專利名稱：：包含甲狀旁腺激素、緩沖劑和穩(wěn)定劑的穩(wěn)定的甲狀旁腺激素組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及穩(wěn)定的甲狀旁腺激素(PTH)，其中包含緩沖劑和穩(wěn)定劑，及更具體地，本發(fā)明涉及穩(wěn)定的PTH組合物，其中使用琥珀酸、蘋(píng)果酸、組氨酸或碳酸氫銨作為緩沖劑，使用山梨糖醇或甘露醇作為穩(wěn)定劑。
背景技術(shù)：
：人甲狀旁腺激素(PTH)作為含有84個(gè)氨基酸的多肽由甲狀旁腺分泌。它在體內(nèi)具有調(diào)節(jié)鈣代謝的重要作用，從而控制骨的生長(zhǎng)和濃縮。已有報(bào)告指出在低C濃度下分泌的PTH通過(guò)作用于骨和腎細(xì)胞促進(jìn)C產(chǎn)的釋放(Mayer,G,P.(1979)Endocrinology2,607-611;Rotts，J.T.，Kronenberg，H.M.,Rosenbaltt,M.(1982)Adv.ProteinChem.35,323-396)，且PTH即使具有全部氨基酸序列的一部分，仍表現(xiàn)出其生物活性，其中PTH(1-34)是有代表性的在氨基末端(N-末端)區(qū)域含有34個(gè)氨基酸的活性片段(Br.Med.J.1980280:1340-44)。盡管PTH(1-34)和PTH(1-38)的生物活性彼此類似，仍發(fā)現(xiàn)在雄性和雌性大鼠中，PTH(1-34)導(dǎo)致骨肉瘤(惡性骨瘤)發(fā)病率增高的副作用，所述骨肉瘤的發(fā)病率依賴于劑量和處理的持續(xù)時(shí)間(BarbehennEKetal.，TrendsEndocrinolMetab.2001Nov;12(9):383)，這一直是一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。根據(jù)已開(kāi)發(fā)的遺傳工程技術(shù)，PTH已經(jīng)從多種細(xì)菌、酶等中以重組蛋白質(zhì)的形式制備而成(J.Biol.Chem.1989264(8):4367-74)，然而，其活性容易喪失，該喪失是由諸如氧化作用、脫酰胺作用等的化學(xué)變性和肽鍵斷裂造成的。實(shí)驗(yàn)上，當(dāng)使含有84個(gè)氨基酸的PTH(1-84)與氧化劑，如過(guò)氧化氫反應(yīng)時(shí)，PTH(l-84)的活性迅速降低，這是由Met8和Metl8殘基的氧化所引起的，這些在最初的研究中有所揭示(TheJournalofBiologicalChemistry,Vol.259,No.9,5507-5513,1984)。在開(kāi)發(fā)具有生物活性的肽，如用于醫(yī)學(xué)目的的PTH中，必然要考慮PTH分離和保存的穩(wěn)定性。然而，PTH的上述不穩(wěn)定性已經(jīng)成為PTH制劑的嚴(yán)重障礙。因此，考慮到制劑，對(duì)克服該障礙的穩(wěn)定的組合物多種研究引起了科學(xué)上的注意力。PCT公開(kāi)號(hào)WO/1993/11785公開(kāi)了穩(wěn)定的甲狀旁腺激素組合物，其含有糖和氯化鈉，和PCT公開(kāi)號(hào)WO/1999/31137公開(kāi)了PTH的穩(wěn)定晶體形式及其制備方法；然而，這兩個(gè)文獻(xiàn)都沒(méi)有描述包含緩沖劑和穩(wěn)定劑的穩(wěn)定的PTH組合物。其間，PCT公開(kāi)號(hào)WO/1999/39337公開(kāi)了含有醋酸鹽或酒石酸鹽和糖類的穩(wěn)定的PTH組合物，它相似于與根據(jù)本發(fā)明的含有緩沖劑和穩(wěn)定劑的PTH組合物。然而，所述緩沖劑和穩(wěn)定劑的成分與本發(fā)明的那些不相同。另外，本發(fā)明的PTH組合物不比上面所參考的文獻(xiàn)中的PTH組合物更容易分解(見(jiàn)表3)，且本發(fā)明的PTH組合物的穩(wěn)定性在冷凍干燥后顯著地增高，從而確保其穩(wěn)定性高于上述文獻(xiàn)中的PTH組合物的穩(wěn)定性。