的免疫系統(tǒng)但不引起疾病的活疫苗。病毒的減毒方法是本領(lǐng)域已知的，包括諸如在適宜細(xì)胞系上在細(xì)胞培養(yǎng)中連續(xù)傳代或者紫外線或化學(xué)誘變等方法。滅活疫苗在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，疫苗包含含有選自FCV-21、FCV-49和FCV26391-4的FCV林的滅活的或死的FCV疫苗。滅活疫苗可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法制備。例如，一旦病毒增殖至高滴度后，本領(lǐng)域技術(shù)人員易于明了，可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法獲得該病毒的抗原性物質(zhì)。例如，可以通過(guò)稀釋、濃縮或提取，獲得該病毒的抗原性物質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)^f吏用福爾馬林、p-丙內(nèi)酯(betapropriolactone,BPL)或者4吏用Binaryethyleneimine(BEI)處理，或者4吏用本領(lǐng)域已知的其它方法，滅活杯狀病毒。福爾馬林滅活通過(guò)將杯狀病毒懸浮液與37%甲醛混合至Q.05%甲醛終濃度而實(shí)現(xiàn)。杯狀病毒-甲醛混合物通過(guò)在室溫下持續(xù)攪拌大約24小時(shí)來(lái)混合。然后可以通過(guò)測(cè)試在適宜的貓細(xì)胞系例如CRFK細(xì)胞上的生長(zhǎng)的試驗(yàn)，檢測(cè)該滅活的杯狀病毒混合物中的殘余活病毒。BEI滅活通過(guò)將本發(fā)明的杯狀病毒懸浮液與0.1MBEI(0.175NNaOH中2-溴-乙胺)混合至最終BEI濃度為lmM而實(shí)現(xiàn)。該杯狀病毒-BEI混合物通過(guò)在室溫下持續(xù)攪拌大約48小時(shí)并之后添加1.0M硫代硫酸鈉至終濃度0.lmM而混合。再持續(xù)進(jìn)行2小時(shí)的混合。通過(guò)測(cè)試在適宜的貓細(xì)胞系例如NLFK細(xì)胞上的生長(zhǎng)的試驗(yàn)，檢測(cè)該滅活的杯狀病毒混合物中的殘余活杯狀病毒。上述本發(fā)明滅活杯狀病毒與任何一種藥學(xué)上的載體混合以制備具有適當(dāng)劑量水平的滅活病毒疫苗。除了選自FCV-21、FCV-49和FCV26391-4的FCV成分，該滅活疫苗還可以包括至少一種其它的貓杯狀病毒株，此其它的貓杯狀病毒優(yōu)選地選自FCV-F9、FCV-M8、FCV-255和FCV-2280。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，疫苗還包括用于免疫貓以抵抗一種或多種其它貓病原體的疫苗，其中所述其它貓病原體優(yōu)選地選自貓皰滲病毒、貓白血病病毒、貓免疫缺陷病毒、貓衣原體和貓全白細(xì)胞減少癥病毒。重組疫苗在本發(fā)明再一實(shí)施方案中，疫苗包含含有編碼此處公開(kāi)的FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的核酸的重組病毒載體。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，重組病毒載體是可以免疫貓以抵抗貓杯狀病毒及貓皰滲病毒兩者的貓皰滲病毒。在另一實(shí)施方案中，重組病毒載體包含一種或多種優(yōu)選選自貓皰療病毒、貓白血病病毒、貓免疫缺陷病毒、貓衣原體和貓全白細(xì)胞減少癥病毒、狂犬病毒和支氣管敗血性鮑特菌的抗原。為了制備表達(dá)FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的重組病毒載體，將編碼該衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的cDM插入病毒載體例如皰滲病毒、痘病毒或腺病毒的基因組中。Wardley等的美國(guó)專利號(hào)5,716,822描述了將編碼貓杯狀病毒林CFI-68FIV衣殼蛋白的DNA插入貓皰滲病毒胸苦激酶基因中的方法。本發(fā)明包括的其它重組病毒載體疫苗包括但不限于腺病毒、腺相關(guān)病毒、細(xì)小病毒和各種痘病毒載體以表達(dá)FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段。本發(fā)明尤其包括表達(dá)FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的重組痘病毒載體疫苗，該疫苗根據(jù)Paoletti等的美國(guó)專利號(hào)5，338，683和5，494，807(在該專利文獻(xiàn)中教導(dǎo)了由表達(dá)外來(lái)抗原的痘苗病毒或金絲雀痘病毒組成的重組病毒載體)；Esposito等的美國(guó)專利號(hào)5，266，313(該專利文獻(xiàn)教導(dǎo)了表達(dá)狂犬病毒抗原的重組浣熊痘病毒載體)；以及Maes等的美國(guó)專利號(hào)6，010，703(該專利文獻(xiàn)教導(dǎo)了表達(dá)貓皰疹病毒gD或gB抗原的重組浣熊痘病毒載體)之任一中教導(dǎo)的方法制備。對(duì)于上述任何重組病毒栽體，編碼FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的cDNA與真核啟動(dòng)子(位于編碼該抗原的cDNA的5'末端)以及真核終止信號(hào)和Poly(A)信號(hào)(位于編碼該抗原的cDNA的3，末端)可操作地連接。在本文中，術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"指本發(fā)明多核苷酸(作為cDNA分子)和含有表達(dá)控制序列的多核苷酸(DNA)，例如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止序列，在載體或細(xì)胞中所處的位置使得該cDNA編碼的抗原的表達(dá)受到該表達(dá)控制序列的調(diào)節(jié)。用于克隆DNA例如編碼FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的cDNA及與其可操作連接的含有表達(dá)控制序列的DNA的方法，是本領(lǐng)域熟知的。適用于在重組病毒載體中表達(dá)FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的啟動(dòng)子的實(shí)例是巨細(xì)胞病毒立即早期(CMV)啟動(dòng)子、Rous肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)(RSV-LTR)啟動(dòng)子、猿猴病毒40(SV40)立即早期啟動(dòng)子，和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子例如金屬疏蛋白啟動(dòng)子。具有終止信號(hào)和Poly(A)信號(hào)的DNA的實(shí)例是SV40的晚期poly(A)區(qū)。適用于產(chǎn)生抗原的另一病毒表達(dá)系統(tǒng)實(shí)例是可從InvUrogen獲得的Sindbis表達(dá)系統(tǒng)。這些商業(yè)可獲得的表達(dá)載體和系統(tǒng)的應(yīng)用是本領(lǐng)域熟知的。核酸或DNA分子疫苗在本發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案中，提供核酸或DNA分子疫苗形式的疫苗，該疫苗可以在貓中引起自動(dòng)免疫反應(yīng)。該DM分子疫苗由具有編碼本文公開(kāi)的FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的核酸序列的DNA組成。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該DNA分子疫苗包含SEQIDNO:l2、14或16的核酸序列、或該核酸序列中編碼SEQIDNO:13、15或17或SEQIDNO:13、15或17的特異的免疫原性片段的片段。編碼衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的核酸可操作地連接在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的位置或附近位置。這使得當(dāng)該核酸被接種入貓細(xì)胞中時(shí)可以從該核酸實(shí)現(xiàn)衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選地，DM分子是質(zhì)粒?？捎糜贒NA疫苗的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于RSVLTR啟動(dòng)子、CMV立即早期啟動(dòng)子和SV40T抗原啟動(dòng)子。還優(yōu)選該核酸在編碼衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的序列的終止密碼子位置或附近位置可操作地連接至包含轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和poly(A)識(shí)別信號(hào)的核酸片段上?？梢栽诳山邮艿乃帉W(xué)載體中或者在脂質(zhì)或脂質(zhì)替栽體(類似于Feigner的美國(guó)專利號(hào)5，703，055中乂^開(kāi)的那些)中向貓?zhí)峁〥NA疫苗?？梢酝ㄟ^(guò)各種方法，例如肌內(nèi)注射、intrajet注射或生物轟擊，將DNA疫苗提供給貓。DNA疫苗的制備方法及其使用方法提供在Feigner的美國(guó)專利號(hào)5，589，466和5，580，859中。最后，制備藥品級(jí)質(zhì)粒DNA的方法見(jiàn)Marquet等的美國(guó)專利號(hào)5，561，064中。因此，使用上述方法，可以使用表達(dá)FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的DNA疫苗免疫貓以抵抗毒性貓杯狀病毒。DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)在于該DNA分子可以方^更地以質(zhì)粒形式增殖，這是一種簡(jiǎn)單而價(jià)廉的制備疫苗的方式，而且，由于該疫苗不是活的，故與活重組病毒載體疫苗相關(guān)的許多管理問(wèn)題不成為DNA疫苗的問(wèn)題。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了本發(fā)明DNA疫苗可以包含合成產(chǎn)生的核酸，該核酸可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的化學(xué)合成方法制備。分離的和純化的FCV衣殼蛋白在本發(fā)明再一實(shí)施方案中，疫苗由分離的和純化的FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段組成。尤其是，其中FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段包含SEQIDNO:13、15、17的氨基酸序列的疫苗。優(yōu)選地，該衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段在可產(chǎn)生該抗原的重組細(xì)菌或真核表達(dá)載體中產(chǎn)生，該抗原可以被分離和純化以制備所述疫苗。例如，在微生物例如細(xì)菌、酵母或真菌中、在真核細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)細(xì)胞中、或通過(guò)重組病毒載體例如腺病毒、痘病毒、皰滲病毒、Semliki森林病毒、桿狀病毒、謹(jǐn)菌體、Sindbis病毒或Sendai病毒，產(chǎn)生FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段。適用于產(chǎn)生FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的細(xì)菌包括大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、或能夠表達(dá)異源多肽的任何其它細(xì)菌。適宜表達(dá)FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的酵母類型包括釀酒酵母(Saccha濯ycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、假絲酵母(Candida)、或負(fù)巨夠表達(dá)異源多肽的任何其它酵母。使用上述細(xì)菌、真核細(xì)胞或重組病毒栽體產(chǎn)生可用于疫苗的抗原的方法是本領(lǐng)域熟知的。為了制備由衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段組成的疫苗，可以將編碼FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的核酸克隆至質(zhì)粒中，并使該核酸與能夠在微生物中實(shí)現(xiàn)該衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接。適宜的啟動(dòng)子包括但不限于，T7噬菌體啟動(dòng)子、T3噬菌體啟動(dòng)子、p-半乳糖苷酶啟動(dòng)子和Sp6噬菌體啟動(dòng)子。FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段在微生物中的表達(dá)使得可以使用商業(yè)上用于制備大量重組抗原性多肽的發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)該衣殼蛋白。分離和純化抗原的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括例如凝膠過(guò)濾、親和層析、離子交換層析或離心等方法。為了利于分離FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段，可以制備融合多肽，其中衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段與使得可以通過(guò)親和層析進(jìn)行分離的另一多肽連接。優(yōu)選地，融合多肽使用以下一種表達(dá)系統(tǒng)制備。例如，編碼FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的cDNA核酸序列在5，末端或3，末端與編碼多肽的核酸連接。這些核酸連接在正確的密碼子閱讀框中從而使得可以產(chǎn)生融合多肽，其中衣殼蛋白化地回收的多肽融合。融合多肽也可以防止抗原在純化過(guò)程中-皮降解。盡管包含融合多肽的疫苗是有效的，但是一些情況下可能期望在純化后除去該第二多肽。因此，也可以考慮該融合多肽在抗原和多肽之間的接合位置含有切割位點(diǎn)。該切割位點(diǎn)由氨基酸序列組成，該氨基酸序列可以被特異于該位點(diǎn)處的氨基酸序列的酶所切割?？梢钥紤]的此類切割位點(diǎn)的實(shí)例包括腸激酶切割位點(diǎn)(被腸激酶切割)、因子X(jué)a切割位點(diǎn)(被因子X(jué)a切割)、和GENENASE切割位點(diǎn)(被GENENASE切割(GE腿ASE是NewEnglandBiolabs，Beverly,Mass.