專利名稱：：以cdca1-kntc2復(fù)合物為靶標(biāo)的篩選和nsclc治療方法以CDCA1-KNTC2復(fù)合物為耙標(biāo)的篩選和NSCLC治療方法本專利申請(qǐng)要求2005年7月29日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)流水號(hào)60/703，704的權(quán)益，本文S1用其全部內(nèi)容作為參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及癌癥治療領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及根據(jù)如下的發(fā)現(xiàn)治療癌癥，即CDCA1和KNTC2的共激活及其關(guān)連(cognate)相互作用在肺癌發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并且抑制該復(fù)合物的方法能夠用于治療非小細(xì)胞肺癌。發(fā)明背景肺癌是世界上最常見的癌癥之一，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)又是最為常見的形式，占總病例的接近80%(GreenleeRT""/.，CACancerJClin.2001;51:15-36)。已經(jīng)報(bào)道了與肺癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的許多遺傳改變。然而迄今為止，其精確的分子機(jī)制仍然不清楚(SozziG.,EurJCancer.2001;37Suppl7:S63_73)。在過去10年里，新開發(fā)的細(xì)胞毒劑，包括紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、吉西他濱(Gemcitabine)和長春瑞濱(vinorelbine),為晚期NSCLC患者提供了多種治療選擇；然而，這些療法與基于順鉑的療法相比只能提供中等的存活效益(SchillerJH,""/.,NEnglJMed.2002;346:92-8;KellyK,"a/.,JClinOncol.2001;19:3210-8)。因此，人們熱切期望有新的治療策略。用cDNA微陣列對(duì)成千上萬個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行系統(tǒng)分析是鑒定參與癌發(fā)生途徑的未知分子的有效方法，并能夠揭示用于開發(fā)新型療法和診斷的候選靶分子。為了嘗試分離用于診斷、治療和/或預(yù)防NSCLC的潛在分子靶標(biāo)，本發(fā)明人利用通過激光顯微解剖純化的腫瘤細(xì)胞群體，在含有23，040個(gè)基因的cDNA微陣列上對(duì)NSCLC細(xì)胞進(jìn)行了全基因組表達(dá)模式分析(KikuchiT,da/"Oncogene.2003;22:2192-205;SuzukiC,"CancerRes.2003;63:7038-41;KakiuchiS,"a/.，MolCancerRes.2003;1:485-99;ZembutsuH,efa/.,IntJOncol.2003;23:29-39;KakiuchiS,"a/"HumMolGenet.2004;13:3029-43)。為了檢驗(yàn)代表性基因產(chǎn)物的生物學(xué)和臨床病理學(xué)意義，本發(fā)明人還對(duì)臨床肺癌材料進(jìn)行了腫瘤組織微陣列分析(IshikawaN，"a/.，ClinCancerRes.2004;10(24):8363-70)。這種系統(tǒng)方法顯示，細(xì)胞分裂關(guān)聯(lián)1(CDCAl)和動(dòng)粒(kinetocore)關(guān)聯(lián)2(KNTC2)經(jīng)常在原發(fā)NSCLC中共過度表達(dá)(另見WO2004/031413)。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的改變是人類癌癥的特征。CDCA1和KNTC2是參與紡錘體檢查點(diǎn)信號(hào)傳導(dǎo)的幾種蛋白質(zhì)的成員。特別地，動(dòng)粒外板內(nèi)的附接位點(diǎn)為染色體運(yùn)動(dòng)提供微管依賴性動(dòng)力，并調(diào)節(jié)紡錘體檢查點(diǎn)蛋白在動(dòng)粒的組裝。由Ndc80(Hecl)、Nuf2、Spc24和Spc25構(gòu)成的Ndc80復(fù)合物對(duì)于中期染色體排列和后期染色體分離至關(guān)重要。Ndc80復(fù)合物首先在芽殖酵母中分離，并且已經(jīng)在蠕蟲、蛙、雞和人類中鑒定了其同源物(Ciferri，C.JBiolChem.280,29088-95(2005).;McCleland，M丄aa/.GenesDev.17,101-114(2003).;Desai，A.GenesDev.17，2421-2435(2003),;DeLuca，J.G."a/.CurrBiol.13,2103-2109(2003).)。動(dòng)粒外寺反內(nèi)CDCA1畫KNTC2復(fù)合物的附接位點(diǎn)為染色體運(yùn)動(dòng)提供微管依賴性動(dòng)力，并調(diào)節(jié)紡錘體檢查點(diǎn)蛋白在動(dòng)粒的組裝。已知缺失該復(fù)合物成員或有成員突變的酵母細(xì)胞會(huì)顯示出動(dòng)粒-微管附接喪失，但不會(huì)喪失動(dòng)粒的全部結(jié)構(gòu)(Wigge，P.A.e^/.JCellBiol.152,349-60(2001).)。當(dāng)著絲粒喪失與紡錘體極體的連接時(shí)，酵母Nuf2也會(huì)在減數(shù)分裂前期從著絲粒消失，并且在染色體分離中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用(Nabetani，A.eM/.Chromosoma.110，322-334(2001).)。人CDCA1已鑒定為與已知細(xì)胞周期基因(包括CDC2、細(xì)胞周期蛋白、拓樸異構(gòu)酶II和others21)共表達(dá)的基因成員，并且報(bào)道與有絲分裂HeLa細(xì)胞的著絲粒結(jié)合；這使人們預(yù)期，CDCA1是酵母Nuf2的功能性同源物(Wigge，P.A."a/.JCellBiol.152,349-360(2001),)。另一方面，使用酵母雙雜交篩選，已經(jīng)鑒定人KNTC2是與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(RB1)的C端相互作用的蛋白，并提示它是參與紡錘體檢查點(diǎn)信號(hào)傳導(dǎo)的數(shù)種蛋白質(zhì)之一(Durfee，T.etal.GenesDev.7，555-569(1993).;Chen，Y.etal,Mol.Cell.Biol.17,6049-6056(1997).)。這種涉及KNTC2的監(jiān)視機(jī)制將MPS1激酶和MAD1/MAD2復(fù)合物募集到動(dòng)粒，并通過檢測(cè)未對(duì)準(zhǔn)的染色體以及在實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)娜旧w雙極附接之前致使前中期暫停，保證細(xì)胞分裂期間染色體的正確分離(Martin-Lluesma,S.etal.Science297,2267-2270(2002))。盡管有這些進(jìn)展，但是到目前為止，還沒有報(bào)道描述CDCA1-KNTC2復(fù)合物共激活在人癌癥進(jìn)展中的重要性以及作為治療和預(yù)后靶標(biāo)的潛力。發(fā)明筒述通過分析非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)基因組范圍的基因表達(dá)模式，本發(fā)明人檢測(cè)到細(xì)胞分裂關(guān)聯(lián)1(celldivisonassociatedCDCA1)的過度表達(dá)。本發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，CDCA1蛋白與一種也在肺癌中特異過度表達(dá)的蛋白質(zhì)一一動(dòng)粒關(guān)聯(lián)2(kinetocoreassociated2，KNTC2)物理相互作用。Northern印跡分析顯示，這兩個(gè)基因在所檢查的23種正常成人組織中只在睪丸中表達(dá)。在體外，用siRNA抑制CDCA1或KNTC2的表達(dá)，或者用顯性負(fù)突變(dominantnegative)CDCA1片段或由膜轉(zhuǎn)導(dǎo)11聚精氨酸序列和CDCA1來源的19氨基酸肽(密碼子398-416)構(gòu)成的合成33氨基酸多肽抑制它們的結(jié)合，有效抑制了NSCLC細(xì)胞的生長。由于這里的數(shù)據(jù)證明，CDCA1和KNTC2屬于癌-睪丸抗原(CTA)類，并且它們的同時(shí)上調(diào)是肺癌細(xì)胞生長/生存的經(jīng)常而重要的特征，所以選擇性抑制CDCA1或KNTC2的活性和/或抑制CDCA1-KNTC2復(fù)合物的形成似乎可是一種治療多種肺癌的便利治療策略。例方法包括如下步驟(1)在測(cè)試化合物的存在下，使KNTC2多肽或其功能等價(jià)物與CDCA1多肽或其功能等價(jià)物接觸；(2)檢測(cè)步驟(l)中多肽間的結(jié)合；和(3)選擇抑制多肽間結(jié)合的測(cè)試化合物。CDCA1多肽的功能等價(jià)物可具有相應(yīng)于KNTC2結(jié)合域的氨基酸序列，例如SEQIDNO:35的氨基酸序列(IQKIKLGIQQLKDAAEREK)。同樣，KNTC2多肽的功能等價(jià)物可具有相應(yīng)于CDCA1結(jié)合域的氨基酸序列。預(yù)防受試者體內(nèi)NSCLC的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于篩選治療或預(yù)防NSCLC的化合物的試劑盒。該試劑盒優(yōu)選地包括如下組分a:KNTC2多肽或其功能等價(jià)物，和b:CDCA1多肽或其功能等價(jià)物。本發(fā)明還提供治療或預(yù)防受試者體內(nèi)NSCLC的方法，其包括向所述受試者施用含有降低KNTC2基因表達(dá)的siRNA的siRNA組合物，其中該siRNA在有義鏈中具有SEQIDNO:9所示的核香酸序列。該siRNA優(yōu)選地具有如下通式5，-[A]-[B]-[A,]-3，，其中[A]是相應(yīng)于SEQIDNO:9的核糖核芬酸序列；[B]是由3-23個(gè)核苷酸構(gòu)成的核糖核苷酸序列；[A，]是與[A]互補(bǔ)的核糖核苦酸序列。本發(fā)明的方法還為通過施用具有顯性失活效應(yīng)的CDCAl突變體或編碼該突變體的多核苷酸來治療或預(yù)防受試者中的NSCLC提供了條件。該CDCAl突變體可以具有包含KNTC2結(jié)合域的氨基酸序列，但排除其nuf2域。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該CDCAl突變體包含SEQIDNO:35的氨基酸序列。該CDCAl突變體可以具有如下的通式[R]-[D]，其中[R]是膜轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，[D]是具有SEQIDNO:35所示氨基酸序列的多肽。膜轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)可以從下組中選擇聚精氨酸；Tat/RKKRRQRRR/SEQIDNO:37;Penetratin/RQIKIWFQNRRMKWKK/SEQIDNO:38;BuforinII/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK/SEQIDNO:39;Transportan/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/SEQIDNO:40;MAP(模型兩親肽)/KLALKLALKALKAALKLA/SEQIDNO:41;K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP/SEQIDNO:42;Ku70/VPMLK/SEQIDNO:43;Ku70/PMLKE/SEQIDNO:50;朊病毒(Prion)/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/SEQIDNO:44;pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK/SEQIDNO:45;P印-l/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/SEQIDNO:46;SynBl/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/SEQIDNO:47;P印畫7/SDLWEMMMVSLACQY/SEQIDNO:48;和HN-1/TSPLNIHNGQKL/SEQIDNO:49.本發(fā)明提供由有義鏈和反義鏈構(gòu)成的雙鏈分子，其中該有義鏈?zhǔn)窍鄳?yīng)于KNTC2靶序列的核糖核苷酸序列，并且其中該反義鏈?zhǔn)桥c所述有義鏈互補(bǔ)的核糖核苷酸序列，其中所述有義鏈和反義鏈彼此雜交形成所述雙鏈分子，并且其中所述雙鏈分子在被引入到表達(dá)KNTC2基因的細(xì)胞中時(shí)抑制所述基因的表達(dá)。該雙鏈分子可以包括由來自SEQIDNO:31核苷酸序列的至少大約10個(gè)連續(xù)核苷酸構(gòu)成的KNTC2靶序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該KNTC2靶序列包含來自SEQIDNO:9核苷S交序列的大約19到大約25個(gè)連續(xù)核苷酸，或者完全由SEQIDNO:9構(gòu)成。該雙鏈分子可以是單一核糖核普酸轉(zhuǎn)錄物，由通過單鏈核糖核苦酸序列連接的有義鏈和反義鏈構(gòu)成。該雙鏈分子典型地是長度小于大約100個(gè)核苷酸、長度小于大約75個(gè)核苷酸、長度小于大約50個(gè)核普酸或者長度小于大約25個(gè)核苷酸的寡核苦酸。該雙鏈分子可以是長度為大約19到大約25個(gè)核普酸之間的寡核苷酸。本發(fā)明還提供一種載體，其編碼如上所述的本發(fā)明的雙鏈分子。該載體可以編碼具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄物，其包括有義鏈和反義鏈。該轉(zhuǎn)錄物可以進(jìn)一步包括連接有義鏈和反義鏈的單鏈核糖核苦酸序列。本發(fā)明提供了一種包含由有義鏈核酸和反義鏈核酸的組合構(gòu)成的多核苦酸的載體，其中該有義鏈核酸具有SEQIDNO:9的核苷酸序列，而該反義鏈核酸具有與該有義鏈互補(bǔ)的序列。該多核苷酸可以具有通式5,-[A]-[B]-[A，]畫3,,其中[A]是SEQIDNO:9的核苷酸序列；[B]是由3-23個(gè)核苷酸構(gòu)成的核苷酸序列；而[A，]是與[A]互補(bǔ)的核苷酸序列。本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防NSCLC的組合物，這種組合物包含藥物有效量的針對(duì)KNTC2基因的siRNA。該siRNA可包括具有SEQIDNO:9所示核苷酸序列的有義鏈作為耙序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于治療或預(yù)防NSCLC的組合物，這種組合物包和藥物可接受的載體。本發(fā)明還提供了用于治療或預(yù)防NSCLC的組合物，這種組合物包含藥物有效量的本發(fā)明CDCA1突變體。本發(fā)明提供了評(píng)估NSCLC預(yù)后的方法，其中該方法包括如下步驟(a)檢測(cè)從待評(píng)估NSCLC預(yù)后的受試者采集的樣品中CDCA1和KNTC2其中之一或二者的表達(dá)水平，和(b)若檢測(cè)到CDCA1和KNTC2其中之一或二者的表達(dá)水平提高，則表明預(yù)后不良。上述方法可以包括檢測(cè)CDCA1和KNTC2兩者表達(dá)水平的步驟。該表達(dá)水平的沖企測(cè)可以通過如下方法中的4壬<可一種(a)檢測(cè)編碼SEQIDNO:34(CDCA1)或SEQIDNO:32(KNTC2)所示氨基酸序列的mRNA的存在，(b)檢測(cè)具有SEQIDNO:34(CDCAl)或SEQIDNO:32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的存在，和(c)檢測(cè)具有SEQIDNO:34(CDCAl)或SEQIDNO:32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的生物活性。本發(fā)明還提供了用于估計(jì)NSCLC預(yù)后的試劑盒，其中該試劑盒包括任何一種,人下組選捧的成分(a)用于檢測(cè)編碼SEQIDNO:34(CDCAl)或SEQIDNO:32(KNTC2)所示氨基酸序列的mRNA的試劑，(b)用于檢測(cè)具有SEQIDNO:34(CDCAl)或SEQIDNO:32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的試劑，和(c)用于檢測(cè)具有SEQIDNO:34(CDCAl)或SEQIDNO:32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的生物活性的試劑。定義除非另外特別指出，這里使用的文字"一個(gè)"、"一種"和"該"表示"至少一個(gè)"。術(shù)語"蛋白質(zhì)"和"多肽"可互換使用。而且，除非另外特別指出，術(shù)語"基因"、"多核苷酸"和"核酸"可互換使用。術(shù)語"有效"是指治療使受試者體內(nèi)NSCLC的大小、患病率或轉(zhuǎn)移潛力降低。在進(jìn)行預(yù)防治療時(shí)，"有效"是指治療延遲或阻止NSCLC的發(fā)生或者減輕NSCLC的臨床癥狀。NSCLC的評(píng)估可以用標(biāo)準(zhǔn)臨床規(guī)程進(jìn)行。而且，治療的有效性可結(jié)合任何已知的用于診斷或治療NSCLC的方法加以確定。例如，NSCLC經(jīng)常通過組織病理學(xué)或者通過鑒定癥狀異常，例如慢性咳嗽、聲嘶、咳血、體重下降、食欲減退、氣短、哮鳴、支氣管炎或肺炎重復(fù)發(fā)作和胸痛來診斷。附圖筒述圖1顯示了CDCA1和KNTC2在肺腫瘤、細(xì)胞系和正常組織中的表達(dá)。圖1A顯示了CDCA1和KNTC2在16例NSCLC臨床樣品(T)和相應(yīng)正常組織(N)中的表達(dá)，通過半定量RT-PCR檢查。本發(fā)明人針對(duì)從臨床肺癌樣品的mRNA制得的每種單鏈cDNA制備了合適稀釋物，以(3-肌動(dòng)蛋白(ACTB)的表達(dá)水平作為定量對(duì)照。圖1B顯示了通過半定量RT-PCR考察的CDCA1和KNTC2在NSCLC細(xì)胞系(1:A549，2:LC319，3:PC14,4:PC3,5:PC9，6:A427,7:NCI畫H1373，8:EBC-1，9:LU61,10:NCI-H520，11:NCI-H1703，12:NCI-H2170,13:NCI-H226,14:RERF-LC-A1,15:SK隱MES-1，16:NCI畫H647,17:LX1，18:DMS114，19:DMS273,20:SBC-3，21:SBC-5，22:NCI國H1666,23:NCI畫H781)中的表達(dá)。圖1C顯示了通過Northern印跡分析檢測(cè)的CDCA1和KNTC2在正常人組織中的表達(dá)。圖2顯示了CDCA1與KNTC2的相互作用以及由此所得的復(fù)合物的亞細(xì)胞定位。圖2A鑒定KNTC2為CDCA1相互作用蛋白。IP免疫沉淀；IB免疫印跡。圖2B顯示了內(nèi)源CDCA1(綠色)和內(nèi)源KNTC2(紅色)在LC319細(xì)胞中的共定位。圖2C和2D通過免疫沉淀實(shí)驗(yàn)鑒定了CDCA1中結(jié)合KNTC2的區(qū)域。缺少CDCAlC端158個(gè)氨基酸的CDCA11-148和CDCA1149-306構(gòu)建體未能保留任何可覺察的與LC319細(xì)胞中內(nèi)源KNTC2相互作用的能力(C)。