此外，以上文獻(xiàn)集中PTH的一部分——PTH(1-34)的穩(wěn)定性，而本發(fā)明顯示能夠在很高的水平上保持全長(zhǎng)PTH(1-84)的穩(wěn)定性，這是本發(fā)明與眾不同的特征。通常，很難配制不穩(wěn)定的全長(zhǎng)PTH，這是因?yàn)榘被岬拈L(zhǎng)度越長(zhǎng)，分解就越容易發(fā)生。此外，由于已有報(bào)道指出當(dāng)長(zhǎng)期施用時(shí)，PTH(1-34)具有可能引起骨肉瘤的發(fā)生的副作用(FDA已命令醫(yī)藥公司將這種危險(xiǎn)作為警告寫(xiě)入PTH(1-34)的產(chǎn)物——特拉帕肽中)。醫(yī)藥公司已設(shè)法開(kāi)發(fā)不具有危險(xiǎn)的全長(zhǎng)PTH的制劑。因此，本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)識(shí)到如下內(nèi)容并完成了本發(fā)明本發(fā)明的PTH組合物能夠從蛋白質(zhì)PTH穩(wěn)定配制，所述蛋白質(zhì)PTH比正常低分子量藥物更加不穩(wěn)定，這是因?yàn)楫?dāng)琥珀酸，蘋(píng)果酸，組氨酸或碳酸氫銨作為緩沖劑使用且山梨糖醇或甘露醇作為穩(wěn)定劑使用時(shí)，本發(fā)明的PTH組合物不易分解。公開(kāi)內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的一個(gè)目的是提供液體甲狀旁腺激素組合物，所述液體甲狀旁腺激素組合物包含甲狀旁腺激素、緩沖劑和穩(wěn)定劑。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供甲狀旁腺激素組合物，所述甲狀旁腺激素組合物經(jīng)冷凍干燥具有含量低于2%的水，且包含甲狀旁腺激素、緩沖劑和穩(wěn)定劑。技術(shù)解決方案本發(fā)明提供液體甲狀旁腺激素組合物，所述液體甲狀旁腺激素組合物包含治療有效劑量的甲狀旁腺激素，一定劑量緩沖劑，該劑量能夠調(diào)節(jié)pH值在4.0-6.0的范圍內(nèi)變化，和在0.05-20重量份范圍內(nèi)的穩(wěn)定劑。另外，本發(fā)明提供甲狀旁腺激素組合物，所述甲狀旁腺激素組合物經(jīng)冷凍干燥具有含量低于2%的水，且包含甲狀旁腺激素、緩沖劑和穩(wěn)定劑。此外，本發(fā)明提供一種利用冷凍干燥的組合物制備注射劑的方法。在下文中，將不具體描述本發(fā)明。首先，本發(fā)明提供甲狀旁腺激素，所述甲狀旁腺激素包含治療有效劑量的甲狀旁腺激素，一定劑量緩沖劑，該劑量能夠調(diào)節(jié)pH值在4.0-6.0的范圍內(nèi)變化，和在0.05-20重量份范圍內(nèi)的穩(wěn)定劑。人甲狀旁腺激素(PTH)作為含有84個(gè)氨基酸的多肽由甲狀旁腺(parathyroidglans)分泌。它在體內(nèi)調(diào)節(jié)鈣代謝中具有重要作用，從而控制骨的生長(zhǎng)和濃縮。已有報(bào)告指出PTH即使具有全部氨基酸序列的一部分，仍表現(xiàn)出其生物活性，且PTH(1-34)是有代表性的在氨基末端(N-末端)區(qū)域含有34個(gè)氨基酸的活性片段(Br.Med.J.1980280:1340-44)。根據(jù)本發(fā)明，PTH包括具有來(lái)源于上述氨基酸序列的PTH活性的所有片段以及具有1到84的氨基酸序列的PTH。另外，本發(fā)明的PTH包括最初的34個(gè)或更多的N-末端殘基，例如，PTH(l-34),PTH(l-37),PTH(l-38)和PTH(1-41)，以及l(fā)-5個(gè)用于提高PTH穩(wěn)定性和半衰期的氨基酸取代。例如，它包括這樣的PTH氨基酸取代，其用提高PTH對(duì)氧化的穩(wěn)定性的亮氨酸或其他疏水性氨基酸取代在第8和/或第18位置的蛋氨酸殘基，以及用提高PTH對(duì)蛋白酶穩(wěn)定性的胰蛋白酶非敏感性氨基酸，例如組氨酸或其他氨基酸，替換第25到27區(qū)域的氨基酸。