專利名稱：：用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及BiP在制備用于預防或治療骨丟失或骨吸收的組合物中的用途。本發(fā)明也涉及方法，例如診斷方法和測定方法，藥物組合物、轉基因動物以及制備他們的方法。
背景技術：
：骨再造失調是許多疾病病理學的主要部分。在這種情形下，骨再吸收破骨細胞群的加速產生和激活是由至今未確認的異常調節(jié)因子網絡引起的。在過去的十年中，已經鑒定出控制造血干細胞和單核細胞/巨噬細胞前體向破骨細胞系定向和分化、破骨細胞增殖和激活的主要信號通路和轉錄因子(1-5)?，F在認識到通過結合RANK配體(RANKL)的破骨細胞前體上組成性表達的NF-KB受體活化劑(RANK)信號傳導和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)的激活一起產生了導致成熟破骨細胞生成的系列事件。在體內由成骨細胞提供M-CSF和RANKL，其和假目標受體骨保護素(OPG)(6-7)一起負責調節(jié)破骨細胞分化和骨吸收。通過成骨細胞組分，其中全身性激素和細胞因子直接影響該過程，與RANKL/OPG的相對比精密地控制破骨細胞生成。但是，在病理狀態(tài)(例如，類風濕性關節(jié)炎(RA))下，激活的丁細胞、成纖維樣滑膜細胞及其他基質細胞可以另外提供RANKL(8-10)。RANKL-RANK結合通過幾個關鍵階段激活細胞信號傳遞級聯反應。該過程依賴于TNF受體相關因子蛋白質(TRAFs)的募集、除Src-和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)介導的Akt激活之外的促分裂素激活的蛋白激酶級聯反應(ERK、JNK和p38)，而且所有這些RANK信號路徑最終都集中激活幾個轉錄因子家族，例如NF-KB(11)、活化蛋白質-1(AP-I)(12)，特別是c-Fos(13)和激活的T細胞核因子(NFAT)，具體地是NFATcI(1;5;14;15)。小白鼠體內的功能缺矢突變體已經明確表明這些信號分子和轉錄因子在破骨細胞分化和激活中具有必需的作用(5)。已經報道了以不同方式已知作為結合免疫球蛋白蛋白質(BiP)或葡萄糖調節(jié)蛋白質(Grp)的人分子伴侶蛋白的抗炎特性(17)。已經克隆編碼BiP的基因，而且也已經表達重組人(rhu)蛋白質(WO00/21995)。給具有膠原誘導關節(jié)炎(CIA)的小白鼠施用rhuBiP可以防止誘導試驗性關節(jié)炎(17)。BiP抗炎作用機理的指征是發(fā)現對rhuBiP響應的T細胞克隆產生細胞因子IL-IO、IL-4和IL-5(18)，而且，BiP刺激的外周血(PB)單核細胞(MC)產生伴隨TNF產生減少的高濃度IL-10。PBMC也造成IL-IR拮抗劑和可溶性TNFRII數量的增加(19)。從對BiP作出響應的PBMC中釋放的細胞因子可以調節(jié)破骨細胞生成(20;21)。為了強化BiP的這些細胞外功能具有生物學關聯性的事實，滑膜液的免疫測定己經顯示來自RA病人的大部分滑膜液包含可溶性BiP(19)。已知CD86和HLA-DR表達下調后單核細胞(MO)的抗原提呈功能會降低，而且BiP可以延緩和防止純化的PBMO發(fā)育成熟為不成熟的樹狀細胞(iDC)(22)。WO02/072133中描述了BiP在制備用于治療不想要的免疫反應的藥物中的用途。骨分別由稱為成骨細胞和破骨細胞的特化細胞不斷地產生或消化。由于骨形成和骨溶解之間的不平衡而導致骨腐蝕或變薄發(fā)生的疾病有許多。因此，該領域需要開發(fā)能調節(jié)(例如預防)該過程的藥物。