專利名稱：應(yīng)用肝配蛋白b2抑制新血管形成的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制血管發(fā)生或新血管形成的方法和組合物，更具體 地說(shuō)，涉及肝配蛋白(ephrin) B2在其中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管發(fā)生是許多眼病病理狀態(tài)如與年齡相關(guān)的黃斑變性、糖尿病 性-現(xiàn)網(wǎng)膜病和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病的標(biāo)志。血管發(fā)生級(jí)聯(lián)由大量介質(zhì)和 趨化因子引發(fā)。例如，與多級(jí)血管發(fā)生過(guò)程有關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞受體酪 氨酸激酶(RTK)已經(jīng)被公認(rèn)是血管發(fā)生的關(guān)鍵介質(zhì)。第一代生血 管細(xì)胞因子，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)，完全符合芽生 的毛細(xì)血管的概念。最近，血管生成素(angiopoietin ) /Tie2系統(tǒng)已 經(jīng)被確定為介導(dǎo)血管組裝和成熟的配體-受體系統(tǒng)。VEGF/VEGF受 體和血管生成素/Tie2受體家族也屬于RTK。Eph受體，即肝配蛋白的受體，是最大的酪氨酸激酶受體家族， 由8種EphA受體和6種EphB受體組成。Eph受體酪氨酸激酶家力矣 代表一個(gè)新的RTK類別，雖然該家族最初被鑒定為神經(jīng)元尋路 (pathfmding)分子，但是它在血管發(fā)生中的作用仍不清楚。基因敲 除小鼠和成年肝配蛋白B2-lacZ轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)已經(jīng)確定EphB受 體和肝配蛋白B配體是血管組裝、協(xié)調(diào)動(dòng)靜脈分化和邊界形成的關(guān) 鍵調(diào)節(jié)因子(非專利文獻(xiàn)2、 3和5)。另一方面，基因靶向?qū)嶒?yàn)已 經(jīng)顯示，肝配蛋白B2是脊推動(dòng)物胚胎中動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的早期標(biāo)記， 而相反地其受體EphB4標(biāo)記靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)1、 2、 4和 6)。而且，成體中的內(nèi)皮細(xì)胞保持其不對(duì)稱的動(dòng)靜脈表達(dá)模式，提 示肝配蛋白B/EphB系統(tǒng)在控制成體的血管內(nèi)環(huán)境平衡方面起作用， 并且具有控制成年人病理性血管發(fā)生的可能性(非專利文獻(xiàn)3和5 )。已有報(bào)道，給予Eph受體的拮抗物(如抗體)主要抑制癌性新血 管形成，而給予其促效劑則刺激新血管形成。因此，希望確定肝配 蛋白的作用模式，以及如何能夠應(yīng)用這些分子操作血管系統(tǒng)，特別 是在病理狀態(tài)中的應(yīng)用。在美國(guó)，糖尿病性視網(wǎng)膜病是20-65歲年齡段人群失明的主要原 因。糖尿病性視網(wǎng)膜病必不可少的病理狀態(tài)是視網(wǎng)膜的微血管病和 隨后的局部缺血。眾所周知，視網(wǎng)膜病中低氧導(dǎo)致視網(wǎng)膜新血管形 成。然而，血流不會(huì)灌注由視網(wǎng)膜新血管形成而新產(chǎn)生的血管溝， 致使視網(wǎng)膜局部缺血。這是因?yàn)檠軠鲜俏闯墒斓牟⑶沂茄?xì)胞滲 出的。此外，這些血管溝會(huì)經(jīng)常貫穿玻璃體腔。 一種理想的糖尿病 性視網(wǎng)膜病的治療方法是獲得成熟的血管溝，以抑制延伸方向錯(cuò)誤 的血管的新生，并且灌注缺氧^L網(wǎng)膜，以及避免缺氧。在歐洲和美國(guó)，與年齡相關(guān)的黃斑變性是成年人失明的主要原 因，并且在日本它占主要因素的三分之一。雖然異常的新血管出血、 視網(wǎng)膜剝離等等導(dǎo)致失明，但是病理狀態(tài)的本質(zhì)是新血管從脈絡(luò)膜 向黃斑的進(jìn)入。因此，抑制這些異常新血管的生成是保持視覺(jué)功能 的基本治療方法。已知色素上皮覆蓋新血管可抑制新血管延伸，但 其機(jī)制還不是很清楚。參考文獻(xiàn)以下文獻(xiàn)引入本文作為參考。4- d 丄I、 、 ^ r^1 4- ,、， 、^_ \TT一 口一 勺r\ a >i /rv i 。 m n ，下，'j人肌i: 矢閨下^'J甲1百么、丌下zuu4/u丄Joy。j。 非專利文獻(xiàn)l: Adams，R. H.等(2001 ) , Cell 104(1):57國(guó)69。 非專利文獻(xiàn)2: Adams， R. H.等(1999)， Genes Dev 13(3):295-306。 非專利文獻(xiàn)3: Gale，N. W.等(2001 ) ， Dev Biol 230(2):151國(guó)160。 非專利文獻(xiàn)4: Gerety，S. S.等(1999) ， Mol Cell 4(3):403國(guó)414。 非專利文獻(xiàn)5: Shin,D.等(2001 ) ， Dev Biol 230(2):139國(guó)150。 非專利文獻(xiàn)6: Wang，H.U.等(1998) ， Cell 93(5):741-753。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供抑制血管發(fā)生或新血管形成的方法、組合物 和預(yù)防和/或治療制劑。本發(fā)明的目的是提供有效治療與血管發(fā)生或 新血管形成有關(guān)的疾病或病癥的方法、組合物和預(yù)防和/或治療制劑。解決問(wèn)題的方法本發(fā)明提供一種抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)中DNA 合成的方法，包括使動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)接觸有效量 的肝配蛋白B2。一個(gè)買施例中，上述的 DNA '含、成由血管內(nèi)皮細(xì)月包生長(zhǎng)因子 (VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)或血小板衍生的生 長(zhǎng)因子(PDGF)誘導(dǎo)。本發(fā)明還提供一種抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)中 p44/p42 MAP激酶活化的方法，包括4吏動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜脈內(nèi)皮 細(xì)胞)接觸有效量的肝配蛋白B2。一個(gè)實(shí)施例中，上述的p44/p42 MAP激酶活化作用由VEGF、 bFGF或PDGF誘導(dǎo)。本發(fā)明還提供一種抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)中管腔 形成的方法，包括使動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)接觸有效量 的肝配蛋白B2。一個(gè)實(shí)施例中，上述的管腔形成由VEGF、 bFGF或PDGF"i秀導(dǎo)。一個(gè)實(shí)施例中，上述的接觸通過(guò)給包含動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜脈內(nèi) 皮細(xì)胞)的哺乳動(dòng)物施用肝配蛋白B2來(lái)完成。本發(fā)明還提供一種抑制視網(wǎng)膜新血管形成的方法，包括給個(gè)體施 用有效量的肝配蛋白B2。一個(gè)實(shí)施例中，上述的個(gè)體是具有病理性視網(wǎng)膜外血管發(fā)生或新 血管形成的個(gè)體或者是具有發(fā)生病理性視網(wǎng)膜外血管發(fā)生或新血管 形成可能性的個(gè)體。本發(fā)明還提供一種治療與血管發(fā)生或新血管形成有關(guān)的疾病或病癥的方法，包括給需要治療的個(gè)體施用有效量的肝配蛋白B2。本發(fā)明還提供一種抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)中DNA 合成的組合物，包含有效量的肝配蛋白B2。本發(fā)明還提供一種抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)中 p44/p42MAP激酶活化的組合物，包含有效量的肝配蛋白B2。本發(fā)明還提供一種抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)中管腔 形成的組合物，包含有效量的肝配蛋白B2。本發(fā)明還提供一種抑制視網(wǎng)膜新血管形成的組合物，包含有效量 的肝配蛋白B2。本發(fā)明還提供一種治療與血管發(fā)生或新血管形成有關(guān)的疾病或 病癥的藥物組合物，包含有效量的肝配蛋白B2。本發(fā)明還提供一種抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)中DNA 合成的制劑，包含有效量的肝配蛋白B2。本發(fā)明還提供一種抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)中 p44/p42MAP激酶活化的制劑，包含有效量的肝配蛋白B2。本發(fā)明還提供一種抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)中管腔 形成的制劑，包含有效量的肝配蛋白B2。本發(fā)明還提供一種抑制視網(wǎng)膜新血管形成的制劑，包含有效量的 肝配蛋白B2。本發(fā)明還提供一種治療與血管發(fā)生或新血管形成有關(guān)的疾病或 病癥的制劑，包含有效量的肝配蛋白B2。在上述用于抑制、阻止和預(yù)防或治療的方法、組合物和制劑的一 個(gè)實(shí)施例中，所述的肝配蛋白B2包含天然肝配蛋白B2的胞外域， 而不含跨膜域和胞質(zhì)域。在上述用于抑制、阻止和預(yù)防或治療的方法、組合物和制劑的另 一實(shí)施例中，所述的疾病或病癥選自與年齡相關(guān)的黃斑變性、局部 缺血性視網(wǎng)膜病、眼內(nèi)新血管形成、角膜新血管形成、視網(wǎng)膜新血 管形成、脈絡(luò)膜新血管形成、糖尿病性黃斑水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜 局部缺血、糖尿病性視網(wǎng)膜水腫、糖尿病性3見網(wǎng)膜病、癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜異位癥以及禿發(fā)癥。在上述用于抑制、阻止和預(yù)防或治療的方法、組合物和制劑的又 一實(shí)施例中，所述的疾病或病癥選自與年齡相關(guān)的黃斑變性、局部 缺血性視網(wǎng)膜病、眼內(nèi)新血管形成、角膜新生血管形成、視網(wǎng)膜新血管形成、脈絡(luò)膜新血管形成、糖尿病性黃斑水胂、糖尿病性^L網(wǎng) 膜局部缺血、糖尿病性視網(wǎng)膜水腫和糖尿病性視網(wǎng)膜病。 發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明提供抑制血管發(fā)生或新血管形成的方法和組合物。本 發(fā)明的組合物和方法能夠抑制病理性的血管發(fā)生或新血管形成而不 抑制生理性的血流。因?yàn)楸景l(fā)明的組合物和方法不影響正常的血管， 所以它們有益于治療與血管發(fā)生或新血管形成有關(guān)的疾病或病癥。