缺少CDCA1368-41位的49個(gè)氨基酸的CDCA1277-367和CDCA1319-367構(gòu)建體不能與內(nèi)源KNTC2相互作用，表明CDCA1368-416位的49個(gè)氨基酸的肽可能是與內(nèi)源KNTC2相互作用的最重要的區(qū)域(D)。圖3顯示了CDCA1和KNTC2過度表達(dá)與更差的NSCLC后果的關(guān)聯(lián)。圖3A顯示了在組織微陣列(X100)上用抗CDCA1(上圖)和抗KNTC2(下圖)多克隆抗體對(duì)來自手術(shù)切除SCC組織的代表性樣品的免疫組織化學(xué)評(píng)價(jià)。圖3B-E顯示了根據(jù)組織微陣列上CDCA1與KNTC2表達(dá)的共表達(dá)(B)、CDCA1表達(dá)(C)、KNTC2表達(dá)(D)對(duì)腫瘤特異性生存時(shí)間的Kaplan-Meier分析結(jié)果。圖3E,CDCA1和KNTC2的共過度表達(dá)與NSCLC患者不良預(yù)后的關(guān)聯(lián)。282例NSCLC分成3組組1為對(duì)CDCA1和KNTC2均有強(qiáng)烈陽性染色(62位患者)的病例，組2為對(duì)兩種標(biāo)記均為陰性染色(29位患者)的病例，組3為任何其他病例(191位患者，顯示為其他)。圖4顯示了針對(duì)CDCA1和KNTC2的siRNA對(duì)NSCLC細(xì)胞生長的抑制。圖4A和4B，左上圖，顯示了通過半定量RT-PCR分析的A549細(xì)胞響應(yīng)si-CDCAl、si-KNTC2或?qū)φ誷iRNA的基因敲低效果。圖4A和4B,左下和右上圖，顯示了被特異siRNA或?qū)φ召|(zhì)粒(EGFP，亂序(Scramble)或螢光素酶)轉(zhuǎn)染的LC319細(xì)胞集落形成和MTT測(cè)定結(jié)果。誤差線代表一式三份測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)差。圖5顯示了顯性負(fù)突變CDCA1片段和肽對(duì)NSCLC細(xì)胞生長的抑制。圖5A顯示了在用CDCA1l-464(全長)和CDCA1200-464構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染的LC319細(xì)胞中，通過免疫沉淀4企測(cè)到的外源CDCA1與KNTC2復(fù)合物形成的降低(左上圖；黑色箭頭)。CDCA1200-464片段與LC319細(xì)胞中內(nèi)源KNTC2相互作用(左上圖；白色箭頭)。投入級(jí)分(I叩utfractions)(左第三圖和下圖)。通過免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)到LC319細(xì)胞中CDCA1200-464與內(nèi)源KNTC2共定位(右圖)。圖5B,LC319細(xì)胞的MTT測(cè)定，檢測(cè)了CDCA1200-464的顯性失活效應(yīng)。CDCA1149-306用作對(duì)照。誤差線代表一式三次實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖5C顯示了LC319細(xì)胞MTT測(cè)定的結(jié)果，檢測(cè)到了11R-CDCA1398-416肽轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)LC319細(xì)胞生長的抑制。誤差線代表一式三次實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖6顯示了CDCA1的顯性負(fù)突變肽對(duì)NSCLC細(xì)胞生長的抑制。圖6A顯示了用11R-CDCA1398-416肽或亂序肽處理后LC319細(xì)胞的細(xì)胞周期分析結(jié)果。圖6B顯示了通過Western印跡分析檢測(cè)的CDCA1和KNTC2蛋白在正常人肺成纖維細(xì)胞衍生的MRC5細(xì)胞中的表達(dá)，與3種肺癌細(xì)胞系比較(左圖)。MTT測(cè)定顯示11R-CDCA1398-416肽對(duì)幾乎不表達(dá)CDCA1和KNTC2蛋白的MRC5細(xì)胞沒有脫靶(off-target)效應(yīng)(右圖)。圖7顯示了細(xì)胞透過性CDCA1肽對(duì)NSCLC細(xì)胞的體內(nèi)生長抑制。圖7A顯示了11R-CDCA1398-416肽對(duì)移才直到-陳鼠的A549細(xì)胞的生長抑制效果。對(duì)3只用11R-CDCA1398-416肽(0.15pmol/只/天)、亂序肽0.15fimol/只/天)或PBS(對(duì)照)處理的小鼠的平均腫瘤體積描點(diǎn)作圖。動(dòng)物每天腫瘤內(nèi)注射每種肽，持續(xù)7周。來源于A549細(xì)胞的嫁接腫瘤的生長受到顯性負(fù)突變細(xì)胞透過性11R-CDCA1398-416肽的顯著抑制。圖7B顯示了移^i到用11R-CDCA1398-416肽(0.15pmol/只/天)、亂序肽0.15jimol/只/天)或PBS(對(duì)照)處理7周的小鼠體內(nèi)的腫瘤的肉眼外觀。詳細(xì)說明治^5戈豫膠A^a:c的化合參的,逸如上所述，本發(fā)明人揭示了在NSCLC細(xì)胞中，CDCA1與KNTC2相互該方法包括如下步驟(a)在測(cè)試化合物的存在下，使KNTC2多肽或其功能等價(jià)物與CDCA1多肽或其功能等價(jià)物接觸；(b)檢測(cè)步驟(l)中多肽間的相互作用；和(c)選擇抑制所述多肽結(jié)合的測(cè)試化合物。在本發(fā)明的上下文中，CDCA1或KNTC2多肽的功能等價(jià)物是具有分別與CDCA1多肽(SEQIDNO:34)或KNTC2多肽(SEQIDNO:32)等價(jià)的生物活性的多肽。用于制備與給定蛋白質(zhì)功能等價(jià)的多肽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括在蛋白質(zhì)中引入突變的已知方法。例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過定點(diǎn)誘變?cè)贑DCA1或KNTC2的任一個(gè)的氨基酸序列中引入合適的突變，來制備與CDCA1或KNTC2功能等價(jià)的多肽(Hashimoto-Gotohefa/.,Gene152:271-5(1995);ZollerandSmith,MethodsEnzymol100:468-500(1983);Kramerda/"NucleicAcidsRes.12:9441-9456(1984);KramerandFritz,MethodsEnzymol154:350-67(1987);Kunkel,ProcNatlAcadSciUSA82:488-92(1985);KunkelTA,MethodsEnzymol.1991;204:125-39.)。氨基酸突變也可以自然發(fā)生。本發(fā)明的多肽具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生突變的CDCAl或KNTC2的氨基酸序列的多肽，只要所得的多肽分別與CDCAl或KNTC2在功能上等價(jià)。這類突變體中被突變的氨基酸數(shù)目一般為20個(gè)氨基酸或者更少，更典型地為10個(gè)氨基酸或者更少，優(yōu)選地為5-6個(gè)氨基酸或者更少，更優(yōu)選地為1-3個(gè)氨基酸。已經(jīng)知道，突變或修飾的蛋白質(zhì)，也就是具有某個(gè)氨基酸序列通過替換、刪除、插入和/或添加某一氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被修飾而得到的序列的蛋白質(zhì)，保持原來的生物活性(Mark"a/.,ProcNatlAcadSciUSA81:5662-6(1984);ZollerandSmith,NucleicAcidsRes10:6487-500(1982);Dalbadie-McFarlandda/.,ProcNatlAcadSciUSA79:6409-13(1982))。待突變的氨基酸殘基優(yōu)選地被突變成保守氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的不同氨基酸(該過程稱作保守氨基酸取代)。氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的實(shí)例是疏水氨基酸(A,I,L，M,F,P，W，Y,V)、親水氨基酸(R,D,N,C，E，Q,QH，K,S，T)和共有如下功能基團(tuán)或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(QA，V，L，I,P);含羥基側(cè)鏈(S，T，Y);含硫原子側(cè)鏈(C,M);含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D,N,E,Q);含堿基側(cè)鏈(R,K，H);和含芳香基側(cè)鏈(H,F，Y，W)。注意，括號(hào)中的字母表示氨基酸的單字母編碼。向CDCA1或KNTC2的氨基S吏序列添加了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的多肽的實(shí)例是分別包含CDCA1或KNTC2的融合蛋白。因此，融合蛋白，也就是CDCA1或KNTC2與其他肽或蛋白質(zhì)的融合物，也包含在本發(fā)明中。融合蛋白可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)制備，例如通過將編碼CDCA1或KNTC2的DNA與編碼其他肽或蛋白質(zhì)的DNA連接，使它們讀框一致，將該融合DNA插入到表達(dá)載體中，并在宿主中表達(dá)之。對(duì)于和本發(fā)明蛋白質(zhì)融合的肽或蛋白質(zhì)沒有限制。本領(lǐng)域已知的用于分離功能等價(jià)多肽的替代方法有，例如，使用雜交4支術(shù)的方法(Sambrook"a/"MolecularCloning2nded.9.47-9.58,ColdSpringHarborLab.Press(1989))。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠容易地分離與CDCA1或KNTC2(也就是分別與SEQIDNOs:34和32)高度同源的DNA,并從所分離的DNA分離與CDCA1或KNTC2功能等^T的多肽。本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括由與編碼CDCA1或KNTC2的DNA序列的全部或部分雜交的DNA編碼的、與CDCA1或KNTC2功能等價(jià)的蛋白質(zhì)。這些多肽包括相應(yīng)于人源蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物同源物(例如由猴、大鼠、兔和?；蚓幋a的多肽)。在分離與來自動(dòng)物的CDCA1或KNTC2編碼DNA高度同源的cDNA時(shí)，特別優(yōu)選使用肺癌組織。優(yōu)選地，功能等價(jià)多肽的氨基酸序列與這里公開的天然CDCA1或KNTC2具有至少大約80%的同源性(也稱作序列同一性)，更優(yōu)選地有至少大約85%，90%，95%,96%，97°/。，98%，或99%的同源性。多肽的同源性可以按照"WilburandLipman，ProcNatlAcadSciUSA80:726-30(1983)，，中的算法加以確定。在其他實(shí)施方案中，功能等價(jià)多肽可以由在嚴(yán)緊條件下(如下文定義)與編碼這種功能等價(jià)多肽的多核苦酸雜交的多核苷酸編碼。除雜交外，還可以使用基因擴(kuò)增方法，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法，使用根據(jù)CDCAl或KNTC2的序列信息合成的引物分離編碼與CDCAl或KNTC2功能等價(jià)的多肽的DNA。本發(fā)明上下文中使用的CDCA1或KNTC2功能等價(jià)物在氨基酸序列、分子量、等電點(diǎn)、糖鏈的存在與否或形式上可以有變化，這取決于用于產(chǎn)生它的細(xì)胞或宿主或者所用的純化方法。無論如何，只要它是CDCA1或KNTC2多肽的功能等價(jià)物，它就落入本發(fā)明的范圍。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，CDCA1多肽的功能等價(jià)物可以包括相應(yīng)于KNTC2結(jié)合域的氨基酸序列，例如SEQIDNO:35的氨基酸序列(IQKIKLGIQQLKDAAEREK)。類似地，KNTC2多肽的功能等價(jià)物可以包括相應(yīng)于CDCAl結(jié)合域的氨基酸序列。如上面討論的，抑制CDCAl與KNTC2間的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑用于本發(fā)明篩選方法的CDCAl和KNTC2多肽可以是重組多肽或來源于自然界的蛋白質(zhì)，或者還可以是其部分肽段，只要它保持全長蛋白質(zhì)的結(jié)合能力即可。這種保持結(jié)合能力的部分肽段在這里稱作"功能等價(jià)物"。在篩選方法中使用的CDCA1和KNTC2多肽可以是，例如，純化多肽、可溶蛋白質(zhì)、與載體結(jié)合的形式，或與其他多肽融合的融合蛋白。作為篩選抑制CDCA1和KNTC2結(jié)合的化合物的方法，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多方法。例如，篩選可以作為體外測(cè)定系統(tǒng)，例如細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行。更明確地，首先，將CDCA1或KNTC2與支持物結(jié)合，對(duì)它添加另一種蛋白質(zhì)與測(cè)試化合物。接著溫育該混合物，清洗，然后4企測(cè)和/或測(cè)量與支持物結(jié)合的另一種蛋白質(zhì)?？捎糜诮Y(jié)合蛋白質(zhì)的支持物的實(shí)例包括，例如，不溶性多糖，如瓊脂糖、纖維素和葡聚糖；和合成樹脂，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅(silicon);優(yōu)選的是，可使用由上述材料制備的可商購的珠子(bead)和板(plate)(例如多孔板、生物傳感器芯片等)。當(dāng)使用珠子時(shí)，可以將它們填充到柱內(nèi)?；蛘?，磁珠的使用在本領(lǐng)域也是已知的，它使人們能夠通過磁性容易地分離結(jié)合在珠子上的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)與支持物的結(jié)合可以根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行，例如化學(xué)鍵合和物理吸附?；蛘?，蛋白質(zhì)可以通過特異識(shí)別該蛋白的抗體與支持物結(jié)合。而且，蛋白質(zhì)與支持物的結(jié)合還可以通過抗生物素蛋白和生物素進(jìn)行。蛋白質(zhì)間的結(jié)合優(yōu)選地在緩沖液中進(jìn)行，緩沖液的實(shí)例包括，但不僅限于，磷酸緩沖液和Tris緩沖液。然而，所選緩沖液不得抑制蛋白質(zhì)間的結(jié)合。在本發(fā)明的上下文中，利用表面等離子體共振現(xiàn)象的生物傳感器可以用作檢測(cè)或定量結(jié)合蛋白質(zhì)的方法。在使用這樣的生物傳感器時(shí)，只用微量的多肽且無需標(biāo)記(例如BIAcore，Pharmacia),蛋白質(zhì)間的相互作用可以作為表面等離子體共振信號(hào)實(shí)時(shí)地被觀察。因此，使用生物傳感器例如BIAcore評(píng)估CDCA1與KNTC2的結(jié)合是可能的?；蛘?，可以對(duì)CDCA1或KNTC2進(jìn)行標(biāo)記，并且可利用結(jié)合蛋白的標(biāo)記物來檢測(cè)或測(cè)量結(jié)合蛋白。具體地，在對(duì)其中一個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)標(biāo)記之后，使被標(biāo)記的蛋白在測(cè)試化合物的存在下與另一種蛋白接觸，清洗后，根據(jù)標(biāo)記物對(duì)結(jié)合蛋白進(jìn)行檢測(cè)或測(cè)量。在本方法中可用于標(biāo)記蛋白質(zhì)的標(biāo)記物質(zhì)包括但不僅限于放射性同位素(例如3H,14C,32P,33P,35S,1251,131I)、酶(例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、卩-半乳糖酶、P-葡萄糖苷酶)、熒光物質(zhì)(例如熒光素異丙烯硫氰酸酯(FITC)、羅丹明)和生物素/抗生物素蛋白。當(dāng)用放射性同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)時(shí)，可以通過液體閃爍進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)量?；蛘?，用酶標(biāo)記的蛋白質(zhì)的檢測(cè)或測(cè)量可以通過添加酶的底物并用吸光測(cè)定計(jì)4企測(cè)底物的酶促變化，例如顏色產(chǎn)生。進(jìn)一步，在使用熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物時(shí)，可以用熒光光度計(jì)檢測(cè)或測(cè)量結(jié)合蛋白。而且，還可以用CDCA1或KNTC2的抗體4企測(cè)或測(cè)量CDCA1與KNTC2的結(jié)合。例如，在使固定在支持物上的CDCA1多肽與測(cè)試化合物和KNTC2接觸之后，溫育和清洗混合物，然后可以用抗KNTC2的抗體進(jìn)行檢測(cè)或測(cè)量?；蛘撸梢詫NTC2固定在支持物上，而使用抗CDCA1的抗體作為抗體。當(dāng)在本篩選中使用抗體時(shí)，優(yōu)選地用一種如上所述的標(biāo)記物質(zhì)對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記，并根據(jù)該標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)或測(cè)量?；蛘?，可以使用抗CDCA1或KNTC2的抗體作為第一抗體，進(jìn)而用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的第二抗體加以枱r測(cè)。而且，在本發(fā)明的篩選中與蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體可以用蛋白G或蛋白A柱加以4企測(cè)或測(cè)量?；蛘撸诒景l(fā)明篩選方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用利用細(xì)胞的雙雜交系統(tǒng)("MATCHMAKER雙雜交系統(tǒng)"，"MammalianMATCHMAKER雙雜交測(cè)定試劑盒"，"MATCHMAKER單雜交系統(tǒng)"(Clontech);"HybriZAP雙雜交載體系統(tǒng)，，(Stratagene);參考文獻(xiàn)"DaltonandTreisman,Cell68:597-612(1992)","FieldsandSternglanz,TrendsGenet10:286-92(1994)")。在雙雜交系統(tǒng)中，例如，CDCA1多肽與SRF-結(jié)合區(qū)或GAL4-結(jié)合區(qū)融合，并在酵母細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)合CDCA1多肽的KNTC2多肽與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合，并且在測(cè)試化合物的存在下也在酵母細(xì)胞中表達(dá)。或者，可以將KNTC2多肽與SRF-結(jié)合區(qū)或GAL4-結(jié)合區(qū)融合，將CDCA1多肽與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合。當(dāng)測(cè)試化合物不抑制CDCA1與KNTC2之間的結(jié)合時(shí)，兩者的結(jié)合激活報(bào)道基因，使陽性克隆可檢測(cè)。