發(fā)明概述本發(fā)明部分上是以BiP抑制、防止或減少骨吸收和破骨細胞成熟這一令人驚訝的發(fā)現為基礎的。在不希望受任何特定理論束縛的情形下，認為這種抑制是通過調節(jié)分化過程中被激活的必需信號通路而發(fā)揮作用的。因此，BiP尤其在調節(jié)骨丟失方面具有治療用途。WO02/072133中已經教導BiP具有免疫調節(jié)特性，而且其中也描述了BiP治療或防止不想要的免疫反應中的用途。此外，也公開了BiP治療自身免疫疾病的用途。通過實施例，引用文獻教導用BiP培養(yǎng)的人血液單核細胞釋放可以下調在此討論的自身免疫疾病，例如類風濕性關節(jié)炎(RA)的IL-10。而且，Corrigall等(17)教導BiP可用于抑制類風濕性關節(jié)炎的發(fā)展，是免疫治療這種紊亂的候選物。因此，雖然已經描述了BiP的免疫調節(jié)和抗炎特性，但現有技術沒有公開在此介紹的BiP可以直接調節(jié)骨吸收和破骨細胞成熟這一令人驚訝的發(fā)現。體外破骨細胞分化測定中使用了在存在M=CSF和RANKL的條件下培養(yǎng)的小白鼠骨髓巨噬細胞(BMM)和人PBMC。結果顯示在小白鼠和人分化測定中，通過酒石酸鹽抗性酸性磷酸酶(TRAP)染色、玻璃體結合蛋白受體(VnR，otvf33)或F肌動蛋白環(huán)的存在目視觀察到的破骨細胞的數目都降低了，而且這種變化與吸收活性的降低是平行的(圖3)。而且，將BiP添加到成熟破骨細胞中降低了破骨細胞的數目(圖4)。在此描述的更進一步的系列實驗也己經對響應BiP的純化PBMO中的基因表達的總體變化進行了研究。與未經過刺激的PBMO相比，利用Affymetrix基因陣列技術的實驗已經顯示純化的PBMO的BiP治療導致許多基因下調和上調。BiP下調在破骨細胞分化中都發(fā)揮重要作用或者對破骨細胞分化都必不可少的VnR(24)、CD44(25)、骨橋蛋白(26)、IK(14)和c-Fos(13)的表達(圖5)。發(fā)明概要第一方面，提供BiP或其變異體、同系物、衍生物或片段在制備預防或治療骨丟失的藥物中的用途。第二方面，提供BiP或其變異體、同系物、衍生物或片段在制備預防或治療骨吸收的藥物中的用途。第三方面，提供BiP調節(jié)破骨細胞成熟的用途。第四方面，提供預防或治療骨丟失的方法，包括施用BiP或其變異體、同系物、衍生物或片段以產生有益的預防或治療效果。第五方面，提供預防或治療骨吸收失的方法，包括施用BiP或其變異體、同系物、衍生物或片段以產生有益的預防或治療效果。第六方面，提供調節(jié)破骨細胞發(fā)育的方法，包括使破骨細胞接觸BiP或其變異體、同系物、衍生物或片段。第七方面，提供診斷由骨丟失引起或與骨丟失有關的疾病或綜合癥的方法，包括步驟(a)檢測受試者的BiP活性；(b)與未受影響的對照比較BiP活性；和(c)將從對照中獲得的數值與從受試者中獲得的數值進行比較；其中，從對照中獲得的數值與從受試者中獲得的數值之間存在的差異指示受試者患有這種疾病或綜合癥。第八方面，提供了鑒定調節(jié)骨破壞或骨丟失的試劑的測定方法，包括步驟(i)選擇調節(jié)BiP活性的試劑；禾Q(ii)測量存在所述試劑時破骨細胞的成熟情況；其中，缺少所述試劑和存在所述試劑時的破骨細胞成熟之間存在差異指示該試劑能調節(jié)骨組織破壞或骨丟失。第九方面，提供了包含下列步驟的方法(a)實施根據本發(fā)明的第八方面的測定方法；(b)鑒定調節(jié)骨破壞或骨丟失的一種或多種試劑；禾n(c)制備大量的已鑒定的一種或多種試劑。第十方面，提供通過根據本發(fā)明的第八方面的測定方法獲取的試劑。