的商標(biāo)))。以下是以融合多肽形式或者以無(wú)該多肽的分離的抗原形式生產(chǎn)衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的方法。以融合蛋白形式制備用于疫苗中的FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的原核表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例是可獲自AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway，N.J.的谷光苷肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用pGEX-4T-l表達(dá)載體質(zhì)粒。編碼衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的cDNA在正確的密碼子閱讀框中與編碼GST的DNA融合。該融合多肽的GST部分允許該融合多肽j吏用谷光苷肽Sepharose4B親和層析進(jìn)行快速純化。純化后，融合多肽的GST部分可以通過(guò)使用位點(diǎn)特異性蛋白酶例如凝血酶或因子X(jué)a切割除去而產(chǎn)生無(wú)GST多肽的抗原。無(wú)GST多肽的衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段可以通過(guò)第二輪谷光苷肽Sepharose4B親和層析產(chǎn)生。制備包含F(xiàn)CV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的疫苗的另一種方法是將編碼該抗原的cDNA和編碼多組氨酸的DNA密碼子在讀框內(nèi)連接的方法。該多組氨酸優(yōu)選地包含6個(gè)組氨酸殘基，這允許通過(guò)金屬親和層析(優(yōu)選地，鎳親和層析)純化該融合多肽。為了制備無(wú)該多組氨酸的衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段，可以在正確讀框內(nèi)在編碼多組氨酸的密碼子和編碼抗原的密碼子之間融合切割位點(diǎn)，例如腸激酶切割位點(diǎn)。通過(guò)腸激酶的切割，以及隨后第二輪結(jié)合游離多組氨酸的金屬親和層析，從該抗原上可以去除掉該多組氨酸。此方法被證實(shí)可以用于制備鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)的LcrV抗原，見(jiàn)Motin等的公開(kāi)(Infect.Immun.64:4313-4318(1996))?？蓮腎nvitrogen(Carlsbad,California)獲得的Xpress系統(tǒng)是可用于制備并之后分離多組氨酸-多肽融合蛋白的商業(yè)試劑盒的實(shí)例。再一可用于制備包含F(xiàn)CV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的疫苗的方法利用了Motin等，Infect.Immun.64:3021-3029(1995)公開(kāi)的方法。Motin等公開(kāi)了編碼融合多肽的DNA，該DNA由與編碼蛋白A部分的DM連接的抗原編碼DNA組成，其中編碼腸激酶切割位點(diǎn)的DNA在正確密碼子閱讀框中被置于編碼蛋白A的DNA和編碼抗原的DNA之間。蛋白A使得該融合蛋白可以通過(guò)IgG親和層析分離，并且無(wú)蛋白A的衣殼蛋白可以通過(guò)使用腸激酶切割而產(chǎn)生。然后可以通過(guò)第二輪IgG親和層析去除蛋白A。制備包含F(xiàn)CV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的疫苗的另一方法基于Daniels等的美國(guó)專利號(hào)5，725，863中^^開(kāi)的方法(在此完整并入作為參考)。Daniels等的方法可以用于制備由腸毒素分子組成的FCV衣殼疫苗，其中每個(gè)分子在FCV衣殼蛋白的100個(gè)氨基酸的上游插入其中?？梢杂糜谥苽浔景l(fā)明疫苗的其它融合多肽疫苗制備方法公開(kāi)在美國(guó)專利號(hào)5，585，100(Mond等)和美國(guó)專利號(hào)5,589,384(Liscombe)。最后，可從NewEnglandBiolabs獲得的pMAL融合及純化系統(tǒng)是融合多肽制備方法的另一實(shí)例，其中麥芽糖結(jié)合蛋白與衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段融合。該麥芽糖結(jié)合蛋白利于該融合多肽通過(guò)直鏈淀粉親和層析而分離。該麥芽糖結(jié)合蛋白可以與抗原通過(guò)一種以上提及的切割位點(diǎn)連接，由此該切割位點(diǎn)將使得可以制備無(wú)該麥芽糖結(jié)合蛋白的該抗原。盡管可以使用細(xì)菌方法制備用于疫苗的FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段，但可能期望在真核表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段。一個(gè)尤其有用的系統(tǒng)是Matsuura等的美國(guó)專利號(hào)5，229，293中公開(kāi)的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(完整地并入此處作為參考)。適于產(chǎn)生衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的桿狀病毒表達(dá)載體是來(lái)自Stratagene的pPbac和pMbac;和可獲自Invitrogen(Carlsbad,Calif.)的Bac-N-Blue載體、pBlueBac4.5載體、pBlueBacHis2-A，B，C和pMelBac?？捎糜诒磉_(dá)在疫苗中使用的FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的另一真核系統(tǒng)是酵母表達(dá)系統(tǒng)，例如可從Stratagene獲得的ESP酵母蛋白表達(dá)和純化系統(tǒng)。另一酵母表達(dá)系統(tǒng)是來(lái)自Invitrogen的任何一種基于畢赤酵母(Pichia)的表達(dá)系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)也在本發(fā)明范圍內(nèi)。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例是Stratagene的LacSwithII系統(tǒng)、pBK噬菌粒、pXTl載體系統(tǒng)和pSG5載體系統(tǒng)；可從Promega公司(Madison，Wis.)獲得的pTargeT哺乳動(dòng)物表達(dá)載體系統(tǒng)、pSI哺乳動(dòng)物表達(dá)載體、pCI哺乳動(dòng)物表達(dá)載體和pAdVantage載體；和可從Invitrogen獲得的蛻皮激素誘導(dǎo)型哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)、pCDM8、pcDNAl.1和pcDNAl.1/Amp。本發(fā)明還包括由包含作為熱穩(wěn)定性孢子遞送系統(tǒng)的成分的FCV衣殼蛋白或該衣殼蛋白的特定表位的疫苗組成的實(shí)施方案，其中所述遞送系統(tǒng)根據(jù)Acheson等的美國(guó)專利號(hào)5，800，821中教導(dǎo)的方法(完整地并入作為參考)制備。因此，本發(fā)明提供含有編碼FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的核酸的遺傳工程細(xì)菌細(xì)胞。當(dāng)將重組細(xì)菌孢子疫苗通過(guò)口服施用給貓時(shí)，孢子在貓的胃腸道中萌發(fā)，并且該細(xì)菌表達(dá)衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段，該衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段與貓的免疫系統(tǒng)發(fā)生接觸并引發(fā)免疫應(yīng)答。該疫苗具有熱穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)；因此，可以在室溫下無(wú)限期的貯存。-皮動(dòng)免疫疫苗盡管本發(fā)明上述實(shí)施方案提供了抗貓杯狀病毒的自動(dòng)免疫，但本發(fā)明還包括提供對(duì)貓杯狀病毒的被動(dòng)免疫力的疫苗。引發(fā)抗貓杯狀病毒的被動(dòng)免疫的疫苗由抗FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段或整個(gè)FCV病毒的多克隆抗體或單克隆抗體組成。為了制備包含多克隆抗體的被動(dòng)免疫疫苗，可以將FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段注射入適宜宿主中以產(chǎn)生這些抗體，優(yōu)選地，所述宿主是馬、豬、兔、綿羊或山羊。從這些宿主產(chǎn)生多克隆抗體疫苗的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，可以將衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段或整個(gè)杯狀病毒FCV衣殼與佐劑例如弗氏完全佐劑或可從CytRx公司(Norcross，Ga.)獲得的毒性較低的TiterMax混合，然后通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法施用給宿主。監(jiān)測(cè)抗體的產(chǎn)生，當(dāng)已經(jīng)產(chǎn)生了足夠抗體后，從宿主取出血清，并優(yōu)選地從血清中回收該抗體。被動(dòng)免疫疫苗可以包含抗FCV衣殼蛋白或整個(gè)FCV病毒的一個(gè)或多個(gè)表位的一種或多種單克隆抗體。用于生產(chǎn)單克隆抗體的方法和雜交瘤是本領(lǐng)域熟知的。盡管可以使用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，但是也可以根據(jù)噬菌體展示方法例如Marks等的美國(guó)專利號(hào)5,977,322體。可以根據(jù)已經(jīng)用于使抗體人源化的方法，例如Queen等的美國(guó)專利號(hào)5，693，762和5，693，761(完整地并入此處作為參考)公開(kāi)的方法，制備抗衣殼蛋白或其部分的貓?jiān)椿贵w。一種可用于制備單克隆抗體的喧菌體展示試劑盒是可從AmershamPharmaciaBiotech獲得的重組嗟菌體抗體系統(tǒng)。多克隆和單克隆抗體本發(fā)明還包括、描述、和要求保護(hù)幾種非常重要的單克隆抗體。這些抗體在此研發(fā)以便快速地鑒定以及在一些情況下定義本文描述的病毒林。單克隆抗體的具體實(shí)例及其描述可以見(jiàn)以下實(shí)施例。尤其參見(jiàn)實(shí)施例1-2和表1-2，并特別參見(jiàn)實(shí)施例1-8，表1-4。以下實(shí)施例旨在促進(jìn)而非限制對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解。第1部分實(shí)施例實(shí)施例1-1.FCV-21的分離生長(zhǎng)貓杯狀病毒(FCV)21林(FCV-21)于1993年6月自Michigan州AnnArbor的貓展示會(huì)上收集。將其稀釋在含有1%培養(yǎng)基的96孔微量管中，制成1:10稀釋液。將lOOju1該稀釋的樣品加入96孔板中的100ja1CRFK細(xì)胞中。通過(guò)在96孔板中有限稀釋，將該FCV-21病毒純化3次。自最終純化物獲取病毒上清液，用于感染于T25燒瓶中生長(zhǎng)至75%匯合度的CRFK細(xì)胞。當(dāng)觀察到100%CPE時(shí)，凍/融上清液三次，并等分至冷凍瓶(lml/瓶)。該病毒原液的滴度經(jīng)測(cè)定是1.5x108TCID5。/ml。FCV-21保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801UniversityBlvd.,Manassas,VA，20110，USA),ATCC保藏號(hào)為PTA-。實(shí)施例1-2.使用各種商業(yè)或現(xiàn)有單克隆抗體對(duì)FCV-21進(jìn)行的免疫焚光和ELISA分析對(duì)于免疫熒光分析試驗(yàn)(IFA)，使用FCV-21的病毒原液感染接種在24孔板中生長(zhǎng)至大約90%匯合度的NLFK細(xì)胞。感染后大約20小時(shí)，用lxPBS洗滌板子2次，并用80%丙酮固定。將各種單克隆抗體稀釋至大約2jig/n1，并加入板子的各孔中(0.2ml/孔)。振蕩下室溫(RT)孵育1小時(shí)后，用1xPBS洗滌每孔2次，加入二抗(抗小鼠FITC，10lug/ml)。用鋁箔覆蓋板子并振蕩下RT孵育30分鐘后，用lxPBS洗滌每孔2次，并空氣干燥。然后在熒光顯微鏡下觀察每孔的FITC染色強(qiáng)度。對(duì)于ELISA試驗(yàn)，用200m1以1:1500稀釋在碳酸鈉緩沖液(1.59g血20)3和2.93gNaHC0"溶解在1升水中)中的抗FCV兔多克隆抗體(Pfizer#16)包被96孔ELISA板。4。C過(guò)夜孵育板子。用含有0.05%Tween-20的1xPBS(pH7.4)(PBST)洗滌板子3次，然后用200ju1于PBST中的1%酪蛋白37C封閉1小時(shí)。將各種單克隆抗體稀釋至大約0.1jug/ml并加至各孔(100ju1/孔)。每種樣品進(jìn)行一式三份試驗(yàn)。37。C溫育l小時(shí)后，用PBST將每孔洗滌3次，并與100jall:200稀釋的過(guò)氧化物酶綴合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)(JacksonI,noResearch，cat.No.715-035-150)—起37C溫育1小時(shí)。然后用PBST洗滌每孔3次，之后向每孔加入100n1ABTS過(guò)氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg，Maryland,cat.No.50-66-18)。RT大約IO分鐘后，使用ELISA讀數(shù)器于405-490nm(雙波長(zhǎng))讀板?；谛?噪比計(jì)算比活性。來(lái)自IFA和ELISA試驗(yàn)的數(shù)據(jù)集彼此良好地相關(guān)(表l-2)，說(shuō)明FCV-21與F9(通常使用的FCV疫苗抹)在免疫學(xué)上是不同的。兩種單克隆抗體(FCVl-43和MAB791P)與F9反應(yīng)，但不與FCV-21反應(yīng)(表1-2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>實(shí)施例1-3.FCV-21衣殼序列分析從FCV-21感染的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液使用TRIzol試劑(Invitrogen;Carlsbad,CA)分離總RNA。