圖1A顯示肝配蛋白B2處理和EphB4處理對(duì)VEGF、 bFGF或 PDGF-BB處理過(guò)的HAoEC中胸苷摻入的影響。圖1B顯示肝配蛋白B2處理和EphB4處理對(duì)VEGF、 bFGF或 PDGF-BB處理過(guò)的HUVEC中胸苷摻入的影響。圖1C是顯示各組內(nèi)皮細(xì)胞形成的照片；分別是VEGF刺激7天 的對(duì)照組(未處理)、sephrinB2處理組、sEphB4處理組以及sephrinB2 與sEphB4共同處理組。圖2A是顯示肝配蛋白B2對(duì)VEGF或bFGF刺激下HAoEC中 ERK磷酸化的影響的電泳照片。圖2B是顯示肝配蛋白B2對(duì)VEGF刺激下HAoEC中VEGF受 體2(KDR)自磷酸化的影響的電泳照片。圖3顯示共施用bFGF和肝配蛋白B2的小鼠角膜中新血管形成 的定量測(cè)定結(jié)果。圖4是顯示平鋪的(flat-mounted)熒光素-葡聚糖灌注的視網(wǎng)膜 形成的熒光顯微照片，分別為對(duì)照(A )和sephrinB處理的模型(B )。圖5顯示無(wú)灌注區(qū)域在對(duì)照才莫型(OIR)中和sephrinB2處理的模型(0IR+肝配蛋白B2)中的面積比值。圖6是顯示第17天時(shí)(P17)新生小鼠視網(wǎng)膜表面的形成的掃描 電子顯微照片；分別為對(duì)照模型(OIR) (A)和sephrinB2處理的模型 (OIR+肝配蛋白B2) (B)。圖7顯示小鼠肝配蛋白B2處理和人肝配蛋白B2處理對(duì)bFGF 處理的HUVEC中胸苷攝入的影響。圖8是顯示眼底狀態(tài)的熒光照片；分別為10ng/mL人肝配蛋白 B2處理(A ) 、 PBS處理(B )和10ng/mL小鼠肝配蛋白處理(C )。
具體實(shí)施方式
肝配蛋白B2/EphB4系統(tǒng)在血管形成和血管發(fā)生中起重要作用。 我們發(fā)現(xiàn)肝配蛋白B2抑制內(nèi)皮細(xì)胞(EC )的DNA合成以及VEGF 和bFGF2誘導(dǎo)的p44/p42 MAP激酶活化作用，本發(fā)明以上述研究結(jié) 果為根據(jù)。肝配蛋白B2也能抑制內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成。此外，根據(jù)小 鼠的角膜微嚢分析(corneal micropocket assay )和角膜新血管形成的 定量，肝配蛋白B2抑制了 bFGF誘導(dǎo)的角膜血管發(fā)生。相應(yīng)地，靶 向肝配蛋白B2/EphB4及其抗血管發(fā)生信號(hào)通路可能有益于治療依 賴血管發(fā)生的疾病。在進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明之前，如下定義本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)， 除非另有說(shuō)明。定義術(shù)語(yǔ)"肝配蛋白B2",除非另有說(shuō)明，是指這樣的多肽其(l) 與天然肝配蛋白B2或其胞外域、優(yōu)選與天然人肝配蛋白B2具有基 本序列相似性；并且(2)具有天然肝配蛋白B2或胞外域的生物活 性。術(shù)語(yǔ)"肝配蛋白B2"包括天然肝配蛋白B2 (優(yōu)選天然人肝配蛋 白B2)及其胞外域，以及具有上述天然肝配蛋白B2或胞外域的生 物活性的類似物和變異體。應(yīng)當(dāng)注意，肝配蛋白B2的序列在本領(lǐng)域 是公知的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以完全認(rèn)識(shí)到胞外域、跨膜域和 胞質(zhì)域的序列和位置。如天然肝配蛋白B2那樣的"天然，，分子，是未經(jīng)人工干預(yù)而存在 的分子。但是，天然肝配蛋白B2也可以是未經(jīng)人工干預(yù)而存在的肝 配蛋白B2的胞外域。"全長(zhǎng)"肝配蛋白B2是既包含胞外域也包含胞內(nèi)域的肝配蛋白 B2。全長(zhǎng)肝配蛋白B2可以是天然的，或者可以是天然肝配蛋白B2 的類似物或變異體。與天然分子具有"基本序列相似性"的多肽與該天然分子在氨基 酸水平上至少約30%相同。該多肽與該天然分子在氨基酸水平上優(yōu) 選至少約40%、 50%、 60%、 .70%、 80%、 85%、 90%、 95%相同、更 優(yōu)選至少約98%相同，進(jìn)一步優(yōu)選約99%相同，更進(jìn)一步優(yōu)選100% 相同。術(shù)語(yǔ)類似物或變異體與天然分子的"百分比同一性"或"％同一 性"是指當(dāng)兩個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，該天然分子中含有的、在該類似物 或變異體中也發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列的百分比。百分比同一性可以用本領(lǐng)域中建立的任何方法或算法來(lái)確定，如LALIGN、 ClustalW或 BLAST。如果一種多肽能夠與天然肝配蛋白B2的受體結(jié)合，或者抑制內(nèi) 皮細(xì)胞的DNA合成、內(nèi)皮細(xì)胞中的胞外信號(hào)調(diào)節(jié)的激酶(ERK)磷 酸化、內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成、血管發(fā)生或新血管形成，則該多肽具 有天然肝配蛋白B2的"生物活性"。抑制內(nèi)皮細(xì)胞的DNA合成、內(nèi) 皮細(xì)胞中的ERK磷酸化、內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成、血管發(fā)生或新血管 形成的活性可以用本領(lǐng)域已知的，特別是如本申請(qǐng)所述的任何方法 來(lái)測(cè)定。"有效量"是足以實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的的物質(zhì)的量。例如，抑制DNA合 成的肝配蛋白B2的有效量是在體內(nèi)或在體外(視情況而定)足以導(dǎo) 致DNA合成量減少的量。治療疾病或病癥的肝配蛋白B2的有效量 是足以減少或消除該疾病或病癥的癥狀以及預(yù)防或延緩該疾病或病 癥的癥狀的肝配蛋白B2的量。特定物質(zhì)的有效量將隨不同因素而變 化，如該物質(zhì)的性質(zhì)、給藥途徑、接受該物質(zhì)的動(dòng)物的大小和物種、以及給予該物質(zhì)的目的。每個(gè)情況中的有效量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人 員按照本領(lǐng)域建立的方法憑經(jīng)驗(yàn)確定。術(shù)語(yǔ)"個(gè)體"是指任何動(dòng)物，優(yōu)選人類或非人類的哺乳動(dòng)物，更 優(yōu)選小鼠、大鼠、其他嚙齒類動(dòng)物、兔、狗、貓、豬、牛、馬或靈 長(zhǎng)類動(dòng)物，進(jìn)一步優(yōu)選人類。"病理性的血管發(fā)生或新血管形成，，可以是非生理性正常狀態(tài)的 血管的形成或新生。這種未成熟的和血細(xì)胞滲出的血管可能成為血 液可能灌注不到的血管。"病理性的血管發(fā)生或新血管形成，，也可本術(shù)語(yǔ)可以指受到如炎癥刺激的新血管的形成。"具有病理性血管發(fā)生或新血管形成的個(gè)體或者具有發(fā)生病理 性血管發(fā)生或新血管形成的可能性的個(gè)體"是指在該個(gè)體中已經(jīng)產(chǎn) 生上述的血管發(fā)生或新血管形成或者在個(gè)體中可能有將要產(chǎn)生這種 血管發(fā)生或新血管形成的因素。后者所述的個(gè)體可能已經(jīng)受到可能 顯示出發(fā)生"病理性血管發(fā)生或新血管形成，，癥狀的疾病或病癥的 影響但還沒(méi)有顯示出該癥狀，也可能已經(jīng)受到將發(fā)生"病理性血管 發(fā)生或新血管形成，，的刺激等等。"病理性血管發(fā)生或新血管形成"可以發(fā)生在"視網(wǎng)膜內(nèi)"或"視 網(wǎng)膜外"。"視網(wǎng)膜外"是指在視網(wǎng)膜組織外。血管發(fā)生或新血管形成的這些類型包括，例如從貫穿內(nèi)界膜的視網(wǎng)膜向玻璃體內(nèi)定 向的血管的形成或新生，以及從視網(wǎng)膜向脈絡(luò)膜定向的血管的形成或新生。術(shù)語(yǔ)"與血管發(fā)生或新血管形成有關(guān)的疾病或病癥"是指發(fā)生上 述"病理性血管發(fā)生或新血管形成，，的任何疾病或病癥，或因"病 理性血管發(fā)生或新血管形成，，引起的個(gè)體機(jī)能障礙。這樣的疾病或 病癥包括但不限于與年齡相關(guān)的黃斑變性、局部缺血性-現(xiàn)網(wǎng)膜病、 眼內(nèi)新血管形成、角膜新生血管形成、視網(wǎng)膜新血管形成、脈絡(luò)膜 新血管形成、糖尿病性黃斑水腫、糖尿病性^L網(wǎng)膜局部缺血、糖尿 病性視網(wǎng)膜水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜病、癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜異位癥以及禿發(fā)癥。術(shù)語(yǔ)"治療"疾病或病癥是指減少或者完全消除疾病或病癥的癥 狀(也可稱為"治愈")，或者阻止或延緩疾病或病癥的發(fā)生。術(shù)語(yǔ)"需要治療，，是指治療者(如治療人的醫(yī)生、護(hù)士、臨床護(hù)士等；治療動(dòng)物(包括非人類的哺乳動(dòng)物)的獸醫(yī))做出的決定。 該決定是根據(jù)治療者的評(píng)價(jià)范圍內(nèi)的多方面因素做出的，包括由于 用某一組合物可治療個(gè)體的某一狀態(tài)，而對(duì)個(gè)體當(dāng)前患病或可能將 患病的判斷。