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及由84個(gè)氨基酸組成的PTH，該P(yáng)TH是通過(guò)利用微生物的重組制備方法(美國(guó)專利5，010,010)或通過(guò)化學(xué)合成(美國(guó)專利4,427,827)制備的。PTH易于分解，該分解是由諸如氧化作用、脫酰胺作用等的化學(xué)變性和肽鍵斷裂造成的。由于其長(zhǎng)度最長(zhǎng)，全長(zhǎng)PTH(1-84)更容易分解。因此，為了用于醫(yī)學(xué)目的，穩(wěn)定PTH是最為重要的。本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)制備與多種緩沖劑和穩(wěn)定劑混合的多種PTH組合物，檢驗(yàn)了哪種組合物最為禾急定。首先，為了選擇適合于利用由重組大腸桿菌制備的PTH(1-84)(SEQ.ID.No.l)制備穩(wěn)定的PTH組合物的pH值，制備在pHs上有代表性的緩沖溶液并將PTH(1-84)加入到所述溶液中，從而比較所述組合物的穩(wěn)定性。結(jié)果，證實(shí)了最穩(wěn)定PTH組合物的pH值為5.0(見(jiàn)表l)。穩(wěn)定性的比較通過(guò)利用反相(RP)HPLC測(cè)定保存下來(lái)的PTH組合物的量的方法進(jìn)行。根據(jù)以上結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人意欲選擇適當(dāng)?shù)木彌_劑，該選擇是通過(guò)設(shè)置pH值為5.0并改變所使用的緩沖劑的種類進(jìn)行的。利用琥珀酸、蘋(píng)果酸、組氨酸、醋酸、甘氨酸或檸檬酸作為緩沖劑對(duì)PTH(1-84)組合物的測(cè)試在5(TC進(jìn)行7天，然而利用RPHPLC測(cè)定保存下來(lái)的PTH(1-84)的量。作為結(jié)果，證實(shí)了用于制備穩(wěn)定的PTH組合物的緩沖劑種類包括琥珀酸、蘋(píng)果酸、醋酸、檸檬酸以及它們的鹽，或氨基酸組氨酸、精氨酸或甘氨酸，優(yōu)選地為，琥珀酸、蘋(píng)果酸、組氨酸以及它們的鹽(見(jiàn)表2)。根據(jù)以上結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人意欲選擇適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑，該選擇是通過(guò)選擇琥珀酸、蘋(píng)果酸或組氨酸作為緩沖劑，并改變所使用的穩(wěn)定劑的種類來(lái)進(jìn)行的，其中所述琥珀酸、蘋(píng)果酸或組氨酸是高度評(píng)級(jí)為導(dǎo)致大量保存下來(lái)的PTH的3種物質(zhì)。利用山梨糖醇或甘露醇作為穩(wěn)定劑對(duì)PTH(1-84)組合物的測(cè)試在40。C進(jìn)行7天，然后利用RPHPLC測(cè)定保存下來(lái)的PTH(1-84)的量。作為結(jié)果，證實(shí)了用于制備穩(wěn)定的PTH組合物的穩(wěn)定劑種類包括山梨糖醇、甘露醇、海藻糖、蔗糖、EDTA或吐溫80，優(yōu)選地，山梨糖醇或甘露醇(見(jiàn)表3)。當(dāng)制備液體PTH組合物時(shí)，PTH濃度為10A/g/mL-5,000A/g/mL，優(yōu)選地，50w/mL-500^/mL，且另外包括胃腸道外可接受的防腐劑，優(yōu)選地，間甲酚或苯甲醇。此外，本發(fā)明提供液體甲狀旁腺激素組合物，所述液體甲狀旁腺激素組合物包含治療有效劑量的甲狀旁腺激素，一定劑量緩沖劑，該劑量能夠調(diào)節(jié)pH值在4.0-6.0的范圍內(nèi)，和在0.05-20重量份范圍內(nèi)的穩(wěn)定劑。根據(jù)以上結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人制備這樣的液體PTH組合物，該P(yáng)TH組合物包含確定為最適合于制備穩(wěn)定的PTH組合物的緩沖劑和穩(wěn)定劑，另外還制備這樣的液體PTH組合物，該液體PTH組合物包含作為緩沖劑的碳酸氫銨和作為穩(wěn)定劑的山梨糖醇或甘露醇，冷凍干燥所述液體PTH組合物具有含量低于2%的水，然后將它們保存在4"C。