4吏用隨才幾引物和SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)合成"第一鏈，，cDNA制備物。<吏用XLrTth聚合酶(AppliedBiosystems;FosterCity;CA)和寡核苷酸引物DEL-653(SEQIDNO:l)和DEL-651(SEQIDNO:2)，進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用BigDye化學(xué)和ABI377遺傳分析儀對(duì)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。完整衣殼序列顯示于SEQIDNO:12(核苷酸序列)和SEQIDNO:13(編碼的氨基酸序列)。實(shí)施例1-4.FCV-49的分離和生長(zhǎng)貓杯狀病毒(FCV)49林(FCV-49,也稱作PHA-49)于1993年自Philadelphia,PA貓展示會(huì)收集。將該標(biāo)本稀釋在含有1%培養(yǎng)基的96孔微量管中，制成1:10稀釋物。將lOOp1該稀釋的樣品加入96孔板中的100|i1CRFK細(xì)胞中。通過(guò)在96孔板中有限稀釋，將該FCV-49病毒純化3次。自最終純化物獲取病毒上清液，用于感染于T25燒瓶中生長(zhǎng)至75%匯合度的CRFK細(xì)胞。當(dāng)觀察到100%CPE時(shí)，凍/融上清液三次，并等分至冷凍瓶(lml/瓶)。該病毒原液的滴度經(jīng)測(cè)定是6.8x107TCID5。/ml。FCV-49保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801UniversityBlvd.,Manassas,VA，20110，USA),ATCC保藏號(hào)為PTA-。實(shí)施例1-5.FCV-49衣殼序列分析從FCV-49感染的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液使用TRIzol試劑(Invitrogen;Carlsbad,CA)分離總RNA。4吏用隨才幾引物和SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)合成"第一鏈"cDNA制備物。使用XLrTth聚合酶(AppliedBiosystems;FosterCity;CA)和寡核苷酸引物DEL-653(SEQIDNO:l)和DEL-651(SEQIDNO:2)，進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用BigDye化學(xué)和ABI377遺傳分析儀對(duì)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。完整衣殼序列顯示于SEQIDNO:14(核苷酸序列)和SEQIDNO:15(編碼的氨基酸序列)。實(shí)施例1-6.FCV-26391-4的分離和生長(zhǎng)貓杯狀病毒(FCV)26391-4林(FCV-26391-4)于2003年自BayCounty的HumaneSociety(PanamaCity,Florida)收集。通過(guò)在含有具2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)的96孔板中有限稀釋，將其純化1次。然后使用該純化的病毒感染T150燒瓶中所含的NLFK(Norden實(shí)驗(yàn)室貓腎)細(xì)胞。一旦達(dá)到100。/。CPE，凍/融上清液三次，并等分至冷凍瓶(O.85ml/瓶)。該病毒原液的滴度經(jīng)測(cè)定是S.6x107TCID5o/ml。FCV-26391-4保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801UniversityBlvd.，Manassas,VA，20110，USA)，ATCC保藏號(hào)為PTA-。實(shí)施例1-7.FCV26391-4衣殼序列分析從FCV26391-4感染的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液使用QIAamp病毒RNA分離試劑盒(Qiagen;Valencia,CA)分離總RNA。將大約1jag病毒RNA用于RT-PCR(使用PlatinumTaq的Superscript—步RT-PCR;來(lái)自Invitrogen)。反應(yīng)條件為50°C30分鐘；2分鐘；之后40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為15秒、55"C30秒和70t:2分鐘；之后72。C最后溫育10分鐘，并4匸儲(chǔ)存。所用引物是FCV-N2(SEQIDNO:3)和FCV-引物2(SEQIDNO:9)。然后使用各種寡核苷酸引物(SEQIDNO:3，4，5，6，7，8，9，lO和ll)，對(duì)該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。FCV26391-4的完整衣殼序列顯示于SEQIDNO:16(核苷酸序列)和SEQIDNO:17(編碼的氨基酸序列)。FCV-21、FCV-49和FCV-26391-4的衣殼基因的氨基酸序列與GenBank中存在的所有全長(zhǎng)FCV衣殼序列進(jìn)^f亍比對(duì)。該比對(duì)使用ClustalW算法(Thompson等，1994)、PAM250權(quán)重矩陣(Dayhoff等，1978)和默認(rèn)程序參數(shù)(MegAlign;DNASTAR，Inc;Madison,WI)進(jìn)行。FCV-21和FCV213-95的衣殼蛋白序列之間的同一性是GenBank中所有條目中最高的，為90.7%。FCV-49和FCV213-95衣殼序列有92.2%35同一性。FCV26391-4和FCVCFI-68衣殼序列彼此有91.3%同一性。對(duì)于FCV-21、FCV-49和FCV26391-4，給出了單一一個(gè)衣殼序列，該序列基于對(duì)所獲PCR的直接測(cè)序。然而，這些序列每一個(gè)均代表一個(gè)病毒準(zhǔn)種群體(已知存在于RNA病毒群體中)(綜述見(jiàn)Domingo等，VirusRes.82:39-44，2002)中的平均或共有序列。準(zhǔn)種是RNA基因組復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的錯(cuò)誤的直接結(jié)果，由此產(chǎn)生基因組中具有突變的后代。因此，預(yù)期對(duì)于這些和其它FCV衣殼基因序列而言天然存在衣殼序列的微小變異。然而，每個(gè)序列中突變的分布將對(duì)毒株(包括FCV-21、FCV-49和FCV26391-4)之間的總體同一性幾乎不/完全不產(chǎn)生影響。實(shí)施例1-8.特異于FCV-21的單克隆抗體的制備A.FCV-21的純化。將來(lái)自感染了FCV-21的NLFK細(xì)胞的約200ml細(xì)胞培養(yǎng)物上清液以3，000rpm在IOC離心30分鐘。將"ml上清液轉(zhuǎn)移至BeckmanUltraclear離心管中，并將10ml10%蔗糖溶液鋪在管底。然后管子以27，000rpm、15。C離心2小時(shí)。離心后，取出上清液并丟棄，沉淀重懸浮在250ju1無(wú)菌水中。使用MicroBCA蛋白分析試劑盒(PierceChemicalCo.，Rockford，IL)測(cè)定蛋白濃度為7mg/ml。小鼠的免疫和雜交瘤細(xì)胞克隆的制備將大約100Mg純化的FCV-21病毒蛋白與弗氏佐劑一起注射入每只小鼠。免疫接種8只小鼠。使用100jLig純化的FCV-21和RIBI佐劑以4周為間隔進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫。使用純化的FCV-21在ELISA中測(cè)定8只小鼠的免疫應(yīng)答，具有31250或以上的效價(jià)。進(jìn)行細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤克隆。培養(yǎng)68個(gè)此類細(xì)胞克隆，并檢測(cè)上清液與FCV-21的反應(yīng)性。對(duì)于此ELISA，用100ju1純化的FCV以5jug/ml的濃度(稀釋在1xPBS中)包被96孔ELISA板。板子在非增濕的溫箱中37。C不加蓋干燥過(guò)夜。通過(guò)施用0.lml甲醇并室溫溫育5分鐘，固定板上的病毒。然后用蒸餾水洗滌板8次，然后用200ja1于1xPBS中的10%house血清4。C封閉過(guò)夜。再次用蒸餾水洗滌板子8次。將各種稀釋度的小鼠血清樣品加入各孔(lQO]Li1/孔)。每個(gè)樣品進(jìn)行一式三份重復(fù)。37。C溫育l小時(shí)后，每孔用PBST洗涂3次，并與100iilU00稀釋的過(guò)氧化物酶綴合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)(JacksonI腿畫Research，Cat.No.715-035-150)37C溫育1小時(shí)。然后每孔用PBST洗涂3次，之后每孔加入100|i1ABTS過(guò)氧化物酶底物(KPL,Gaithersburg，Maryland,Cat.No.50-66-18)。RT大約10分鐘后，用ELISA讀數(shù)器于405-490nm(雙波長(zhǎng))讀板。基于信/噪比計(jì)算比活性。FCV-21特異性單克隆抗體的反應(yīng)性使用以上雜交瘤細(xì)胞克隆的上清液在夾心ELISA試驗(yàn)中檢測(cè)其對(duì)FCV-21和F9的反應(yīng)性。簡(jiǎn)而言之，用200y1以1:1500稀釋在碳酸鈉緩沖液(l.59gNa2C03和2.93gNaHC03，溶解在1升水中)中的抗FCV兔多克隆抗體(Pfize"16)包被96孔ELISA板。4C過(guò)夜孵育板子。用含有0.05%Tween-20的1xPBS(pH7.4)(PBST)洗涂板子3次，然后用200jul于PBST中的1%酪蛋白37"封閉1小時(shí)。向每孔加入1:10稀釋的FCV-21和F-9上清液。37t:溫育1小時(shí)后，洗滌板子并按一式三份向各孔加入各種雜交瘤上清液和它們的各種稀釋物(100|u1/孔)。然后，板子在37C溫育1小時(shí)，用PBST洗滌3次，并與100ju11:200稀釋的過(guò)氧化物酶綴合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)(JacksonImm畫Research，Cat.No.715-035-150)—起37。C溫育1小時(shí)。洗滌后，向每孔加入100plABTS過(guò)氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg,Maryland,Cat.No.50-66-18)。RT大約10分4中后，使用ELISA讀數(shù)器于405-490nm(雙波長(zhǎng))讀板?；谛?噪比計(jì)算比活性。表1-3.ELISA篩選各種雜交瘤細(xì)胞上清液對(duì)FCV-21及F9的特異反應(yīng)性mAb未孝^釋的1:IO稀釋的mAb1:50稀釋的mAbmAb\病毒PHA-21F9PHA-21F9PHA-21F91sup30131212Asup212Bsup313sup2932111614sup115sup116sup117sup2632211718sup98319Asup119Bsup1110sup151310611sup1113sup2722191414Asup2214Bsup315sup1116sup212512117sup20114112118sup2722251120sup1121sup179722122sup2123sup12110110124sup14141126sup1127sup1578328sup1229sup24823129130sup17713118131sup1919161132sup28162112181033sup2017151334sup2018151335sup14129636sup17515121137sup124311138sup6539sup231517640sup16310113141sup19714142sup13115117143sup1144sup944145sup1146sup843247sup4348sup11115449sup12138750sup1138<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>B.特異于FCV-21而非其它FCV林的單克隆抗體。選擇18個(gè)雜交瘤細(xì)胞克隆(3、7、17、23、27、29、30、36、37、40、41、42、44、53、56、59、60和61),進(jìn)一步檢測(cè)其對(duì)FCV-21的特異性。在本試驗(yàn)中使用11種FCV病毒(FCV-21，49，26391-4，F(xiàn)9，CFI-68，33585，89391，255，J-l,2280和H)。再次使用如上所述的夾心ELISA。結(jié)果總結(jié)在表1-4中。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>如上顯示的，雜交瘤細(xì)胞系23、41、44和56對(duì)FCV-21具有特異性而對(duì)任何其它的測(cè)試FCV不具有特異性。因此，這些單克隆抗體可以用作FCV-21的診斷工具。而且，雜交瘤36似乎僅與疫苗FCV林(FCV-21、49、26391-4)反應(yīng)而不與任何其它的FCV林反應(yīng)。雜交瘤細(xì)胞系23、36、41、44和56全部保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801UniversityBlvd.，Manassas,VA，20110，USA)，并具有如下ATCC保藏號(hào)PTA-7349(23)PTA-7350(36)PTA-7353(41)PTA-7351(44)PTA-7352(56)實(shí)施例1-9.FCV-21和FCV-49的血清針對(duì)1993年分離的FCV病毒的血清交叉中和分初"A.同源抗血清的滴定。在無(wú)特定病原體(SPF)貓中產(chǎn)生抗12種FCV分離株的恢復(fù)期抗血清，并在第一和第二次接種后收集該抗血清。該病毒接種物根據(jù)原液滴度而變，范圍在104至108TCID5。/貓之間。初次給貓接種，3周后進(jìn)行加強(qiáng)，然后于加強(qiáng)后2周放血取血清。所述12種分離林包括F9、CFI-68、LS012、JOK63、JOK92、和野外分離林18、21、49、50、54、27和11。這些野外分離林基于各林衣殼蛋白序列的高變區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)生分析而選擇。選擇最大趨異的分離林進(jìn)行該研究。56°C30分鐘熱滅活血清，使用標(biāo)準(zhǔn)恒定病毒-可變血清技術(shù)(Griest1979，Mahy1996),針對(duì)其同源病毒進(jìn)行滴定。簡(jiǎn)而言之，向96孔組織培養(yǎng)板的每孔中加入培養(yǎng)基(100-150ja1)。向頂排的每孔加入血清(100-150ju1)(1:2或1:4最初的血清稀釋；F9和LS012為1:4)，使用多道吸液器混合(l:2稀釋)后將100ja1在板上向下轉(zhuǎn)移。丟棄最后的100ji1。向每孔加入50ji1滴定過(guò)的同源病毒(稀釋至200TCID5。/50|u1),板子在C02溫箱中37C溫育2小時(shí)。