第十一方面，提供確定BiP或其變異體、同系物、衍生物或片段對破骨細胞分化的影響的方法，包括步驟(a)將BiP添加到處于破骨細胞分化的一個或多個不同階段的一個或多個破骨細胞中；和(b)確定BiP對破骨細胞生成的影響。第十二方面，本發(fā)明涉及鑒定在破骨細胞分化期間受BiP調節(jié)的一種或多種蛋白質的方法，包括步驟(a)在存在和缺少BiP的情況下分化破骨細胞；和(b)鑒定與缺少BiP時分化的破骨細胞相比，在有BiP時分化的破骨細胞中表達存在差異的一種或多種蛋白質。第十三方面，本發(fā)明涉及BiP或其變異體、同系物、衍生物或片段在制備預防或治療骨質疏松癥的藥物中的用途。優(yōu)選實施例本發(fā)明優(yōu)選涉及BiP在制備治療骨丟失藥物中的用途。本發(fā)明優(yōu)選涉及BiP在制備治療骨吸收藥物中的用途。本發(fā)明優(yōu)選涉及BiP在治療骨丟失中的用途。本發(fā)明優(yōu)選涉及BiP在治療骨吸收中的用途。骨丟失或骨吸收優(yōu)選是與癌癥或癌轉移有關的骨破壞。這種骨組織破壞與這此討論的其他形式的骨丟失具有相同的生物學基礎。骨丟失或骨吸收優(yōu)選與肌肉骨骼疾病有關。肌肉骨骼疾病優(yōu)選是骨質疏松癥。調節(jié)優(yōu)選是抑制、減少或防止破骨細胞的成熟或發(fā)育。破骨細胞成熟的調節(jié)優(yōu)選在體內或體外實施。破骨細胞優(yōu)選是破骨細胞前體、多核前體或成熟的破骨細胞。優(yōu)選的，在根據本發(fā)明第七方面的方法中，與從對照中獲得的數值相比，BiP活性降低。根據本發(fā)明第七方面的方法優(yōu)選包含測量破骨細胞發(fā)育或骨吸收的可選歩驟。優(yōu)選的，在此描述的試劑升高或下調BiP活性。優(yōu)選的，在根據本發(fā)明第i^一方面的方法中，以0.02-20jag/ml的濃度添加BiP。優(yōu)選通過測量TRAP活性、VnR和/或F-肌動蛋白環(huán)來量化破骨細胞的數目。根據本發(fā)明第十一方面的方法優(yōu)選包含量化骨吸收的可選步驟。優(yōu)選的，利用測量一種或多種破骨細胞特異標記表達的PCR來證實破骨細胞分化。破骨細胞特異標記優(yōu)選是降鈣素受體基因或組織蛋白酶K基因。優(yōu)選的，根據本發(fā)明第十二方面鑒定的蛋白質是信號分子或轉錄因子。優(yōu)選的，在根據本發(fā)明第十二方面的方法中，優(yōu)選在培養(yǎng)開始時或出現多核破骨細胞的培養(yǎng)接近結束時的24-72hr期間內添加BiP。優(yōu)選利用qt-RT-PCR禾n/或Western印跡檢測編碼蛋白質的核酸或蛋白質。圖1BiP.FITC結合外周血單核細胞。利用人血清白蛋白.FITC(實線)或BiP.FITC(空白線)在(C對人單核細胞進行染色，持續(xù)20mins，并通過流式細胞計測量熒光。FACscan直方圖是利用Cellquest軟件產生的。圖2BiP在小鼠顱蓋模型中抑制骨吸收。將BiP(l-1000ng/ml)添加到用RANKL孵育5天的小鼠顱蓋中。通過鈣釋放確定骨吸收。圖3BiP與M-CSF和RANKL—起添加時對破骨細胞分化的影響。與單獨用M-CSF+RANKL的對照培養(yǎng)相比，在用BiP(0.02-20pg/ml)和M-CSF+RANKL培養(yǎng)人單核細胞14天后，用TRITC毒傘素來檢測F-肌動蛋白環(huán)陽性細胞。通過甲苯胺藍染色牙本質切片上的骨吸收陷窩骨吸收陷窩來測量骨吸收。*p<0.03。圖4添加BiP到成熟破骨細胞中。在第10天，添加BiP(2-5(Vg/ml)到成熟的人破骨細胞中。