此時(shí)，由于碳酸氫銨用作緩沖劑可在酸性條件下?lián)]發(fā)，所以設(shè)定該液體PTH組合物的pH值為7.0-8.5，并冷凍干燥該液體PTH組合物。冷凍干燥的PTH組合物可通過(guò)水合作用制備為注射劑。如果在冷凍干燥過(guò)程中加入的緩沖劑是琥珀酸、蘋(píng)果酸或組氨酸，則利用蒸餾水進(jìn)行水合作用，而如果在冷凍干燥過(guò)程中加入的緩沖劑是碳酸氫銨，則利用緩沖溶液進(jìn)行水合作用，這是因?yàn)樘妓釟滗@在冷凍干燥過(guò)程中可揮發(fā)。將緩沖劑和穩(wěn)定劑在冷凍干燥的PTH中的濃度表示為液體注射劑的最終濃度。從冷凍干燥的組合物通過(guò)加入水、緩沖劑或混合的液體(緩沖劑和穩(wěn)定劑的)制備的用于注射施用的最終液體的成分為10^/mL-5,000〃g/mL的PTH，優(yōu)選地，50〃g/mL-500〃g/mL;O.lmM-lOOmM的緩沖齊!j;和0.05-20重量份的穩(wěn)定劑，最終pH值優(yōu)選地在4.0-6.0的范圍內(nèi)。將由上述方式制備的液體組合物保存在5(TC三天，從而利用RPHPLC測(cè)定保存下來(lái)的PTH的量。作為結(jié)果，證實(shí)了冷凍干燥的PTH組合物非常穩(wěn)定，因?yàn)闇y(cè)量到80%或更多的量的冷凍干燥后由蒸餾水水合的保存下來(lái)的PTH組合物(見(jiàn)表4)。具體地，已明白其中使用碳酸氫銨，保存下來(lái)的PTH的量非常穩(wěn)定，因?yàn)闇y(cè)量到90%或更多的量的保存下來(lái)的PTH(見(jiàn)表4)。另外，本發(fā)明的PTH組合物包括胃腸道外可接受的防腐劑，優(yōu)選地，間甲酚或苯甲醇。本發(fā)明的組合物除上述成分外可包括至少一種提供相同或相似功能的有效成分。本發(fā)明的組合物除了上述成分外還可包含至少一種藥用載體。所述藥用載體可包含選自由下列各項(xiàng)組成的組中的至少一項(xiàng)鹽溶液、無(wú)菌水、林格氏溶液、緩沖鹽溶液、右旋糖溶液、麥芽右旋糖(maltodextrose)溶液、甘油、乙醇、脂質(zhì)體以及它們的混合物，并且，如果需要還進(jìn)一步包含其它普通的添加劑，如抗氧化劑、緩沖溶液、細(xì)菌抑制劑等。另外，可將稀釋劑、分散劑、表面活性劑和潤(rùn)滑劑加入其中，從而用于制備可注射制劑，如水性溶液、混懸液和乳劑等。而且，對(duì)靶器官或其它配體的特異性抗體可與PTH相連接，從而特異性作用于該耙標(biāo)。另外，化學(xué)綴合物可與PTH(1-84)相結(jié)合或聚合物可與PTH(1-84)相混合。例如，該P(yáng)TH化學(xué)綴合物物質(zhì)或該聚合物混合物可包括PTH綴合物質(zhì)，其中PTH化學(xué)結(jié)合于聚乙二醇，聚乙烯醇等，或包括與聚乳酸-共-乙二醇(polylactic-co-glycolicalcohol)(PLGA)混合的微粒。根據(jù)本發(fā)明的PTH組合物的給藥方法不受上述特別限制，而依照所要求的方法，可使用胃腸道外給藥(例如，靜脈內(nèi)的、皮下的、腹膜內(nèi)的或局部的給藥)或口服給藥。胃腸道外給藥是理想的，更特別地，通過(guò)皮下注射或靜脈內(nèi)注射的給藥是優(yōu)選的。劑量可以是多樣的，這根據(jù)患者的體重、年齡、性別、健康和飲食狀況、給藥時(shí)間、給藥方法、排泄率、疾病的嚴(yán)重性等。每日劑量大約0.1嗎/kg-2mg/kg，優(yōu)選地，0.5pg/kg-100嗎/kg。最理想的是每天一次或分為若干次施用該P(yáng)TH組合物。通過(guò)對(duì)小鼠經(jīng)靜脈內(nèi)注射施用本發(fā)明的PTH組合物進(jìn)行了毒性實(shí)驗(yàn)，將該P(yáng)TH組合物鑒定為安全物質(zhì)，其50%致命劑量LD5Q為至少4mg/kg。本發(fā)明的PTH組合物可獨(dú)立地或與任何其它治療方法聯(lián)合使用，所述其他治療方法諸如手術(shù)、激素治療、藥物治療、利用生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的方法等。