溫育后，每孔加入50jnl1:IO稀釋的CRFK細(xì)胞懸浮液。使用該稀釋的病毒設(shè)置病毒滴度板以確保向每孔添加適當(dāng)?shù)慕臃N物。在含有150ju1培養(yǎng)基的頂排使用50jul病毒；板的剩余部分含有180jli1/孔，并使用20jal在板上向下實(shí)施10倍稀釋。板子溫育4天，使用Karber^^式計(jì)算血清和病毒滴定(對(duì)于血清滴度，在等式中使用受保護(hù)的孔與未受保護(hù)的孔的比率)。當(dāng)?shù)味ㄑ鍟r(shí)，TCIDs。定義為50。/。的中和終點(diǎn)稀釋度(Griest1979)。一個(gè)抗體單位(AU)定義為在50%測(cè)試培養(yǎng)物中能夠中和32-320TCID5。的同源病毒的該抗血清的最高稀釋度。因此，獲得的該TCIDs。等于1AU。針對(duì)2.5、5、10和20AU的血清濃度實(shí)施病毒交叉中和。B.病毒交叉中和試驗(yàn)。每個(gè)病毒野外分離林以及病毒林F9、LS012、皿63、J0K92、SA113和CFI-68在交叉中和試驗(yàn)中針對(duì)12種FCV抗血清之每一種進(jìn)行測(cè)試。每種病毒需要5塊96孔板。每種血清稀釋至2.5、5、10和20AU，在板上向下8次重復(fù)接種(3種血清/板，總4塊板)，以及一塊病毒滴度板(按用于血清滴定的相同方式設(shè)置)。通過(guò)首先將血清稀釋至20AU,然后向下進(jìn)行2倍稀釋至2.5AU,在DMEM中制備抗血清稀釋物。然后將每種稀釋物的等分試樣(100jil)加入板的每一列孔。將病毒37X:快速融化，置于水上，然后稀釋至200TCID5。/孔(置于冰上)。為了維持均一性，對(duì)于大多數(shù)病毒原液使用3步稀釋法，在任一步都不超過(guò)1:100。將稀釋的病毒原液(50jal)加入血清板的所有孔，按前述進(jìn)行滴定。板子在37'C于C02溫箱中溫育2小時(shí)，之后向每孔加入50ju11:10稀釋的之前生長(zhǎng)至匯合的CRFK細(xì)胞懸浮液。在每一組5塊板后更換吸液器頭和儲(chǔ)液槽。4天后對(duì)板子進(jìn)行評(píng)分。一些情況下，使用預(yù)先滴定的、預(yù)先稀釋的病毒。承SN中^吏用2,5、5、10、20個(gè)抗體單位，N-8/8-陂保護(hù)的孔n-4-7/8被保護(hù)的孔，-=0-3/8被保護(hù)的孔，空白=血清不足/未做表1-5.血清交叉中和結(jié)果腦3JOK92CFI68LS0122.5/5/10/20*一一nn2,5/5/10/202.5/5/10/20nNNN一一-n,〗H一一nN一nnnnnnnNXXXXnNnN一nNn一nn2.5/5/10/20nNNN一n—nn—一一nnnN一一nN112.5/5/10/20f二n謂,一一nxnNNx一XXX--Nx一xxxnxxx一XXX—Nnx一一nx一nnx一nnxNNNxnnNx一一一xNNNxnnNxNxxx一—nx一nnx一XXX一一—X一—nxnnnx一一NxNNNxnNNxNXXX一XXX一XXXNxxxNxxx一xxxNxxxF92.5/5/10/20NxNxNxNxIIxNxXX-nNx一XXXNXXX一XXXNXXX一一NxN，NNNNXN夷NNnN一42表l-5(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>本SN中使用2.5、5、10、20個(gè)抗體單位N=8/8祐沐護(hù)的孔n=4-7/84皮保護(hù)的孔-=0-3/8被保護(hù)的孔空白=血清不足/未做交叉中和數(shù)據(jù)總結(jié)在表1-5中。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表分析的8個(gè)重復(fù)孔。"N，，、"n，，或"-，，代表被保護(hù)的孔相對(duì)于未保護(hù)的孔的比率，該比率指示了交叉中和的程度。表中突出顯示的血清中和結(jié)果對(duì)應(yīng)于每種單特異性血清針對(duì)其同源病毒檢測(cè)到的結(jié)果。這些血清應(yīng)當(dāng)完全地中和；對(duì)于大部分而言它們確是如此。少數(shù)例外，最顯著的是JOK63、JOK92和11,在較高AU值時(shí)表現(xiàn)出完全的中和作用，但是在2.5AU時(shí)則不。這可能是由于稀釋誤差導(dǎo)致的。該數(shù)據(jù)集中最顯著的結(jié)果是血清FCV-21和FCV-49，尤其是后者，所表現(xiàn)出的高度交叉中和作用。這些血清的交叉中和模式似乎類似于F9的。(應(yīng)當(dāng)注意，對(duì)于F9以及對(duì)于FCV-21和FCV-49在20AU下的數(shù)據(jù)集由于血清量不足而是不完全的)。盡管3種血清(FCV-21、FCV-49和F9)之間在中和模式上存在一些差異，但是分離林ll、38和39—貫地不被這三種血清中的任一種所中和。實(shí)施例1-10.FCV-21和FCV-49抗血清針對(duì)2003年分離的FCV病毒進(jìn)行的交叉中和分析本研究中的FCV抗血清通過(guò)使用105至106TCID5。/mlFCV鼻內(nèi)接種貓(4-5只貓/組)而產(chǎn)生。之后3周使用相同量的病毒進(jìn)行加強(qiáng)接種。加強(qiáng)接種后2周收集血清，并56t:30分鐘熱滅活。將來(lái)自每只接種的貓的血清樣品用于血清中和試驗(yàn)中針對(duì)26種FCV林之每一種進(jìn)行分析(表1-6)。以1:8稀釋血清樣品并之后在600ju1體積中進(jìn)行2倍系列稀釋至1:16384(總共12次稀釋)。將600u1中具有50-500TCID5。/ml滴度的FCV與稀釋的血清樣品一起混合，并室溫溫育45分鐘。然后，按一式四份將200ju1樣品轉(zhuǎn)移至接種有CRFK細(xì)胞的96孔板的每孔中。板子于37°C，5%0)2下溫育6天，確定終點(diǎn)中和滴度。根據(jù)Spearman-Karber的方法(Spea簡(jiǎn)nC，1908，BritJPsychol2:227-242;KarberG，1931，ArchexpPathPharmak162:480-487),計(jì)算血清中和(SN)滴度和攻擊病毒的返滴定滴度(back-titer)。用>23和>15和>10的截?cái)嗟味确治鲅逯泻蛿?shù)據(jù)。結(jié)果顯示在表1-7中。數(shù)據(jù)提示FCV-21、FCV-49和FCV26391-4具有更寬的交叉中和譜，因此是比現(xiàn)有的FCV疫苗林F9更好的疫苗候選者。表1-6.交叉中和研究中使用的26種FCV林<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表1-7.與F9相比較對(duì)FCV-21、FCV-49和FCV26391-4進(jìn)行的交叉中和分析A.候選者超過(guò)F9°/。(SN滴度>23)%增加(IN)FCV-21IN43.968.9FCV-49IN33.930.4FCV26391-4IN28.911.2F9IN26B.候選者超過(guò)F9%(SN滴度>15)氧依FCV-21IN51.562.5FCV-49IN37.718.9FCV26391-4IN39.424.3F9IN31.7C.候選者超過(guò)F9^(SN滴度MO)%增加(IN)FCV-21IN74.636.1FCV-49IN63.115,2FCV26391-4IN63,515.9F9IN54.8實(shí)施例1-11.接種帶有和不帶有FCV-21的Felocell4成分的貓的死亡率和臨床得分約8周齡的家養(yǎng)短毛貓接種FELOCELL4成分，其中該成分含有修飾的活貓鼻氣管炎病毒[FHV]、杯狀病毒[FCV-F9]、全白細(xì)胞減少癥病毒[FP]和鸚鵡熱衣原體并含有或不含有另一種FCV林FCV-21。所評(píng)價(jià)的免疫接種方案包括初次皮下接種，之后于第21天皮下加強(qiáng)接種(SQ/SQ);初次皮下接種，之后在第21天進(jìn)行一次口服加強(qiáng)免疫(SQ/口服)；或者初次口服免疫接種，之后于第21天第二次口服免疫接種。46口服接種通過(guò)將疫苗施用于口中來(lái)實(shí)現(xiàn)。第42天，用大約lml強(qiáng)毒性系統(tǒng)性FCV-33585(3log的TCID5。/ml)攻擊所有的貓。攻擊后持續(xù)14天監(jiān)測(cè)所有貓的疾病臨床征候(溫度、結(jié)膜炎漿液狀排出物、結(jié)膜炎含粘液膿性排出物、鼻炎漿液狀排出物、鼻炎含粘液膿性排出物、打噴嚏、可聽(tīng)見(jiàn)的羅音、咳嗽、張嘴呼吸、厭食、脫水、〈4mm的一個(gè)口腔潰瘍、多個(gè)口腔潰瘍、〉4mm的口腔潰瘍、過(guò)量分泌唾液、非流血性表面潰瘍、流血性表面潰瘍)。將攻擊后表現(xiàn)出與杯狀病毒發(fā)病相一致的幾種臨床征候的貓?zhí)幇矘?lè)死。如表1-8所示，添加新的毒林FCV-21顯著地增加FELOCELL4(有或無(wú)FCV-F9存在)的效力。SQ/SQ接種和SQ/口服接種兩者均似乎可以有效地預(yù)防FCV感染。而且，我們已經(jīng)證實(shí)在FELOCELL4和FELOCELL3(FELOCELL3是無(wú)鸚鵡熱衣原體的FELOCELL4)中添加FCV-21但不存在F9的情況下甚至通過(guò)口服/口服免疫接種也可以有效地抗FCV感染。對(duì)于表1-9，所評(píng)價(jià)的免疫接種方案包括初次皮下接種之后于第21天和第42天進(jìn)行兩次口服加強(qiáng)免疫(SQ/口服/口服)。我們證實(shí)，在FELOCELL4中添加FCV-21，無(wú)論是否存在FCV-F9，均顯著地降低了死亡率和臨床得分。表l-8<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>*FELOCELL4A:無(wú)FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL4"FELOCELL3A:無(wú)FCV-F9但具iFCV-21的FELOCELL3<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>實(shí)施例1-12.來(lái)自使用具有和不具有FCV-21的FEL0CELL4成分免疫接種的貓的血清的交叉中和分析從實(shí)施例1-11所描述的研究中在第二次接種后但在85攻擊之前的每只貓收集血清。樣品56匸熱處理30分鐘，并在血清中和試驗(yàn)中針對(duì)之前實(shí)施例1-10中所述26種FCV林(表l-6)之每一種進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用〉23和〉15的截?cái)嗟味确治鲅逯泻蛿?shù)據(jù)，計(jì)算兩個(gè)截?cái)嗟味鹊钠骄?Ave)。結(jié)果顯示在表l-10種。數(shù)據(jù)顯示，含有FCV-21的所有疫苗制劑均比含有傳統(tǒng)FCV-F9林的疫苗具有更寬的交叉中和譜(大約60°/。對(duì)40%)。這導(dǎo)致被中和的FCV林?jǐn)?shù)目增加了大約50%。表I-IO<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>*FELOCELL4A:無(wú)FCV-F94旦具有FCV-21的FELOCELL4"FELOCELL3A:無(wú)FCV-F9^fS^有FCV-21的FELOCELL3如表1-10所示，添加新毒林FCV-21,無(wú)論是否存在FCV-F9,均顯著地增加了FEL0CELL4的交叉中和鐠。使用SQ/SQ接種和SQ/口服接種均觀察到較寬的中和譜。而且，我們證實(shí)FEL0CELL4和FEL0CELL3中存在FCV-21但無(wú)F9時(shí)使用口服/口服免疫接種增強(qiáng)了交叉中和鐠。表l-ll中，所評(píng)價(jià)的免疫接種方案包括初次的皮下接種及之后于第21天和第42天的兩次加強(qiáng)免疫(SQ/口服/口服)。結(jié)果說(shuō)明，在FEL0CELL4中添加FCV-21在有或無(wú)FCV-F9的情況下均導(dǎo)致顯著更寬的交叉中和譜(大約增加40%)。表l-ll<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>*FELOCELL4A:無(wú)FCV-F9^S^TFCT-21的FELOCELL4編號(hào)的本發(fā)明描述。本發(fā)明的其它描述和實(shí)施例。1.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗，其包含F(xiàn)CV-21衣殼蛋白或分離的FCV-21衣殼蛋白。2.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗，其包含F(xiàn)CV-21衣殼蛋白或分離的FCV-21衣殼蛋白和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述衣殼蛋白包含蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:13)和具有至少大約91.2%、95%和99%同一性的序列；其中所述衣殼蛋白以有效產(chǎn)生免疫應(yīng)答的量提供。3.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的DM疫苗，其包含編碼FCV-21衣殼蛋白或分離的FCV-21衣殼蛋白的核酸序列，其中所述DM包含序列(SEQIDNO:12)和具有至少大約78.7%和79.2%序列同一性并允許保守替代的序列。4.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗，其包含F(xiàn)CV-49衣殼蛋白或分離的FCV-49衣殼蛋白，其中所述衣殼蛋白包含來(lái)自FCV-49林的蛋白質(zhì)序列。5.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗，其包含F(xiàn)CV-49衣殼蛋白或分離的FCV-49衣殼蛋白和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述衣殼蛋白包含蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:15)和具有至少大約92.7%、95%和99%同一性的序列；其中所述衣殼蛋白以有效產(chǎn)生免疫應(yīng)答的量提供。6.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的DNA疫苗，其包含編碼FCV-49衣殼蛋白或分離的FCV-49衣殼蛋白的核酸序列，其中所述DNA包含序列(SEQIDNO:14)和具有至少大約78.9%，即79.4%(78.9+0.5)序列同一性并允許保守替代的序列。7.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗，其包含F(xiàn)CV-26391-4衣殼蛋白或分離的FCV-26391-4衣殼蛋白，其中所述衣殼蛋白包含來(lái)自FCV-26391-4林的蛋白質(zhì)序列。8.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗，其包含F(xiàn)CV-26391-4衣殼蛋白和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述衣殼蛋白包含蛋白質(zhì)序列(SEQIDN0:17)和具有至少大約91.8%、95%和99%同一性的序列；其中所述衣殼蛋白以有效產(chǎn)生免疫應(yīng)答的量提供。9.