術(shù)語(yǔ)"組合物"包含至少一種活性成分，并且涉及有關(guān)物質(zhì)的組 合，所述物質(zhì)用于在對(duì)其應(yīng)用或施用該組合物的細(xì)月包、組織、器官 或動(dòng)物(優(yōu)選哺乳動(dòng)物、更優(yōu)選小鼠、大鼠、其他嚙齒類動(dòng)物、兔、 狗、貓、豬、牛、馬或靈長(zhǎng)類動(dòng)物，更進(jìn)一步優(yōu)選人類)中產(chǎn)生所 述活性成分的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將根據(jù)其需要理解并識(shí)別一種 適合的技術(shù)方法用于測(cè)定活性成分是否產(chǎn)生有效的預(yù)期結(jié)果。"藥物組合物"包含至少一種活性成分，并組合有使所述活性成 分在下述動(dòng)物上產(chǎn)生藥物作用的物質(zhì)，所述動(dòng)物為，優(yōu)選哺乳動(dòng)物， 更優(yōu)選小鼠、大鼠、其他嚙齒類動(dòng)物、兔、狗、貓、豬、牛、馬或 靈長(zhǎng)類動(dòng)物，更進(jìn)一步優(yōu)選人類。本領(lǐng)域技術(shù)人員能根據(jù)其需要理期結(jié)果。術(shù)語(yǔ)"抑制制劑"、"阻止制劑"和"預(yù)防和/或治療制劑"是 指至少 一 種活性成分被調(diào)制成能使活性成分產(chǎn)生作用，適合應(yīng)用或 施用形式的制劑。這些制劑可以在組合物的應(yīng)用或施用對(duì)象，即細(xì) 胞、組織、器官或動(dòng)物(優(yōu)選哺乳動(dòng)物、更優(yōu)選小鼠、大鼠、其他 嚙齒類動(dòng)物、兔、狗、貓、豬、牛、馬或靈長(zhǎng)類動(dòng)物，更進(jìn)一步優(yōu) 選人類)中使所述活性成分產(chǎn)生作用。肝配蛋白B2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響內(nèi)皮細(xì)胞能響應(yīng)生長(zhǎng)因子如VEGF、 bFGF或PDGF-BB ( PDGF 的B亞基二聚體)而被誘導(dǎo)增殖。肝配蛋白B2抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)中所有VEGF、bFGF和PDGF-BB刺激物誘導(dǎo)的DNA 合成。如圖1A所示，10ng/mL VEGF、bFGF或PDGF-BB誘導(dǎo)的DNA 合成的增加分別被200ng/mL肝配蛋白B2抑制40%、 30%和90%。 使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)也獲得幾乎相同的結(jié)果(圖IB)。 肝配蛋白B 2對(duì)DNA合成的這種抑制作用不是由細(xì)胞凋亡引起的。相應(yīng)的，肝配蛋白B2能夠抑制多種刺激物包括VEGF、 bFGF 和PDGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞DNA合成。雖然肝配蛋白B2的受體 (EphB4)為靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)識(shí)，這種受體是否存在于動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì) 胞中尚未知曉，盡管如此^f旦靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的DNA 合成均被抑制。相反地，VEGF誘導(dǎo)的管腔形成并不受EphB4處理的影響。 肝配蛋白B2抑制生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的促有絲分裂反應(yīng)。這是因?yàn)楦?配蛋白B2能抑制在動(dòng)脈和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF和bFGF誘導(dǎo)的 ERK (p42/44)磷酸化。然而，肝配蛋白B2不能抑制VEGF受體2 的自磷酸化，這表明肝配蛋白B2不是如同抑制VEGF功能那樣的機(jī) 制，來(lái)干擾VEGF和VEGF受體2之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，肝配蛋 白B2可以用于抑制動(dòng)脈或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF或bFGF誘導(dǎo)的 ERK磷酸化。已知bFGF是有效的生血管因子。肝配蛋白B2能夠抑制bFGF 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖。施用肝配蛋白B2可顯著阻斷bFGF誘導(dǎo)的血 管發(fā)生。相反地，施用EphB4顯示沒(méi)有影響。肝配蛋白B2在體內(nèi)模型中的作用角膜微嚢分析是一種典型的新血管形成體內(nèi)模型。在此模型中， 施用肝配蛋白B2能顯著阻斷bFGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生。相反地，施用 EphB4顯示沒(méi)有影響。氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病(OIR)模型是糖尿病性視網(wǎng)膜病的動(dòng)物模型。 在此動(dòng)物模型中，肝配蛋白B2能抑制定向視網(wǎng)膜外的病理性血管發(fā) 生，并增強(qiáng)視網(wǎng)膜內(nèi)血管網(wǎng)狀系統(tǒng)的形成和血管成熟。激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)模型是作為與年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)的實(shí)驗(yàn)性疾病模型。肝配蛋白B2能夠抑制CNV。 因此，肝配蛋白B2能夠抑制定向視網(wǎng)膜外的病理性血管發(fā)生的 新生(如脈絡(luò)膜新血管形成、跨越內(nèi)界膜的新血管形成)而不抑 制生理性血流。相應(yīng)地，肝配蛋白B2可用于抑制病理性血管發(fā)生或 新血管形成。因此，肝配蛋白B2有益于治療與年齡相關(guān)的黃斑變性、 局部缺血性視網(wǎng)膜病、眼內(nèi)新血管形成、角膜新血管形成、視網(wǎng)膜 新生血管形成、脈絡(luò)膜新血管形成、糖尿病性黃斑水肺、糖尿病性 -f見網(wǎng)膜局部缺血、糖尿病性一見網(wǎng)膜水腫、糖尿病性-f見網(wǎng)膜病、癌癥、 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜異位癥以及禿發(fā)癥，以及與血管發(fā)生或 新血管形成相關(guān)的其他疫病或病癥。一個(gè)實(shí)施例中，肝配蛋白B2用于治療與眼血管發(fā)生或新血管形 成相關(guān)的疾病或病癥。肝配蛋白B2不會(huì)引起對(duì)—見網(wǎng)膜生理性血流的 損害，這種損害通常是由目前主要使用的光動(dòng)力學(xué)療法(PDT)和 多種抗生成血管制劑治療引起的。因此，可以利用肝配蛋白B2來(lái)治 療濕性和早期干性AMD，例如通過(guò)抑制病理性脈絡(luò)膜新血管形成， 而不會(huì)引起對(duì)視網(wǎng)膜生理性血流的損傷。也可以通過(guò)抑制跨越內(nèi)界 膜的病理性新血管形成來(lái)治療糖尿病性-現(xiàn)網(wǎng)膜病，而不會(huì)引起對(duì)朝L 網(wǎng)膜生理性血流的損傷。肝配蛋白B2的使用和施用在本發(fā)明中有用的肝配蛋白B2可以是具有所需活性的任何肝配 蛋白B2，包括類似物和變異體。肝配蛋白B2的結(jié)構(gòu)不受限制，只 要其能達(dá)到本發(fā)明的效果即可。雖然肝配蛋白B2包含胞外域，但也 可以不含跨膜域和胞質(zhì)域，肝配蛋白B2也可以是全長(zhǎng)的。肝配蛋白 B2還可以是一短片段。本發(fā)明使用的肝配蛋白B2可以通過(guò)分離和純化天然存在的蛋白 質(zhì)來(lái)獲得，也可以通過(guò)基因重組從微生物等中產(chǎn)生。例如參考美 國(guó)專利號(hào)6303769或Mol Immunol. 1995 Nov; 32(16):1197-205中描 述的人肝配蛋白B2cDNA的序列，全長(zhǎng)蛋白質(zhì)、包含胞外域的蛋白 質(zhì)等等可以利用常規(guī)技術(shù)來(lái)制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以改變天然肝配蛋白B2,優(yōu)選利用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的技術(shù)方法。也可以 使用市場(chǎng)上可買到的作為醫(yī)藥制品或制劑的任何肝配蛋白B 2 。尤其， 當(dāng)肝配蛋白B2用于藥物組合物時(shí)，更優(yōu)選純化成用于醫(yī)療目的的純 度的肝配蛋白B2。例如鑒于肝配蛋白的免疫原性，可以通過(guò)融合 到免疫球蛋白的Fc區(qū)域上(優(yōu)選人IgG的Fc區(qū)域)，將其改變成 任何適于給個(gè)體施用的形式。應(yīng)當(dāng)注意在隨后將描述的實(shí)施例中， 因?yàn)榫哂信c人Fc融合的可溶性肝配蛋白B2 (通常含有胞外域但不 含跨膜域和胞質(zhì)域)的蛋白質(zhì)易于得到，所以使用所述蛋白質(zhì)。然 而，這不表示本發(fā)明的效果僅限于實(shí)施例中應(yīng)用的肝配蛋白B2。含有肝配蛋白B2的組合物可以為多種形式，如適于給個(gè)體(如 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)施用的組合物，或給樣本(如細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞，尤其 是動(dòng)脈或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)、組織或器官)應(yīng)用的組合物。制備這些 形式的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。即，本發(fā)明也提供適合預(yù)先確定 的肝配蛋白B2應(yīng)用的制劑。雖然適于預(yù)先確定的肝配蛋白B2應(yīng)用 的制劑沒(méi)有特別限制，但可以提到的有"抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜 脈內(nèi)皮細(xì)胞)中DNA合成的制劑"、"抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜脈 內(nèi)皮細(xì)胞)中p44/42 MAP激酶活化的制劑"、"抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì) 胞(或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)中管腔形成的制劑"、"抑制視網(wǎng)膜新血管 形成的制劑，，等等。