附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案的應(yīng)用參考附圖得到最好的理解，其中圖1是顯示了利用高效液相色譜(HPLC)分析PTH穩(wěn)定性的結(jié)果的圖，該分析是在將PTH在pH6.0-8.0的緩沖溶液(磷酸鹽溶液)中，在50°C保持了7天后進(jìn)行的，其中分別使用了20mM和pH6.0的磷酸鹽溶液和20rnM和pH7.0的磷酸鹽溶液，20mM和pH8.0的磷酸鹽溶液以及標(biāo)準(zhǔn)PTH(1-84)的初始狀態(tài)；圖2是顯示了利用HPLC分析PTH穩(wěn)定性的結(jié)果的圖，該分析是在將PTH在pH4.0-6.0的緩沖溶液(檸檬酸鹽溶液)中，在5(TC保持了7天后進(jìn)行的，其中分別使用了20mM和pH4.0的擰檬酸鹽溶液、20mM和pH5.0的檸檬酸鹽溶液，20mM和pH6.0的檸檬酸鹽溶液以及標(biāo)準(zhǔn)PTH(1-84)的初始狀態(tài)；圖3是顯示了利用HPLC分析PTH穩(wěn)定性的結(jié)果的圖，該分析是在將PTH在緩沖溶液(琥珀酸、蘋(píng)果酸或檸檬酸)中，在50'C保持了7天后進(jìn)行的，其中分別使用了20mM和pH5.0的檸檬酸鈉緩沖溶液、20mM和pH5.0的蘋(píng)果酸鈉緩沖溶液和20mM和pH5.0的琥珀酸鈉緩沖溶液以及標(biāo)準(zhǔn)PTH(1-84)的初始狀態(tài)；圖4顯示描繪了利用HPLC分析PTH穩(wěn)定性的結(jié)果的圖，該分析是在將包含緩沖劑和穩(wěn)定劑的液體PTH組合物在4(TC保持了7天后進(jìn)行的，其中，在圖(a)中分析了含有琥珀酸和山梨糖醇的液體組合物；在圖(b)中分析了含有琥珀酸和海藻糖的液體組合物；在圖(c)中分析了含有組氨酸和山梨糖醇的液體組合物；在圖(d)中分析了含有組氨酸和海藻糖的液體組合物，并且，其中O表示PTH(1-84)的初始狀態(tài)；l表示將各種液體組合物在4(TC保持了1天；3表示將各種液體組合物在4(TC保持了3天；并且7表示將各種液體組合物在40。C保持了7天；圖5顯示描繪了利用HPLC分析PTH穩(wěn)定性的結(jié)果的圖，該分析是在對(duì)包含緩沖劑和穩(wěn)定劑的冷凍干燥的PTH組合物迸行水合并將它們保持在5(TC達(dá)三天后進(jìn)行的，其中使用蒸餾水進(jìn)行水合作用，其中在圖(a)中分析了含有檸檬酸和山梨糖醇的冷凍干燥的組合物；在圖(b)中分析了含有琥珀酸和山梨糖醇的冷凍干燥的組合物；在圖(c)中分析了含有蘋(píng)果酸和山梨糖醇的冷凍干燥的組合物；在圖(d)中分析了含有組氨酸和山梨糖醇的冷凍干燥的組合物，并且，其中O天表示PTH(1-84)水合后的初始狀態(tài);3天表示將各種冷凍干燥的組合物PTH(l-84)水合后在50°C保持了3天；和圖6顯示描繪了利用HPLC分析PTH穩(wěn)定性的結(jié)果的圖，該分析是在將包含揮發(fā)性緩沖劑和穩(wěn)定劑的冷凍干燥的PTH組合物與含有緩沖劑的液體水合，并將它們保持在5(TC三天后進(jìn)行的，其中使用了含有碳酸氫銨和甘露醇的冷凍干燥的組合物，其中使用檸檬酸溶液進(jìn)行水合作用并如圖(a)中所示；使用琥珀酸(succineacid)溶液進(jìn)行水合作用并如圖(b)中所示；使用蘋(píng)果酸溶液進(jìn)行水合作用并如圖(c)中所示；和使用組氨酸溶液進(jìn)行水合作用并如圖(d)中所示，并且其中O天表示PTH(1-84)水合后的初始狀態(tài)；3天表示將各種PTH(l-84)組合物水合后在5(TC保持了3天。實(shí)施本發(fā)明的最佳方式在下文中，將參考附圖給出本發(fā)明的詳述。本發(fā)明不受以下的實(shí)施方案限制，且在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的許多變化是可能的。提供本發(fā)明的實(shí)施方案，從而向本領(lǐng)域中的任何的技術(shù)人員更完整地解釋本發(fā)明。實(shí)施例l:選擇適合于制備穩(wěn)定的PTH(1-84)組合物的pH值用于本發(fā)明的PTH(1-84)(SEQ.ID.No.l)由重組的大腸桿菌制備而來(lái)。