作為報(bào)道基因，除了HIS3基因之外，合適的實(shí)例包括，但不僅限于，Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、安光素酶基因等。任何測(cè)試化合物，例如細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物上清、發(fā)酵微生物產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化或粗蛋白、肽、非肽化合物、合成微分子化合物和天然化合物均可用于本發(fā)明篩選方法的內(nèi)容。本發(fā)明的測(cè)試化合物還可以用本領(lǐng)域已知的大量組合文庫方法中的任何一種獲得，包括但不僅限于(l)生物學(xué)文庫，(2)空間可尋址平行固相或溶液相文庫(spatiallyaddressableparallelsolidphaseorsolutionphaselibraries),(3)需要解巻積(deconvolution)的合成文庫方法，(4)"一珠子一化合物，，文庫方法和(5)使用親和色譜選擇的合成文庫方法。使用親和色語選擇的生物學(xué)文庫方法僅限于肽文庫，而其他4種方法適用于肽、非肽寡聚體或小分子化合物文庫(Lam，爿""c朋cwDn^i)^.12:145-67(1997))。用于分子文庫合成的方法實(shí)例可在本領(lǐng)域中找到(DeWitt&a/.，尸rac.A^/.爿cfld5W.90:6909(1993);Erbda/"Prac.Ato/.Sc/.C/5^91:11422-6(1994);ZuckermanndMedC/ze附.37:2678-85(1994);ChoWa/"5We"ce261:1303-5(1993);Carellefa/.，^wgeiuCAem./"A￡<i.33:2059(1994);Carell&^"gevu/脫￡d33:2061(1994);GallopWa/.,/MW.G/ze附.37:1233-51(1994))?；衔镂膸炜纱嬖谟谌芤?見Houghten，5z'o/rec/7"z々wes13:412-211992))或珠子(Lam，Atow354:82-4(1991》、芯片(Fodor,A^w^364:555-6(1993》、細(xì)菌(美國專利5，223，409)、孢子(美國專利5，571，698;5,403,484,和5，223，409)、質(zhì)粒(Cullda/"7Va"爿cac/.5W.C/5L489:1865-9(1992))或噬菌體(ScottandSmith,5We臟249:386-90(1990);Devlin,5We腳249:404-6(1990);Cwirlada/"尸rac.A^//.^c"dL/S487:6378-82(19卯)；Felici,JMo/.Ao/.222:301-10(1991);美國專利申請(qǐng)20020103360)。暴露于根據(jù)本發(fā)明篩選方法的細(xì)胞或蛋白質(zhì)的測(cè)試化合物可以是單種化合物或化合物的組合。當(dāng)在本發(fā)明的篩選方法中使用化合物組合時(shí)，多個(gè)化合物可以順次或同時(shí)接觸。通過本發(fā)明篩選方法分離的化合物是可抑制CDCA1和KNTC2的活性、用于治療或預(yù)防被歸于細(xì)胞增生性疾病的疾病，例如NSCLC的藥物的J美選物。由本發(fā)明篩選方法獲得的化合物中部分結(jié)構(gòu)添加刪除和/或替換而被改變的化合物，也包含在通過本發(fā)明篩選方法獲得的化合物中?？捎行б种七^度表達(dá)基因一一即CDCA1和KNTC2基因——之表達(dá)的化合物視為具有臨床效益，并可以進(jìn)一步在動(dòng)物模型或測(cè)試對(duì)象中測(cè)試其降低或防止癌細(xì)胞生長的能力。本發(fā)明還可包括篩選與CDCA1或KNTC2多肽結(jié)合從而抑制其相互作用的蛋白質(zhì)。為了達(dá)到這個(gè)目的，可以使用許多本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法。這種篩選可以用例如本領(lǐng)域熟知的方法通過例如免疫沉淀測(cè)定進(jìn)行。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用標(biāo)準(zhǔn)程序重組產(chǎn)生。例如，可以通過將編碼目的多肽的基因插入到外來基因表達(dá)載體，例如pSV2neo，pcDNAI，pcDNA3.1,pCAGGS和pCD8，在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)該基因。用于表達(dá)的啟動(dòng)子可以是通常使用的任何啟動(dòng)子，包括例如SV40早期啟動(dòng)子(RigbyinWilliamson(ed.),Gew幼'c五wgz'"eenf"g'vol.3.AcademicPress,London,83-141(1982》，EF-a啟動(dòng)子(Kim自/.，Ge"e91:217-23(1990》，CAG啟動(dòng)子(Niwa"a/.，G認(rèn)108:193(1991》，RSVLTR啟動(dòng)子(Cullen,MeAo(is/"五"zymo/ogy152:684-704(1987))，SRa啟動(dòng)子(Takebee^/"Mo/Ce〃5^/8:466-72(1988))，CMV立即早期啟動(dòng)子(SeedandAruffo,尸rac7Va//^cad5W84:3365-9(1987)),SV40晚期啟動(dòng)子(GheysenandFiers,JMo/々p/GWzd1:385-94(1982))，腺病毒晚期啟動(dòng)子(Kaufinan"a/.,Mo/CW/所o/9:946-58(1989))，HSVTK啟進(jìn)行，例如電穿孔法(Chu""/.,A^c/e/cA^fe/^15:1311-26(1987))，磷酸釣法(ChenandOkayama，Mo/Ce〃所o/7:2745-52(1987))，DEAE葡聚糖法(Lopataefa/"iVwc/e/cJczVis12:5707-17(1984);SussmanandMilman,Mo/CW/4:1641-3(1984》，Lipofectin(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑)法(DerijardB，Ce〃76:1025-37(1994);Lambefa/"胸腳G匿"cs5:22-30(1993):Rabindran&a/.,>SWewe259:230-4(1993))等等。多肽還可以表達(dá)成含有單克隆抗體識(shí)別位點(diǎn)(表位)的融合蛋白，其是通過將已顯示特異性的單克隆抗體的表位引入到多肽的N或C端實(shí)現(xiàn)的。也可以4吏用商品化的表位-抗體系統(tǒng)(五xpen'wewto/MeA"Yze13:85-90(1995))。能夠利用其多克隆位點(diǎn)表達(dá)與例如(3-半乳糖苦酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、綠色熒光蛋白(GFP)等融合的融合蛋白的載體是可商購的。本文還提供了融合蛋白，其通過僅引入由幾個(gè)到數(shù)十個(gè)氨基酸構(gòu)成的小表位制備而得，而不會(huì)由于融合而改變?cè)级嚯牡男再|(zhì)。表位以及識(shí)別它們的單克隆抗體可以用作篩選與CDCA1或KNTC2多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的表位-抗體系統(tǒng)(五x;en'we"to/Me&c/"e13:85-90(1995)),所述表位例如多聚組氨酸(His-標(biāo)簽)、流感聚集物(influenzaaggregate)HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-標(biāo)簽)、人類單純皰滲病毒糖蛋白(HSV-標(biāo)簽)、E-標(biāo)簽(單克隆噬菌體上的表位)等。在免疫沉淀中，通過將這些抗體添加到用合適去垢劑制備的細(xì)胞裂解產(chǎn)物中形成免疫復(fù)合物。免疫復(fù)合物由CDCA1或KNTC2多肽、具有該多肽結(jié)合親和力的多肽和抗體構(gòu)成。除了抗上述表位的抗體之外，免疫沉淀還能夠用抗CDCA1或KNTC2多肽的抗體進(jìn)行，這些抗體可以根據(jù)常規(guī)的方法制備，并可以是任何形式，例如單克隆或多克隆抗體，并且包括，例如，通過用多肽免疫動(dòng)物如家兔獲得的抗血清，全部類型的多克隆和單克隆抗體以及重組抗體(例如人源化抗體)。具體地，抗CDCA1或KNTC2多肽的抗體可以用本領(lǐng)域熟知的4支術(shù)制備。例如，用作抗原以獲得抗體的CDCA1或KNTC2多肽可以來源于任何動(dòng)物物種，但是優(yōu)選地來源于哺乳動(dòng)物，例如人、小鼠、家兔或大鼠，更優(yōu)選地來源于人。用作抗原的多肽可以重組產(chǎn)生或者從天然來源分離。在本發(fā)明的上下文中，用作免疫抗原的多肽可以是CDCA1或KNTC2多肽的完整蛋白或者部分肽。任何哺乳動(dòng)物均可用抗原免疫；然而，優(yōu)選地考慮與用于細(xì)胞融合的親本細(xì)胞的相容性。通常使用嚙齒目(Rodentia)，兔形目(Lagomorpha)或靈長類(Primates)動(dòng)物。嚙齒目動(dòng)物包括例如小鼠、大鼠和倉鼠(hamster)。兔形目動(dòng)物包括例如野兔(hares)、鼠兔(pikas)和家兔。靈長類動(dòng)物包括例如狹鼻猿(Catarrhini)(東半球猴(oldworldmonkey))如食蟹猴(Macacafascicularis)、恒河猴(rhesusmonkey)、狒狒(sacredbaboon)和黑猩猩(chimpanzee)。用抗原免疫動(dòng)物的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。腹腔注射或皮下注射抗原是免疫哺乳動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)方法。更具體地，抗原可以在合適量的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、生理鹽水等中稀釋和懸浮。如果希望，抗原懸浮液可以和適當(dāng)量的標(biāo)準(zhǔn)輔助劑，例如弗氏完全佐劑，混合制成乳液，然后施予哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地，隨后每4-21天施用與適當(dāng)量弗氏不完全佐劑混合的抗原數(shù)次。免疫還可以使用合適的載體。在上述免疫之后，用標(biāo)準(zhǔn)方法檢查血清中期望抗體量的增加?？笴DCA1或KNTC2多肽的多克隆抗體，可以通過從已4企查血清中期望抗體增加的免疫哺乳動(dòng)物采集血液，并通過任何常規(guī)方法從血液分離血清加以制備。多克隆抗體包括含有多克隆抗體的血清，以及從血清中分離的含有多克隆抗體的級(jí)分。免疫球蛋白G或M可以從只識(shí)別CDCA1或KNTC2多肽的組分中制備，例如使用與所述多肽偶聯(lián)的親和柱，進(jìn)一步用蛋白A或蛋白G柱純化該級(jí)分。為了制備單克隆抗體，從如上所述的用抗原免疫并檢查到血清中期望抗體的水平增加的哺乳動(dòng)物收集免疫細(xì)胞，用于細(xì)胞融合。用于細(xì)胞融合的免疫細(xì)胞優(yōu)選地從脾獲得。其他優(yōu)選用于和上述免疫細(xì)胞融合的親本細(xì)胞包括，例如，哺乳動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞，更優(yōu)選的是獲得了利用藥物選擇融合細(xì)胞所需的性質(zhì)的骨髓瘤細(xì)胞。上述的免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞可以根據(jù)已知的方法進(jìn)行融合，例如Milstein等的方法(GalfreandMilstein,M"/zo<*五wzjmo/73:3-46(1981))。通過細(xì)胞融合獲得的最終雜交瘤細(xì)胞可以通過在標(biāo)準(zhǔn)選擇培養(yǎng)基，例如HAT培養(yǎng)基(含有次黃噪呤,氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)基)上對(duì)它們進(jìn)行培養(yǎng)加以選擇。細(xì)胞培養(yǎng)典型地在HAT培養(yǎng)基上持續(xù)數(shù)天至數(shù)星期，這個(gè)時(shí)間足以使除了期望的雜交瘤細(xì)胞之外的其他細(xì)胞(非融合細(xì)胞)死亡。然后，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)有限稀釋，篩選和克隆產(chǎn)生期望抗體的雜交瘤細(xì)胞。除了上述用抗原免疫非人類動(dòng)物以制備雜交瘤細(xì)胞的方法之外，可以在體外用CDCA1或KNTC2多肽、表達(dá)這種多肽的細(xì)胞，或其裂解物免疫人淋巴細(xì)胞，例如被EB病毒感染的人淋巴細(xì)胞。然后，使被免疫的淋巴細(xì)胞與能夠無限分裂的人源骨髓瘤細(xì)胞例如U266融合，得到生產(chǎn)能夠結(jié)合CDCA1或KNTC2多肽的期望人抗體的雜交瘤(特開昭(JP-A)63-17688號(hào))。隨后可將所得雜交瘤移植到小鼠的腹腔內(nèi)，并可提取腹水。所得單克隆抗體可通過例如硫酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換色譜或偶聯(lián)有本發(fā)明任一靶蛋白(CDCA1或KNTC2多肽)的親和柱加以純化。抗體不^f又能夠用于本篩選方法，還可用于純化和4企測(cè)CDCA1或KNTC2多肽。它們可以進(jìn)一步用作目標(biāo)多肽的激動(dòng)劑或拮抗劑的候選物。此外，用作拮抗劑候選物的這類抗體可用于CDCA1或KNTC2多肽相關(guān)疾病包括下文中描述的NSCLC的抗體治療。這樣獲得的單克隆抗體還可以用基因工程技術(shù)重組制備(見例如BorrebaeckandLarrick，TherapeuticMonoclonalAntibodies,MacMillanPublishersLTD在英國出版(1990))。例如，可以從免疫細(xì)胞——例如產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細(xì)胞或免疫淋巴細(xì)胞——克隆編碼抗體的DNA,將其插入到合適的載體內(nèi)，并引入宿主細(xì)胞，制備重組抗體。這種重組抗體也可在本篩選的上下文中使用。而且，在篩選等中使用的抗體可以是抗體的片段或修飾抗體，只要它能夠結(jié)合CDCA1和KNTC2之一或兩者即可。例如，抗體片段可以是Fab,F(ab，)2，F(xiàn)v,或單鏈Fv(scFv)，其中單鏈Fv中來自于H和L鏈的Fv片段通過合適的接頭連接(Hustonda/"尸rac7VaWJcad85:5879-83(1988))。更具體地，抗體片段可以用酶(例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)處理抗體而產(chǎn)生?；蛘?，可以構(gòu)建編碼抗體片段的基因，將其插入表達(dá)載體內(nèi)，并且在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)(見例如CoWa/.,152:2968-76(1994);BetterandHorwitz,五"z;;附o/178:476-96(1989);PluckthimandSkerra，AfeAo<iy￡wz_ywo/178:497-515(1989);Lamoyi，A/^/zo<is￡>72ymo/121:652-63(1986);Rousseauxa/"MeAoA五"z少附o/121:663-9(1986);BirdandWalker,7>e"A5/ofec/wo/9:132-7(1991))?？贵w可以通過與各種分子例如聚乙二醇(PEG)偶聯(lián)而加以修飾。修飾抗體可以通過抗體的化學(xué)修飾獲得。這些修飾方法是本領(lǐng)域的常規(guī)方法。區(qū)之間形成的嵌合抗體，或者作為由來源于非人抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)、來源于人抗體的框架區(qū)(FR)和恒定區(qū)構(gòu)成人源化抗體而獲得。這類抗體可以用已知的技術(shù)制備。人源化可以用嚙齒動(dòng)物CDRs或CDR序列替換人抗體的相應(yīng)序列(見例如Verhoeyene/5We"ce239:1534-6(1988))來實(shí)施。因此，這樣的人源化抗體是嵌合抗體，其中實(shí)質(zhì)上小于完整人可變域的部分被來自非人物種的相應(yīng)序列所取代。也可以使用由人可變區(qū)以及人框架和恒定區(qū)構(gòu)成的完全人抗體。這類抗體可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)產(chǎn)生。例如，體外方法涉及使用展示于噬菌體上的人抗體片^爻重組文庫(例如，Hoogenboom&Winter,JMo/.5z'o/.227:381-8(1992))。類似地，可以通過將人免疫王求蛋白座位引入到內(nèi)源免疫球蛋白基因部分或完全失活的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物例如小鼠中來制備人抗體。這種方法在例如美國專利Nos.6，150，584，5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016中有描述?？蓪⑷缟纤玫目贵w純化到均質(zhì)。例如，抗體的分離和純化可根據(jù)用于一般蛋白質(zhì)的分離和純化方法。例如，可以適當(dāng)選擇和組合柱色譜法如親和色譜、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦等來分離和4是純4元體(Antibodies:ALaboratoryManual.EdHarlowandDavidLane,ColdSpringHarborLaboratory(1988));然而，本發(fā)明并不僅限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作親和柱。使用的蛋白A柱的實(shí)例包括例如HyperD,POROS和SepharoseF.F.(Pharmacia)。除親和柱之外的色譜實(shí)例包括例如離子交換色語、疏水色譜、凝膠過濾、反相色i普、吸附色譜等(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual.EdDanielR.Marshakda/"ColdSpringHarborLaboratoryPress(1996))。色譜程序可以通過液相色譜，例如HPLC和FPLC來實(shí)施。當(dāng)抗體是小鼠IgG抗體時(shí)，可以用例如蛋白Asepharose或蛋白Gsepharose沉淀免疫復(fù)合物。如果CDCA1或KNTC2多肽被制備成具有表位例如GST的融合蛋白，則可以用特異結(jié)合這些表位的物質(zhì)例如谷胱甘肽-Sepharose4B，，按照與使用抗CDCA1或KNTC2多肽抗體相同的方式形成免疫復(fù)合物。免疫沉淀可以遵循或根據(jù)例如文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行(HarlowandLane,Antibodies,511-52,ColdSpringHarborLaboratorypublications,NewYork(1988))。免疫沉淀后的蛋白質(zhì)通常用SDS-PAGE來分析，可以用合適濃度的凝膠根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量來分析結(jié)合的蛋白質(zhì)。因?yàn)榕cCDCA1或KNTC2多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)難以用常規(guī)的染色方法例如考馬斯藍(lán)染色或銀染色來檢測(cè)，所以，通過在含有放射性同位素"S-甲硫氨酸或"S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，標(biāo)記細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，然后^r測(cè)該蛋白質(zhì)，可以提高蛋白質(zhì)檢測(cè)的靈敏度。