這種含有肝配蛋白B2的制劑可以包含除肝配蛋 白B2以外的成分，只要其不阻斷肝配蛋白B2的作用并對(duì)上述個(gè)體 或樣本不產(chǎn)生任何有害作用即可。將這樣的制劑施用給個(gè)體或應(yīng)用到樣本(如纟田胞(如內(nèi)皮細(xì)胞，尤其是動(dòng)脈或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)、組 織或器官)中是按下述的方式完成的，即將制劑內(nèi)的肝配蛋白B2接 觸上述的個(gè)體或樣本。含有肝配蛋白B2的藥物組合物也可以是適于給個(gè)體施用該組合 物的多種形式的制劑。制備這些形式的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。 即，本發(fā)明也提供適合預(yù)先確定的肝配蛋白B2應(yīng)用的制劑。雖然適 于預(yù)先確定的肝配蛋白B2應(yīng)用的制劑沒(méi)有特別限制，但可以提到的 有"抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)中DNA合成的制劑"、"抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)中p44/42 MAP激酶活化 的制劑"、"抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)中管腔形成的 制劑，，、"抑制視網(wǎng)膜新血管形成的制劑"、"預(yù)防或治療與血管 發(fā)生或新血管形成相關(guān)的疾病或病癥的制劑"等等。雖然本說(shuō)明書 中用"動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(或靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)"進(jìn)行表述，但僅本發(fā)明 優(yōu)選的實(shí)施例涉及動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。本發(fā)明也提供用于預(yù)防或治療疾 病或病癥的藥物組合物或制劑，所述的疾病或病癥選自與年齡相關(guān) 的黃斑變性、局部缺血性視網(wǎng)膜病、眼內(nèi)新血管形成、角膜新生血 管形成、視網(wǎng)膜新血管形成、脈絡(luò)膜新血管形成、糖尿病性黃斑水 腫、糖尿病性視網(wǎng)膜局部缺血、糖尿病性一見網(wǎng)膜水腫、糖尿病性禎L 網(wǎng)膜病、癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜異位癥以及禿發(fā)癥。肝 配蛋白B2能夠治療或預(yù)防至少一種上述疾病或病癥。這樣的組合物 可以包含有效量的肝配蛋白B2和藥物可接受的載體。該組合物可以 包含其他藥物可接受的成分(包括除了肝配蛋白B2以外的抑制新血 管形成的制劑)，只要不阻斷肝配蛋白B2的作用即可。還可以提供 主要包含肝配蛋白B2、用于預(yù)防和/或治療的藥物組合物或制劑。肝配蛋白B2可以與適合給藥途徑的藥物可接受的載體混合在一 起全身給藥，例如口服或者通過(guò)肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)注射?？梢杂枚喾N 生理學(xué)可接受的載體來(lái)施用肝配蛋白B2，其制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員 所知的,并且在例如Remington's Pharmaceutical Science (第18版) A. Gennaro編，1990, Mack Publishing Company, Easton， PA和Pollock 等中有描述。肝配蛋白B2優(yōu)選通過(guò)非腸胃途徑給藥(例如通過(guò)肌肉內(nèi)、腹膜 內(nèi)、靜脈內(nèi)、眼內(nèi)、玻璃體內(nèi)或皮下注射或植入)。用于非腸胃給 藥的制劑包括無(wú)菌水溶液或非水溶液、懸浮液或乳劑?？梢允褂枚?種水性載體，例如水、緩沖水、鹽水等。其他合適的載體的例子包 括聚丙二醇、聚乙二醇、植物油、明膠、氫化的萘和可注射的有機(jī) 酯，如油酸乙酯。這樣的制劑也可以含有輔助物質(zhì)，如防腐劑、濕 潤(rùn)劑、緩沖劑、乳化劑和/或分散劑。生物相容的、生物可降解的交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以 用來(lái)控制活性成分的釋放?；蛘?，肝配蛋白B2可以通過(guò)口服給藥。預(yù)期用于口服的制劑可 以根據(jù)藥物組合物生產(chǎn)領(lǐng)域所知的任何方法制備為固體或液體的形 式。該組合物可以任選地含有甜味劑、調(diào)p未劑、著色劑、芳香劑和 防腐劑，以提供更可口的制劑。用于口服給藥的固體劑型包括膠嚢、片劑、丸劑、粉劑和顆粒劑。 通常，這些藥物制劑含有與藥物可接受的無(wú)毒賦形劑混合在一起的 活性成分。這些賦形劑包括，例如，惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、 蔗糖、葡萄糖、甘露醇、纖維素、淀粉、磷酸鈣、磷酸鈉、高嶺土 等。也可以使用粘合劑、緩沖劑和/或潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂)。片劑和丸劑還可以用腸溶包衣制備。用于口服給藥的液體劑型包括藥物可接受的乳劑、溶液、懸浮劑、 糖漿和軟明膠膠嚢。這些劑型含有本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑，如水或油介質(zhì)，并且也 可以含有輔劑，如濕潤(rùn)劑、乳化劑和懸浮劑。肝配蛋白B2也可以局部給藥，例如通過(guò)貼劑或者直接涂lt于眼 部，或者通過(guò)離子電滲療法。肝配蛋白B2可以作為持續(xù)釋放組合物提供，如美國(guó)專利 5,672,659和5，595，760中所述的組合物。使用立即釋放組合物還是持 續(xù)釋放組合物取決于所治療的疾病的性質(zhì)。如果該疾病由急性或超急 性疾病組成，則用立即釋放形式治療比持續(xù)釋放組合物更優(yōu)選。另夕卜， 對(duì)于某些預(yù)防性的或長(zhǎng)期的治療，持續(xù)釋放組合物可能是合適的。肝配蛋白B2也可以用植入物遞送。這樣的植入物可以是生物可 降解的和/或生物相容的植入物，或者可以是生物不可降解的植入物。 該植入物對(duì)于活性劑可以是通透的或不通透的。 一種眼才直入物可以 插入眼腔如前房或后房?jī)?nèi)，或者可以植入鞏膜、跨脈絡(luò)膜間隙或磁二 璃體外部的無(wú)血管區(qū)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，眼植入物可以置于無(wú)血管區(qū)上方，如鞏膜上，從而使藥物透過(guò)鞏膜擴(kuò)散到需要的治療 部位，例如眼內(nèi)間隙和眼黃斑。此外，透過(guò)鞏膜擴(kuò)散的部位優(yōu)選;也 靠近黃斑。用于遞送肝配蛋白B2的植入物的實(shí)例包括但不限于以下專利所 述的裝置美國(guó)專利3,416,530; 3,828,777; 4,014,335; 4,300,557; 4,853,224; 5，300，114; 5,516,522; 5,766,242; 5,830,173; 6，001，386;4,327,725 5，178，635 5,476,511 5,743,274 5,824,073 5,916,584 6,251 ，090;4,946,450,4,997,652,5,147,647;5,164,188;;5,322,6915,403,901，5,443,505;5，466，466;;5,632,984:5,679,6665,710,165;5,725,493;;5,766,619:5,770,5925,773,019;5,824,072;;5,836,935.5，869，079,5,902,598;5，904，144;;6,074，661,6，110，485.,6,126,687;6,146,366;和6,299,895，和WO 01/30323和WO 01/28474，所有這 些專利都在此引入作為參考。 劑量為了產(chǎn)生單一劑量而與載體材料結(jié)合的活性成分的量隨所治療 的對(duì)象和具體給藥方式而變化。通常，應(yīng)當(dāng)以足以減少或消除疾病 癥狀的量施用肝配蛋白B2。每次給藥約lng/kg至100mg/kg體重的劑量水平在新生血管性疾 病的治療中通常是有用的。當(dāng)直接對(duì)眼睛給藥時(shí)，優(yōu)選的劑量范圍 是眼內(nèi)濃度達(dá)到約lng/mL至約100ng/mL。該劑量可以單次給藥或 者分為多次給藥。通常，所需劑量應(yīng)當(dāng)以設(shè)定好的間隔給藥持續(xù)延 長(zhǎng)的一段時(shí)間，通常至少幾周，盡管可能需要幾個(gè)月或幾個(gè)月以上 的更長(zhǎng)的給藥時(shí)間。本領(lǐng)域4支術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，準(zhǔn)確的劑量可以4艮據(jù)以下多種因素略 微調(diào)整給藥時(shí)間；給藥途徑；制劑的性質(zhì)；排泄率；所治療的具 體疾?。患膊〉膰?yán)重程度；以及患者的年齡、體重、健康狀況和性 別。由于各種給藥途徑具有不同的效率，預(yù)期所需的劑量有很大的 差異。例如， 一般預(yù)計(jì)口服比靜脈內(nèi)或玻璃體內(nèi)注射需要更高的劑 量水平。這些劑量水平的變化可以用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化程序進(jìn)行調(diào)整。精確的治療有效劑量水平和模式優(yōu)選地由主治醫(yī)生考 慮上述因素來(lái)確定。除了治療已有的新生血管性疾病以外，肝配蛋白B2還可以預(yù)防 性地給藥，以預(yù)防或減緩這些疾病的發(fā)作。在預(yù)防性應(yīng)用中，給易 患特定新生血管性疾病或處于該病危險(xiǎn)中的對(duì)象施用肝配蛋白B2。 精確的給藥量取決于多種因素如該對(duì)象的健康狀態(tài)、體重等。下面本發(fā)明根據(jù)實(shí)施例進(jìn)行描述，但本發(fā)明不被限制于這些實(shí)施 例范圍內(nèi)。實(shí)施例在下面的實(shí)施例中，下列縮寫具有如下含意。未定義的縮寫具有 其公認(rèn)的含意。 °C =攝氏度 hr =小時(shí) min =分鐘 scc =秒 |LlM =微摩爾mM二毫摩爾mL^毫升 HL =微升 mg =毫克 嗎=微克DMEM = Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基ITS =胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒FBS =胎牛血清MEM =改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基PBS-磷酸鹽緩沖液VEGF =血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF =成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子PDGF =血小板衍生的生長(zhǎng)因子 SDS =十二烷基硫酸鈉 PAGE =聚丙烯酰胺凝膠電泳 EC^內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC =人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 HAoEC =人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞 OIR =氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病 CNV =脈絡(luò)膜新血管形成 AMD^與年齡相關(guān)的黃斑變性在實(shí)施例中，由于可溶性蛋白易于得到，作為肝配蛋白B2和 EphB4使用可溶性蛋白(下文中，分別稱為"sephrinB2"和"sEphB4"; 這些蛋白均含有胞外域，但不包含跨膜域和胞質(zhì)域)。小鼠sephrinB2 和sEphB4(兩者都是與人Fc區(qū)域融合的形式)來(lái)自R&D Systems, Inc. (614 McKinley Place NE， Minneapolis 55413, USA)。如下面實(shí)施例5 所描述，合成的人肝配蛋白B2-人Fc蛋白也用作肝配蛋白B2。下面所顯示的實(shí)驗(yàn)除非特殊說(shuō)明均重復(fù)三次，得出代表性實(shí)驗(yàn)的 數(shù)據(jù)(平均值土SD)。對(duì)正態(tài)分布群體采用Student t-檢驗(yàn)，當(dāng)p<0.05 時(shí)認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。實(shí)施例1:肝配蛋白B2抑制生長(zhǎng)因子刺激下內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移為研究肝配蛋白B2和EphB4對(duì)生長(zhǎng)因子刺激下血管內(nèi)皮細(xì)胞的 影響，進(jìn)行HAoEC和HUVEC的fH]胸苷摻入-DNA合成和內(nèi)皮管 腔試驗(yàn)。1. HAoEC和HUVEC的[3H]胸苷摻入-DNA合成 人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAoEC)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)購(gòu) 自Clonetics Corp. ( San Diego, California, USA ),并且保存在添加有 10%胎牛血清(FBS)的Clonetics EGM培養(yǎng)基中。內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添 加物也由Clonetics提供。HAoEC和HUVEC在涂鋪I型膠原蛋白 的培養(yǎng)皿(iwaki,日本)上內(nèi)皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Clonetics Corp., San Diego,California, USA)中，在37。C和5% C02、 95%空氣的條件下培養(yǎng)， 培養(yǎng)基每2-3天更換一次。細(xì)胞傳代4-5次后用于實(shí)驗(yàn)。在存在或不 存在200ng/mL的肝配蛋白B2或者EphB4的條件下，內(nèi)皮細(xì)胞在含 有10% FCS的DMEM ( Nacalai tesque，日本)中用10ng/mL VEGF、 bFGF或PDGF-BB處理18小時(shí)。然后細(xì)胞暴露于20|aCi/mL的[甲基 -3司胸苷(Amersham) 6小時(shí)。細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用自動(dòng)細(xì)胞收 集器回收到玻璃纖維濾器上，并且用直接(3計(jì)數(shù)器測(cè)量[曱基」H]胸苷 的攝入。結(jié)果顯示于圖1A和圖1B中。人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAoEC)在VEGF、 bFGF或PDGF-BB處 理后與未處理對(duì)照相比DNA合成增長(zhǎng)3-10倍。肝配蛋白B2抑制這 些刺激物刺激下的DNA合成，然而，sEphB4或者sEphB4和sephrinB2 兩者則都不抑制。圖1A和圖1B分別顯示sephrinB2對(duì)HAoEC (圖IA) 和HUVEC (圖1B )在VEGF、 bFGF或PDGF-BB刺激下DNA 合成的影響。圖中參考字符代表如下C:對(duì)照組(未處理)，B2: sephrinB2處理組，B4: sEphB4處理組。圖中*標(biāo)記表示結(jié)果為處理 組與無(wú)生長(zhǎng)因子刺激的未處理組具有顯著差異，而**標(biāo)記表示結(jié)果 為處理組與有相同生長(zhǎng)因子刺激^旦無(wú)sephrinB2或sEphB4處理組具 有顯著差異。如圖1A所示，10ng/mL的VEGF、 bFGF或PDGF-BB 誘導(dǎo)下DNA合成的增長(zhǎng)分別被200嗎/mL sephrinB2抑制40%、 30% 和90%。使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)獲得幾乎相同的結(jié)果(圖IB) 。在細(xì)胞培養(yǎng)期間未觀察到明顯的凋亡細(xì)胞(未顯示數(shù)據(jù))。 2.內(nèi)皮管腔試驗(yàn)?zāi)z原蛋白凝膠如下形成將水冷的明月交溶液(10xM199, H20, 0.53MNaHCO3, 200mM L-谷氨酰胺，I型膠原蛋白，O.IM NaOH，體積 比為100:27.2:50:10:750:62.5 )與細(xì)胞在lx基礎(chǔ)培養(yǎng)基(見下文)中 混合在一起，細(xì)胞濃度為3xl(^細(xì)胞/mL,體積比為4^f分明膠溶液 l份細(xì)胞。在37。C下膠凝30分鐘后，在凝膠上覆蓋lx基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 該培養(yǎng)基是由1% FBS、 2mM L-谷氨酰胺、50|ug/mL抗壞血酸、 26.5mMNaHC03、 100單位/mL青霉素和110單位/mL鏈霉素并且補(bǔ)充了 40ng/mL bFGF、 40ng/mL VEGF和80nM PMA、 lxITS組成的。 膠凝后立即添加sephrinB2和sEphB4 (各200 ng/mL )到lx基礎(chǔ)培 養(yǎng)基中。為了對(duì)管腔形成進(jìn)行定量，在加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基48小時(shí)后測(cè) 量每個(gè)高倍(20倍)視野的管腔數(shù)目。 一個(gè)管腔被定義為由一個(gè)或 多個(gè)長(zhǎng)度超過(guò)lOOpm的內(nèi)皮細(xì)胞組成的伸長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)。對(duì)于每個(gè)孔， 評(píng)價(jià)間隔為100jim光學(xué)切面的5個(gè)獨(dú)立的視野，測(cè)量每個(gè)20倍視野 中管腔的平均數(shù)。細(xì)胞毒性用來(lái)自Boehringer Mannheim的細(xì)胞增殖 試劑盒II評(píng)價(jià)。在第7天也可觀察到對(duì)照組(未處理)和sephrinB2 或sEphB4處理組以及sephrinB2和sEphB4共同處理組中VEGF 刺激下內(nèi)皮細(xì)胞的形成。圖1C為顯示對(duì)照組(未處理)和sephrinB2或sEphB4處理組 以及sephrinB2和sEphB4共同處理組中內(nèi)皮細(xì)胞在VEGF刺激7天 時(shí)管腔形成狀態(tài)的照片。在第7天時(shí)，sephrinB2處理組中VEGF誘 導(dǎo)的管腔形成比對(duì)照組減少(圖1C)。相反，VEGF誘導(dǎo)的管腔形 成不受sEphB4處理的影響。相應(yīng)的，肝配蛋白B2能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞在包括VEGF、 bFGF 和PDGF的多種刺激物誘導(dǎo)下的DNA合成。盡管肝配蛋白B2的確 切機(jī)制還不清楚，但是DNA合成的減少不會(huì)是由細(xì)胞凋亡引起的， 因?yàn)楦鶕?jù)細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)沒(méi)有觀察到明顯的凋亡。令人驚訝的是靜脈 內(nèi)皮細(xì)胞和動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的DNA合成均被抑制，因?yàn)楦闻涞鞍?B2的受體(EphB4)是靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記，而已知?jiǎng)用}內(nèi)皮細(xì)胞 不具有這種受體。與對(duì)DNA合成的影響一致，肝配蛋白B2也能夠抑制VEGF誘 導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成。實(shí)施例2:肝配蛋白B2對(duì)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的p42/44 ERK磷酸化和 受體自磷酸化的影響為了研究肝配蛋白B2抑制內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF或bFGF誘導(dǎo)的促 有絲分裂應(yīng)答的機(jī)制，我們通過(guò)Western分析檢測(cè)了肝配蛋白B2對(duì) 內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF或bFGF刺激下ERK ( p42/44 )磷酸化的影響。在存在或不存在50ng/mL的sephrinB2的條件下，內(nèi)皮細(xì)胞在含 有3% FCS的EGM-DMEM ( Nacalai tesque，日本)中放置1小時(shí)。 進(jìn)一步，加入10ng/mL的bFGF或10ng/mL的VEGF處理內(nèi)皮細(xì)月包 5分鐘(對(duì)照組細(xì)胞不處理)。