本發(fā)明通過(guò)在韓國(guó)專利號(hào)10-0230578中所公開(kāi)的方法使用PTH(1-84)，所述PTH(1-84)是完全由用表達(dá)載體(pA15UP,pl53PTH和pml53PTH)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌MC1061分離而來(lái)的，本發(fā)明還通過(guò)在韓國(guó)專利號(hào)10-0255270中所公開(kāi)的DO-stat補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法進(jìn)行表達(dá)。更具體地，將PTH(l-84)以融合蛋白的形式表達(dá)為大腸桿菌中的內(nèi)含體，其中所述融合蛋白由磷酸核酮糖激酶片段和PTH(1-84)(磷酸核酮糖激酶片段通過(guò)尿激酶切割位點(diǎn)與PTH(1-84)連接，其中磷酸核酮糖激酶是融合蛋白的氨基末端片段)組成。對(duì)表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞裂解，從而收集內(nèi)含體。隨后，將所收集到的內(nèi)含體溶解于尿素后，通過(guò)利用透析或SephadexG25(Sigma)進(jìn)行凝膠過(guò)濾去除尿素，從而使融合蛋白重新折疊。用尿激酶以最佳比例(融合蛋白尿激酶=100:1)處理該融合蛋白，從而去除磷酸核酮糖激酶片段，并且，然后，利用陽(yáng)離子交換層析和反相層析完全分離該P(yáng)TH(1-84)。為了選擇穩(wěn)定的PTH組合物的pH值，制備并加入了根據(jù)pH值的有代表性的緩沖劑溶液，從而將PTH(1-84)轉(zhuǎn)變?yōu)?00ug/ml，然后再在50°C保持7天。通過(guò)利用RPHPLC分析保存下來(lái)的完整的PTH(1-84)的量來(lái)根據(jù)pHs比較所述組合物的穩(wěn)定性。RPHPLC分析條件如下用含有0.1%的TFA的35%的乙腈緩沖溶液平衡C18HPLC柱(0.46x25cm)，向其中注射待分析的目標(biāo)組合物，并通過(guò)逐漸增加乙腈的比率至45%來(lái)進(jìn)行洗脫。這里，在214nm處測(cè)量其吸光度且其流速為0.8ml/分鐘。保存下來(lái)的完整PTH(l-84)的量以基于100%的初始PTH峰面積的各個(gè)測(cè)試溶液的峰面積的％表示。表1是這樣的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)顯示所測(cè)試的緩沖劑的種類和濃度以及經(jīng)保持7天后保存下來(lái)的完整的PTH(1-84)的量。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>基于上述測(cè)試結(jié)果，確定了適合于制備穩(wěn)定的PTH組合物的pH值為5,0。實(shí)施例2:選擇適合于制備穩(wěn)定的PTH(1-84)組合物的緩沖劑基于上述實(shí)施例1的結(jié)果，將pH值設(shè)定為5.0，通過(guò)改變所使用的緩沖劑的種類來(lái)選擇適合的緩沖劑。這里，液體PTH(1-84)的濃度為100Aig/ml，所使用的緩沖劑的種類和濃度以及經(jīng)過(guò)在5(TC保持7天后保存下來(lái)完整的PTH(1-84)的量描述于表2中。以相同于實(shí)施例1中的方式分析穩(wěn)定的PTH組合物。比較例1除了緩沖劑的種類外實(shí)驗(yàn)的其他條件與實(shí)施例2中的條件一致。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>基于上述測(cè)試結(jié)果，確定了適合于制備穩(wěn)定的PTH組合物的緩沖劑為琥珀酸、蘋(píng)果酸或組氨酸。實(shí)施例3:選擇適合于制備穩(wěn)定的PTH(1-84)組合物的穩(wěn)定劑基于上述實(shí)施例2的結(jié)果，將緩沖劑的種類固定為琥珀酸、蘋(píng)果酸或組氨酸，從而通過(guò)改變所使用的穩(wěn)定劑的種類選擇適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑。這里，液體PTH(1-84)的濃度為100呢/ml，將所使用的穩(wěn)定劑的種類和濃度以及經(jīng)過(guò)在4(TC保持7天后保存下來(lái)完整的PTH(l-84)的量描述于表3中。以相同于實(shí)施例1中的方式分析穩(wěn)定的PTH組合物。比較例2除了穩(wěn)定劑的種類外實(shí)驗(yàn)的其他條件與實(shí)施例3中的條件一致。比較例3除了緩沖劑的種類外實(shí)驗(yàn)的其他條件與實(shí)施例3中的條件一致。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>基于上述測(cè)試結(jié)果，確定了適合于制備穩(wěn)定的PTH組合物的穩(wěn)定劑為山梨糖醇或甘露醇。另外，從上述測(cè)試結(jié)果證實(shí)了本發(fā)明的PTH組合物具有比利用檸檬酸鹽作為緩沖劑的PTH組合物更高的功效。實(shí)施例4:確認(rèn)冷凍干燥后由蒸餾水水合的PTH組合物的穩(wěn)定性冷凍干燥后，將包含100)ug/ml的PTH(l-84)、緩沖劑和穩(wěn)定劑的液體PTH(1-84)組合物，或包含100jug/ml的PTH(1-84)、碳酸氫銨和穩(wěn)定劑的液體PTH(1-84)組合物保存在4T:。利用蒸餾水或緩沖溶液水合該冷凍干燥的組合物，從而用于注射給藥，并在50。C保存3天。隨后，測(cè)定該組合物的穩(wěn)定性。表4是這樣的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)顯示冷凍干燥的PTH(1-84)的成分以及保存下來(lái)的完整的PTH(1-84)的量。以相同于實(shí)施例1中的方式分析穩(wěn)定的PTH組合物。比較例4除了緩沖劑的種類外實(shí)驗(yàn)的其他條件與實(shí)施例4中的條件一致。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>如表4所示，已明白根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)冷凍干燥和與蒸餾水水合的PTH組合物是非常穩(wěn)定的，因?yàn)樗鶞y(cè)量到的保存下來(lái)的PTH為90%或更多，且包含碳酸氫銨作為緩沖劑，山梨糖醇或甘露醇作為穩(wěn)定劑的PTH組合物，經(jīng)冷凍干燥和與含有琥珀酸、蘋(píng)果酸或組氨酸的緩沖溶液水合后，非常穩(wěn)定，因?yàn)樗鶞y(cè)量到的保存下來(lái)的PTH為90%或更多。本領(lǐng)域中的那些技術(shù)人員將意識(shí)到在以上描述中所公開(kāi)的概念和具體的實(shí)施方案可以很容易地作為修改或設(shè)計(jì)其他實(shí)施方案的基礎(chǔ)而使用，從而實(shí)現(xiàn)與本發(fā)明相同的目的。本領(lǐng)域中的那些技術(shù)人員還將意識(shí)到這些等價(jià)的實(shí)施方案不違反后附的權(quán)利要求所闡明的本發(fā)明的精神和范圍。工業(yè)適用性根據(jù)本發(fā)明的包含緩沖劑和穩(wěn)定劑的穩(wěn)定的甲狀旁腺激素(PTH)組合物是由全長(zhǎng)PTH(1-84)穩(wěn)定配制的，所述全長(zhǎng)PTH(1-84)經(jīng)過(guò)大量化學(xué)變性且，更特別地，包含碳酸氫銨的冷凍干燥的組合物甚至在水合后仍具有優(yōu)秀的穩(wěn)定性，其中所述碳酸氫銨在冷凍干燥過(guò)程中揮發(fā)，因此該組合物有效地作為穩(wěn)定的PTH藥物使用。序列表PTH(l-84)SerValSerGlulieGinLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsn151015SerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGinAspValHis202530AsnPheValAlaLeuGlyAlaProLeuAlaProArgAspAlaGlySer354045GinArgProArgLysLysGluAspAsnValLeuValGluSerHisGlu505560LysSerLeuGlyGluAlaAspLysAlaAspValAsnValLeuThrLys65707580AlaLysSerGin權(quán)利要求1.