在第14天，利用TRITC-毒傘素測量F-肌動蛋白環(huán)陽性的細胞。圖5通過Affymetrix基因陣列測量BiP誘導的基因活性的成倍降低。利用通過免疫磁珠負選擇制備的，在缺少或存在BiP(20pg/ml)的條件下培養(yǎng)24小時的純化的人單核細胞進行雙重Affymetrix基因陣列芯片分析。表達的倍數差異通過BiP處理的和靜息的細胞間基因表達的差異來計算。所有的數據通過GeneSpring軟件分析。圖6Affymetrix基因陣列分析。用BiP刺激或者不刺激純化的單核細胞，測量基因活化，并在一式兩份樣品中進行比較。照這樣標記了在R&D細胞因子基因陣列上因為出現類似上調或下調而被記錄的那些基因(*)，或者流式細胞計和/或蛋白質生產已經證實的那些基因CJ。降低-20倍是BiP處理的單核細胞中缺少基因活性的圖形顯示。發(fā)明詳述BIP在此使用的術語"BiP"指WO00/21995中公開的78kD的內質網伴侶蛋白。優(yōu)選的BiP多肽具有WO00/21995的第23頁的附錄2所示的氨基酸序列。BiP蛋白質優(yōu)選具有WO00/21995的SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。在此使用的BiP序列優(yōu)選缺乏標簽，例如存在于上文提到的多肽中的6His標記。在此使用的術語"氨基酸序列"和術語"多肽"和/或術語"蛋白質"同義。在有些情況下，術語"氨基酸序列"和術語"肽"同義。在有些情況下，術語"氨基酸序列"和術語"蛋白質"同義。BiP蛋白質優(yōu)選由WO00/21995的SEQIDNO.3給出的核苷酸序列編碼。核苷酸序列可以是基因組、合成或重組來源的DNA或RNA，例如cDNA。核苷酸序列可以是代表有義鏈或反義鏈或其組合的雙鏈或單鏈。利用重組DNA技術(例如重組DNA)可以制備核苷酸序列。特別值得注意的是WO00/21995中公開了在大腸桿菌中表達BiP和純化重組蛋白質的方法。核苷酸序列可以與天然形式相同，或者可以是其片段、同系物、變異體或衍生物。這里使用的術語"BiP活性"指BiP表達和/或活性的水平和/或模式。破骨細胞在此使用的術語"破骨細胞"指積極重新吸收骨以便成骨細胞能夠替代新生骨的細胞。該術語至少包括破骨細胞前體、多核破骨細胞前體和成熟破骨細胞。對于破骨細胞再吸收骨水平異常(例如，水平異常高)和成骨細胞形成骨水平正常的疾病，例如肌肉骨骼疾病，例如骨質疏松癥，破骨細胞是治療靶標。舉例來說，治療策略依賴于降低破骨細胞數目或破骨細胞的吸收活性。這種策略可以用來恢復骨吸收和形成之間的平衡，在本發(fā)明的上下文中，治療目標是利用BiP調節(jié)(例如抑制)破骨細胞發(fā)育，優(yōu)選是調節(jié)破骨細胞成熟。在本發(fā)明的上下文中，破骨細胞成熟也包括所附實施例中描述的破骨細胞分化和發(fā)育。破骨細胞成熟包括，但不局限于破骨細胞前體(例如分化)或多核前體成熟發(fā)育為成熟破骨細胞。有關成骨細胞和破骨細胞在骨形成和吸收過程中的綜述可以參考H.Fleisch,BisphosphonatesInBoneDisease,FromTheLaboratoryToThePatient,3rdEdition,ParthenonPublishing(1997)。依照背景信息可知破骨細胞是與骨重新塑型有關的骨再吸收細胞。他們是富含酒石酸鹽抗性酸性磷酸酶的多核吞噬細胞，由來源于單核細胞z巨噬細胞系的前體細胞融合形成。已經鑒定了幾個在調節(jié)破骨細胞分化過程中非常重要的分子(BrMedJ1997;315:469-472)。