來(lái)自內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)樣品的制備和 Western印跡分析操作如下全細(xì)胞裂解液、胞質(zhì)或核提取物均乂人內(nèi) 皮細(xì)胞中分離。應(yīng)用以及不應(yīng)用免疫沉淀進(jìn)行Western印跡分析。蛋 白質(zhì)樣品通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 分離，隨后蛋白質(zhì)通過(guò)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用脫脂奶封閉 后，將轉(zhuǎn)印有蛋白質(zhì)的膜與抗磷酸酪氨酸或KDR ( sc-504).的抗體 (購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, California, USA ))(抗 體稀釋濃度為1:500) —起在4。C下孵育過(guò)夜。洗滌后，將膜與辣根 過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體(Bio-Rad， Richmond, California, USA) (抗體稀釋濃度為1:3000 ) —起室溫孵育1小時(shí)。用Amersham增 強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)系統(tǒng)按照制造商的使用說(shuō)明進(jìn)行顯色。圖2A中顯示肝配蛋白B2對(duì)VEGF或bVGF刺激下HAoEC的 ERK磷酸化的影響(p44/p42:總ERK; pp44/pp42:磷酸化的ERK)。 10ng/mL VEGF或25ng/mL的bFGF處理增加了 ERK的磷酸化水平。 sephrinB2抑制VEGF和bFGF誘導(dǎo)的ERK磷酸化。例如，200(ig/mL 的sephrinB2抑制70% VEGF誘導(dǎo)的ERK磷酸化。因此，可見肝配 蛋白抑制HAoEC中VEGF和bFGF刺激下ERK的磷酸化。然后，我們研究了 VEGF刺激的HUVEC中VEGF-受體2( KDR) 的自磷酸化。在存在或不存在50ng/mL的sephrinB2的條件下，內(nèi)皮 細(xì)胞在含有3% FCS的EGM-DMEM (Nacalai tesque，日本)中放置 1小時(shí)。進(jìn)一步，加入lOng/mL的bFGF或10ng/mL的VEGF處理 內(nèi)皮細(xì)胞5分鐘(對(duì)照組細(xì)胞不處理)。與上述方法相同，從細(xì)胞 裂解物中免疫沉淀(IP)出受體(KDR),印跡分析用磷酸酪氨酸抗體 (PY20)來(lái)完成。圖2 B為顯示肝配蛋白對(duì)VEGF刺激的HAoEC中VEGF受體2 (KDR)自磷酸化的影響的電泳照片。圖2B顯示肝配蛋白B2對(duì)VEGF刺激的HAoEC中VEGF受體2的自磷酸化沒(méi)有明顯作用。 10ng/mL VEGF使VEGF-受體2自磷酸化提高14倍。sephrinB2不抑 制VEGF-受體2的自磷酸化。在上述兩種磷酸化實(shí)驗(yàn)中，用HUVEC獲得基本相同的結(jié)果(未 顯示數(shù)據(jù))。因此這些結(jié)果表明，肝配蛋白B2抑制動(dòng)脈和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中 VEGF或bFGF誘導(dǎo)的ERK磷酸化。這種作用可能至少部分解釋了 肝配蛋白B2抑制VEGF或bFGF誘導(dǎo)的這些細(xì)胞增殖的活性。但是， 肝配蛋白B2不抑制VEGF-受體2的自磷酸化。因此，肝配蛋白B2 不以干擾VEGF與VEGF-受體2之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作為抑制VEGF功 能的機(jī)制。實(shí)施例3:在小鼠角膜中共施用肝配蛋白B2抑制bFGF誘導(dǎo)的 血管發(fā)生已知堿性FGF (bFGF)是一種有效的生血管因子。由于肝配蛋 白B2能夠抑制bFGF誘導(dǎo)的EC細(xì)胞增殖，我們檢查了肝配蛋白B2 是否也能夠抑制血管發(fā)生。我們基本如Kenyon， B.M.等，(1996) Ophthalmol. Vis. Sci" Vol. 37(8):1625-1632中所述，略加改動(dòng)，在小鼠中進(jìn)行了角膜孩t嚢分析 以及角膜新血管形成的定量。簡(jiǎn)言之，制備含有90ng人bFGF的 0.3jiL Hydron丸(IFN Sciences, New Brunswick, New Jersey, USA )， 將其植入雄性BALB/c小鼠的角膜中。sephrinB2或sEphB4 ( 100ng/ 丸)直接加入bFGF/Hydron溶液中。該丸定位于距角膜緣1.0mm處。 才直入后，對(duì)每只眼滴加氧氟沙星/滴眼劑。6天后，殺死動(dòng)物，對(duì)角 膜血管照相。用軟件包NIH Image進(jìn)行小鼠角膜中新血管形成的定 量分析。植入藥丸6天后，我們檢查了新血管的外生長(zhǎng)。bFGF明顯 誘導(dǎo)了小鼠角膜中的血管發(fā)生。我們進(jìn)一步檢查了 sephrinB2和sEph B4對(duì)bFGF誘導(dǎo)的角膜新 血管形成的影響。施用sephrinB2明顯阻斷了 bFGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生， 但是施用EphB4顯示沒(méi)有影響。圖3顯示小鼠角膜中bFGF和肝配蛋白共給藥的血管發(fā)生定量分析的結(jié)果。圖3的縱軸表示當(dāng)bFGF 存在時(shí)新血管形成區(qū)域面積以100%表示時(shí)，代表新血管形成區(qū)i或面 積的百分?jǐn)?shù)值。豎條為每組(每組n=6)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。 定量分析也證明，肝配蛋白B2完全抑制了 bFGF誘導(dǎo)的角膜新血管 形成(圖3)。實(shí)施例4:肝配蛋白B2對(duì)氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新血管形成的影響利用C57BL/6J小鼠(來(lái)自SLC，日本)如下制備氧誘導(dǎo)的視網(wǎng) 膜病(OIR)模型。將出生7天(P7)的小鼠和母鼠一同放入已制成 為含75%高含氧量狀態(tài)的盒子中5天。小鼠在置于高含氧量條件下5 天后，即出生后第12天(P12),被;改回到20%含氧量的標(biāo)準(zhǔn)條件 下，研究此后的視網(wǎng)膜血管反應(yīng)。這樣處理的小鼠顯示了視網(wǎng)膜新 血管形成的大范圍發(fā)展。動(dòng)物在P19時(shí)100%發(fā)生—見網(wǎng)膜新血管形成。 在第19天(P19)時(shí)，新生血管束是澄清的，并且從內(nèi)界膜向玻璃 體延伸，尤其在中部外周。為研究肝配蛋白B2對(duì)視網(wǎng)膜新血管形成的影響，第13天(P13) 和第15天(P15 )時(shí)將溶于100fiL PBS ( n=6 )中的200嗎sephrinB2 和作為對(duì)照的200|xL PBS ( n=6 )腹膜內(nèi)注射給OIR小鼠，每天一次。 在第17天(P17)測(cè)定一見網(wǎng)膜新血管形成。按照以下概述的方案，利用熒光素-葡聚糖血管造影術(shù)(Lab Invest 2004; 84(8): 973-80)測(cè)定平鋪的視網(wǎng)膜。首先，將小鼠深麻醉并按 0.03mL/g體重向左心室灌注50mg/mL含2 x 106分子量焚光素-葡聚 糖(Sigma)的溶液。取出眼睛，在4%多聚曱醛中固定至少3個(gè)小 時(shí)。然后移出角膜和晶狀體，切開周邊視網(wǎng)膜并在顯微鏡載玻片上 平鋪，用于在熒光顯微鏡下檢查。圖4所示為平鋪的熒光素-葡聚糖 灌注的視網(wǎng)膜對(duì)照組和sephrinB2處理的模型組的熒光顯微照片(A: 對(duì)照OIR才莫型；B: sephrinB2處理的才莫型)。在sephrinB2處理的才莫 型中，從視網(wǎng)膜的中部到外周是清楚的白色(圖4B)。這表明視網(wǎng) 膜中存在能灌注熒光素-葡聚糖的正常血管。觀察到在sephrinB2處 理的模型中存在的正常血管較OIR模型中相對(duì)更多(圖4A)。平鋪的熒光素-葡聚糖灌注視網(wǎng)膜的熒光顯微照片也可以在軟件
中測(cè)量無(wú)灌注區(qū)域的面積。圖5是顯示對(duì)照模型(OIR)和sephrinB2 處理模型(OIR+肝配蛋白B2)中無(wú)灌注區(qū)域的面積比的圖。圖5中縱 軸表示無(wú)灌注區(qū)域的面積比，以百分?jǐn)?shù)(％)表示，OIR模型中無(wú)灌 注區(qū)域表示為100%。豎條為每組(每組11=6)所有動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)偏差 (SD)。由圖5可見，sephrinB2處理模型相對(duì)于對(duì)照模型，其無(wú)灌 注區(qū)域的面積減少。sephrinB2處理才莫型和對(duì)照;漠型之間的碎見網(wǎng)膜無(wú) 血管比例具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5中標(biāo)記為**: pO.Ol)。
此外，用掃描電子顯微鏡檢查sephrinB2對(duì)新血管的新生的影響。 如同以前在Cell Tissue Res. ( 1992) 270:165-172中所述，在分析血 管系統(tǒng)的最佳條件下進(jìn)行掃描透射電子顯微術(shù)。用日立H-800透射 電子顯微鏡和S-800掃描電子顯微鏡拍照。圖6為SEM照片(從玻 璃體側(cè)觀察的視網(wǎng)膜)，顯示新生鼠在P17時(shí)的視網(wǎng)膜表面，分別 為對(duì)照模型(OIR) ( A)和sephrinB2處理模型(OIR+肝配蛋白B2 ) (B)。在圖6A對(duì)照模型的照片中，觀察到從視網(wǎng)膜到玻璃體有異 常新血管(跨越內(nèi)界膜的新血管形成)新生(尤其圖右側(cè)像孔的部 分)。反之，在圖6B的sephrinB2處理模型的照片中，沒(méi)有觀察到 這種像孔的部分，由此可見進(jìn)入到玻璃體的新血管的新生被抑制。
因此，通過(guò)用sephrinB2處理OIR小鼠，即使觀察到脈管網(wǎng)狀系 統(tǒng)基本平行的向膜延伸，也能抑制向玻璃體形成的新血管的新生。 并且，sephrinB2處理不會(huì)減少視網(wǎng)膜本身的血流量。這是sephrinB2 在血管生長(zhǎng)中的一個(gè)重要作用。sephrinB2不僅抑制定向視網(wǎng)膜夕卜(本 實(shí)施例中為向玻璃體延伸)的病理性新血管形成，而且能夠增強(qiáng)脈 管網(wǎng)狀系統(tǒng)的形成和—見網(wǎng)膜中脈管成熟。這一作用對(duì)治療糖尿病性 視網(wǎng)膜病是最佳的。
實(shí)施例5:人肝配蛋白B2對(duì)新血管形成的抑制作用