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的DNA疫苗，其包含編碼FCV-26391-4衣殼蛋白或分離的FCV-26391-4衣殼蛋白的核酸序列，其中所述DNA包含序列(SEQIDNO:16)和具有至少大約78.4%,即78.9%(78.4+0.5)序列同一性的序列。10.權(quán)利要求l-3之任一項(xiàng)的疫苗，其中多核苷酸選自基本上由SEQIDN0:12、14、16組成的組。11.權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的疫苗，還包含以下的單獨(dú)一項(xiàng)或任何組合其中疫苗包含佐劑，其中FCV成分是活的，其中FCV成分是減毒的，其中FCV成分是滅活的，該疫苗可以包括至少一種選自FCV-F9、FCV-LLK、FCV-M8、FCV-255和FCV-2280的其它貓杯狀病毒林。12.權(quán)利要求1、4和7的疫苗，其中疫苗包括至少一種選自貓皰滲病毒、貓白血病病毒、貓免疫缺陷病毒、鸚鷸熱衣原體和貓細(xì)小病毒、狂犬病毒和支氣管敗血性鮑特菌的其它貓病原體。13.免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗，其包含有效產(chǎn)生免疫應(yīng)答的量的FCV衣殼蛋白的核苷酸序列和藥學(xué)上可接受的栽體，所述衣殼蛋白選自與SEQIDNO:13、15或17具有93%或更高同一性的多肽，其中所述FCV分離林不是213-95林，并且其中所述核酸序列與異源啟動(dòng)子序列可操作地連接。14.權(quán)利要求13的疫苗，其中核苷酸序列選自基本上由SEQIDNO:12、14和16組成的組。15.權(quán)利要求13的疫苗，其中核苷酸序列以以下任一種形式存在質(zhì)粒、重組病毒載體。16，權(quán)利要求13的疫苗，其中重組病毒載體選自貓皰滲病毒、浣熊痘病毒、金絲雀痘病毒、腺病毒、Semliki森林病毒、Sindbis病毒和痘苗病毒。17.包含獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑載體和分離的FCV株的免疫原性組合物，其中所述FCV林可以與選自本文描述為23、26、41、44和56的單克隆抗體的單克隆抗體結(jié)合。18.包含獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑載體和分離的FCV林的免疫原性組合物，其中所述FCV抹選擇性地與選自本文描述為23、26、41、44和56的單克隆抗體的單克隆抗體結(jié)合。19.權(quán)利要求17和18的免疫原性組合物，其中FCV林是滅活的，其中所述FCV林是疫苗并且其中該組合物包含佐劑。20.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的方法，包括給貓施用有效劑量的權(quán)利要求l-14之任一項(xiàng)的疫苗，其中該疫苗還包含佐劑。第2部分以下部分提供有關(guān)免疫動(dòng)物以抵抗病毒，尤其是免疫貓以抵抗杯狀病毒的方法的詳細(xì)信息除非另行指明，否則以下的公開(kāi)使用上面和下面給出的定義。此處描述使用疫苗治療和免疫動(dòng)物，尤其是貓以抵抗貓杯狀病毒(FCV)的方法和材料。該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗，所述疫苗能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，尤其是在貓中誘導(dǎo)抗FCV的免疫應(yīng)答。第一疫苗典型地通過(guò)胃腸外途徑施用，但在一些情況下可以通過(guò)口服施用，而第二疫苗通過(guò)口服或者口鼻途徑于第一疫苗施用后N天施用。這些疫苗典型地首先通過(guò)胃腸外途徑施用，因?yàn)槿绻畛跬ㄟ^(guò)口服途徑施用，它們典型地將造成口腔損傷。令人驚奇的是，在此我們公開(kāi)了FCV-21、FCV-49和FCV26391-4林，這些病毒林十分安全和有效以致可以按照第一次口服施用之后第二次口服施用的方式進(jìn)行施用。在此，N為3至120(包括3和120)的整數(shù)，但典型地是7至42(包括7和42)的整數(shù)，或者14至28(包括14和28)的整數(shù)，優(yōu)選是大約3周以及大約2-4周。備選地，第二疫苗可以在貓出現(xiàn)大約1:6、1:9、1:12、1:15、1:18或更高的FCV血清中和滴度后施用。該方法也可以包括在第一疫苗或第二疫苗施用后M天再進(jìn)行一次或多次胃腸外、口服或口鼻FCV疫苗施用，其中M是l至120(包括l和120)的整數(shù)。因此，代表性的免疫接種方案包括(l)皮下施用第一FCV疫苗，之后口服施用笫二FCV疫苗；(2)相繼皮下施用第一和第三FCV疫苗，之后口服施用第二FCV疫苗；和(3)皮下施用第一FCV疫苗，之后相繼口服施用第二和第三FCV疫苗。如上所述，第一疫苗通過(guò)胃腸外途徑(例如皮下)施用，第二疫苗通過(guò)口服或口鼻施用，并且任選的第三疫苗可以通過(guò)胃腸外途徑、口服或口鼻施用?？梢允褂萌魏窝b置施用這些疫苗，包括注射器、滴管、無(wú)針頭注射裝置等等。對(duì)于口鼻施用，裝有套管的注射器可用于將疫苗滴入貓的鼻子和嘴。該方法可以使用能夠在貓中誘導(dǎo)抗FCV的免疫應(yīng)答的任何疫苗，只要可以使第一疫苗適應(yīng)于胃腸外施用而使第二疫苗適應(yīng)于口服或口鼻施用即可。如上所述，使任選的第三疫苗適應(yīng)于胃腸外、經(jīng)口或口鼻途徑施用。第一、笫二和任選的第三疫苗可以是相同或不同的并且各自可以獨(dú)立地包含來(lái)源于一種或多種FCV林的一種或多種抗原。因此有用的疫苗包括活的病毒疫苗、修飾的活病毒疫苗、和滅活的病毒疫苗?；畹暮托揎椀幕畹腇CV疫苗包含在貓中不造成疾病并且已經(jīng)以非毒性形式分離或者已經(jīng)使用熟知方法(包括在適宜的細(xì)胞系中連續(xù)傳代或者暴露于紫外線或者化學(xué)誘變劑)而減毒的FCV抹。滅活的或死的FCV疫苗包含已經(jīng)通過(guò)已知方法，包括利用福爾馬林、0-丙內(nèi)酯(BPL)或者BEI等進(jìn)行處理而滅活的FCV林。示例性疫苗包括含有選自FCV-F9、FCV-M8、FCV-255、FCV-2280、FCV-21、FCV-49、FCV-26391-4等的單獨(dú)的或任何組合的非毒性林的那些疫苗。54其它有用的來(lái)源于一種或多種FCV林的疫苗包括重組疫苗和DM疫苗(即，亞單位疫苗)。重組疫苗包括重組病毒載體，每一個(gè)均含有編碼來(lái)源于FCV林的抗原的核酸。此類載體可以通過(guò)將編碼源于FCV林的抗原(例如衣殼蛋白)的cDNA插入非毒性病毒(包括皰滲病毒、痘病毒、腺病毒等的林系)的基因組中而制備。對(duì)于病毒載體，該cDNA在抗原編碼序列5，末端與真核轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子可操作地連接，并在抗原編碼序列的3，末端與真核終止信號(hào)和poly(A)信號(hào)可操作地連接，由此該轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止序列可以調(diào)節(jié)該抗原的表達(dá)。有用的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子包括Rous肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)啟動(dòng)子(RSV-LTR)、巨細(xì)胞病毒(CMV)主要立即早期啟動(dòng)子、猿猴空泡病毒40(SV40)T抗原啟動(dòng)子，和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如金屬硫蛋白啟動(dòng)子。對(duì)于重組FCV疫苗的討論，參見(jiàn)Wardley等的美國(guó)專利號(hào)5,716,822,在此完整地并入作為參考。DNA疫苗包括具有編碼FCV抗原例如FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的核酸序列的DNA分子(例如質(zhì)粒)，其中所述抗原在貓中引起抗FCV的免疫應(yīng)答。該核酸編碼序列與使得該DNA能夠在其接種入貓細(xì)胞中時(shí)實(shí)現(xiàn)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子可操作地連接。有用的啟動(dòng)子包括RSV-LTR啟動(dòng)子、CMV主要立即早期啟動(dòng)子、和SV40T抗原啟動(dòng)子。此外，該核酸還可以在編碼該FCV抗原的序列的終止密碼子位置或附近位置與包含轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和poly(A)識(shí)別信號(hào)的核酸片段可操作地連接。對(duì)于DNA疫苗的討論，參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,580,859、美國(guó)專利號(hào)5，589，466和美國(guó)專利號(hào)5，703，055(Feigner等)。其它有用的疫苗包括含有一種或多種亞單位抗原，例如FCV衣殼蛋白或該衣殼蛋白的免疫原性片段的疫苗，其中所述抗原已經(jīng)得以分離和純化。該亞單位抗原可以在能夠通過(guò)上述方法體外產(chǎn)生該抗原的重組表達(dá)栽體中產(chǎn)生。所得抗原隨后進(jìn)行分離和純化。有用的表達(dá)載體包括各種微生物，包括細(xì)菌、酵母和真菌，以及真核生物，例如哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)細(xì)胞。其它有用的表達(dá)栽體包括病毒，例如腺病毒、痘病毒、皰滲病毒、Semliki森林病毒、桿狀病毒、謹(jǐn)菌體、Sindbis病毒、Sendai病毒等。FCV亞單位抗原在微生物中的表達(dá)使得可以使55用商業(yè)規(guī)模的發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)該抗原性蛋白?？梢允褂酶鞣N方法分離和純化該抗原，包括凝膠過(guò)濾、親和層析、離子交換層析、離心等。這些疫苗中的一種或多種還可以含有用于免疫貓以抵抗一種或多種FCV之外的病原體的抗原，其中所述病原體包括貓皰疹病毒、貓白血病病毒、貓免疫缺陷病毒、貓全白細(xì)胞減少癥病毒和貓衣原體。疫苗的其它成分可以包括藥學(xué)上可接受的賦形劑，包括載體、溶劑和稀釋劑、等滲劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、免疫調(diào)節(jié)劑(例如，白介素、干擾素和其它細(xì)胞因子)、血管收縮劑、抗細(xì)菌劑、抗真菌劑等。典型的栽體、溶劑和稀釋劑包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油等。代表性等滲劑包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖等。有用的穩(wěn)定劑包括明膠、白蛋白等。疫苗還可以包括一種或多種增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的佐劑。代表性佐劑包括基于油的佐劑，例如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、基于霉菌酸(mycolate)的佐劑(例如，海藻糖二霉菌酸酯)，細(xì)菌脂多糖、肽聚糖(即，胞壁質(zhì)、粘肽或糖蛋白例如N-0paca、胞壁酰二肽或其類似物)、蛋白聚糖(例如，提取自肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiellapneumoniae))、鏈球菌制品(例如0K432)、Biostim(例如，01K2)、Iscoms(例如，見(jiàn)歐洲專利申請(qǐng)?zhí)朎P109942、EP180564和EP231039)、氫氧化鋁、皂苷、二乙基氨基乙基-葡聚糖、中性油(例如，miglyol)、植物油(例如花生油)、脂質(zhì)體、Pluronic⑧多元醇類。其它佐劑包括RIBI佐劑系統(tǒng)、明礬、氫氧化鋁凝膠、膽固醇、水包油乳劑、油包水乳劑、嵌段共聚物(CytRx,AtlantaGA)、SAF-M(Chiron，EmeryvilleCA)、AMPHIGE^佐劑、急苷、QuilA、QS-21(CambridgeBiotechInc.，CambridgeMA)、GPI-OIOO(GalenicaPharmaceuticalsInc.,Birmingham,AL)或其它皂苷級(jí)分、單磷酰脂A、Avridine脂-胺佐劑、來(lái)自大腸桿菌(Escherichiacoli)的熱不穩(wěn)定性腸毒素(重組的或者其它形式)、霍亂毒素、或胞壁酰二肽等等。FCV疫苗劑量的大小范圍典型為大約lmL至大約2mL，包括lmL和2mL。每一劑均含有治療有效量的所述FCV抗原(一種或多種)，其中該有效量可以隨著貓的年齡和總體狀況、施用途徑、FCV抗原的性質(zhì)及其它因素而變。對(duì)于含有修飾的活病毒或減毒的病毒的疫苗，治療有效劑量一般為大約106TCIDs。至大約108TCID5。(包括106TCIDs。和108TCIDs。在內(nèi))。對(duì)于含有亞單位抗原，例如FCV衣殼蛋白的疫苗，治療有效劑量一般為大約10yg至大約100jag(包括10ng和100|ig在內(nèi))?？梢詫?duì)疫苗的其它成分進(jìn)行調(diào)整以修飾疫苗的物理和化學(xué)性質(zhì)。例如，佐劑典型地包含lmL劑量大約25yg至大約1000pg(包括25jjg和1000ug在內(nèi))。類似地，抗生素典型地包含lmL劑量大約1jng至大約60jig(包括ljng和60"g在內(nèi))。FCV疫苗可以根據(jù)施用途徑、儲(chǔ)存要求等因素以各種形式提供。例如，可以將疫苗制備成適于在注射器、滴管等中使用的無(wú)菌水溶液或分散體，或者可以制備成可以在用前于鹽水、HEPES緩沖液等中復(fù)水的凍干的粉末。第2部分實(shí)施例和表以下實(shí)施例旨在舉例說(shuō)明而非限制，并代表本發(fā)明的幾個(gè)特定的實(shí)施方案。實(shí)施例2-1.^吏用FELOCELL4和FEL-0-VAX⑧的皮下/口月l疫苗接種方案4-5月齡的家養(yǎng)短毛貓用FELOCELL4(PfizerInc.;修飾的活貓鼻氣管炎病毒[FHV]、杯狀病毒[FCV]、全白細(xì)胞減少癥病毒[FP]和鸚鵡熱衣原體)、用FEL-O-VAX(FortDodge;死的FHV、FCV、FP和鸚鷸熱衣原體)、或用無(wú)菌稀釋劑(對(duì)照組)免疫接種。所評(píng)價(jià)的免疫接種方案包括最初的皮下接種之后于第21天和第42天皮下加強(qiáng)(SQ/SQ/SQ);最初的皮下接種之后于第21天和第42天兩次口服加強(qiáng)免疫(SQ/口服/口服)；或者最初皮下接種之后于第21天第二次皮下接種及第42天口服加強(qiáng)。所有劑量均為lml?？诜臃N通過(guò)將疫苗施用至口中而實(shí)現(xiàn)。于第99天，用大約3,5ml強(qiáng)毒性系統(tǒng)性FCV-33585(4.8log的TCID5。/ml)攻擊所有的貓。該攻擊通過(guò)在罐狀貓糧中施用該劑量的大約3ml并通過(guò)鼻滴注0.05ml而進(jìn)行。攻擊后持續(xù)14天監(jiān)測(cè)所有貓的疾病臨床征候。將攻擊后表現(xiàn)出與杯狀病毒發(fā)病相一致的嚴(yán)重臨床征候的貓?zhí)幇矘?lè)死。