當(dāng)?shù)鞍椎姆肿恿恳阎獣r(shí)，可以從SDS-聚丙烯酰胺凝膠直接純化出靶蛋白，并可確定其序列。與CDCA1或KNTC2多肽結(jié)合的化合物也可以用親和色譜篩選。例如，可以將CDCA1或KNTC2多肽固定在親和柱的載體上，并向柱上施加測(cè)試化合物。本文中的測(cè)試化合物可以是例如細(xì)胞提取物、細(xì)胞裂解物等。加載測(cè)試化合物之后，清洗柱，然后可制備與CDCA1或KNTC2多肽結(jié)合的化合物。當(dāng)測(cè)試化合物是蛋白質(zhì)時(shí)，分析所得蛋白質(zhì)的氨基酸序列，根據(jù)該序列合成寡DNA，并用該寡DNA作為探針對(duì)cDNA文庫進(jìn)行篩選，從而獲得編碼該蛋白質(zhì)的DNA。利用表面等離子體共振現(xiàn)象的生物傳感器也可用作檢測(cè)或定量本發(fā)明結(jié)合化合物的手段。在使用這種生物傳感器時(shí)，其只需用微量的多肽，并且無需標(biāo)記(例如BIAcore，Pharmacia),即可以根據(jù)表面等離子體共振信號(hào)實(shí)時(shí)地觀察CDCA1或KNTC2多肽與測(cè)試化合物之間的相互作用。因此，有可能用生物傳感器例如BIAcore來評(píng)估CDCA1或KNTC2多肽與測(cè)試化合物之間的結(jié)合。當(dāng)使固定化的CDCA1或KNTC2多肽暴露于合成化合物或天然物質(zhì)庫(naturalsubstancebanks)或隨機(jī)喧菌體肽展示文庫(randomphagepeptidedisplaylibrary)時(shí)，篩選結(jié)合分子的方法，以及使用基于組合化學(xué)技術(shù)的高通量來分離與CDCA1或KNTC2蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)乃至化合物(包括激動(dòng)劑和拮抗劑)的篩選方法(Wrightonetal"Science273:458-64(1996);Verdine,Nature384:11-13(1996);Hogan,Nature384:17-9(1996))，是本領(lǐng)域技術(shù)人員/>知的。個(gè)體的基因組構(gòu)成的差異可導(dǎo)致他們代謝各種藥物的相對(duì)能力產(chǎn)生差異。在受試者體內(nèi)被代謝后起抗NSCLC物質(zhì)作用的化合物，可以通過誘導(dǎo)受試者細(xì)胞中的基因表達(dá)圖式從癌性狀態(tài)特征改變?yōu)榉前┬誀顟B(tài)的基因表達(dá)圖式，來顯示出自身的存在。因此，本文公開的差別表達(dá)的CDCA1或KNTC2基因，使得通過在來自選定受試者的測(cè)試細(xì)胞(或測(cè)試細(xì)胞群體)中測(cè)試候選化合物，選擇特異性適合于受試者的假定治療性或預(yù)防性NSCLC抑制劑成為可能。為了鑒定適合于特殊受試者的抗NSCLC物質(zhì)，使來源于受試者的測(cè)試細(xì)胞或測(cè)試細(xì)胞群體暴露于治療劑，并確定CDCA1或KNTC2基因中一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)。測(cè)試細(xì)胞或測(cè)試細(xì)胞群體包含表達(dá)CDCA1或KNTC2基因的NSCLC細(xì)胞。優(yōu)選地，測(cè)試細(xì)胞或測(cè)試細(xì)胞群體包括肺細(xì)胞。例如，可以在候選試劑的存在下溫育測(cè)試細(xì)胞或測(cè)試細(xì)胞群體，測(cè)量測(cè)試細(xì)胞或測(cè)試細(xì)胞群體的基因表達(dá)圖式，并與一種或多種參考模式，例如NSCLC參考表達(dá)模式或非NSCLC參考表達(dá)模式進(jìn)行比較。測(cè)試細(xì)胞或測(cè)試細(xì)胞群體中CDCA1或KNTC2的表達(dá)比含有NSCLC的參考細(xì)胞群體降低，表明所述物質(zhì)治療有效。治^減豫銀A^CZC的才法本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于治療、減輕或預(yù)防受試者NSCLC的方法。治療化合物可以預(yù)防性或治療性施加給患有NSCLC或者有風(fēng)險(xiǎn)(或者易于)發(fā)生NSCLC的受試者。這些受試者用標(biāo)準(zhǔn)臨床方法或者通過4企測(cè)CDCA1或KNTC2基因或多肽的異常表達(dá)水平或活性加以鑒定。預(yù)防性給藥發(fā)生在該疾病顯現(xiàn)出明顯的臨床癥狀之前，從而疾病或紊亂被阻止或其進(jìn)展被延遲。本發(fā)明方法包括降低一種或多種基因的基因產(chǎn)物的表達(dá)或功能，或者表達(dá)和功能，其中所述基因在NSCLC細(xì)胞中相比于與NSCLC源自相同組織類型的正常細(xì)胞表達(dá)異常增加。表達(dá)可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法加以抑制。例如，可以用有效量的可降低受試者體內(nèi)CDCA1或KNTC2基因量的化合物處理受試者。化合物的施用可以是系統(tǒng)的或者是局部的。這類治療化合物包括降低NSCLC細(xì)胞中內(nèi)源存在基因的表達(dá)水平的化合物(即下調(diào)CDCA1或KNTC2基因表達(dá)的化合物)。這類治療化合物的施用對(duì)抗受試者NSCLC細(xì)胞中異常過度表達(dá)基因的效應(yīng)，并預(yù)期可改善受試者的臨床狀況。這類化合物可以通過上述的本發(fā)明篩選方法獲得?；蛘撸赏ㄟ^向受試者施用抑制或拮抗過度表達(dá)基因表達(dá)的核酸來抑制CDCA1或KNTC2的表達(dá)。可以使用干擾過度表達(dá)基因表達(dá)的反義寡核苷酸、siRNA或核酶來抑制過度表達(dá)基因的表達(dá)。如上文指出的，相應(yīng)于CDCA1或KNTC2基因任一核苷酸序列的反義寡核苷酸可用于降低基因的表達(dá)水平。相應(yīng)于在NSCLC中上調(diào)的CDCA1或KNTC2基因的反義寡核苷酸可用于治療或預(yù)防NSCLC。針對(duì)這些基因的反義寡核苷酸可以如下起作用這些基因編碼的任一相應(yīng)多肽，或相應(yīng)的mRNA，從而抑制所述基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進(jìn)mRNA降解，和/或抑制CDCA1或KNTC2核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)，最終抑制這些蛋白的功能。這里使用的術(shù)語"反義寡核苷酸"包括與靶序列完全互補(bǔ)的核苷酸和具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸錯(cuò)配的核苷酸，只要該反義寡核苷酸能夠與該靶序列特異雜交即可。例如，本發(fā)明的反義寡核苷酸包括與CDCA1或KNTC2基因的任意核苷酸序列在至少15個(gè)連續(xù)核苷酸至全長序列的范圍內(nèi)有至少70%或者更高，優(yōu)選地至少80%或者更高，更優(yōu)選地至少90%或者更高，甚至更優(yōu)選地至少95%或者更高的同源性(也稱作序列同一性)的多核苷酸。可以使用本領(lǐng)域已知的算法確定同源性。而且，反義寡核苷酸的衍生物或修飾產(chǎn)物也可以用作本發(fā)明中的反義寡核苷酸。這類修飾產(chǎn)物的實(shí)例包括膦酸低級(jí)烷基酯修飾(loweralkylphosphonatemodifications),例如膦酸曱酯類型或膦酸乙酯類型，硫代磷酸酯(phosphorothioate)修飾和氨基磷酸鹽(phosphoroamidate)修飾。本發(fā)明的siRNA分子還可以通過其與來自本文中^^開基因的mRNA或cDNA特異性雜交的能力加以定義。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語"雜交"和"特異雜交"可互換使用，表示兩個(gè)核酸分子在"嚴(yán)緊雜交條件下"雜交的能力。短語"嚴(yán)緊雜交條件"是指這樣的條件，在該條件下，典型地在核酸的復(fù)交。嚴(yán)緊條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境下會(huì)不同。越長的序列在越高的溫度發(fā)生特異性雜交。在下列文獻(xiàn)中可找到核酸雜交的詳細(xì)指導(dǎo)Tijssen，T^c/zw/《wey5/oc/ew^^vA/o/ec"/"r5/o/o<gy--^;6n't//za//oww/f/zjVwc/e/c"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)。一般地，嚴(yán)緊條件選擇比限定的離子強(qiáng)度pH下特定序列的熱解鏈溫度(Tm)低大約5-10°C。Tm是這樣的溫度(在限定的離子強(qiáng)度，pH和核濃度)，在該溫度平衡狀態(tài)時(shí)50%的與靶序列互補(bǔ)的探針與靶序列雜交(因?yàn)榘行蛄羞^量存在，因此在Tm時(shí)，50%的探針被占據(jù))。嚴(yán)緊條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑如曱酰胺實(shí)現(xiàn)。為了選擇性或特異性雜交，陽性信號(hào)至少是背景的2倍，優(yōu)選地是背景雜交的10倍。嚴(yán)緊雜交條件的實(shí)例包括下列50%曱酰胺、5xSSC和l。/。SDS，42。C溫育，或者5xSSC、1%SDS,65。C溫育，在50。C0.2xSSC、和0.1。/。SDS中清洗。反義寡核苷酸及其衍生物通過下述方式作用于產(chǎn)生由CDCA1或KNTC2基因編碼的蛋白質(zhì)的細(xì)胞，其是通過與編碼該蛋白質(zhì)的DNA或mRNA結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進(jìn)mRNA的降解和抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的抑制。材料摻混，制成外用制劑，例如搽劑或罨劑。本發(fā)明的反義寡核苷酸抑制至少一種由CDCA1或KNTC2基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而可用于抑制各自蛋白質(zhì)的生物活性。抑制過度表達(dá)基因一種或多種基因產(chǎn)物的多核苷酸還包括小干擾RNA(siRNA),其由核苷酸序列的有義鏈核酸和反義鏈核酸的組合構(gòu)成，其中所述核苷酸序列編碼由CDCA1或KNTC2基因編碼的過度表達(dá)蛋白質(zhì)。術(shù)語"siRNA"指阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。將siRNA引入細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括其中DNA是RNA轉(zhuǎn)錄模板的技術(shù)，可用于本發(fā)明的治療或預(yù)防中。構(gòu)建siRNA使得單個(gè)轉(zhuǎn)錄物同時(shí)具有靶基因的有義和互補(bǔ)反義序列，例如發(fā)夾。使用該方法抑制CDCA1或KNTC2基因表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞中的基因表達(dá)。siRNA與靶細(xì)胞中CDCA1或KNTC2基因的轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生的CDCA1或KNTC2蛋白減少。寡核苷酸的長度至少為10個(gè)核苷酸，并可以和天然存在的轉(zhuǎn)錄物一樣長。優(yōu)選地，寡核苷酸的長度為大約75、大約50或大約25個(gè)核苷酸。更優(yōu)選地，寡核苷酸的長度小于大約19-大約25個(gè)核苷酸。本發(fā)明使用的優(yōu)選siRNA具有通式5，-[A]-間-[A，]-3，，其中[A]是相應(yīng)于CDCA1或KNTC2基因的靶序列的核糖核苷酸序列；[B]是由大約3-23個(gè)核苦酸構(gòu)成的核糖核苷酸序列；[A，]是與[A]互補(bǔ)的核糖核苷酸序列。本文中，短語"CDCA1或KNTC2基因的靶序列"指在引入到NSCLC細(xì)胞系中時(shí)有效抑制細(xì)胞生存能力的序列。優(yōu)選的siRNA是降低KNTC2基因表達(dá)的siRNA，其中該siRNA在有義鏈中具有SEQIDNO:9的核苷酸序列。該siRNA具有通式5，-[A]-[B]-[A,]-3，，其中[A]是相應(yīng)于SEQIDNO:9的核糖核苷酸序列；[B]是由3-23個(gè)核苷酸構(gòu)成的核糖核苷酸序列；和[A，]是與[A]互補(bǔ)的核糖核香酸序列。而且，siRNA的核苷酸序列可以用siRNA設(shè)計(jì)計(jì)算機(jī)程序加以設(shè)計(jì)，該程序可以從Ambion網(wǎng)站獲得Qittp:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNAfinder.html)。siRNA的核香酸序列可以根據(jù)如下的方案由計(jì)算機(jī)程序選擇選擇siRNA耙點(diǎn)1.從轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼子開始向下游掃描AA二核芬酸序列。記錄每個(gè)AA的出現(xiàn)及其3，側(cè)相鄰的19個(gè)核苷酸作為潛在siRNA靶點(diǎn)。Tuschl等在TargetedmRNAdegradationbydouble-strandedRNA/"W&o.Ge"^Dev13(24):3191-7(1999)中不推薦針對(duì)5，和3'非翻譯區(qū)(UTR)以及鄰近起始密碼子的區(qū)域(75堿基之內(nèi))設(shè)計(jì)siRNA，因?yàn)檫@里可能富含調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，因此針對(duì)這些區(qū)域設(shè)計(jì)的核酸內(nèi)切酶和siRNA的復(fù)合物可能會(huì)干擾UTR結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù)合物的結(jié)合。2.將潛在靶點(diǎn)與合適的基因組數(shù)據(jù)庫(人、小鼠、大鼠等)進(jìn)行比較，將任何與其他編碼序列有顯著同源性的靶序列排除出考慮之外?？梢允褂肂LAST(AltschulSF，e/.a/.,NucleicAcidsRes.1997;25:3389-402;JMolBiol.19卯;215:403-10.)進(jìn)行同源性搜索，其可見于NCBI服務(wù)器www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。3.選擇合格的靶序列用于合成。在Ambion網(wǎng)站上，可以沿著待評(píng)估的基因的長度選擇幾個(gè)優(yōu)選的靶序列?？梢岳棉D(zhuǎn)染表達(dá)本發(fā)明siRNA多核苷酸的載體抑制NSCLC細(xì)胞的生長。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供由有義鏈和反義鏈構(gòu)成的雙鏈分子，該分子起CDCA1或KNTC2的siRNA的作用，還提供了編碼該雙鏈分子的載體。本發(fā)明的雙鏈分子包括有義鏈和反義鏈，其中有義鏈?zhǔn)窍鄳?yīng)于CDCA1或KNTC2靶序列的核糖核苷酸序列，并且其中反義鏈?zhǔn)桥c所述有義鏈互補(bǔ)的核糖核苷酸序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈相互雜交形成雙鏈分子，抑制所述基因的表達(dá)。本發(fā)明的雙鏈分子可以是得自于其原始環(huán)境(若其是天然存在的分子，即為自然環(huán)境)的多核苷酸，從其自然狀態(tài)發(fā)生物理或化學(xué)改變的多核苷酸，或者化學(xué)合成的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，這類雙鏈分子包括由DNA、RNA及其衍生物構(gòu)成的分子。DNA適當(dāng)?shù)赜蓧A基如A、T、C和G構(gòu)成，在RNA中T被替換為U。在合適細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。例如，通過將本發(fā)明雙鏈分子的編碼序列克隆到含有例如來自于小核RNA(snRNA)U6的RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄單元或者人H1RNA啟動(dòng)子的載體中，可以使它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄?；蛘撸据d體可以這樣制備例如將靶序列克隆到表達(dá)載體內(nèi)，使目標(biāo)序列與載體的調(diào)節(jié)序列可操作連接從而允許其表達(dá)(DNA分子轉(zhuǎn)錄)(Lee,N.S."a/.，iVflfwe說ofec/2"o/ogy20:500-5(2002))。例如，具有草巴序列之反義序列的RNA分子的轉(zhuǎn)錄可以由第一啟動(dòng)子(例如與克隆DNA的3，端連接的啟動(dòng)子序列)驅(qū)動(dòng)，而具有靶序列之有義序列的RNA分子可以由第二啟動(dòng)子(例如與克隆DNA的5'端連接的啟動(dòng)子序列)驅(qū)動(dòng)。表達(dá)的有義和反義鏈在體內(nèi)相互雜交產(chǎn)生siRNA構(gòu)建體，以沉默含有靶序列的基因。而且，可以使用兩種構(gòu)建體(載體)分別產(chǎn)生siRNA構(gòu)建體的有義和反義鏈。為了將載體引入到細(xì)胞內(nèi)，可以使用轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑。FuGENE6(Rochediagnostice),Lipofectamine2000(Invitrogen),Oligofectamine(Invitrogen)和Nucleofector(WakopureChemical)可用作轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑。抑制過度表達(dá)基因一種或多種基因產(chǎn)物的核酸還包括針對(duì)這些基因的核酶。在本發(fā)明的上下文中，核酶抑制過度表達(dá)CDCA1或KNTC2蛋白的表達(dá)，借此可用于抑制該蛋白質(zhì)的生物活性。因此，由這種核酶構(gòu)成的組合物可用于治療或者預(yù)防NSCLC。一般地，核酶分成大核酶和小核酶。大核酶已知是切割核酸的磷酸酯鍵的酶。在與大核酶反應(yīng)后，反應(yīng)位點(diǎn)由5，-磷酸和3，-羥基構(gòu)成。大核酶進(jìn)一步分成(l)I型內(nèi)含子RNA，催化5，-剪接位點(diǎn)上鳥嘌呤核苷的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)；(2)1I型內(nèi)含子RNA,催化通過套索結(jié)構(gòu)進(jìn)行的兩步自剪接；和(3)核糖核酸酶的RNA組分，其通過水解在5'位點(diǎn)剪切tRNA前體。另一方面，小核酶與大核酶相比具有更小的尺寸(大約40bp),它們切割RNA產(chǎn)生5，-羥基和2，-3，環(huán)磷酸。錘頭型核酶(Koizumi&a/.,i^^S丄e仗228:225(1988))和發(fā)夾型核酶(Buzayan，他組e323:349(1986);KikuchiandSasaki，A^c/e/c爿c油7&s.19:6751(1991))屬于小核酶。設(shè)計(jì)和構(gòu)建核酶的方法在本領(lǐng)域是已知的(見Koizumiefa/.,FE5S228:225(1988》Koizumi"/.，7V"c/e/c17:7059-71(1989);KikuchiandSasaki,7Vwc/e/cJc/&Was.19:6751-5(1991))，并且可以基于編碼CDCA1或KNTC2蛋白的核苷酸序列的序列信息，根據(jù)常規(guī)核酶產(chǎn)生方法構(gòu)建抑制過度表達(dá)NSC蛋白表達(dá)的核酶?；蛘?，可以通過施用與基因產(chǎn)物結(jié)合或以其它方式抑制其功能的化合物，來抑制過度表達(dá)基因的一種或多種基因產(chǎn)物的功能。