液體甲狀旁腺激素組合物，包含治療有效劑量的甲狀旁腺激素；一定劑量緩沖劑，所述劑量能夠調(diào)節(jié)pH值在4.0-6.0的范圍內(nèi)變化；和在0.05-20重量份范圍內(nèi)的穩(wěn)定劑。2.如權(quán)利要求1所述的液體甲狀旁腺激素組合物，其中所述緩沖劑是選自由下列各項(xiàng)組成的組組氨酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸以及它們的鹽的一種緩沖劑。3.如權(quán)利要求1所述的液體甲狀旁腺激素組合物，其中所述穩(wěn)定劑是山梨糖醇或甘露醇。4.如權(quán)利要求1所述的液體甲狀旁腺激素組合物，其中所述緩沖劑是琥珀酸，且所述穩(wěn)定劑是山梨糖醇。5.如權(quán)利要求1所述的液體甲狀旁腺激素組合物，其中所述緩沖劑是蘋(píng)果酸，且所述穩(wěn)定劑是山梨糖醇。6.如權(quán)利要求1所述的液體甲狀旁腺激素組合物，其中所述緩沖劑是組氨酸，且所述穩(wěn)定劑是山梨糖醇。7.如權(quán)利要求1所述的液體甲狀旁腺激素組合物，其進(jìn)一步包含胃腸道外可接受的防腐劑。8.如權(quán)利要求7所述的液體甲狀旁腺激素組合物，其中所述防腐劑是間甲酚或苯甲醇。9.甲狀旁腺激素組合物，其經(jīng)冷凍干燥具有含量低于2%的水，且所述甲狀旁腺激素組合物包含-治療有效劑量的甲狀旁腺激素；一定劑量緩沖劑，所述劑量能夠調(diào)節(jié)pH值在4.0-8.5的范圍內(nèi)變化；禾口在0.05-20重量份范圍內(nèi)的穩(wěn)定劑。10.如權(quán)利要求9所述的冷凍干燥的甲狀旁腺激素組合物，其中所述緩沖劑是選自由下列各項(xiàng)組成的組組氨酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸、碳酸氫銨以及它們的鹽的一種緩沖劑。11.如權(quán)利要求9所述的冷凍干燥的甲狀旁腺激素組合物，其中所述穩(wěn)定劑是山梨糖醇或甘露醇。12.如權(quán)利要求9所述的冷凍干燥的甲狀旁腺激素組合物，其中所述緩沖劑是琥珀酸，且所述穩(wěn)定劑是山梨糖醇。13.如權(quán)利要求9所述的冷凍干燥的甲狀旁腺激素組合物，其中所述緩沖劑是組氨酸，且所述穩(wěn)定劑是山梨糖醇。14.如權(quán)利要求9所述的冷凍干燥的甲狀旁腺激素組合物，其中所述緩沖劑是碳酸氫銨，且所述穩(wěn)定劑是甘露醇或山梨糖醇。15.—種制備甲狀旁腺激素注射劑的方法，該方法是通過(guò)向權(quán)利要求14的冷凍干燥甲狀旁腺激素組合物中加入緩沖溶液進(jìn)行的。16.如權(quán)利要求15所述的制備甲狀旁腺激素注射劑的方法，其中所述緩沖溶液是選自由下列各項(xiàng)組成的組組氨酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸以及它們的鹽的一種緩沖溶液。全文摘要本發(fā)明所公開(kāi)的內(nèi)容涉及穩(wěn)定的甲狀旁腺激素(PTH)，其包含緩沖劑和穩(wěn)定劑以及，更具體地，涉及穩(wěn)定的PTH組合物，其中使用琥珀酸、蘋(píng)果酸、組氨酸或碳酸氫銨作為所述緩沖劑，使用山梨糖醇或甘露醇作為所述穩(wěn)定劑。本發(fā)明的PTH組合物能夠用于穩(wěn)定地配制PTH蛋白質(zhì)，所述PTH蛋白質(zhì)比正常低分子量藥物更加不穩(wěn)定得多，從而很容易分解。文檔編號(hào)A61K38/22GK101189025SQ200680019222公開(kāi)日2008年5月28日申請(qǐng)日期2006年6月5日優(yōu)先權(quán)日2005年6月3日發(fā)明者康官燁,樸斗鴻,李庸碩,田仲源申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人牧巖生命工學(xué)研究所