早期破骨細胞前體上表達的轉錄因子PU-I是破骨細胞和單核細胞初期分化所必需的，而包括c-fos和NF-kB的其他轉錄因子在刺激已定向前體分化為成熟破骨細胞的過程中起重要作用。破骨細胞的形成和激活也依賴于破骨細胞前體和骨髓基質細胞之間的緊密接觸?；|細胞分泌細胞因子M-CSF，M-CSF對于來自常見前體的破骨細胞和巨噬細胞的分化是必不可少的。基質細胞也在細胞表面上表達被稱為RANK配體(RANKL)的分子，RANK配體與破骨細胞前體上的另一種被稱為RANK(核因子kB受體活化劑)細胞表面受體相互作用從而促進破骨細胞前體向成熟的破骨細胞分化。被稱為骨保護素(OPG)的另一種分子可以阻斷RANK-RANKL相互作用，骨保護素是RANK的"假"配體，因此是破骨細胞形成的有效抑試劑。成熟的破骨細胞在骨表面形成密封層，并通過分泌經"皺折緣"進入在破骨細胞下方的間隙(豪希普陷窩)的鹽酸和蛋白水解酶來再吸收骨。皺折緣的形成關鍵取決于一種細胞膜相關信號蛋白質c-src的存在。破骨細胞分泌的鹽酸可以溶解羥基磷灰石，而且鹽酸也允許蛋白水解酶(主要是組織蛋白酶K和基質金屬蛋白酶)降解膠原及其他基質蛋白質。已經確定在調節(jié)破骨細胞活性中起重要作用的分子包括催化破骨細胞內氫離子形成的碳酸酐酶II(Ca-II);編碼破骨細胞質子泵亞單位的TCIRG1以及降解膠原及其他非膠原蛋白質的組織蛋白酶K。完成吸收之后，破骨細胞將經歷程序性細胞死亡(凋亡)，這也稱為預示骨形成開始的逆轉階段。骨丟失與骨丟失有關或與骨丟失相關的紊亂包括，但不局限于佩吉特(氏)病、原發(fā)性和繼發(fā)性骨質疏松癥、絕經后骨質疏松癥、老年性骨質疏松、糖皮質激素誘導的骨質疏松癥、牙周病、牙槽骨丟失、截骨術后的骨丟失和兒童期自發(fā)性骨丟失、骨質疏松癥的長期并發(fā)癥例如脊椎骨彎曲和高度損失，和假體手術的長期并發(fā)癥，以及假體關節(jié)例如髖、膝等等的松弛。骨丟失可以表現為骨破壞、骨腐蝕、骨變薄或骨消化。骨沉積和骨吸收平衡的病理變化會導致上述情況發(fā)生，這一點是很明顯的。在另一個的實施方案中，BiP可以用于治療與低骨質量有關的狀況。當骨質量水平低于世界衛(wèi)生組織骨折風險評估及其篩選絕經后骨質疏松(1994)的應用，世界衛(wèi)生組織研究組的報告，世界衛(wèi)生組織技術系列843的標準(standardsbyWorldHealthOrganizationAssessmentofFractureRiskanditsApplicationtoScreeningforPostmenopausalOsteoporosis(1994))所限定的特定年齡的正常值時，這種情形是很明顯的。短語"骨質量低的狀態(tài)"也指脊椎動物，例如患骨質疏松癥的機會比平均機會顯著增高的己知脊椎動物，例如哺乳動物(例如絕經后婦女，年齡50歲以上的男人)。其他的骨質量增加或增強的用途包括骨恢復、增加骨折愈合速度、完全代替骨移植手術、增強成功骨移植的比率、面部再建或上頜骨再建或下頜骨再建后的骨愈合、假體向內生長、脊椎骨結合或長骨延伸。在高度優(yōu)選的實施方案中，BiP被用來預防或治療骨吸收。在本發(fā)明的上下文中，通過直接或間接改變破骨細胞的形成或活性來調節(jié)(例如防止)骨吸收從而預防或治療骨吸收。通過直接或間接改變破骨細胞的形成或活性來抑制從礦物相和/或有機基質相中除去存在的骨可以調節(jié)骨吸收。人及其他哺乳動物的多種紊亂包括異常的骨吸收或與異常的骨吸收有關。這種紊亂包括，但不局限于骨質疏松癥、糖皮質激素誘導的骨質疏松癥、佩吉特(氏)病、異常增加的骨翻轉、牙周病、牙丟失、骨折、假體周圍骨質溶解、成骨不全、轉移性骨疾病、惡性腫瘤高鈣血癥和多發(fā)性骨髓瘤。