這種化合物的實(shí)例是與過度表達(dá)的一種或多種基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。本發(fā)明涉及抗體的用途，特別是針對(duì)由上調(diào)基因CDCA1或KNTC2中任何一種編碼的蛋白質(zhì)的抗體或者這種抗體的片段的用途。如這里使用的，術(shù)語"抗體"指具有特異結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白分子，其特異性地與含有合成該抗體所用抗原的分子(即上調(diào)基因產(chǎn)物)，或者與其緊密相關(guān)的抗原相互作用(結(jié)合)。結(jié)合過度表達(dá)的CDCA1或KNTC2核苷酸的抗體可以是任何形式，例如單克隆或多克隆抗體，包括用多肽免疫動(dòng)物例如家兔獲得的抗血清、所有類型的多克隆和單克隆抗體、人抗體或通過基因重組產(chǎn)生的人源化抗段或修飾抗體，只要其結(jié)合由標(biāo)志基因(CDCA1或KNTC2基因)編碼的一種可以經(jīng)過修飾，包括化學(xué)修飾抗體和嵌合抗體。這類抗體和抗體片段可以根據(jù)上述的方法獲得(同上文)。若所得抗體要施用給人體(抗體治療)，優(yōu)選地使用人抗體或人源化抗體，以降低免疫原性。例如，可以用抗原如CDCA1或KNTC2多肽、表達(dá)該多肽的細(xì)胞、或其裂解物對(duì)具有人抗體基因庫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行免疫。然后從動(dòng)物收集抗體產(chǎn)生細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞，由它可以制備針對(duì)該多肽的人抗體(見WO92-03918,WO94-02602，W094-25585,W096-33735和WO96-34096)?；蛘?，可以利用癌基因使產(chǎn)生抗體的免疫細(xì)胞，例如免疫淋巴細(xì)胞永生化，并將其用于制備單克隆抗體。本發(fā)明提供了使用針對(duì)過度表達(dá)CDCA1或KNTC2多肽的抗體治療或預(yù)防NSCLC的方法。才艮據(jù)本方法，施用藥物有效量的針對(duì)CDCA1或KNTC2多肽的抗體。針對(duì)過度表達(dá)CDCA1或KNTC2多肽的抗體的施用劑量足以降低CDCA1或KNTC2蛋白的活性?；蛘?，可以使用結(jié)合腫瘤細(xì)胞特異性細(xì)胞表面標(biāo)志的抗體作為藥物遞送工具。這樣，例如，可以施用與細(xì)胞毒劑偶聯(lián)的針對(duì)過度表達(dá)CDCA1或KNTC2多肽的抗體，施用的劑量足以損害腫瘤細(xì)胞。此外，本文中公開的蛋白質(zhì)的顯性失活突變體可用于治療或預(yù)防NSCLC。例如，本發(fā)明^提供了通過施用具有顯性失活效應(yīng)的CDCA1突變體或編碼這種突變體的多核苦酸治療或預(yù)防受試者中NSCLC的方法。CDCA1突變體可包括含有KNTC2結(jié)合區(qū)的氨基酸序列，而不含有其nuf2域。CDCA1突變體可以具有SEQIDNO:35的氨基酸序列。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，CDCA1突變體與膜轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)連接。若干肽序列轉(zhuǎn)位進(jìn)入活細(xì)胞的能力已經(jīng)得到表征，并可用于本發(fā)明的這個(gè)目的。這類膜轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)(典型地是肽)是根據(jù)它們內(nèi)化后到達(dá)活細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)區(qū)室和/或細(xì)胞核區(qū)室的能力定義的?？勺鳛檗D(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)來源的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括HIVTat4爭(zhēng)錄ilU舌子1、2、果蟲|)(1>01//7//0附e/awogos/er)專爭(zhēng)錄因子Antennapedia3。此外，使用了具有轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的非天然肽。這些肽典型地是小肽，它們被轉(zhuǎn)位測(cè)試的膜相互作用性質(zhì)是已知的。K-成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)分泌信號(hào)序列中的疏水區(qū)、毒液毒素mastoparan(transportan)13、和Buforin114(—種兩棲動(dòng)物抗微生物肽)已顯示可以用作轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)。關(guān)于本發(fā)明有用的轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)的綜述見Joliot"a/.7V"加reCW/所o/ogy6:189-196(2004)。CDCA1突變體可具有通式[R]-[D]，其中[R]是膜轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，[D]是具有SEQIDNO:35所示氨基酸序列的多肽。在通式中，[R]可以直接與[D]相連，或者通過接頭(linker)與[D]間接相連。連接子可以使用具有多功能基團(tuán)的肽或化合物。具體地講，可以使用-GGG-氨基酸序列作用連接子。或者，膜轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)和具有SEQIDNO:35氨基酸序列的多肽可以結(jié)合在微顆粒(micro-particle)的表面。在本發(fā)明中，[R]可以和[D]的任意區(qū)域(arbitralregion)連接。例如，[R]可以和[D]的N端或C端連接，或者構(gòu)成[D]的氨基酸之側(cè)鏈連接。而且，多個(gè)[R]分子也可以和一個(gè)[D]分子連接。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)[R]分子可以和[D]的不同位點(diǎn)連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，[D]可以被連接在一起一些[R]的所修飾。膜轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)可以由下選擇[聚精氨酸];Matsushita,M.aa/,JNeurosci.21，6000-6007(2003).[Tat/RKKRRQRRR]SEQIDNO:37;Frankel，A."a/,Cell55,1189-93(1988).Green,M.&Loewenstein,P.M.Cell55,1179-88(1988).Penetratin[RQIKIWFQNRRMKWKK]SEQIDNO:38;Derossi，D.""/，J.Biol.Chem.269,10444-50(1994).BuforinII[TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK]SEQIDNO:39;Park,C.B.da/.Proc.NatlAcad.Sci.USA97,8245-50(2000).Transportan[GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL]SEQIDNO:40;Pooga,M.da/.FASEBJ.12，67-77(1998).MAP(模型兩親肽)[KLALKLALKALKAALKLA]SEQIDNO:41;Oehlke，J.e/a/.Biochim.Biophys.Acta.1414，127-39(1998).K畫FGF[AAVALLPAVLLALLAP]SEQIDNO:42;Lin,Y.Z.da/.J.Biol.Chem.270,14255-14258(1995).Ku70[VPMLK/SEQIDNO:43;Sawada，M.a/.NatureCellBiol.5,352-7(2003).Ku70[PMLKE/SEQIDNO:50;Sawada,M.aNatureCellBiol.5,352-7(2003).朊病毒(Prion)[MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP]SEQIDNO:44;Lundberg，Rda/.Biochem.Biophys.Res.Co醒im.299,85-90(2002).pVEC[LLIILRRRIRKQAHAHSK]SEQIDNO:45;Elmquist，A."a/.Exp.CellRes.269,237-44(2001).Pep-1[KETWWETWWTEWSQPKKKRKV]SEQIDNO:46;Morris,M.C."a/.NatureBiotechnol.19，1173-76(2001).SynBl[RGGRLSYSRRRFSTSTGR]SEQIDNO:47;Rousselle,C.&a/.Mol.Pharmacol.57,679-86(2000).Pep-7[SDLWEMMMVSLACQY]SEQIDNO:48;Gao,C."a/.Bioorg.Med.Chem,10,4057-65(2002).麗-1[TSPLNI麗GQKL]SEQIDNO:49.Hong，F(xiàn).D.&Clayman,G.L.CancerRes.60，6551-6(2000).在本發(fā)明中，構(gòu)成聚精氨酸的精氨酸殘基數(shù)目沒有限制。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，可以有5-20個(gè)連續(xù)的精氨酸殘基。在優(yōu)選實(shí)施方案中，聚精氨酸中精氨酸殘基的數(shù)目是11(SEQIDNO:36)。如這里所用的，短語"CDCA1的顯性失活片段"是指能夠與KNTC2形成復(fù)合物(complexing)的CDCAl突變型。因此，顯性失活片段是與全長CDCAl多肽在功能上不等價(jià)的片段。優(yōu)選的顯性失活片段是包含KNTC1結(jié)合區(qū)，而不含其nuf2域的顯性失活片段。本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防NSCLC的組合物，其包括通過本發(fā)明篩選方法選擇的、改變CDCA1或KNTC2基因的表達(dá)或活性的化合物。這種活性成分還可以是針對(duì)該基因的反義寡核苷酸、siRNA或核酶，或者反義寡核芬酸、siRNA或核酶的衍生物，例如表達(dá)載體，如上文所述。當(dāng)施用通過本方法的篩選方法分離的化合物作為人類和其他動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、狗、羊、豬、牛、猴、狒狒或黑猩猩，的藥物，治療細(xì)胞增殖性疾病(例如非小細(xì)胞肺癌)時(shí)，分離的化合物可以直接施用或者用常規(guī)的藥物制備方法制成一定劑型的制劑。本組合物的這類藥物制劑包括適合于口服、直腸、鼻、局部(包括口腔和舌下)施用，陰道或非消化道(包括肌肉內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi))或者通過吸入或吹入法施用的制劑。制劑可以任選地包裝成離散的劑量單元。適于口服施用的藥物制劑包括膠嚢劑、扁嚢劑(cachet)或片劑，它們各自含有一定量的活性成分。適合的制劑還包括粉末、顆粒、溶液、懸浮液和乳液。活性成分任選以大丸藥糖劑(boluselectuary)或糊劑(paste)的形式施用。用于口服給藥的片劑和膠嚢劑可含有常規(guī)賦形劑諸如粘合劑、填充劑、潤滑劑、崩解劑或濕潤劑。片劑可通過壓縮或成型來制備，任選與一種或多種配方成分壓縮或成型。壓縮片劑可通過如下方法制備將自由流動(dòng)形式的活性成分，如粉末或顆粒，任選與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、潤滑劑、表面活性劑和/或分散劑混合，在適當(dāng)?shù)臋C(jī)器中進(jìn)行壓縮。成型片劑可通過如下方法制備在適當(dāng)?shù)臋C(jī)器中對(duì)利用惰性液體稀釋劑濕潤的粉末化合物的混合物進(jìn)行成型。所述片劑可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行包衣(coated)。口服液體制備物可以是例如水性或油性的懸濁液、溶液、乳液、糖漿或酏劑的形式；或者也可以作為干燥產(chǎn)物提供，在使用前用水或其它適宜溶媒來構(gòu)成。所述液體制備物可含有常規(guī)添加劑諸如懸浮劑，乳化劑，非水性溶媒(可包括食用油)和/或防腐劑。片劑可任選地配制以提供其中活性成分的緩釋或控釋。片劑的包裝中可以包含每月服用的一片藥物。示例性的供非消化道施用的制劑包括水性和非水性的無菌注射溶液，其中任選地含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑(bacteriostat)和使得制劑與預(yù)期接受者的血液等張(isotonic)的溶質(zhì)；以及水性和非水性的無菌懸浮液，包括但不限于懸浮劑和增稠劑。所述制劑可以提供為單位劑量或多次劑量容器，例如密封的安瓿和小瓶；還可以在冷凍-干燥(凍干的)條件下保存，僅需要在即將使用前添加無菌液體載體例如鹽水、注射用水?；蛘?，可提供所述制劑用于連續(xù)輸注(continuousinfusion)?？梢詮那笆龇N類的無菌并分末、顆粒及片劑制備即配即用的注射溶液和懸浮液。示例性的直腸施用制劑包括含有標(biāo)準(zhǔn)載體如可可脂或聚乙二醇的栓劑(suppository)。用于口內(nèi)局部給藥，例如口腔或舌下給藥的制劑包括錠劑(lozenge)和軟錠劑(pastille),其中錠劑在調(diào)味基質(zhì)，如蔗糖和阿拉伯膠(acacia)或黃蓍膠中包含活性成分，而軟錠劑在基質(zhì)，如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠中包含活性成分。對(duì)于活性成分的鼻內(nèi)給藥，可以使用液體噴霧劑、可分散粉末，或滴鼻劑(drops)的形式。滴鼻劑可用水性或非水性基質(zhì)配制，該基質(zhì)中也含有一種或多種分散劑、增溶劑和/或懸浮劑。吸入給藥時(shí)，可以由吹入器、霧化器、加壓包裝(pressurizedpack)或其它便利的氣溶膠噴霧遞送裝置方便地遞送組合物。氣溶膠包裝可含有適宜的噴射劑，如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適宜氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可通過提供閥門輸送計(jì)量量(meteredamount)來確定劑量單位?；蛘?，對(duì)于通過吸入或吹入給藥，組合物可以采用干粉組合物的形式，例如活性成分與合適粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉末組合物可以裝入例如膠嚢、藥筒、膠或發(fā)泡包裝(blisterpack)中以單位劑量的形式提供，可以在吸入器或吹入器的幫助下從它們中施用粉末。其他合適的制劑包括釋放治療劑的可植入裝置和貼片。如果期望，可調(diào)適上述制劑以提供活性成分的穩(wěn)定釋放。藥物組合物還可以包含其他的活性成分，包括但不限于，抗微生物劑、免疫抑制劑和防腐劑。應(yīng)當(dāng)理解，除了上文特別提到的成分之外，本發(fā)明的制劑還可以包括與該制劑類型有關(guān)的其他本領(lǐng)域常規(guī)物質(zhì)；例如適合于口服給藥的制劑可以包含增味劑。優(yōu)選的單位劑型含有如下文記載的有效量的活性成分或者其適當(dāng)?shù)牟糠?。?duì)于前述的每種條件，組合物，例如多肽和有機(jī)化合物，可以按照大約0.1-大約250mg/kg/天的劑量口服或注射給藥。成人的劑量范圍一般為大約5mg-大約17.5g/天，優(yōu)選地大約5mg-大約10g/天，最優(yōu)選地大約100mg-大約3g/天。片劑或其它以分散單元提供的單位劑型可適宜地含有這樣的量，該量在該劑量條件下為有效量，或者在多個(gè)該劑量條件下為有效量；例如，單位劑型含有約5mg-約500mg,通常為約100mg-約500mg的單位。所用劑量將取決于多種因素，包括受試者的年齡和性別，治療的確切病癥和嚴(yán)重程度。同時(shí)，給藥途徑也可隨病癥和嚴(yán)重程度而改變。如上所述，本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于治療或預(yù)防NSCLC的組合物，其含有抑制過度表達(dá)基因表達(dá)的活性成分。該活性成分可以通過與對(duì)于該衍生物無活性的適當(dāng)基質(zhì)材料摻混，制成外用制劑，例如搽劑或罨劑。另外，如果需要，活性成分可以通過添加賦形劑、等滲劑、增溶劑、防腐劑、止痛劑等配制成片劑、粉末、顆粒、膠嚢、脂質(zhì)體膠嚢、注射劑、溶液、滴鼻劑和凍干劑。其制備可以根據(jù)制備含核酸藥物的常規(guī)方法。優(yōu)選地，反義寡核苦酸書1"生物、siRNA書f生物或核酶書f生物通過直接施用到患病部位或者通過注射入血管從而達(dá)到患病部位而施加給患者。在組合物中還可以使用封固劑(mountingmedium),以提高耐久性和膜透過性。封固劑的實(shí)例包括脂質(zhì)體、多聚-L-賴氨酸、脂質(zhì)、膽固醇、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑(lipofectin)及其衍生物。這些組合物的劑量可以根據(jù)患者的狀況加以調(diào)節(jié)，以期望的量使用。例如，可以施用0.1-100mg/kg，優(yōu)選地0.1-50mg/kg的劑量范圍。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于治療或預(yù)防NSCLC的組合物，其由抗CDCA1或KNTC2多肽的抗體或可結(jié)合該多肽的抗體片段構(gòu)成。盡管劑量可以隨癥狀而改變，在口服施用給普通成人(體重60kg)時(shí)，用于治療或預(yù)防NSCLC的抗體或其片段的劑量實(shí)例是大約O.lmg-大約100mg/天，優(yōu)選地大約1.0mg-大約50mg/天，更優(yōu)選地大約1.0mg-大約20mg/天。以注射形式向普通成人(體重60kg)非消化道給藥時(shí)，盡管根據(jù)患者的狀況、疾病癥狀和給藥方法存在一些差異，方便的靜脈內(nèi)注射劑量為大約0.01mg-大約30mg/天，伊C選;也大約0.1mg-大約20mg/天，更優(yōu)選;也大約0.1mg-大約10mg/天。同樣，在其他動(dòng)物的情況下，可能施用換算為60kg體重的劑量。本文鑒定的差異表達(dá)的CDCA1或KNTC2基因還使得NSCLC治療的過程的預(yù)后或監(jiān)測(cè)成為可能。在本方法中，從正在進(jìn)行NSCLC治療的受試者提供測(cè)試生物樣品。如果期望，在不同的時(shí)間點(diǎn)，例如在治療之前、期間或之后，從受試者獲得多個(gè)測(cè)試生物樣品。然后確定樣品中CDCA1或KNTC2基因的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)水平，并與沒有經(jīng)過治療的具有已知NSCLC狀態(tài)的參考樣品進(jìn)行比較。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，可以同曰于檢觀'JCDCA1和KNTC2基因的表達(dá)水平。如果參考樣品不含NSCLC細(xì)胞，則測(cè)試生物樣品與參考樣品中CDCA1或KNTC2基因的表達(dá)水平相似表明治療有效。然而，與參考樣品相比，測(cè)試樣品中CDCA1或KNTC2基因表達(dá)水平的差異表明臨床結(jié)果或預(yù)后不良。在本發(fā)明的上下文中，從具有良好預(yù)后的患者獲得的NSCLC細(xì)胞可以用作參考樣品。例如，一般地，當(dāng)患者在手術(shù)后能夠生存超過5年時(shí)，患者具有良好的預(yù)后。更具體地講，長生存期者(即良好預(yù)后)組和短生存期者(即不良預(yù)后)組分別包括平均5年腫瘤特異生存比例大于69%和小于45%的患者。因此，來自短生存期者的顯示強(qiáng)烈染色的樣品，可以用作不良預(yù)后的陽性對(duì)照?