在本實(shí)施例中，評(píng)價(jià)了來(lái)自于人類DNA庫(kù)和人Fc的肝配蛋白 B2融合蛋白及其新血管形成抑制效果。
1.人肝配蛋白B2-人Fc合成蛋白的制備如下所述，將人肝配蛋白B2的cDNA片段融合到編碼人IgGl抗體 Fc部分的cDNA的5'末端。參考美國(guó)專利號(hào)6,303,769或Mol Immunol. 1995Nov; 32(16): 1197-205中這種人肝配蛋白B2cDNA的序列。
Fc的克隆操作如下以人脾cDNA庫(kù)(100ng)作為模板，使用正 向引物GAA GAT CTC CCA AAT CTT GTG AC A AAA CTC (序列 1 )和反向引物GCG GCC GCT CAT TTA CCC GGA GA (序歹寸2 ) 以及KODplus (TOYOBO)進(jìn)行PCR。純化擴(kuò)增得到的約700bp的 DNA片段，將純化后的DNA片段亞克隆到Teasy載體(Promega)中， 鑒定為人IgGlFc。
人肝配蛋白B2的克隆操作如下以人胎盤cDNA庫(kù)(100ng)作為 模板，使用正向引物GCG AAG CTT ACC ATG GCT GTG AGA AGG GAC(序列3 )和反向引物GCG AGA TCT GGC CAC TTC GGA ACC GAG GAT (序列4)以及KODplus (TOYOBO)進(jìn)行PCR。純化擴(kuò) 增得到的約680bp的DNA片段。當(dāng)純化的DNA片段亞克隆到Teasy 載體(Promega)中，并驗(yàn)證堿基序列時(shí)，在上述人肝配蛋白B2 cDNA 堿基序列中，678 bp DNA片段按1-678的堿基位置顯示。推測(cè)人肝 配蛋白B2 DNA片段編碼的蛋白質(zhì)包括人肝配蛋白B2的胞外域但不 包括胞質(zhì)域和跨膜域。
對(duì)于克隆的EFN-B2DNA片段，其5'末端用Hind III限制性內(nèi)切 酶處理，3'末端用BglII限制性內(nèi)切酶處理；而對(duì)于FcDNA片#殳， 其5'末端用BglII限制性內(nèi)切酶處理，3'末端用Not I限制性內(nèi)切酶 處理。對(duì)于這些片段，利用HindIII和NotI限制性內(nèi)切酶處理后的 哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA4-Myc-His A (Invitrogen)和DNA連4姿試 劑盒ver.2.1 (TAKARA)將三段片段連接。將通過(guò)連接得到的載體轉(zhuǎn) 化到大腸桿菌XL21中。從長(zhǎng)成的大腸桿菌菌落中純化質(zhì)粒，鑒定堿 基序列，確定其為人EFN-B2 ( 1-678 bp) -Fc。
將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，按以下培養(yǎng)條件培養(yǎng)。培養(yǎng)基 為添加10% FBS(Biowest胎牛血清)和抗生素(GIBCO 1%青霉素和 1%鏈霉素)的DMEM (SIGMA)。在37。C下，在含5%(302的孵箱中培養(yǎng)3天。肝配蛋白B2穩(wěn)定細(xì)胞系通過(guò)磷酸4丐法基因轉(zhuǎn)染和 250嗎/mL Zeocin (invivogen)藥物篩選獲得。當(dāng)從穩(wěn)定細(xì)胞系中收集 培養(yǎng)上清液時(shí)，用GIT培養(yǎng)基培養(yǎng)(Nihon Pharmaceutical Co.， Ltd.)。 隨后，按如下操作從肝配蛋白B2-Fc穩(wěn)定細(xì)胞系中純化表達(dá)蛋白。 收集約100mL的培養(yǎng)上清液，離心(1100rpm， 5分鐘，4°C ) 去除碎片，如死細(xì)胞。在其中加入100pL蛋白A-瓊脂糖，4。C下?lián)u 動(dòng)2小時(shí)。此后，離心(2000rpm, 5分鐘，4°C )棄上清，通過(guò)向沉 淀(瓊脂糖+肝配蛋白B2 )中加入洗滌緩沖液(IO mM Tris-HCl pH7.4, 150mMNaCl， 0.1% NP40)去除非特異性吸附的蛋白質(zhì)等。該洗滌操 作進(jìn)行3次。洗滌3次后，加入70pL洗脫緩沖液(0.1M甘氨酸pH3.0 )， 在冰上靜置10分鐘，離心(2000rpm, 2分鐘，4°C )后收集沉淀。 本操作重復(fù)7次。在吸光度OD280下測(cè)量收集的上清液中蛋白質(zhì)的濃 度。收集含有高濃度蛋白質(zhì)的上清液，加入1/10量的1MTris-HClpH8.0 進(jìn)行中和，逆磷酸鹽緩沖液透析過(guò)夜。透析后收集樣品，用BCA方法 進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測(cè)定。同時(shí)以非還原態(tài)或還原態(tài)進(jìn)行SDS-PAGE,并通 過(guò)分子量確認(rèn)樣品為人肝配蛋白B2-人Fc合成蛋白。 2. HUVEC的[3司胸苷摻入-DNA合成與實(shí)施例1同樣的方式，我們研究上述的人肝配蛋白B2-人Fc 合成蛋白對(duì)HUVEC中DNA合成的影響。然而，在存在或不存在1 nM、 10nM或100nM的人肝配蛋白B2-Fc蛋白的條件下，內(nèi)皮細(xì)胞 在含有10% FCS的DMEM ( Nacalai tesque，曰本)中用0.6nM bFGF 處理18小時(shí)。用100nM的小鼠肝配蛋白B2-人Fc嵌合蛋白(R&D Systems, Inc. (614 McKinley Place NE， Minneapolis 55413， USA))作 為陽(yáng)性對(duì)照。圖7中顯示HUVEC的胸香摻入結(jié)果。圖7中縱軸表示沒(méi)有bFGF 和肝配蛋白B2處理時(shí)的百分?jǐn)?shù)(％ )。當(dāng)HUVEC受bFGF ( 0.6 nM ) 刺激而沒(méi)有肝配蛋白B2處理時(shí)，與bFGF未處理的對(duì)照組相比DNA 合成增長(zhǎng)5倍。甚至在沒(méi)有bFGF刺激作用時(shí)100 nM的人肝配蛋白 B2-人Fc合成蛋白也抑制了 DNA合成。0.6 nM bFGF誘導(dǎo)的DNA合成的增長(zhǎng)分別被1 nM、10nM和100nM的人肝配蛋白B2-Fc合成 蛋白抑制10%、 30%和95% (圖7)。細(xì)胞培養(yǎng)期間未觀察到明顯的 凋亡細(xì)胞(未顯示數(shù)據(jù))。實(shí)施例6:肝配蛋白B2在CNV沖莫型上的評(píng)傷、激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)模型被認(rèn)為是AMD的生 物學(xué)模型，利用該模型評(píng)價(jià)人肝配蛋白B2-人Fc合成蛋白抑制新血 管形成的作用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物.利用來(lái)自6只短尾猴的12只眼睛。這些動(dòng)物是從抹式會(huì)社新日 本科學(xué)(Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd )挑選出的無(wú)病原 體動(dòng)物，都進(jìn)行無(wú)痛處理。用鹽酸氯胺酮全麻后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在林式 會(huì)社新日本科學(xué)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)認(rèn)可的道德標(biāo)準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào) cl89-001 )下進(jìn)行實(shí)-驗(yàn)。脈絡(luò)膜新血管形成的實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)在上述猴子的眼底后極，利用多色激光(波長(zhǎng)647nm),通過(guò)光 凝固法實(shí)'瞼性誘導(dǎo)CNV (Novus Omni Laser; Lumenis， Santa Clara, Calif)。斑點(diǎn)大小為直徑lOO^im,曝光時(shí)間0.1秒。角膜表面的輸出 功率為700 mW。通過(guò)利用接觸透鏡，在每只眼的中心窩以外部分造 成8處灼傷。肝配蛋白B2的給藥方法和濃度激光照射后立即給藥和在照射后五天給藥，即共分兩次，按上文 實(shí)施例5所述方法制備的人肝配蛋白B2-人Fc合成蛋白在玻璃體內(nèi) 給藥。用27G注射針頭分別將調(diào)節(jié)玻璃體內(nèi)肝配蛋白B2濃度為1 ng/mL、 10 ng/mL和100 ng/mL的0.1 mL PBS溶液/人睫狀環(huán)處注射 到眼中。注射0.1mL的PBS作為陰性對(duì)照。用10ng/mL和100 ng/mL 上述小鼠肝配蛋白B2-人Fc嵌合蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照。CNV的評(píng)價(jià)激光照射10天后，進(jìn)行熒光素眼底血管造影術(shù)來(lái)鑒定脈絡(luò)膜新 生血管。由靜脈內(nèi)施用0.1 mL/kg的5%熒光素鈉，用眼底照相枳j(TRC-50EX， Topcon Corporation)完成熒光素眼底血管造影術(shù)。開始 注射后5-6分鐘拍攝熒光素眼底照片評(píng)價(jià)脈絡(luò)膜新生血管的超射線 透射性(hiperlucency )。由專業(yè)的眼科專家對(duì)照片進(jìn)行評(píng)價(jià)。除了 3只眼睛由于眼部介質(zhì)不透明而不能評(píng)價(jià)外，確定每個(gè)有顯著熒光染 料超射線透射性的激光斑損傷都具有活性。圖8為如下處理后提供的熒光素眼底照片。圖8A為10ng/mL人 肝配蛋白B2治療結(jié)果；圖8B為陰性對(duì)照(PBS處理)結(jié)果；圖8C 為10ng/mL小鼠肝配蛋白B2治療結(jié)果。對(duì)于PBS注射的陰性對(duì)照，10/16為具有活性的CNV。相反， 肝配蛋白B2處理組的CNV活性損傷比為1 ng/mL、 10ng/mL和 100ng/mL肝配蛋白B2治療時(shí)損傷比分別為5/16、 0/8和3/8。在利 用10ng/mL和100ng/mL的小鼠肝配蛋白B2-人Fc嵌合蛋白的陽(yáng)性 對(duì)照組中，分別有5/8和5/16為活性CNV。如上所述，在利用HUVEC的體外系統(tǒng)中，人肝配蛋白B2-人Fc 合成蛋白呈濃度依賴性抑制細(xì)胞增殖。尤其，蛋白濃度為100 nM時(shí)， 抑制增殖能力達(dá)95%。人肝配蛋白B2-人Fc合成蛋白也抑制激光誘 導(dǎo)CNV模型中新血管的產(chǎn)生。10ng/mL的玻璃體內(nèi)濃度是有效的。肝配蛋白B2在激光模型中遷移的色素上皮上表達(dá)(未顯示數(shù) 據(jù))。因此，推測(cè)色素上皮上肝配蛋白B2的表達(dá)終止了新血管形成。 該實(shí)施例的結(jié)果證明了肝配蛋白B 2抑制新血管形成的作用。工業(yè)上的應(yīng)用本發(fā)明的組合物和方法有益于治療與血管發(fā)生或新血管形成有 關(guān)的疾病或病癥。特別是，本發(fā)明的組合物和方法能夠抑制視網(wǎng)膜 外的病理性血管發(fā)生和新血管形成而不抑制視網(wǎng)膜內(nèi)的生理性血 流。因此，與目前建議使用的注射PTD和其他多種抗血管發(fā)生劑(如 抗-VEGF劑)的治療方法相比，本發(fā)明的組合物和方法能有利地用 于治療與血管發(fā)生或新血管形成有關(guān)的疾病或病癥，如AMD和糖尿 病性^L網(wǎng)膜病。