如表2-1所示，通過(guò)該SQ/口服/口服方案接種的組具有僅10%的死亡率，而對(duì)照組具有90%死亡率。通過(guò)該SQ/SQ/SQ方案接種的組具有50%死亡率，而通過(guò)SQ/SQ/口服方案接種的組具有20%死亡率。這些結(jié)果提示，SQ接種后進(jìn)行口服加強(qiáng)顯著地增強(qiáng)FELOCELL4免疫接種抗毒性FCV攻擊的效力。當(dāng)口服接種作為接種方案的一部分時(shí)不僅死亡率從50%(SQ/SQ/SQ)降低至10。/。(SQ/口服/口服)或20。/0(SQ/SQ/口服)，而且如表2-2所示，臨床征候例如皮膚損傷(SL)、食欲不振(IA)、抑郁(DP)、口腔潰瘍(OU)、跛足(LN)、打噴嚷(SZ)、鼻排出物(ND)、和淚汪汪的眼(WE)的嚴(yán)重程度也降低。表2-1.在免疫接種后被強(qiáng)毒性FCV-33585攻擊的貓的死亡率(實(shí)施例2-1)表2-1組別處理免疫接種#動(dòng)物途徑#動(dòng)物攻擊死亡率'/。Tl對(duì)照10SQ/SQ/SQ1090T2FELOCELL45SQ/SQ/SQ450T3FELOCELL410SQ/SQ/口服1020T4FELOCELL410SQ/口服/口服1010T5FEL-0-VAX5SQ/SQ/SQ560表2-2.免疫接種和隨后FCV-33585攻擊后的臨床癥狀(％動(dòng)物)(實(shí)施例2-1)_"^表2一2組別途徑SLIABPOUSZNDWETlSQ/SQ/SQ5010010070100309070T2SQ/SQ/SQ1001001001001002510025T3SQ/SQ/口服7070506070203010T4SQ/口月良/口月艮104020405010300T5SQ/SQ/SQ4080606060406020實(shí)施例2-2.SQ/口服免疫接種后平均FCV血清中和滴度58在第0、21、42、63、98和113研究日自實(shí)施例2-1的貓收集血液樣品，并在血清中和(SN)試驗(yàn)中評(píng)價(jià)它們中和FCV的能力。血清樣品1:8稀釋，之后在600pl體積中2倍系列稀釋至1:16384(總共l2次稀釋)。將600|i1中具有50-500TCID5。/ml滴度的貓杯狀病毒與稀釋的血清樣品混合，室溫溫育45分鐘。然后，按一式四份將每種稀釋的樣品各200p1轉(zhuǎn)移至接種有Crandel貓腎(CrFK)細(xì)胞的96孔板的各孔中。板子在37。C、5%0)2下溫育6天，在此時(shí)間測(cè)定終點(diǎn)中和滴度。施用Spearman-Karber的方法計(jì)算血清中和(SN)滴度和攻擊病毒的返回滴定滴度。見(jiàn)C.Spearman,Brit，J.Psychol.2:227-242(1908)和G.Karber，Arch.Exp.Path.Pharmak.162:480-487(1931)。如表2-3所示，通過(guò)SQ/口服/口服或SQ/SQ/口服接種方案施用的FELOCELL4具有顯著更高的FCVSN滴度。這些數(shù)據(jù)與實(shí)施例2-1中所述的死亡率顯著降低相關(guān)。表2-3.在不同研究日的平均FCVSN(血清中和)滴度(實(shí)施例2-2)表2-3<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>*免疫接種后第Q天、第21天、第42天、第63天、第98天和笫133天測(cè)量的。實(shí)施例2-3.FELOCELL4和FEL-O-VAX⑧的SQ/口服施用的抗貓全白細(xì)胞減少癥病毒的效力還分析來(lái)自實(shí)施例2-1的貓的血清樣品的平均FP滴度。如表2-4所示，所有的貓均在研究開(kāi)始時(shí)為血清反應(yīng)陰性。隨后，在取樣間隔期間(第21和42天)，對(duì)照組的平均滴度保持在1。然而，其它4個(gè)接種組的平均滴度顯著地增加。表2-4.針對(duì)貓全白細(xì)胞減少癥病毒的平均血清抗體滴度(實(shí)施例2-3)<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>*免疫接種后第0天、第21天和第42天測(cè)量的。實(shí)施例2-4.通過(guò)各種施用途徑免疫接種FEL0CELL4的貓的臨床癥狀通過(guò)將液滴滴注入動(dòng)物鼻孔，進(jìn)行FEL0CELL⑧4的口鼻(ON)施用。如表2-5所示，6-7月齡的貓，每組10只(T1，T2，T3)，按照表2-5所示方案接種并于第21天進(jìn)行加強(qiáng)皮下接種和加強(qiáng)(SQ/SQ);皮下接種和口鼻加強(qiáng)(SQ/ON);或者口鼻接種和加強(qiáng)(ON/ON)。疫苗于頸右側(cè)皮下施用(lmL);口鼻施用通過(guò)將0.5ml疫苗遞送入每個(gè)鼻孔進(jìn)行。于第1天開(kāi)始，觀察所有貓每日的總體健康情況。表2-5.通過(guò)不同施用途徑接種FEL0CELL4的貓的臨床癥狀(實(shí)施例2-4)<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>如表2-5所示，接受2次口鼻免疫接種的貓具有高水平的臨床癥狀，包括鼻潰瘍(NU)、口腔潰瘍(0U)、持續(xù)打噴嚏(SZ)、鼻排出物(ND)、淚汪汪的眼(WE)和短暫的食欲不振(IA)。然而，通過(guò)SQ/ON方案免疫接種的貓比ON/ON免疫接種的貓表現(xiàn)出較少的臨床癥狀，沒(méi)有鼻潰瘍、口腔潰瘍、鼻排出物(ND)或淚汪汪的眼的跡象。而且，SQ/0N組的個(gè)體比0N/0N組的貓表現(xiàn)出較少的噴噢。SQ/0N組的安全i普與SQ/SQ組的相似。實(shí)施例2-5.不同免疫接種途徑對(duì)FEL0CELL4抗原的血清學(xué)應(yīng)答的影響分析在實(shí)施例2-4所述研究中入選的貓的血清樣品對(duì)于FEL0CELL4疫苗中存在的各種病毒抗原的血清學(xué)反應(yīng)性。在研究的第0、21和42天測(cè)定對(duì)FCV、FHV和FP的平均血清中和抗體滴度。如表2-6所示，所有三種免疫接種方案均導(dǎo)致對(duì)FP的強(qiáng)免疫應(yīng)答。對(duì)于FHV的免疫應(yīng)答由于該試驗(yàn)的困難而幾乎檢測(cè)不到。然而，抗FCV的血清中和滴度在0N/0N和SQ/0N組比SQ/SQ組顯著高。這些結(jié)果提示0N/0N和SQ/0N組的貓將獲得抵抗毒性FCV攻擊的保護(hù)作用，而SQ/SQ組則可能不能獲得該保護(hù)作用。表2-6.通過(guò)不同途徑免疫接種FEL0CELL4的貓的血清學(xué)應(yīng)答(實(shí)施例2-5)表2-6<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>*于接種后第0天、第21天和第42天測(cè)量。實(shí)施例2-6.對(duì)通過(guò)SQ或0N途徑施用的FCV-F9的血清中和滴度通過(guò)SQ或0N，使用FEL0CELL4中存在的FCV-F9抗原免疫接種貓，每組6只貓。最初免疫接種后3周，所有貓使用相同抗原通過(guò)與之前相同的途徑進(jìn)行加強(qiáng)免疫。所有劑量均為lml。加強(qiáng)免疫后3周收集血清樣品。如表2-7所示，測(cè)定這些樣品針對(duì)一組26種FCV抹的血清中和滴度。選用于該組的FCV林是基于遺傳多樣性(按照它們的衣殼高變區(qū)的序列所確定的)以及地理分布而選擇的。此外，還考慮每林的毒性表型。來(lái)自0N免疫接種F9的貓的血清樣品，與來(lái)自SQ免疫接種的貓相比，在該組26個(gè)成員中中和更多的FCV林。使用23作為中和滴度的截?cái)嘀?，ON免疫接種導(dǎo)致該組26%的成員具有等于或高于該截?cái)嘀档牡味龋鳶Q免疫接種導(dǎo)致僅16。/。符合該標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于15的滴度截?cái)嘀担?N免疫接種產(chǎn)生32%的組成員等于或高于該截?cái)嘀?；SQ產(chǎn)生僅17%。表2-7.對(duì)于FCV-F9的SQ與0N產(chǎn)生的血清抗一組26種FCV病毒的血清交叉中和滴度(實(shí)施例2-6)<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>*>23的中和滴度作為截?cái)嘀?；或?gt;15的中和滴度作為截?cái)嘀祵?shí)施例2-7.免疫接種兩劑FELOCELL4或FELOCELL3成分以及修飾的活FCV-21的貓的死亡率和臨床得分給約8周齡的家養(yǎng)短毛貓施用含有修飾的活貓鼻氣管炎病毒(FHV)、全白細(xì)胞減少癥病毒(FP)、鸚鷸熱衣原體，以及(l)FCV-F9(FELOCELL4或FELOCELL3)、(2)FCV-F9和FCV-21(FELOCELL4加FCV-21或FELOCELL3加FCV-21)或(3)FCV-21(FELOCELL4A或FELOCELL3A)的疫苗。免疫接種方案包括初次皮下免疫接種，之后在第21天皮下加強(qiáng)(SQ/SQ);初次皮下免疫接種，之后在第21天一次口服加強(qiáng)免疫(SQ/口服)；或初次口服免疫接種，之后在第21天進(jìn)行第2次口服免疫接種(口服/口服)。不同給藥方案中的每只貓(T1至T10組，每組10只貓)各接受lml疫苗?？诜庖呓臃N通過(guò)將疫苗施用于口中而實(shí)現(xiàn)。在第42天，所有貓施用大約lml強(qiáng)毒性系統(tǒng)性FCV-33585(3log的TCID5。/ml)進(jìn)行攻擊。攻擊后持續(xù)14天，監(jiān)測(cè)所有貓的疾病臨床征候，包括升高的溫度、結(jié)膜炎漿液狀排出物、結(jié)膜炎含粘液膿性排出物、鼻炎漿液狀排出物、鼻炎含粘液膿性排出物、打噴嚏、可聽(tīng)見(jiàn)的羅音、咳嗽、張嘴呼吸、厭食、脫水、"mm的一個(gè)口腔潰瘍、多個(gè)口腔潰瘍、〉4fflin的口腔潰瘍、過(guò)量分泌唾液、非流血性表面潰瘍、流血性表面潰瘍。攻擊后表現(xiàn)出與杯狀病毒發(fā)病一致的嚴(yán)重臨床征候的貓被處安樂(lè)死。如表2-8所示，當(dāng)與SQ/SQ免疫接種相比時(shí)，對(duì)于FEL0CELL⑧4接種的貓，SQ/口服免疫接種方案將死亡率由44%降低至10%并且將平均臨床得分由12改善至5.5。而且，向FELLOCELL3和向FELLOCELL4添加FCV-21林導(dǎo)致攻擊后無(wú)死亡。用FCV-21林置換FELLOCELL3及FELLOCELL4中的FCV-F9林導(dǎo)致與含有FCV-F9及FCV-21兩者的疫苗相似的效力，甚至是在口服/口服免疫接種方案中也是如此。表2-8.免疫接種2劑帶有或不帶有FCV-F9和/或FCV-21的FEL0CELL3或4后以毒性FCV-33585攻擊的貓的死亡率(實(shí)施例2-7)表2-8<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>FELOCELL4A:無(wú)FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL4FELOCELL3A:無(wú)FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL3實(shí)施例2-8.以FELOCELL4成分和修飾的活FCV-21進(jìn)行3劑免疫接種的貓的死亡率和臨床得分給大約8周齡的家養(yǎng)短毛貓施用含有修飾的活貓鼻氣管炎病毒(FHV)、全白細(xì)胞減少癥病毒(FP)、鸚鵠熱衣原體，以及(l)FCV-F9(FEL0CELL4)、(2)FCV-F9和FCV-21(FEL0CELL4A)或(3)FCV-21(FEL0CELL4B)的疫苗。在每一種情況下，給貓進(jìn)行最初的皮下免疫接種并隨后于第21天和第42天進(jìn)行相繼的口服施用(SQ/口服/口服)。不同給藥方案中的每只貓(T1至T4組，每組10只貓)接受lmL疫苗?？诜臃N通過(guò)將疫苗施用于口中而實(shí)現(xiàn)。第63天，所有貓施用大約lml的毒性系統(tǒng)性FCV-33585(3log的TCID5。/ml)攻擊。攻擊后持續(xù)14天，監(jiān)測(cè)所有貓的如實(shí)施例2-7所述的疾病臨床征候。將攻擊后表現(xiàn)出與杯狀病毒發(fā)病相一致的嚴(yán)重臨床征候的貓?zhí)幱诎矘?lè)死。如表2-9所示，按照攻擊后死亡率和臨床得分測(cè)量的，此三劑量方案的效力與實(shí)施例2-7中所述的2劑量方案的效力相當(dāng)。表2-9.在使用FCV-F9和/或FCV-F21進(jìn)行3劑量免疫接種后被毒性FCV-33585攻擊的貓的死亡率(實(shí)施例2-8)表2-9<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>FELOCELL4A:無(wú)FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL4實(shí)施例2-9.來(lái)自以帶有和不帶有FCV-21的FELOCELL4成分免疫接種的貓的血清的交叉中和分析對(duì)在實(shí)施例2-7所述研究中的每只貓，在第二次免疫接種后但在攻擊之前，收集其血清樣品。樣品56。C30分鐘熱處理，并且如之前實(shí)施例1-10中所述針對(duì)26種FCV林(表l-6)之每一種的血清中和試驗(yàn)之每一種的血清中和試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用>23和>15的截?cái)嗟味确治鲅逯泻蛿?shù)據(jù)，并計(jì)算兩個(gè)截?cái)嗟味鹊钠骄?Ave)。結(jié)果顯示在表2-10中。該數(shù)據(jù)說(shuō)明，無(wú)論施用途徑是SQ/SQ還是SQ/口服，F(xiàn)ELOCELL4(含有FCV-F9)的交叉中和譜保持不變。然而，添加FCV-21后，當(dāng)疫苗以SQ/SQ或SQ/口服方式施用時(shí)，該交叉中和譜顯著增強(qiáng)。而且，對(duì)于FELOCELL4A(含有FCV-21但不含有FCV-F9)，對(duì)于SQ/SQ、SQ/口服以及甚至口服/口服免疫接種途徑，該交叉中和語(yǔ)均得以增強(qiáng)。表2-10<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>*FELOCELL4A:無(wú)FCV-F9姊有FCV-21的FELOCELL4"FELOCELL3A:無(wú)FCV-F9^SA^"FCV-21的FELOCELL3在表2-11中，所評(píng)價(jià)的免疫接種方案包括最初的皮下接種以及之后于第21天和第42天的兩次口服加強(qiáng)免疫(SQ/口服/口服)。結(jié)果說(shuō)明，在FELOCELL4中添加FCV-21,無(wú)論有或無(wú)FCV-F9，都導(dǎo)致顯著更寬的交叉中和譜(增加大約40%)。<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>*FELOCELL4A:無(wú)FCV-F9但有FCV-21的FELOCELL4我們還公開(kāi)了我們的如下發(fā)現(xiàn)對(duì)于本文描述的與FCV林FCV-21、FCV-49和FCV26391-4相關(guān)的肽、蛋白和DNA形式的疫苗，可以首先進(jìn)行口服或口鼻(ON)施用之后，進(jìn)行第二次口服或口鼻施用，而沒(méi)有以上在實(shí)施例2-4和表2-5中提及的先前公開(kāi)的副作用。