；蛘撸藖碓从诨颊叩臉悠?，顯示與來源于患者的樣品相似的強(qiáng)烈染色的樣品或肺癌細(xì)胞系也可以用作陽性對(duì)照。而且，在一些實(shí)施方案中，正常肺細(xì)胞、不表達(dá)CDCA1和KNTC2的肺癌細(xì)胞或其他細(xì)胞可以用作不良預(yù)后的陰性對(duì)照。本發(fā)明還包括用于預(yù)測(cè)NSCLC預(yù)后的試劑盒，其中該試劑盒含有從下組選擇的一種或多種組分(a)用于檢測(cè)編碼SEQIDNO:34(CDCAl)或SEQIDNO:32(KNTC2)所示氨基酸序列的mRNA之存在的試劑，(b)用于才企測(cè)具有SEQIDNO:34(CDCAl)或SEQIDNO:32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)之存在的試劑，和(c)用于才企測(cè)具有SEQIDNO:34(CDCAl)或SEQIDNO:32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)之生物活性的試劑。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，(a)用于檢測(cè)編碼SEQIDNO:34(CDCAl)或SEQIDNO:32(KNTC2)所示氨基酸序列的mRNA之存在的試劑可以是特異結(jié)合或識(shí)別CDCA1或KNTC2核酸的核酸，例如與CDCA1或KNTC2核酸互補(bǔ)的寡核苷酸序列。具體地，SEQIDNO:34(CDCAl)和SEQIDNO:32(KNTC2)的氨基酸序列由SEQIDNO:33和SEQIDNO:31的核苷酸序列編碼。因此，包含從SEQIDNO:33和SEQIDNO:31所示核普酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸可以用作本方法優(yōu)選的引物或探針?；蛘?，在本發(fā)明中，(b)用于檢測(cè)具有SEQIDNO:34(CDCAl)或SEQIDNO:32(KNTC2)所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)之存在的試劑可以是結(jié)合CDCA1或KNTC2蛋白質(zhì)的抗體。而且，(c)用于檢測(cè)具有SEQIDNO:34(CDCAl)或SEQIDNO:32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)之生物活性的試劑可用于本發(fā)明的試劑盒。檢測(cè)試劑可以用試劑盒的形式包裝在一起。上述試劑優(yōu)選地封裝在不同的容器內(nèi)，例如核酸或抗體(與固體基質(zhì)結(jié)合或者分別與用于將它們結(jié)合到基質(zhì)的試劑包裝)、對(duì)照試劑(陽性和/或陰性)、和/或可片企測(cè)標(biāo)簽。試劑盒還包含實(shí)施測(cè)定的說明書(例如書面、磁帶、VCR、CD-ROM等)。試劑盒的測(cè)定樣式可以是Northern雜交或者夾心式ELISA,兩者在本領(lǐng)域是已知的。例如，檢測(cè)試劑可以固定在固體基質(zhì)，例如多孔片條(strip)上，以形成至少一個(gè)NSCLC檢測(cè)位點(diǎn)。多孔條帶的測(cè)量或檢測(cè)區(qū)可包括多個(gè)位點(diǎn)，每一個(gè)均含有核酸。測(cè)試片條還可以包含陰性和/或陽性對(duì)照的位點(diǎn)?；蛘?，對(duì)照位點(diǎn)可以位于不同于測(cè)試片條的片條上。對(duì)照位點(diǎn)可以包含不同量的固化核酸，即，在第一個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的量較高，在隨后位點(diǎn)的量較低。添加測(cè)試樣品后，顯示可檢測(cè)信號(hào)的位點(diǎn)數(shù)目提供樣品預(yù)后的定量指示。檢測(cè)位點(diǎn)可以配置成任何適合于檢測(cè)的形狀，典型地成跨測(cè)試條帶寬度的條形或點(diǎn)形。下文提供實(shí)施例來說明本發(fā)明并幫助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員制造和使用它。這些實(shí)施例決不意圖構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的范圍的限制。除非另外定義，本文中使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的意義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員共同理解的意思相同。盡管在實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明時(shí)可以使用與本文公開的方法或材料相似或等價(jià)的方法或材料，下文描述了合適的方法和材料。這里引用的專利申請(qǐng)和公開的全部內(nèi)容并入本文作為參考。實(shí)施例提供如下的實(shí)施例用于舉例，但并不限制要求保護(hù)的發(fā)明。(a)肺癌細(xì)胞系和組織樣品:下文^見程中使用的人肺癌細(xì)胞系如下肺腺癌(ADC)A427,A549，LC319,PC3，PC9，PC14,NCI-H23,NCI-H522和NCI-H1373;細(xì)支氣管肺泡細(xì)胞癌(BAC)NCI-H1666和NCI-H1781;肺腺鱗癌(ASC)NCI-H226和NCI-H647;肺鱗狀細(xì)胞癌(SCC)RERF-LC-AI,SK誦MES-1,EBC畫1,LC176,LU61，NCI-H520,NCI-H1703，和NCI-H2170;肺大細(xì)胞癌(LCC)LX1;和小細(xì)胞肺癌(SCLC)DMS114,DMS273,SBC-3和SBC-5。全部細(xì)胞在添加10。/。胎牛血清(FCS)的合適培養(yǎng)基中單層生長，保持在37。C、5%C02的濕潤氣氛中。人小氣道上皮細(xì)胞(SAEC)生長在從CambrexBioScience公司(Walkersville，MD)購買的優(yōu)化培養(yǎng)基(SAGM)中。如前所述從37位具有書面知情同意的患者獲得原發(fā)性NSCLC樣品，其中22例歸類為ADC,14例歸類為SCC，1例歸類為ASC(KikuchiT，a/.,Oncogene.2003;22(14):2192-205)。另一組獨(dú)立的16個(gè)原發(fā)性NSCLC,包括8例ADC和8例SCC，與相鄰的正常肺組織樣品一起從正在進(jìn)行外科手術(shù)的患者獲得。還從接受手術(shù)的患者獲得了總共256例NSCLC和相鄰正常肺組織，用于在組織微陣列上進(jìn)行免疫染色及進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析。本研究和全部臨床材料的使用均獲得了各機(jī)構(gòu)的倫理委員會(huì)(individualinstitutionalEthicalCommittee)的批準(zhǔn)。(b)半定量RT-PCR:用Trizol試劑(LifeTechnologies/>司Gaithersburg，MD)根據(jù)制造商的規(guī)程從培養(yǎng)細(xì)胞和臨床組織提取總RNA。將提取的RNA和正常人組織多聚(A)RNA用DNA酶I(NipponGene,Tokyo,Japan)處理，并用寡(dT)引物和SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)反轉(zhuǎn)錄。用下列合成的CDCAl特異性引物、KNTC2特異性引物或者作為內(nèi)部對(duì)照的ACTB特異引物進(jìn)行半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)CDCAl，5'-GAGAAACTGAAGTCCCAGGAAAT-3，(SEQIDNO:l)和5，-CTGATACTTCCATTCGCTTCAAC-3，(SEQIDNO:2);KNTC2,5，-AAAAGAACCGAATCGTCTAGAGTC-3，(SEQIDNO:29)和5,-CCGAGAGATCTTCTGACATGC畫3，(SEQIDNO:30);ACTB,5，-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3，(SEQIDNO:3)和5，-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3，(SEQIDNO:4)。優(yōu)化PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)，以確保產(chǎn)物強(qiáng)度在擴(kuò)增的對(duì)數(shù)期內(nèi)。(c)Northern印跡分析:將人多組織印跡(blot)(BDBiosciencesClontech,PaloAlto,CA)與CDCAl或KNTC1的32P標(biāo)記PCR產(chǎn)物雜交。CDCAl和KNTC1的cDNA探針是用上述引物通過RT-PCR制備的。根據(jù)供應(yīng)商的推薦進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和清洗。印跡(blot)用增感BAS屏(intensifyingBASscreen)(BIO-RAD,Hercules,CA)在室溫下放射自顯影30個(gè)小時(shí)。(d)抗體:為了獲得抗CDCAl抗體，本發(fā)明人用pET28載體(Novagen,Madison,WI)制備了表達(dá)CDCAl部分片段(密碼子15-338)的質(zhì)粒，其中CDCAl部分片段在麗2末端具有帶His標(biāo)簽的表位。該重組肽在大腸桿菌、BL21codon-plus菌抹(Stratagene,LaJolla，CA)中表達(dá)，并用TALON樹脂(BDBioscience)根據(jù)供應(yīng)商的規(guī)程加以純化。從SDS-PAGE凝膠提取的蛋白質(zhì)接種到兔體內(nèi)；在親和柱上根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法純化免疫血清。親和純化的兔多克隆抗CDCAl抗體用于western印跡、免疫沉淀和免疫染色。山羊抗KNTC2多克隆抗體從abeam公司(Cambridge,MA)購得。在western印跡上，本發(fā)明人利用內(nèi)源表達(dá)或不內(nèi)源表達(dá)CDCAl和KNTC2的NSCLC細(xì)胞系或者被CDCAl或KNTC2—表達(dá)栽體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的裂解物i正實(shí)了該抗體對(duì)CDCAl或KNTC2是特異性的。(e)Western印跡:在下述裂解緩沖液中裂解細(xì)胞50mMTris-HCl(pH8.0)、150mMNaCl、0.5%NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉、0.1%SDS，加蛋白酶抑制劑(蛋白酶抑制劑合劑系列III;CalbiochemDarmstadt,Germany)。本發(fā)明人使用如前人記載(IshikawaN，"a/.，ClinCancerRes.2004;10(24):8363-70.)的ECLWestern印跡分沖斤系統(tǒng)(GEHealthcare/AmershamBiosciencesCorp，Piscataway,NJ)。ffl鑒定CDCA1關(guān)聯(lián)蛋白:將來自肺癌細(xì)胞系LC319的細(xì)胞提取物與50pi蛋白A和G瓊脂糖珠子在蛋白酶抑制劑的存在下、最終體積為2ml的免疫沉淀緩沖液(0.5%NP-40,50mMTris-HCl,150mMNaCl)中，于4。C溫育1小時(shí)，來加以預(yù)澄清。1,000rpm4。C離心5min后，上清液在4。C與抗CDCA1多克隆抗體、抗KNTC2多克隆抗體、或者正常家兔IgG溫育2小時(shí)。與50pl蛋白A和G瓊脂糖珠子4。C溫育1小時(shí)后，通過5,000rpm離心2min/人每個(gè)樣品收集J朱子，用1ml免疫沉淀i爰沖液清洗6次，清洗后的珠子重新懸浮在50plLaemmli樣品緩沖液中，煮沸5min，之后在5-10%SDSPAGE凝膠(BIORAD)上分離蛋白質(zhì)。電泳后，對(duì)凝膠4艮染色。將特異地出現(xiàn)在與抗CDCA1多克隆抗體溫育的提取物中的蛋白條帶切出，用基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS;AXIMA-CFRplus,SHIMADZUBIOTECH,Kyoto,Japan)進(jìn)行分析。為了確認(rèn)CDCA1與KNTC2之間的相互作用，本發(fā)明人進(jìn)行了免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。為了獲得pCAGGSn3Fc-CDCAl,本發(fā)明人將整個(gè)編碼序列克隆到pCAGGSn3Fc-CDCAl質(zhì)粒載體的合適位點(diǎn)中。用ABIPrism3700DNA測(cè)序儀(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)利用T3、T7或合成寡核香酸引物根據(jù)制造商的說明確定每個(gè)cDNA克隆的核苷酸序列。將來自被pCAGGSn3Fc-CDCAl轉(zhuǎn)染的LC319細(xì)胞的提取物分別用KNTC2多克隆抗體(Abcom,Inc.)和正常兔IgG免疫沉淀。用抗FLAGM2單克隆抗體(Sigma-AldrichCo.)進(jìn)行了免疫印跡。(g)鑒定CDCA1中的KNTC2結(jié)合區(qū):將CDCA1的11個(gè)缺失構(gòu)建體(CDCA1200-464，CDCA1149-464，CDCA11-348,CDCA11-148，CDCA1149-306,CDCA1306-464，CDCA1319-464，CDCA1277-416，CDCA1277-367，CDCA1319-416,和CDCA1319-367)克隆到C端FLAG標(biāo)簽pCAGGS載體的合適位點(diǎn)中。用表達(dá)CDCA1之11個(gè)缺失構(gòu)建體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞系LC319,將該細(xì)胞的提取物在蛋白酶抑制劑的存在下與100pi蛋白G-瓊脂糖珠子在最終體積為2ml的免疫沉淀緩沖液(0.5%NP-40，50mMTris-HCl,150mMNaCl)中4。C溫育1小時(shí)，來加以預(yù)澄清。4。C1,000rpm離心5min后，將上清液在4。C與抗FLAGM2瓊脂糖一起溫育2小時(shí)。通過5,000rpm離心2min從每個(gè)樣品收集珠子，并用lml免疫沉淀緩沖液清洗6次之后，將清洗后的珠子重新懸浮在50plLaemmli樣品緩沖液中，煮沸5min，然后在10%SDSPAGE凝膠上分離蛋白質(zhì)。分別用KNTC2多克隆抗體(Abcom,Inc.)和抗FLAGM2單克隆抗體(Sigma-AldrichCo.)進(jìn)行免疫印跡。(h)免疫細(xì)胞化學(xué):將培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS(-)清洗2次，在4%甲醛溶液中室溫固定60min,并通過用含有0.1%TritonX-100的PBS(-)處理1.5分鐘使其可透過。用含3。/。BSA的PBS(-)覆蓋細(xì)胞60分鐘，以便在第一抗體反應(yīng)之前封閉非特異結(jié)合。然后，將細(xì)胞與抗人CDCA1或KNTC2蛋白的抗體溫育。用與Alexa488偶聯(lián)的山羊抗兔第二抗體(MolecularProbes,Eugene,OR)和與Alexa594偶聯(lián)的驢抗山羊第二抗體(MolecularProbes)對(duì)免疫復(fù)合物進(jìn)行染色，用激光共聚焦顯微鏡(TCSSP2AOBS:LeicaMicrosystems,Wetzlar，Germany)進(jìn)行觀察。(i)免疫組織化學(xué)和組織樣i陣列分析:腫瘤組織微陣列用福爾馬林固定的NSCLC根據(jù)先前的公開進(jìn)行構(gòu)建(IshikawaN，WClinCancerRes.2004;10(24):8363-70)。用于采樣的組織區(qū)域根據(jù)與載玻片上相應(yīng)HE染色切片的目測(cè)對(duì)齊來加以選擇。用組織微陣列點(diǎn)樣器(BeecherInstruments,SunPrairie，WI)將從供體腫瘤塊獲得的3、4或5個(gè)組織核(直徑0.6mm;高3-4mm)放置在接收石蠟塊內(nèi)。從每個(gè)病例鉆取正常組織核。使用所得微陣列塊的5pm切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。CDCA1和KNTC2的陽性度由3位獨(dú)立的研究者在事先不知道臨床隨訪數(shù)據(jù)的情況下半定量地進(jìn)行評(píng)估，每位研究者按照不存在(評(píng)分為0)、微弱(l+)或強(qiáng)陽性(2+)記錄染色強(qiáng)度。只有當(dāng)所有研究均確定其為強(qiáng)陽性(2+)時(shí)，肺癌才評(píng)分為強(qiáng)陽性(2+)。為了研究臨床材料中CDCA1/KNTC2蛋白的存在，本發(fā)明人用ENVISION+Kit/HRP(DakoCytomation，Glostrup,Denmark)對(duì)組織切片進(jìn)行染色。在封閉內(nèi)源過氧化物酶和蛋白質(zhì)之后，添加親和純化的抗CDCA1抗體或抗KNTC2抗體，并將每個(gè)切片與作為第二抗體的HRP-標(biāo)記的抗兔或抗山羊IgG溫育。添加底物-色原，用蘇木精復(fù)染。(i)統(tǒng)計(jì)分析:本發(fā)明人嘗試將臨床病理變量，例如年齡、性別和病理TNM階段，與通過組織微陣列分析確定的CDCA1和/或KNTC2蛋白的表達(dá)水平相互關(guān)聯(lián)起來。從手術(shù)時(shí)起，到NSCLC相關(guān)的死亡時(shí)或到最后隨訪觀察止，計(jì)算腫瘤特異的生存曲線。對(duì)每個(gè)相關(guān)變量和CDCA1/KNTC2的表達(dá)計(jì)算Kaplan-Meier曲線；用log-rank時(shí)序檢驗(yàn)分析(log-ranktest)患者亞群之間的生存時(shí)間差異。用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例-危險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單變量和多變量分析，確定臨床病理變量與癌癥相關(guān)死亡率之間的關(guān)聯(lián)。首先，本發(fā)明人分析了死亡與可能的預(yù)后因素包括年齡、性別、pT分類和pN分類的關(guān)聯(lián)，一次考慮一個(gè)因素。其次，采用總是強(qiáng)迫CDCA1/KNTC2表達(dá)以及任意或全部滿足進(jìn)入水平即p值小于0.05的變量進(jìn)入模型的向后(逐步)程序進(jìn)行多變量Cox分析。該模型不斷加入因素時(shí)，獨(dú)立因素沒有超過P0.05的出口水平。(k)RNA干擾測(cè)定:本發(fā)明人先前建立了基于載體的RNA干擾(RNAi)系統(tǒng)psiHlBX3.0,其設(shè)計(jì)用于在哺乳動(dòng)物內(nèi)合成siRNA(ShimokawaT，Wa/.,CancerRes.2003;63(19):6116-20)。通過將表1中的雙鏈寡核苦酸克隆進(jìn)入psiHlBX載體的Bbsl位點(diǎn)制備針對(duì)CDCA1(si-CDCAl)和KNTC2(si-KNTC2)的siRNA表達(dá)載體。將10pgsiRNA表達(dá)載體用30)ilLipofectamine2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染進(jìn)入NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549和LC319。