權(quán)利要求
1. 一種抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中DNA合成的方法，包括使該動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞接觸有效量的肝配蛋白B2的步驟。
2，如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述DNA合成由內(nèi)皮細(xì)月包 生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子或血小板衍生的生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)。
3. —種抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中p44/p42MAP激酶活化的方法，包 括使該動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞接觸有效量的肝配蛋白B2的步驟。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述p44/p42MAP激酶活化 由內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子或血小板衍生的生 長(zhǎng)因子誘導(dǎo)。
5. —種抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成的方法，包括^f吏該動(dòng)脈內(nèi) 皮細(xì)胞接觸有效量的肝配蛋白B2的步驟。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述管腔形成由內(nèi)皮細(xì)胞生 長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子或血小板衍生的生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)。
7. 如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述肝配蛋白B2 包含天然肝配蛋白B2的胞外域，而不包含跨膜域和胞質(zhì)域。
8. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中對(duì)包含動(dòng)脈內(nèi)皮 細(xì)^^的哺乳動(dòng)物施用肝配蛋白B2。
9. 一種抑制視網(wǎng)膜新血管形成的方法，包括對(duì)個(gè)體施用有效量的 肝配蛋白B2。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述個(gè)體是具有病理性一見網(wǎng) 膜外血管發(fā)生或新血管形成的個(gè)體或可能產(chǎn)生病理性視網(wǎng)膜外血管 發(fā)生或新血管形成的個(gè)體。
11. 一種治療與血管發(fā)生或新血管形成有關(guān)的疾病或病癥的方 法，包括對(duì)需要治療的個(gè)體施用有效量的肝配蛋白B2。
12.如一又利要求11所述的方法，其中所述疾病或病癥選自與年 齡相關(guān)的黃斑變性、局部缺血性視網(wǎng)膜病、眼內(nèi)新血管形成、角膜 新生血管形成、視網(wǎng)膜新血管形成、脈絡(luò)膜新血管形成、糖尿病性 黃斑水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜局部缺血、糖尿病性視網(wǎng)膜水胂、糖尿病性視網(wǎng)膜病、癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜異位癥和禿發(fā)癥。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述疾病或病癥選自與年 齡相關(guān)的黃斑變性、局部缺血性視網(wǎng)膜病、眼內(nèi)新血管形成、角膜 新生血管形成、視網(wǎng)膜新血管形成、脈絡(luò)膜新血管形成、糖尿病性 黃斑水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜局部缺血、糖尿病性^L網(wǎng)膜水腫和糖尿 病性3見網(wǎng)膜病。
14. 如權(quán)利要求9-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述肝配蛋白 B2包含天然肝配蛋白B2的胞外域，而不包含^,膜域和胞質(zhì)域。
15. —種抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中DNA合成的組合物，包含有效量 的肝配蛋白B2。
16. —種抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中p44/p42MAP激酶活化的組合物， 包含有效量的肝配蛋白B2。
17. —種抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成的組合物，包含有效量的 肝配蛋白B2。
18. —種抑制視網(wǎng)膜新血管形成的組合物，包含有效量的肝配蛋 白B2。
19. 一種治療與血管發(fā)生或新血管形成有關(guān)的疾病或病癥的藥物 組合物，包含有效量的肝配蛋白B2。
20. 如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其中所述疾病或病癥選 自與年齡相關(guān)的黃斑變性、局部缺血性視網(wǎng)膜病、眼內(nèi)新血管形成、角膜新生血管形成、視網(wǎng)膜新血管形成、脈絡(luò)膜新血管形成、糖尿 病性黃斑水腫、糖尿病性—見網(wǎng)膜局部缺血、糖尿病性一見網(wǎng)膜水胂、 糖尿病性視網(wǎng)膜病、癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜異位癥和禿 發(fā)癥。
21. 如^又利要求20所述的藥物組合物，其中所述疾病或病癥選 自與年齡相關(guān)的黃斑變性、局部缺血性視網(wǎng)膜病、眼內(nèi)新血管形成、角膜新生血管形成、視網(wǎng)膜新血管形成、脈絡(luò)膜新血管形成、糖尿 病性黃斑水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜局部缺血、糖尿病性視網(wǎng)膜水腫和 糖尿病性一見網(wǎng)膜病。
22. 如權(quán)利要求15-21中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述肝配蛋白B2包含天然肝配蛋白B2的胞外域，而不包含跨膜域和胞質(zhì)域。
23. —種抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)>5包中DNA合成的制劑，包含有效量的 肝配蛋白B2。
24. —種抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)月包中p44/p42 MAP激酶活化的制劑， 包含有效量的肝配蛋白B2。
25. —種抑制動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成的制劑，包含有效量的肝 配蛋白B2。
26. 如權(quán)利要求23-25中任一項(xiàng)所述的制劑，其中所述肝配蛋白 B2包含天然肝配蛋白B2的胞外域，而不包含跨膜域和胞質(zhì)域。
27. —種抑制視網(wǎng)膜新血管形成的制劑，包含有效量的肝配蛋白B2。
28. 如權(quán)利要求27所述的制劑，其中所述肝配蛋白B2包含天 然肝配蛋白B2的胞外域，而不包含跨膜域和胞質(zhì)域。
29. —種預(yù)防或治療與血管發(fā)生或新血管形成有關(guān)的疾病或病癥 的制劑，包含有效量的肝配蛋白B2。
30. 如權(quán)利要求29所述的預(yù)防或治療疾病或病癥的制劑，其中 所述疾病或病癥選自與年齡相關(guān)的黃斑變性、局部缺血性一見網(wǎng)膜病、 眼內(nèi)新血管形成、角膜新生血管形成、視網(wǎng)膜新血管形成、脈絡(luò)膜 新血管形成、糖尿病性黃斑水腫、糖尿病性一見網(wǎng)膜局部缺血、糖尿 病性視網(wǎng)膜水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜病、癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、子 宮內(nèi)膜異位癥和禿發(fā)癥。
31. 如權(quán)利要求30所述的預(yù)防或治療疾病或病癥的制劑，其中 所述疾病或病癥選自與年齡相關(guān)的黃斑變性、局部缺血性一見網(wǎng)力莢病、 眼內(nèi)新血管形成、角膜新生血管形成、視網(wǎng)膜新血管形成、脈絡(luò)膜 新血管形成、糖尿病性黃斑水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜局部缺血、糖尿 病性視網(wǎng)膜水腫和糖尿病性#見網(wǎng)膜病。
32. 如權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)所述的制劑，其中所述肝配蛋白 B2包含天然肝配蛋白B2的胞外域，而不包含跨膜域和胞質(zhì)域。
全文摘要
抑制血管發(fā)生或新血管形成的方法和組合物，以及有益于治療與血管發(fā)生或新血管形成有關(guān)的疾病或病癥的方法和組合物。本發(fā)明的組合物包含有效量的肝配蛋白B2，本發(fā)明的方法包括施用有效量的肝配蛋白B2的步驟。本發(fā)明的組合物和方法有益于治療與血管發(fā)生或新血管形成有關(guān)的疾病或病癥。本發(fā)明的組合物和方法也可以抑制視網(wǎng)膜新血管形成。
文檔編號(hào)A61P43/00GK101257915SQ20068003240
公開日2008年9月3日 申請(qǐng)日期2006年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月5日
發(fā)明者佐佐由季生, 石橋達(dá)朗, 藤澤公彥, 鍵本忠尚 申請(qǐng)人:阿克曼生物制藥株式會(huì)社;國(guó)立大學(xué)法人九州大學(xué)