應(yīng)當(dāng)注意，在本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書中，除非上下文中清楚地另行說(shuō)明，否則單數(shù)形式的冠詞例如"a"、"an"和"the",可以指一個(gè)對(duì)象或者多個(gè)對(duì)象。因此，例如，提及含有"化合物"的組合物可以包括單--種化合物或者兩種或更多種化合物。應(yīng)當(dāng)理解，上述實(shí)施例和描述旨在舉例說(shuō)明而非限制。許多實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言在閱讀以上描述后將是明顯的。因此，本發(fā)明范圍應(yīng)當(dāng)參考所附權(quán)利要求以及這些權(quán)利要求有權(quán)要求的整個(gè)等同范圍來(lái)確定。所有文章和參考文獻(xiàn)，包括專利、專利申請(qǐng)及出版物，的公開(kāi)為了所有的目的均完整地并入此處作為參考。在表2-1至表2-9中，F(xiàn)elocell4、Felocel14或FELOCELL4或后面有數(shù)字"3"的這些詞是Felocell的變體疫苗，Pfizer擁有名稱Felocell的任何變體。提及Felocell4A指無(wú)FCV-F9的Felocell4，提及Felocell3A指無(wú)FCV-F9的Felocel13。注意，這些研究中使用的實(shí)際抗原并非來(lái)自該商業(yè)產(chǎn)品，相反地這些抗原僅為研究目的而小批地制備，但是制備方法和該商業(yè)產(chǎn)品的制備方法相同。鑒于本公開(kāi)，本文公開(kāi)和要求保護(hù)的所有組合物和/或方法可以無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)即可制備和實(shí)施。盡管本發(fā)明組合物和方法以優(yōu)選實(shí)施方案的形式已經(jīng)進(jìn)行描述，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言明顯地可以對(duì)這些組合物和/或方法以及本文描述的該方法的步驟或者步驟的順序進(jìn)行改變而不偏離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更具體地，明顯地，可以將本文描述的藥劑替代為化學(xué)及生理學(xué)上相關(guān)的某些藥劑而仍獲得相同或相似的結(jié)果。本領(lǐng)域沖支術(shù)人員明了的所有這些相似的替代物和修飾被認(rèn)為落入所附權(quán)利要求定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。編號(hào)的本發(fā)明描述。其它描述和實(shí)施例。1.免疫貓以抵抗貓杯狀病毒(FCV)的方法，該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗，其中第一和第二疫苗適應(yīng)于在貓中誘導(dǎo)抗FCV免疫應(yīng)答，第一疫苗通過(guò)胃腸外途徑施用而第二疫苗通過(guò)口服或者口鼻途徑施用，并且第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用，其中N是3至120天(包括3和120天)的整數(shù)，也描述N為大約3周和大約2-4周。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述疫苗獨(dú)立地包含活病毒疫苗、修飾的活病毒疫苗、滅活病毒疫苗、重組疫苗、DNA疫苗或亞單位抗原疫苗中的任一種或其組合。3.權(quán)利要求1的方法，其中至少一種疫苗包括一種或多種FCV抹。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述一種或多種FCV林包括F9或FCV-21或F9和FCV-21。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述疫苗是相同的。6.權(quán)利要求1的方法，其中至少一種疫苗也適應(yīng)于誘導(dǎo)抗一種或多種選自皰療病毒、貓白血病病毒、貓免疫缺陷病毒、貓全白細(xì)胞減少癥病毒和貓衣原體的病原體的免疫應(yīng)答。7.權(quán)利要求1的方法，其中第一疫苗通過(guò)皮下施用。8.權(quán)利要求1的方法，其中第二疫苗經(jīng)口或口鼻施用。9.權(quán)利要求1的方法，其中第二疫苗或隨后的疫苗在貓出現(xiàn)大約1:6或更高的FCV血清中和滴度之后施用。10.權(quán)利要求1至9之任一項(xiàng)的方法，還包括給貓施用治療有效量的第三疫苗，其中該第三疫苗適應(yīng)于在貓中誘導(dǎo)抗FCV的免疫應(yīng)答并通過(guò)胃腸外、口服或口鼻途徑在笫一或第二疫苗施用后M天施用，其中M是1至120(包括1和120)的整數(shù)。11.權(quán)利要求10的方法，其中第三疫苗通過(guò)皮下途徑施用。12.免疫貓以^氐抗貓杯狀病毒(FCV)的方法，該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗，其中第一和第二疫苗適應(yīng)于在貓中誘導(dǎo)抗FCV免疫應(yīng)答，其中第一疫苗通過(guò)口服或口鼻施用而第二疫苗通過(guò)口服或口鼻施用，并且第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用，其中N是3至120(包括3和120)的整數(shù)，也規(guī)定N是大約3周和大約2-4周。13.權(quán)利要求12的方法，其中FCV林選自FCV-21、FCV-49、FCV26391-4。14.免疫動(dòng)物的方法，包括給動(dòng)物施用治療有效量的第一和第二疫苗以及任選的第三疫苗，其中第一和第二疫苗以及任何的第三疫苗適應(yīng)于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，并且第一疫苗通過(guò)胃腸外或口服施用，第二疫苗通過(guò)口服或口鼻施用，第二和任何的第三疫苗在第一疫苗施用后N天施用，其中N是包括3和120在內(nèi)的3至120的整數(shù)，也規(guī)定N是大約3周和大約2-4周，并且該方法可以包括任選的該疫苗的每年一次加強(qiáng)施用，包括大約1年的M期。第3部分該部分提供免疫動(dòng)物以抵抗貓細(xì)小病毒(FPV)和貓皰疹病毒(FHV)的方法和組合物此處描述使用疫苗治療和免疫動(dòng)物，尤其是貓以抵抗由貓杯狀病毒(FCV)引起的貓呼吸道疾病、由貓細(xì)小病毒(FPV)引起的貓全白細(xì)胞減少癥、由貓皰滲病毒(FHV)(也稱作貓鼻氣管炎病毒)引起的貓病毒性鼻氣管炎的方法和材料。以下描述新的疫苗組合，該組合當(dāng)以描述的方式給予貓時(shí)允許有效的單次口服和口服/口服及皮下/口服遞送FPV和/或FHV疫苗。單次口服意味著可以賦予被免疫接種的動(dòng)物有效的保護(hù)作用的單次口服遞送?？诜?口月l指給予兩次口服遞送，類似于以上第2部分中的描述，即，口服后一段時(shí)間然后通過(guò)口服途徑再給一劑，而皮下/口服是通過(guò)皮下給予第一劑之后一段時(shí)間然后通過(guò)口服途徑再給一劑。此處描述修飾的活FPV和/或修飾的活FHV與修飾的活衣原體疫苗、或修飾的活衣原體疫苗的任何成分，例如生長(zhǎng)培養(yǎng)基、細(xì)胞裂解物或整個(gè)細(xì)胞，衣原體本身的任何成分的聯(lián)合的遞送。衣原體也稱作貓衣原體或者貓鸚鷸熱衣原體或FCp。當(dāng)修飾的活FPV獨(dú)自或者與修飾的活FCV或修飾的活FHV疫苗聯(lián)合給予時(shí)，該FPV在以口服/口服方式遞送時(shí)是無(wú)效的，并且在使用SQ/口服施用途徑時(shí)表現(xiàn)出降低的SN滴度。類似地，當(dāng)修飾的活FHV獨(dú)自或者與修飾的活FCV或者與修飾的活FPV疫苗聯(lián)合給予時(shí)，該FHV在以口服/口服方式遞送時(shí)是無(wú)效的，并且在使用SQ/口服施用途徑時(shí)表現(xiàn)出降低的效力。只有當(dāng)FPV和/或FHV與修飾的活衣原體疫苗聯(lián)合給予時(shí)，通過(guò)皮下/口服或口服/口服途徑遞送該聯(lián)合疫苗才可以提供充足的抗FPV和/或FHV的保護(hù)作用。根據(jù)上述提供以下實(shí)施例。以下實(shí)施例旨在舉例說(shuō)明而非限制，并代表本發(fā)明的幾個(gè)具體的實(shí)施方案。實(shí)施例3-1(純理論的).使用FPV和衣原體的皮下/口服免疫接種方案。在帶有或不帶有其它成分的聯(lián)合疫苗中提供FPV和衣原體(或修飾的活衣原體疫苗的任何成分)。該修飾的活疫苗可以通過(guò)皮下/口服遞送。實(shí)施例3-2(純理論的).使用FPV和衣原體的口服/口服免疫接種方案。在帶有或不帶有其它成分的聯(lián)合疫苗中提供FPV和衣原體(或修飾的活衣原體疫苗的任何成分)。該修飾的活疫苗可以通過(guò)口服/口服遞送。實(shí)施例3-3(純理論的).使用FPV、FHV和衣原體的皮下/口服免疫接種方案。在帶有或不帶有其它成分的聯(lián)合疫苗中提供FPV、FHV和衣原體(或修飾的活衣原體疫苗的任何成分)。該修飾的活疫苗可以通過(guò)皮下/口服遞送。實(shí)施例3-4(純理論的).使用FPV、FHV和衣原體的口服/口服免疫接種方案。在帶有或不帶有其它成分的聯(lián)合疫苗中提供FPV、FHV和衣原體(或修飾的活衣原體疫苗的任何成分)。該修飾的活疫苗可以通過(guò)口服/口服遞送。實(shí)施例3-5(純理論的).使用FPV、FHV、FCV和衣原體的皮下/口服免疫接種方案。在帶有或不帶有其它成分的聯(lián)合疫苗中提供FPV、FHV、FCV和衣原體(或修飾的活衣原體疫苗的任何成分)。該修飾的活疫苗可以通過(guò)口服/口服遞送(表3-1)。實(shí)施例3-6(實(shí)際的).使用FPV、FHV、FCV和衣原體的口服/口服免疫接種方案。在帶有或不帶有其它成分的聯(lián)合疫苗中提供FPV、FHV、FCV和衣原體(或修飾的活衣原體疫苗的任何成分)。該修飾的活疫苗可以通過(guò)口服/口服遞送。見(jiàn)表3-l。約8周齡家養(yǎng)短毛貓用FEL0CELL4A和3A成分(含有修飾的活貓鼻氣管炎病毒[FHV]、杯狀病毒[FCV-21]、全白細(xì)胞減少癥病毒[FPV]和鸚鵡熱衣原體[FCp])免疫接種。所評(píng)價(jià)的接種方案包括最初皮下接種之后于第21天皮下加強(qiáng)免疫(SQ/SQ);最初皮下接種之后于第21天一次口服加強(qiáng)免疫(SQ/口服)；或者最初口服接種之后于笫21天第二次口服接種。口服接種通過(guò)將疫苗施用于口中來(lái)實(shí)現(xiàn)。第二次免疫接種后從每只貓收集血清樣品，并56。C熱處理30分鐘。樣品在針對(duì)FPV的血清中和試驗(yàn)中評(píng)價(jià)。表3-1<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>FEL0CELL4A:FPV/FHV/FCV-21/FCpFEL0CELL3A:FPV/FHV/FCV-21表3-l的結(jié)果提示，如以前文獻(xiàn)中報(bào)道的，貓對(duì)FPV抗原產(chǎn)生極樣t弱的應(yīng)答。(口J良施用減毒的貓全白細(xì)胞減少癥病毒后無(wú)免疫應(yīng)答。SchultsRD，ScottFW,InfectI隨n.1973，Apr7(4):547-9)。然而，存在衣原體或者與衣原體疫苗有關(guān)的任何成分時(shí)，該FPVSN滴度高得多，說(shuō)明體內(nèi)抗FPV攻擊的效力。而且，我們觀察到不僅SQ/SQ、SQ/口服而且口服/口服組均具有增強(qiáng)的FPV免疫原性。實(shí)施例3-7(實(shí)際的).使用FPV、FHV、FCV的口服/口服免疫接種方案。在帶有或不帶有其它成分的聯(lián)合疫苗中提供FPV、FHV和FCV。該修飾的活疫苗可以口服/口服遞送。見(jiàn)表3-2。約8周齡家養(yǎng)短毛貓用FEL0CELL3A(含有修飾的活貓鼻氣管炎病毒[FHV]、杯狀病毒[FCV-21]和全白細(xì)胞減少癥病毒[FPV])免疫接種。所評(píng)價(jià)的接種方案包括最初皮下接種之后于第21天皮下加強(qiáng)(SQ/SQ);最初皮下接種之后于第21天一次口服加強(qiáng)免疫(SQ/口服)；或者最初口服接種之后于第21天第二次口服接種?？诜庖呓臃N通過(guò)將疫苗施用于口中來(lái)實(shí)現(xiàn)。第一次和第二次免疫接種后從每只貓收集血清樣品，并56C熱處理30分鐘。在針對(duì)FPV的血清中和試驗(yàn)中分析這些樣品。表3-2<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>表3-2的結(jié)果說(shuō)明，存在于FELOCELL3A疫苗中的FPV抗原當(dāng)通過(guò)口月1/口服給予時(shí)誘導(dǎo)了極小的免疫應(yīng)答(與表3-1的結(jié)果一致)。然而，當(dāng)這些疫苗以SQ/SQ或SQ/口服給予時(shí)，觀察到高FPVSN滴度，說(shuō)明了體內(nèi)效力。編號(hào)的本發(fā)明描述。其它描述和實(shí)施例。以下注意，F(xiàn)CV是貓杯狀病毒，F(xiàn)PV是貓細(xì)小病毒(也稱作全白細(xì)胞減少癥或FPL)，以及最后FHV是貓皰滲病毒。1.免疫原性組合物，包含在一個(gè)施用刑量中施用的修飾的活FPV和修飾的活衣原體兩者。2.疫苗，包含在兩個(gè)分開(kāi)的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FPV和修飾的活衣原體，所述的兩個(gè)單施用劑量通過(guò)口服或口鼻途徑遞送并且在時(shí)間上間隔3至120天，或者大約3周或大約2周。3.免疫貓以抵抗FPV的方法，該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗，其中第一和第二疫苗適應(yīng)于在貓中誘導(dǎo)抗FPV的免疫應(yīng)答，第一疫苗通過(guò)口服或口鼻施用而第二疫苗通過(guò)口服或口鼻施用，第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用，其中N是包括3和120在內(nèi)的3至120的整數(shù)，或者其中N是大約3周或其中N是大約2周，其中所述第一和第二疫苗由修飾的活FPV和修飾的活衣原體組成。4.免疫原性組合物，包含在單個(gè)施用劑量中施用的修飾的活FHV和修飾的活衣原體。5.疫苗，包含在兩個(gè)分開(kāi)的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FHV和修飾的活衣原體，所述兩個(gè)單施用劑量通過(guò)口服或口鼻途徑施用，并且在時(shí)間上間隔3至120天，或者大約3周或大約2周。6.免疫貓以抵抗FHV的方法，該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗，其中第一和第二疫苗適應(yīng)于在貓中誘導(dǎo)抗FHV的免疫應(yīng)答，第一疫苗通過(guò)口服或口鼻施用并且第二疫苗通過(guò)口服或口鼻施用，第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用，其中N是包括3和120在內(nèi)的3至120的整數(shù)，或者其中N是大約3周或其中N是大約2周，其中所述第一和第二疫苗由修飾的活FHV和修飾的活衣原體組成。