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在合適濃度遺傳霉素(G418)的存在下培養(yǎng)7天，通過Giemsa染色計(jì)數(shù)集落數(shù)目，并且在處理7天后通過MTT測(cè)定評(píng)估細(xì)胞的生存力；簡(jiǎn)而言之，向每個(gè)培養(yǎng)亞添加濃度為1/10體積的細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cellcountingkit-8)溶液(DOJINDO，Kumamoto,Japan),將培養(yǎng)板在37。C繼續(xù)溫育4小時(shí)。用MicroplateReader550(BIO-RAD)測(cè)量490nm吸光度，以630nm作為參比。為了證實(shí)CDCA1或KNTC2mRNA表達(dá)的抑制，用如下的合成CDCA1特異引物和KNTC2特異引物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程進(jìn)行半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)。用于RNAi的合成寡核苦酸的靶序列如下(EGFP:增強(qiáng)綠色焚光蛋白(GFP)基因，維多利亞多管水母(」^"o^aW"on'a)GFP突變體)，5，-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3，(SEQIDNO:5);對(duì)照2(亂序:編碼5S和16SrRNA的葉纟錄體小目艮蟲(五wg/ew"gra"7/s)基因)，5，-GCGCGCTTTGTAGGATTCG-3，(SEQIDNO:6);對(duì)照3(螢光素酶北美安火蟲(尸/70""asp_yra//s)螢光素酶基因)，5，-CGTACGCGGAATACTTCGA-3，(SEQIDNO:7);siRNA-CDCAl-#2,5，-AAGATGCTGCTGAAAGGGAGA-3，(SEQIDNO:8);siRNA-KNTC2-#1，5，-GCTGGATGATCTTTACCAA-3，(SEQIDNO:9)。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>(m)11R-肽對(duì)肺癌細(xì)力包生長的效果:LC319和A546以及源自正常人肺成纖維細(xì)胞的MRC5細(xì)胞與濃度為5^M，10^M,和20的11R-肽溫育7天。培養(yǎng)基每隔一天更換一次，使每種肽處于合適的濃度，并在處理后7天通過MTT測(cè)定評(píng)估細(xì)胞的生存能力；簡(jiǎn)而言之，向每個(gè)培養(yǎng)皿添加濃度為1/10體積的細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8溶液(DOJINDO,Kumamoto，Japan),培養(yǎng)板在37°C繼續(xù)溫育4小時(shí)。然后用MicroplateReader550(BIO-RAD)測(cè)量490nm吸光度，以630nm作為參比。如前所述地進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析(Suzuki,C.da/.CancerRes.65,11314-11325(2005).)。(n)小鼠模型:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照看和使用的機(jī)構(gòu)和國家指導(dǎo)方針進(jìn)行，并獲得機(jī)構(gòu)動(dòng)物使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。將lx106個(gè)六549細(xì)胞皮下植入到6周齡BALB/c雄性棵鼠(nu/nu)的右肩。注射2周后，將帶有肺瘤(平均體積30mm3)的小鼠隨才幾分為3組，并用11R-CDCA1398-416肽(0.15|amol/只/天)、亂序(0.15pmol/只/天)或PBS(對(duì)照)胂瘤內(nèi)給藥7周。每天使用卡鉗測(cè)量腫瘤的體積，并將數(shù)據(jù)代入公式(體積=0.52x[寬度]2x[長度])計(jì)算球狀體的體積。潛果(a)CDCAl和KNTC2基因共激活:利用代表23,040個(gè)基因的cDNA微陣列篩選在大部分NSCLC中高度反式激活的元件，鑒定出CDCA1(登錄號(hào)NO.hCT1957725(Celera)SEQIDNO:33,34)為良好的候選物。該基因在絕大部分被檢NSCLC病例中顯示3倍或者更高的表達(dá)。隨后，在另外16個(gè)NSCLC病例中的10例(8例ADC中的4例，8例SCC中的6例)中用半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了其反式激活(圖1A)。在所;險(xiǎn)查的全部23個(gè)NSCLC和SCLC細(xì)胞系中均觀察到CDCA1上調(diào)，而在來源于正常支氣管上皮的SAEC細(xì)胞中幾乎不能檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄物(圖1B)。在12個(gè)肺癌細(xì)胞系中，使用抗CDCA1抗體在western印跡上確認(rèn)了CDCA1的內(nèi)源表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。用CDCA1cDNA作為探針進(jìn)行的Northern印跡分析鑒定了一個(gè)2.4kb轉(zhuǎn)錄物；只在睪丸中觀察到大量存在，表明CDCA1是典型的癌-睪丸抗原(圖1C)。(b)鑒定KNTC2是與CDCA1相互作用的蛋白質(zhì):為了闡釋CDCA1在肺癌細(xì)胞中的功能，本發(fā)明人首先尋找可以和CDCA1相互作用的蛋白質(zhì)。提取LC319細(xì)胞的裂解物，用抗CDCA1抗體免疫沉淀。蛋白復(fù)合物用SilverQuest(Invitrogen)在SDS-PAGE凝膠上染色。提取出現(xiàn)于被抗CDCA1免疫沉淀的細(xì)胞裂解物中但不出現(xiàn)于用正常兔IgG免疫沉淀的細(xì)胞裂解物中的75kDa條帶，通過MALDI-TOF質(zhì)語確定其肽序列。該程序鑒定KNTC2(GenBank登陸號(hào)NO.NM—006101，SEQIDNO:31，32)是CDCA1相互作用蛋白的候選物。外源CDCA1和內(nèi)源KNTC2的關(guān)連(cognate)相互作用免疫沉淀實(shí)驗(yàn)確認(rèn)(圖2A)。為了確定內(nèi)源CDCA1和KNTC2在肺癌細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，用兔多克隆抗CDCA1和山羊多克隆抗KNTC2抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析；檢測(cè)到兩種蛋白質(zhì)在Gl/S期主要共定位于中心體和細(xì)胞核，在G2/M期共定位于中心體和著絲粒(圖2B)。隨后對(duì)原發(fā)NSCLC組織和肺癌細(xì)胞系進(jìn)行重新;險(xiǎn)查，通過半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在16例NSCLC臨床樣品的9例中(8例ADC中的3例，8例SCC中的6例)，以及在全部23個(gè)肺癌細(xì)胞系中KNTC2表達(dá)提高(圖1A,B)。相對(duì)于ACTB基因更高的CDCA1和KNTC2基因mRNA表達(dá)圖式在臨床樣品中是顯著相關(guān)的(f-檢驗(yàn)PO.OOl)。這兩個(gè)基因還在幾乎所有被檢的肺癌細(xì)胞系中共激活(f-檢驗(yàn)PO.OOl)。用KNTC2cDNA作為探針的Northern印跡鑒定了一個(gè)只在睪丸大量存在的2.5-kb轉(zhuǎn)錄物，表明KNTC2屬于癌-睪丸抗原范疇(圖1C)。KNTC2在肺癌和正常組織中的表達(dá)分布圖式與CDCA1非常相似。(c)鑒定CDCA1的KNTC2結(jié)合區(qū)域:為了確定CDCA1中與KNTC2相互作用所需的具體域，將6種具有COOH(C)端FLAG-序列的CDCA1缺失構(gòu)建體(CDCA1200-464，CDCA1149-464,CDCA11-348，CDCA11-148,CDCA1149-306,和CDCA1306-464)其中之一轉(zhuǎn)染進(jìn)入LC319細(xì)胞。使用單克隆抗Flag抗體的免疫沉淀表明，缺失C端158個(gè)氨基酸的CDCA11-148和CDCA1149-306構(gòu)建體不能與內(nèi)源KNTC2相互作用(圖2C)。為了進(jìn)一步確定CDCA1的最小KNTC2結(jié)合域，將額外的5種具有C端FLAG序列的CDCA1缺失構(gòu)建體(CDCA1319-464，CDCA1277-416,CDCA1277-367，CDCA1319-416,和CDCA1319-367)其中之一轉(zhuǎn)染進(jìn)入LC319細(xì)胞。使用單克隆抗Flag抗體的免疫沉淀表明，缺失CDCA1368-416中49個(gè)氨基酸的CDCA1277-367和CDCA1319-367構(gòu)建體不能與內(nèi)源KNTC2相互作用(圖2D)。(d)CDCAl和KNTC2過度表達(dá)與不良預(yù)后的關(guān)聯(lián):使用從256例NSCLC制備的組織微陣列，用親和純化的抗CDCA1和KNTC2多克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，分別在2"(88%)和225(88%)例中見到陽性染色。其中，對(duì)于CDCA1染色，138例ADC腫瘤中的117例(85%)為陽性；80例中的72例是SCC(90%);21例中的19例是LCC(90%)，全部10例BAC(100%)和全部7例ASC(100%)呈陽性，而對(duì)于KNTC2染色，138例ADC肺瘤中的117例為陽性(85%);80例中的75例為SCC(94%);21例中的20例為LCC(95°/。)，全部10例BAC(100°/。)和全部7例ASC(100%)呈陽性。所有這些腫瘤均是手術(shù)切除的NSCLC，在任何相鄰的正常肺組織中未觀察到染色(圖3A)。在這些肺瘤中，CDCA1蛋白的表達(dá)圖式與KNTC2蛋白表達(dá)顯著一致0(2-檢驗(yàn)PO.OOl)，證實(shí)了RT-PCR和Western印跡的結(jié)果。CDCA1/KNTC2的表達(dá)圖式被歸類為無/微弱(打分0~1+)或強(qiáng)(打分2+)。具有同時(shí)表現(xiàn)CDCA1和KNTC2強(qiáng)烈陽性的腫瘤的病例^f艮可能具有更差的預(yù)后(Logrank時(shí)序檢驗(yàn)P=0.146;圖3B)。在該CDCA1/KNTC2免疫染色實(shí)驗(yàn)中長期和短期生存者的定義如下長期生存者屬于平均5年生存比例至少為69%的患者組的患者，和短期生存者屬于平均5年生存比例不超過45%的患者組的患者。而且，使用從282例石蠟包埋NSCLC制備的組織微陣列，用親和純化的抗CDCA1和抗KNTC2多克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。CDCA1/KNTC2的表達(dá)圖式被歸類為無/微弱(打分0~1+)或強(qiáng)(打分2+)。所檢查的282例NSCLC中，95例(33.7%)顯示強(qiáng)烈CDCA1染色(打分2+)，113例(40.1%)中可見微弱染色(打分l+)，74例(26.2°/。)中沒有觀察到染色(打分0)。對(duì)于KNTC2,在112例(39.7%)中觀察到強(qiáng)烈染色(打分2+)，122例(43.3%)中可見微弱染色(打分l+)，48例(17%)中沒有觀察到染色(打分0)。所有這些腫瘤均是手術(shù)切割NSCLC病例，在其任何相鄰正常肺組織中未觀察到染色(圖lc)。282例腫瘤中有189例對(duì)CDCA1和KNTC2同時(shí)陽性(打分為1+2+),有29例對(duì)兩種蛋白均為陰性。282例腫瘤中有19例只對(duì)CDCA1陽性，有45例只對(duì)KNTC2陽性。在這些腫瘤中CDCA1蛋白的表達(dá)圖式與KNTC2蛋白的表達(dá)顯著一致(f-檢驗(yàn)P〈0.0001)，進(jìn)一步確證了RT-PCR和Western印跡的結(jié)果，提示CDCA1和KNTC2可能具有共同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。CDCA1在NSCLC中的強(qiáng)烈表達(dá)與pT因素狀態(tài)顯著相關(guān)(%2=5.473，P=0.019),并與腫瘤特異性5年生存顯著相關(guān)(Log-rank時(shí)序檢驗(yàn)P=0.0233)(圖3C)。KNTC2在NSCLC中的強(qiáng)烈表達(dá)與pT因素狀態(tài)顯著相關(guān)(%2=11.664,P=0.0006)，并與5年生存能力顯著相關(guān)(時(shí)序檢驗(yàn)P=0.0384)(圖3D)。腫瘤既不表達(dá)CDCA1也不表達(dá)KNTC2的NSCLC患者可獲得最佳的生存效益，而兩個(gè)標(biāo)記均為強(qiáng)陽性的患者胂瘤特異生存時(shí)間最短(Logrank時(shí)序檢驗(yàn)P二0.0250;圖3E)。利用單變量分析，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)狀態(tài)(NO對(duì)Nl，N2:P<0.0001;計(jì)分4企驗(yàn))、肺瘤大小(T1對(duì)T2,T3，T4:P<0.001;計(jì)分檢驗(yàn))和高CDCA1/KNTC2表達(dá)(P分別為0.0233，0.0384;計(jì)分檢驗(yàn))是NSCLC患者不良預(yù)后的重要相關(guān)特征。(e)通過針對(duì)CDCA1和KNTC2的特異siRNA抑制NSCLC細(xì)胞生長為了評(píng)估CDCA1和KNTC2是否對(duì)于肺癌細(xì)胞生長或生存至關(guān)重要，構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)針對(duì)CDCA1(si-CDCAl)或KNTC2(si-KNTC2)的siRNA，用針對(duì)EGFP、螢光素酶和亂序的siRNA作為對(duì)照。將任一質(zhì)粒(si-CDCAl-弁2或si-KNTC2弁l)轉(zhuǎn)染進(jìn)入A549或LC319細(xì)胞，與對(duì)照相比，顯著抑制了內(nèi)源CDCA1或KNTC2蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致MTT(非配對(duì)t檢驗(yàn)分別為P=0.0008和0.0005)和集落形成測(cè)定(A549的代表性數(shù)據(jù)如圖4A,B所示)測(cè)得的細(xì)胞生存能力和集落數(shù)目明顯降低。(f)CDCA1的顯性失活肽對(duì)NSCLC細(xì)胞生長的抑制:為了調(diào)查CDCA1-KNTC2相互作用在功能上對(duì)于肺癌細(xì)胞生長或生存的重要性，考察了一種CDCA1缺失片段(CDCA1200-464;見圖2C)抑制CDCA1與KNTC2之間直接相互作用的顯性負(fù)作用，該缺失片段缺少CDCA1的N端部分，但與其他缺失突變體相比顯示與內(nèi)源KNTC2有最強(qiáng)的親和性。由于用抗CDCA1/KNTC2抗體免疫沉淀的內(nèi)源CDCA1條帶與IgG重鏈條帶重疊，難以檢測(cè)內(nèi)源CDCA1和KNTC2的相互作用。因此，為了證實(shí)CDCA1和KNTC2之間的直接相互作用受到CDCA1200-464構(gòu)建體的抑制，將兩個(gè)質(zhì)粒組合CDCA11-464(全長)和CDCA1200-464;或CDCA11-464(全長)和不能與內(nèi)源KNTC2相互作用的CDCA1149-306(對(duì)照)(圖5A,左二上圖)，共轉(zhuǎn)染進(jìn)入LC319細(xì)胞。用抗KNTC2多克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀只4企測(cè)到CDCA11-464(全長)或CDCA1200-464與內(nèi)源KNTC2的相互作用(圖5A;左上圖；黑白箭頭)。進(jìn)一步證實(shí)，CDCA1200-464的過度表達(dá)降低外源CDCA1(CDCA11-464;全長)與內(nèi)源KNTC2間復(fù)合物的形成(圖5A;左上圖；黑箭頭)。CDCAl200-464與內(nèi)源KNTC2在LC319細(xì)胞中共定位還通過免疫細(xì)胞化學(xué)得到了證實(shí)(圖5A;右圖)。接著，將編碼CDCA1200-464的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入LC319細(xì)胞，4企測(cè)該構(gòu)建體的顯性失活效應(yīng)。如預(yù)期的，轉(zhuǎn)染CDCA1200-464的顯性失活片段導(dǎo)致MTT測(cè)定測(cè)得的細(xì)胞生存能力顯著降低(非配對(duì)t檢驗(yàn)P二0.0026，CDCA1200-464對(duì)CDCAl149-306;圖5B)。如圖2D所示，CDCA1368-416的49氨基酸肽被認(rèn)為是與內(nèi)源KNTC2相互作用最重要的區(qū)域。為了開發(fā)能夠在體內(nèi)抑制CDCA1-KNTC2復(fù)合物形成的生物活性細(xì)胞透過性化合物，合成了4種氨基酸多肽，它們覆蓋CDCA1368-416的KNTC2結(jié)合域，且其N端與膜轉(zhuǎn)導(dǎo)11聚精氨酸序列(l1R)共價(jià)連接。為了檢驗(yàn)這些聚精氨酸連接肽對(duì)肺癌細(xì)胞生長/生存能力的效果，分別用4種CDCA1衍生肽之一處理LC319細(xì)胞。通過MTT測(cè)定得知，11R-CDCA1398-416的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致細(xì)胞生存能力顯著且呈劑量依賴地降低(圖5C;非配對(duì)t檢驗(yàn)P:0.001或0.0021)。11R-CDCA1398-416處理72小時(shí)以后，數(shù)個(gè)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期并被阻止于有絲分裂期，顯示圓形細(xì)胞學(xué)形態(tài)，與siRNA抑制CDCA1或KNTC2的效果非常相似(數(shù)據(jù)未顯示)。對(duì)比地，未處理細(xì)胞與用非有效肽處理的細(xì)胞之間在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上沒有差異，它們均顯示正常的間期細(xì)胞呈伸展形、有絲分裂細(xì)胞呈圓形的分布。為了闡明11R-CDCA1398-416肽抑制腫瘤的機(jī)制，對(duì)用這些肽處理的胂瘤細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞引起G2/M阻斷，處理72小時(shí)后亞Gl級(jí)分(sub-Glfraction)顯著增力口(圖6A)。11R-CDCA1398-416對(duì)正常肺成纖維細(xì)胞衍生的MRC5細(xì)胞的細(xì)胞生存力沒有影響，其中MR5細(xì)胞的CDCA1和KNTC2表達(dá)水平幾乎不能檢測(cè)到(圖6B)。這些數(shù)據(jù)表明，可轉(zhuǎn)導(dǎo)11R-CDCA1398-416肽能夠抑制CDCA1和KNTC2功能復(fù)合物的形成，而且對(duì)不表達(dá)這些蛋白的正常人類細(xì)胞沒有毒性作用。(g)顯性失活肽對(duì)NSCLC細(xì)胞的體內(nèi)生長抑制:為了進(jìn)一步研究CDCA1的顯性失活肽的體內(nèi)抑制腫瘤效果，將A549細(xì)胞皮下植入6周齡BALB/c小鼠的右肩，并通過腫瘤內(nèi)注射11R-CDCA1398-416肽(0.15pmo1/只/天)、亂序肽(0.15pmol/只/天)或PBS(對(duì)照)處理小鼠7周。三個(gè)處理組中體重或食物攝入沒有差異(數(shù)據(jù)未顯示)。腫瘤生長受到11R-CDCA1398-416肽的顯著抑制，但不被亂序肽或PBS抑制(圖7A,B)。這些數(shù)據(jù)表明，CDCA1的顯性失活肽在體外和體內(nèi)對(duì)癌細(xì)胞具有生長抑制效果，并且抑制CDCA1-KNTC2相互作用可能是開發(fā)新型抗癌藥物的潛力靶標(biāo)。/,論盡管迄今為止已經(jīng)報(bào)道了許多用于肺癌治療的分子靶標(biāo)，但是在臨床環(huán)境下顯示抗癌生物活性且有害副作用極小的物質(zhì)幾乎沒有。因此，本發(fā)明人以開發(fā)用于肺癌治療新型小化合物為目的嘗試了鑒定上調(diào)基因。策略如下l)通過用cDNA微陣列系統(tǒng)進(jìn)行全基因組篩選，鑒定NSCLC中的上調(diào)基因，2)通過多組織Northern印跡核實(shí)候選基因在正常器官中最小限度表達(dá)，3)通過組織微陣列在數(shù)百個(gè)NSCLC組織樣品中確認(rèn)過高表達(dá)和與臨床病理學(xué)因素的相互關(guān)聯(lián)，和4)用siRNA核實(shí)靶基因?qū)τ诜伟┘?xì)胞生存或生長至關(guān)重要。通過這種系統(tǒng)的方法，鑒定了兩種新型癌-睪丸抗原，CDCA1和KNTC2,在大部分臨床NSCLC樣品和細(xì)胞系中共同過高表達(dá)。此外，發(fā)現(xiàn)由這些基因的產(chǎn)物形成的復(fù)合物對(duì)于NSCLC細(xì)胞的生長和進(jìn)展不可或缺。有人指出CDCA1和KNTC2參與有絲分裂的調(diào)節(jié)(Ciferri，C.etal.JBiolChem.280，2卯88-95(2005).)。在人類腫瘤細(xì)胞中，大部分有絲分裂調(diào)節(jié)蛋白的與其正常的對(duì)應(yīng)物相比異常表達(dá)，其中一些已知起癌基因的作用(Nicholas，K.andStephen,T.NatRevCancer.4，927-36(2004).)。其中一個(gè)亞類還凈皮預(yù)期為用于開發(fā)新型抗癌劑的可能靶分子來源。例如，高度保守的極光激酶(aurorakinase)就是其中一個(gè)有絲分裂關(guān)鍵調(diào)節(jié)物家族(Doggrell，S.A.ExpertOpinInvestigDrugs.13，1199-201(2004).)。事實(shí)上，最近有幾種極光激酶抑制劑包括ZM447439、Hesperadin和VX-680被描述為抗癌藥物(Doggrell,S.A.ExpertOpinInvestigDrugs.13,1199-201(2004);Harrington,E.A.etal.NatMed.10，262-7(2004).)。在本研究中，本發(fā)明人通過組織微陣列分析發(fā)現(xiàn)，顯示CDCA1/KNTC2大量表達(dá)的NSCLC患者具有較短的胂瘤特異生存期，因此提示CDCA1和KNTC2—道在肺癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。對(duì)于新分子靶標(biāo)，人們預(yù)期其估計(jì)的各種影響最小，同時(shí)具有強(qiáng)大的抗癌生物活性。CDCA1和KNTC2均已知是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)物，利用我們的MTN篩選，本發(fā)明人證明，這兩種蛋白質(zhì)屬于癌-睪丸抗原。本發(fā)明人還證明，CDCA1和KNTC2在NSCLC中同時(shí)過高表達(dá)。從256或282例NSCLC制備的組織微陣列上免疫組織化學(xué)分析顯示，對(duì)兩種蛋白均顯強(qiáng)陽性染色的NSCLC的患者很可能顯示更短的腫瘤特異性生存時(shí)間，提示CDCA1與KNTC2—起對(duì)于肺癌進(jìn)展具有關(guān)鍵作用。而且，抑制內(nèi)源CDCA1或KNTC2降低了它們的表達(dá)，并抑制了A549和LC319細(xì)胞的生長。此外，本發(fā)明人首次證明，這些結(jié)合被CDCA1蛋白的顯性失活形式以及由膜轉(zhuǎn)導(dǎo)聚精氨酸序列和CDCA1衍生的19氨基酸肽(密碼子398-416)構(gòu)成的合成33氨基酸多肽阻斷，繼而肺癌細(xì)胞的生長被有效抑制。最近，幾個(gè)研究組沖艮道，抑制分子間相互作用導(dǎo)致復(fù)合物功能喪失。例如，將一種細(xì)胞透過性短肽與來源于JNK相互作用蛋白l(JIP-l)之JNK結(jié)合域的20氨基S吏序列共〗介連接，可改善糖尿病小鼠的胰島素抵抗，并改善糖耐量(KanetoH，a/.，NatMed.2004;10:1128-32)。此外，一種細(xì)胞透過肽(SN50)阻斷NF-[k]B在外來刺激物激活后的轉(zhuǎn)位(LinYZ，""/.，JBiolChem.1995;270:14255-8)。阻斷NF-[k]B可保護(hù)[p]細(xì)胞免于IL-l[p]誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(StephensLA,e/a/.,JAutoimmun.1997;10:293-8)。類似的方法已成功用于阻斷活化性蛋白l(AP-l)、活化T細(xì)胞的一種核因子(NFAT)和一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)1的細(xì)胞核移入(TorgersonTR，^a/"JImmunol.1998;161:6084-92;Bonnya/.,Diabetes.2001;50:77-82)。所有這些表明，將大蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為小化合物更容易成功。選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞沒有或者只有極小毒性作用在癌癥患者治療中是最理想的。Chen等報(bào)道，一些細(xì)胞膜透過性肽誘導(dǎo)癌細(xì)胞以比未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相對(duì)更高的水平經(jīng)歷細(xì)胞凋亡，這些肽含有抑制底物被細(xì)胞周期蛋白A(CCNA)/細(xì)胞周期依賴的激酶2(CDK2)或細(xì)胞周期蛋白E(CCNE)/CDK2磷酸化的基序(Chen,Y.N."a/.ProcNatlAcadSciUSA.96,4325-9(1999).)。也有報(bào)道稱，阻斷p53-MDM2相互作用的抗MDM2肽在玻璃體內(nèi)注射后可誘發(fā)p53快速積累，激活細(xì)胞凋亡誘發(fā)基因，優(yōu)先殺傷成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞，并且只有極小的視網(wǎng)膜損傷(Harbour,J.W."a/.Arch.Ophthalmol.2,1341-6(2002).)。我們使用特異性靶向癌細(xì)胞的細(xì)胞透過性肽的結(jié)果提示，抑制CDCA1-KNTC2復(fù)合物為開發(fā)作為抗肺瘤藥劑的新型拮抗劑提供了理論依據(jù)。總之，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，CDCA1-KNTC2癌-睪丸抗原復(fù)合物在癌細(xì)胞生長和/或生存中發(fā)揮特殊的功能作用。我們的數(shù)據(jù)顯示了設(shè)計(jì)新的抗癌肽以及特異靶向CDCA1和KNTC2和/或其復(fù)合物活性的小化合物，作為治療肺癌患者的治療策略的可行性。應(yīng)當(dāng)理解，這里描述的實(shí)施例和實(shí)施方案只是出于舉例說明的目的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以想到它的各種修改或改變，并且這些修改或改變也包含在本申請(qǐng)的精神和以及由附加權(quán)利要求限定的本發(fā)明范圍內(nèi)。這里虧J用的全部出版物、專利和專利申請(qǐng)的全部內(nèi)容并入本文作為參考。權(quán)利要求1.篩選用于治療或預(yù)防NSCLC的化合物的方法，所述方法包括如下步驟(a)在測(cè)試化合物的存在下，使KNTC2多肽或其功能等價(jià)物與CDCA1多肽或其功能等價(jià)物接觸；(b)檢測(cè)步驟(1)中多肽間的相互作用；和(c)選擇抑制所述KNTC2與CDAC1多肽之間結(jié)合的測(cè)試化合物。2.權(quán)利要求1的方法，其中CDCA1多肽的功能等價(jià)物包含KNTC2結(jié)合域的氨基酸序列。3.權(quán)利要求2的方法，其中CDCA1多肽的功能等價(jià)物包含SEQIDNO:35所示的氨基酸序列(IQKIKLGIQQLKDAAEREK)。4.權(quán)利要求1的方法，其中KNTC2多肽的功能等價(jià)物包含CDCA1結(jié)合域的氨基酸序列。5.用于篩選治療或預(yù)防NSCLC的化合物的試劑盒，所述試劑盒包括如下組分(a)KNTC2多肽或其功能等價(jià)物，和(b)CDCAl多肽或其功能等價(jià)物。6.用于治療或預(yù)防受試者體內(nèi)NSCLC的方法，包括向所述受試者施用siRNA組合物，該組合物包含降低KNTC2基因表達(dá)的siRNA，其中該siRNA在有義鏈中包含SEQIDNO:9所示的核苷酸序列。7.權(quán)利要求6的方法，其中該siRNA具有通式5'畫[A]冊(cè)[A，]-3，，其中[A]是相應(yīng)于SEQIDNO:9的核糖核苷酸序列；[B]是由3-23個(gè)核苷酸構(gòu)成的核糖核苷酸序列；[A，]是與[A]互補(bǔ)的核糖核苷酸序列。8.治療或預(yù)防受試者體內(nèi)NSCLC的方法，所述方法包括施用通過權(quán)利要求1的方法獲得的化合物的步驟。9.治療或預(yù)防受試者體內(nèi)NSCLC的方法，所述方法包括施用具有顯性失活效應(yīng)的CDCA1突變體或編碼所述突變體的多核苷酸的步驟。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述CDCA1突變體含有包括KNTC2結(jié)合區(qū)的氨基酸序列，且不包含其nuf2域。11.權(quán)利要求9的方法，其中所述CDCA1突變體包含SEQIDNO:35所示的氨基酸序列。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述CDCA1突變體具有通式[R]-[D],其中[R]是膜轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，[D]是包含SEQIDNO:35所示氨基酸序列的多肽'肽'13.權(quán)利要求12的方法，其中所述膜轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)從下組中選擇聚精氨酸；Tat/RKKRRQRRR/SEQIDNO:37;Penetratin/RQIKIWFQNRRMKWKK/SEQIDNO:38;BuforinII/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK/SEQIDNO:39;MAP(模型兩親肽)/KLALKLALKALKAALKLA/SEQIDNO:41;K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP/SEQIDNO:42;Ku70/VPMLK/SEQIDNO:43;Ku70/PMLKE/SEQIDNO:50;朊病毒/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/SEQIDNO:44;pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK/SEQIDNO:45;Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/SEQIDNO:46;SynBl/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/SEQIDNO:47;Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY/SEQIDNO:48;和麗-l/TSPLNIHNGQKL/SEQIDNO:49.14.一種由SEQIDNO:35所示氨基酸序列構(gòu)成的多肽。15.—種多肽，具有通式[R]-[D]，其中[R]是膜轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，[D]是包含SEQIDNO:35所示氨基酸序列的多16.—種包括有義鏈和反義鏈的雙鏈分子，其中該有義鏈包含相應(yīng)于KNTC2靶序列的核糖核苷酸序列，反義鏈包含與所述有義鏈互補(bǔ)的核糖核苷酸序列，而且其中所述有義鏈和反義鏈彼此雜交形成所述雙鏈分子，并且所述雙鏈分子當(dāng)被引入到表達(dá)KNTC2基因的細(xì)胞中時(shí)抑制所述基因的表達(dá)。17.權(quán)利要求16的雙鏈分子，其中所述KNTC2靶序列包含來自SEQIDNO:31所示核香酸序列的至少大約IO個(gè)連續(xù)核苷酸。18.權(quán)利要求17的雙鏈分子，其中所述KNTC2靶序列包含來自SEQIDNO:9所示核芬酸序列的大約19-大約25個(gè)連續(xù)核苷酸。19.權(quán)利要求18的雙鏈分子，其中所述KNTC2靶序列由SEQIDNO:9構(gòu)成。20.權(quán)利要求16的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子是單一核糖核香酸轉(zhuǎn)錄物，包括通過單鏈核糖核苷酸序列連接的有義鏈和反義鏈。21.權(quán)利要求16的雙鏈分子，其中該雙鏈分子是長度小于大約100個(gè)核芬酸的寡核香酸。22.權(quán)利要求21的雙鏈分子核苷酸的寡核香酸。23.權(quán)利要求22的雙鏈分子核苷酸的寡核苷酸。24.權(quán)利要求23的雙鏈分子核苷酸的寡核苷酸。25.權(quán)利要求24的雙鏈分子25個(gè)核苷酸的寡核苦酸。26.—種載體，其編碼權(quán)利要求16的雙鏈分子。27.權(quán)利要求26的載體，其中該載體編碼具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄物，該轉(zhuǎn)錄物包括有義鏈和反義鏈。28.權(quán)利要求27的載體，其中該轉(zhuǎn)錄物進(jìn)一步包括連接所述有義鏈和所述反義鏈的單鏈核糖核普酸序列。29.—種載體，其包括多核芬酸，該多核苷酸包括有義鏈核酸和反義鏈核酸的組合，其中所述有義鏈核酸包括由SEQIDNO:9構(gòu)成的核香酸序列，而所述反義鏈核酸由與所述有義鏈互補(bǔ)的序列構(gòu)成。30.根據(jù)權(quán)利要求29的載體，其中所述多核苷酸具有通式5，畫[A]-[B]-[A，]-3，，其中[A]是SEQIDNO:9的核苷酸序列；[B]是由3-23個(gè)核苷酸構(gòu)成的核苷酸序列；[A，]是與[A]互補(bǔ)的核苷酸序列。31.用于治療或預(yù)防NSCLC的組合物，所述組合物包含藥物有效量的針對(duì)KNTC2基因的siRNA。，其中該雙鏈分子是長度小于大約75個(gè),其中該雙鏈分子是長度小于大約50個(gè)，其中該雙鏈分子是長度小于大約25個(gè),其中該雙鏈分子是長度為大約19-大約32.權(quán)利要求31的組合物，其中所述siRNA包括含有SEQIDNO:9所示核苷酸序列的有義鏈作為靶序列。33.用于治療或預(yù)防NSCLC的組合物，所述組合物包含藥物有效量的通過權(quán)利要求1的方法選出的化合物作為活性成分，和藥物可接受的載體。34.用于治療或預(yù)防NSCLC的組合物，所述組合物包含藥物有效量的具有顯性失活效應(yīng)的CDCA1突變體或者編碼所述突變體的多核苷酸作為活性成分，和藥物可接受的載體。35.權(quán)利要求34的組合物，其中該CDCA1突變體包括含有KNTC2結(jié)合區(qū)的氨基酸序列，但不包含其nuf2域。36.權(quán)利要求35的組合物，其中該CDCA1突變體包含SEQIDNO:35所示的氨基酸序列。37.權(quán)利要求35的組合物，其中該CDCA1突變體具有通式.-[R]-[D]，其中[R]是膜轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，[D]是包含SEQIDNO:35所示氨基S吏序列的多肽。38.權(quán)利要求37的組合物，其中該膜轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)從下組中選擇聚精氨酸；Tat/RKKRRQRRR/SEQIDNO:37;Penetratin/RQIKIWFQNRRMKWKK/SEQIDNO:38;BuforinII/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK/SEQIDNO:39;Transportan/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/SEQIDNO:40;MAP(模型兩親肽)/KLALKLALKALKAALKLA/SEQIDNO:41;K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP/SEQIDNO:42;Ku70/VPMLK/SEQIDNO:43;Ku70/PMLKE/SEQIDNO:50;朊病毒/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/SEQIDNO:44;pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK/SEQIDNO:45;Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/SEQIDNO:46;SynBl/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/SEQIDNO:47;Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY/SEQIDNO:48;和麗-l/TSPLNIHNGQKL/SEQIDNO:49.39.—種評(píng)價(jià)NSCLC預(yù)后的方法，其中該方法包括如下步驟(a);險(xiǎn)測(cè)從待評(píng)價(jià)NSCLC預(yù)后的受試者收集的樣品中CDCA1和KNTC2其中之一或兩者的表達(dá)水平，和(b)若檢測(cè)到CDCAl和KNTC2其中之一或兩者的表達(dá)水平提高，則表明預(yù)后不良。40.權(quán)利要求39的方法，其中該方法包括檢測(cè)CDCAl和KNTC2兩者的表達(dá)水平的步驟。41.權(quán)利要求39的方法，其中表達(dá)水平是通過從下組選擇的任何一種方法;險(xiǎn)測(cè)的(a)檢測(cè)編碼SEQIDNO:34(CDCAl)或SEQIDNO:32(KNTC2)所示氨基酸序列的mRNA的存在，(b)才企測(cè)包含SEQIDNO:34(CDCAl)或SEQIDNO:32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的存在，和(c)檢測(cè)包含SEQIDNO:34(CDCAl)或SEQIDNO:32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的生物活性。42.用于評(píng)價(jià)NSCLC預(yù)后的試劑盒，其中該試劑盒包含從下組選^^的任何一種成分(a)用于才企測(cè)編碼SEQIDNO:34(CDCAl)或SEQIDNO:32(KNTC2)所示氨基酸序列的mRNA之存在的試劑，(b)用于檢測(cè)包含SEQIDNO:34(CDCAl)或SEQIDNO:32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)之存在的試劑，和(c)用于檢測(cè)包含SEQIDNO:34(CDCAl)或SEQIDNO:32(KNTC2)所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)之生物活性的試劑。全文摘要本發(fā)明基于如下的觀察，即CDCA1和KNTC2共激活以及它們的關(guān)連相互作用(cognateinteraction)在肺癌發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并且抑制該復(fù)合物的方法可用于治療非小細(xì)胞肺癌。文檔編號(hào)A61K47/46GK101283279SQ200680035270公開日2008年10月8日申請(qǐng)日期2006年7月19日優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日發(fā)明者中村佑輔,中鶴修一,醍醐彌太郎申請(qǐng)人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司