7.免疫原性組合物，包含在單個(gè)施用劑量中施用的修飾的活FCV和修飾的活衣原體。8.疫苗，包含在兩個(gè)分開(kāi)的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FCV和修飾的活衣原體，所述兩個(gè)單施用劑量通過(guò)口服或口鼻途徑施用，并且在時(shí)間上間隔3至120天，或者大約3周或大約2周。9.免疫貓以抵抗FCV的方法，該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗，其中第一和第二疫苗適應(yīng)于在貓中誘導(dǎo)抗FCV的免疫應(yīng)答，第一疫苗通過(guò)口服或口鼻施用并且第二疫苗通過(guò)口服或口鼻施用，第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用，其中N是包括3和120在內(nèi)的3至120的整數(shù)，或者其中N是大約3周或其中N是大約2周，其中所述第一和第二疫苗由修飾的活FCV和修飾的活衣原體組成。10.免疫原性組合物，包含在單個(gè)施用劑量中施用的修飾的活FPV、修飾的活FHV和修飾的活衣原體。11.疫苗，包含在兩個(gè)分開(kāi)的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FPV、修飾的活FHV和修飾的活衣原體，所述兩個(gè)單施用劑量通過(guò)口服或口鼻途徑施用，并且在時(shí)間上間隔3至120天，或者大約3周或大約2周。l2.同時(shí)免疫貓以抵抗FPV和FHV的方法，該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗，其中第一和第二疫苗適應(yīng)于在貓中誘導(dǎo)抗FPV和FHV的免疫應(yīng)答，第一疫苗通過(guò)口服或口鼻施用并且第二疫苗通過(guò)口服或口鼻施用，第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用，其中N是包括3和120在內(nèi)的3至120的整數(shù)，或者其中N是大約3周或其中N是大約2周，其中所述第一和第二疫苗包含修飾的活FPV、修飾的活FHV和修飾的活衣原體。13.免疫原性組合物，包含在單個(gè)施用劑量中施用的修飾的活FPV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體。14.疫苗，包含在兩個(gè)分開(kāi)的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FPV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體，所述兩個(gè)單施用劑量通過(guò)口服或口鼻途徑施用，并且在時(shí)間上間隔3至12Q天，或者大約3周或大約2周。15.同時(shí)免疫貓以抵抗FPV和FCV的方法，該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗，其中第一和第二疫苗適應(yīng)于在貓中誘導(dǎo)抗FPV和FHV的免疫應(yīng)答，第一疫苗通過(guò)口服或口鼻施用并且第二疫苗通過(guò)口服或口鼻施用，第二疫苗在笫一疫苗施用后N天施用，其中N是包括3和120在內(nèi)的3至120的整數(shù)，或者其中N是大約3周或其中N是大約2周，其中所述第一和第二疫苗包含修飾的活FPV、修飾的活FHV和修飾的活衣原體。16.免疫原性組合物，包含在單個(gè)施用劑量中施用的修飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體。17.疫苗，包含在兩個(gè)分開(kāi)的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體，所述兩個(gè)單施用劑量通過(guò)口服或口鼻途徑施用，并且在時(shí)間上間隔3至120天，或者大約3周或大約2周。18.同時(shí)免疫貓以抵抗FHV和FCV的方法，該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗，其中第一和第二疫苗適應(yīng)于在貓中誘導(dǎo)抗FHV和FCV的免疫應(yīng)答，第一疫苗通過(guò)口服或口鼻施用并且第二疫苗通過(guò)口服或口鼻施用，第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用，其中N是包括3和120在內(nèi)的3至120的整數(shù)，或者其中N是大約3周或其中N是大約2周，其中所述第一和第二疫苗包含修飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體。19.免疫原性組合物，包含在單個(gè)施用劑量中施用的修飾的活FPV、修飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體。20.疫苗，包含在兩個(gè)分開(kāi)的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FPV、修飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體，所述兩個(gè)單施用劑量通過(guò)口服或口鼻途徑施用，并且在時(shí)間上間隔3至120天，或者大約3周或大約2周。21.同時(shí)免疫貓以抵抗FPV、FHV和FCV的方法，該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗，其中第一和第二疫苗適應(yīng)于在貓中誘導(dǎo)抗FPV的免疫應(yīng)答，第一疫苗通過(guò)口服或口鼻施用并且第二疫苗通過(guò)口服或口鼻施用，第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用，其中N是包括1和120在內(nèi)的1至120的整數(shù)，或者其中N是大約3周或其中N是大約2周，其中所述第一和第二疫苗包含修飾的活FPV、修飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體。權(quán)利要求1.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗，其包含F(xiàn)CV-21衣殼蛋白或分離的FCV-21衣殼蛋白。2.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗，其包含F(xiàn)CV-21衣殼蛋白或分離的FCV-21衣殼蛋白和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述衣殼蛋白包含蛋白質(zhì)序列(SEQIDN0:13)和具有至少大約91.2%、95%和99%同一性的序列；其中所述衣殼蛋白以有效產(chǎn)生免疫應(yīng)答的量提供。3.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的DNA疫苗，其包含編碼FCV-21衣殼蛋白或分離的FCV-21衣殼蛋白的核酸序列，其中所述DNA包含序列(SEQIDNO:12)和具有至少大約78.7%和79.2%的序列同一性和允許保守替代的序列。4.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗，其包含F(xiàn)CV-49衣殼蛋白或分離的FCV-49衣殼蛋白，其中所述衣殼蛋白包含來(lái)自FCV-49林的蛋白質(zhì)序列。5.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗，其包含F(xiàn)CV-49衣殼蛋白或分離的FCV-49衣殼蛋白和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述衣殼蛋白包含蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:15)和具有至少大約92.7°/。、95%和99%同一性的序列；其中所述衣殼蛋白以有效產(chǎn)生免疫應(yīng)答的量提供。6.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的DNA疫苗，其包含編碼FCV-49衣殼蛋白或分離的FCV-49衣殼蛋白的核酸序列，其中所述DNA包含序列(SEQIDN0:14)和具有至少大約78.9%，即，79,4%(78.9+0.5)的序列同一性和允許保守替代的序列。7.權(quán)利要求l-6之任一項(xiàng)的疫苗，其還包含以下的單獨(dú)一項(xiàng)或任何組合其中該疫苗含有佐劑，其中該FCV成分是活的，其中該FCV成分是減毒的，其中該FCV成分是滅活的，其中該疫苗可以包括至少一種選自FCV-F9、FCV-LLK、FCV-M8、FCV-255和FCV-2280的其它貓杯狀病毒林。8.免疫貓以^氐抗貓杯狀病毒(FCV)的方法，該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗，其中該第一和第二疫苗適應(yīng)于在貓中誘導(dǎo)抗FCV的免疫應(yīng)答，該第一疫苗通過(guò)胃腸外施用且第二疫苗通過(guò)口服或口鼻施用，該第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用，其中N是包括3和120在內(nèi)的3至120的整數(shù)。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述疫苗獨(dú)立地包含活病毒疫苗、修飾的活病毒疫苗、滅活病毒疫苗、重組疫苗、DM疫苗或亞單位抗原疫苗中的任一種或其組合。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述疫苗中的至少一種包括一種或多種FCV抹。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述一種或多種FCV林包括F9或FCV-21或F9和FCV-21。12.免疫原性組合物，其包含在單個(gè)施用劑量中施用的修飾的活FPV和修飾的活衣原體，和/或包含在單個(gè)施用劑量中施用的修飾的活FHV和修飾的活衣原體，和/或包含在單個(gè)施用劑量中施用的修飾的活FCV和修飾的活衣原體，和/或包含在單個(gè)施用劑量中施用的修飾的活FPV、<務(wù)飾的活FHV和^f務(wù)飾的活衣原體，和/或包含在單個(gè)施用劑量中施用的修飾的活FPV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體，和/或包含在單個(gè)施用劑量中施用的》務(wù)飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體，和/或包含在單個(gè)施用劑量中施用的修飾的活FPV、修飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體。13.疫苗，其包含在兩個(gè)分開(kāi)的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FPV和修飾的活衣原體，和/或包含在兩個(gè)分開(kāi)的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FHV和修飾的活衣原體，和/或包含在兩個(gè)分開(kāi)的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FCV和修飾的活衣原體，和/或包含在兩個(gè)分開(kāi)的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FPV、修飾的活FHV和修飾的活衣原體，和/或包含在兩個(gè)分開(kāi)的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FPV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體，和/或包含在兩個(gè)分開(kāi)的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體，和/或包含在兩個(gè)分開(kāi)的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FPV、^修飾的活FHV、^修飾的活FCV和^"飾的活衣原體，所述兩個(gè)單施用劑量通過(guò)口服或口鼻途徑施用且時(shí)間上間隔3至120天。14.免疫貓以抵抗FPV、FCV和/或FHV的方法，該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗，其中第一和第二疫苗適應(yīng)于在貓中誘導(dǎo)抗FPV和/或FCV和/或FHV的免疫應(yīng)答，第一疫苗通過(guò)口服或口鼻施用且第二疫苗通過(guò)口服或口鼻途徑施用，第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用，其中N是包括3和120在內(nèi)的3至120的整數(shù)，其中所述第一和第二疫苗由如下組合物組成，所述組合物a)包含修飾的活FPV和修飾的活衣原體；和/或b)包含修飾的活FHV和纟務(wù)飾的活衣原體；和/或c)包含修飾的活FCV和修飾的活衣原體；和/或d)包含修飾的活FPV、修飾的活FHV和修飾的活衣原體；和/或e)包含修飾的活FPV、{務(wù)飾的活FCV和^f務(wù)飾的活衣原體；和/或f)包含修飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體；和/或g)包含lt飾的活FPV、^修飾的活FHV、<務(wù)飾的活FCV和^務(wù)飾的活衣原體，或其任何組合。15.本文所述的用于治療動(dòng)物，尤其是貓的任何免疫原性組合物、疫苗和方法。全文摘要本發(fā)明涉及用于免疫貓以抵抗貓病毒的疫苗。本發(fā)明還涉及編碼分離的貓杯狀病毒的衣殼蛋白的核酸克隆。本發(fā)明還涉及含有分離的貓杯狀病毒的活或死疫苗、含有分離的貓杯狀病毒的衣殼蛋白的亞單位疫苗、含有分離的貓杯狀病毒的核酸克隆的核酸疫苗、和包含編碼分離的貓杯狀病毒的衣殼蛋白的核酸的重組病毒載體疫苗。本發(fā)明也涉及鑒定可用于疫苗組合物的制備以及診斷感染貓杯狀病毒的貓的試驗(yàn)中的貓杯狀病毒的方法。本發(fā)明還公開(kāi)免疫動(dòng)物，特別是貓以抵抗疾病，尤其是，貓杯狀病毒(FCV)的方法。該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二FCV疫苗。所述第一疫苗通過(guò)口服或腸胃外途徑(例如，皮下、肌內(nèi)等途徑)施用。所述第二疫苗在第一疫苗使用后N天通過(guò)口服或口鼻途徑施用，其中N是包括3和120在內(nèi)的3至120的整數(shù)。也可以給予第三疫苗施用。本發(fā)明也描述使用疫苗治療和免疫動(dòng)物，尤其是貓以抵抗FPV或貓細(xì)小病毒(也稱作全白細(xì)胞減少癥或FPL)以及另一種疾病，F(xiàn)HV或貓皰疹病毒(也稱作貓鼻氣管炎病毒)的方法和材料。文檔編號(hào)A61K48/00GK101563096SQ200680035988公開(kāi)日2009年10月21日申請(qǐng)日期2006年7月17日優(yōu)先權(quán)日2005年7月28日發(fā)明者C·M·塔克爾,D·E·洛沃里,P·M·克萊爾,P·M·吉蒙德,T·J·紐比,欣容申請(qǐng)人:輝瑞產(chǎn)品公司