骨丟失或骨吸收優(yōu)選與肌肉骨骼疾病，例如骨質疏松癥或佩吉特(氏)病有關。骨丟失或骨吸收優(yōu)選導致肌肉骨骼疾病，例如骨質疏松癥或佩吉特(氏)病的基礎。在高度優(yōu)選的實施方案中，這種與骨丟失或骨吸收有關的情形是骨質疏松癥。骨質疏松癥是社會上主要的健康問題，即使存在其他的導致骨質量降低的疾病，即佩吉特(氏)病，骨質疏松癥目前仍然是最常見的疾病，而且從衛(wèi)生保健的角度來說，這種疾病的花費也是最多的。因為雌激素是直接和間接調節(jié)骨代謝的激素，因此絕經后婦女中雌激素生成的下降和雄激素(在男性體內酶促轉變?yōu)榇萍に?的生成隨年齡的衰退導致患骨質疏松癥的風險，估計年齡在45歲以上的85%的婦女和15%的男性都存在患骨質疏松癥的風險。在骨質疏松癥中，通常會發(fā)生由于衰老過程而導致成骨細胞負責的骨形成的下降。關于骨質疏松癥的一個最令人遺憾的誤解是普遍認為骨質疏松癥幾乎是專門的衰老病。雖然經絕后骨質疏松是老年婦女疾病最常見的疾病之—，但其導致骨丟失殘廢的過程在很早以前就開始了。實際上，估計年齡在25-35之間的女性群體中有令人吃驚的大部分人存在加快的骨丟失。在女性生命一半的時間里，即在女性開始經歷絕經癥狀以前，骨丟失己經發(fā)生了。治療"繼發(fā)性骨質疏松癥"的方法也包括在本發(fā)明的范圍內。"繼發(fā)性骨質疏松癥"包括，但不局限于脊椎動物，例如哺乳動物(包括人)中的糖皮質激素誘導的骨質疏松癥、甲狀腺機能亢進誘導的骨質疏松癥、固定誘導的骨質疏松癥、肝素誘導的骨質疏松癥和免疫抑制誘導的骨質疏松癥。利用本領域已知的各種方法，例如實施骨吸收評估可以確定骨丟失或骨吸收的存在。這是骨丟失生物化學標記的非侵入性評價。在利用其他措施，例如骨密度檢測這些問題很久以前，也可以利用它來測量骨丟失速度。因為骨基質骨架經歷吸收，因此穩(wěn)定膠原的交聯例如脫氧吡啶諾林(D-pyd)和/或吡啶(Pyd)會在尿中排泄，，他們相對于正常水平的水平是骨丟失速度多快的指征。當這些標記水平高時，表明骨正在以大于機體能夠替換它的速度丟失。另夕卜，通過臨床技術，例如脊柱和/或股骨頸的雙能X射線吸收儀(DEXA)掃描可以確定骨丟失或吸收。在哺乳動物中甚至可以促進骨生長。有益于促進骨生長的情形包括在脊椎動物，例如哺乳動物(包括人)等等中增強骨移植、誘導脊椎骨結合、增強長骨延伸、在面部再建、上頜骨再建和/或下頜骨再建后增強骨愈合。診斷在更進一步的方面，本發(fā)明涉及診斷由骨丟失或骨吸收引起的疾病或綜合癥，或與骨丟失或骨吸收有關的疾病或綜合癥的方法。為了提供診斷這種疾病的基礎，應建立BiP表達和/或活性的正?；驑藴仕交蚰Ｊ健Ｍㄟ^測試來自一個或多個正常受試者，例如正常動物或受試驗的人的樣品中的BiP的表達和/或活性的水平或模式可以完成這一過程。通過將樣品中的BiP與系列稀釋的陽性對照進行比較可以量化樣品中BiP表達和/或活性的標準水平和/或模式，其中系列稀釋的陽性對照中BiP的表達和/或活性的水平或模式的量是已知的。然后，將從正常樣品中獲得標準值與從樣品中獲得的數值相比較，其中樣品來自可能受骨丟失或骨吸收引起的疾病或與骨丟失或骨吸收有關的疾病影響的受試者。對照和受試者的數值的偏差可以用來確定疾病狀態(tài)的存在。典型地，與對照相比，來自可能受疾病影響的受試者的樣品中的這種偏差會是BiP表達和/或活性的水平或模式的下降。為了實現診斷，量化破骨細胞和成骨細胞是必需的，在破骨細胞吸收骨水平異常(例如，水平異常高)和成骨細胞形成骨水平正常的疾病，例如肌肉骨骼疾病，例如骨質疏松癥的診斷中更是如此。通過量化破骨細胞和成骨細胞，確定骨吸收和形成之間的平衡并確定疾病或綜合癥是否與這種平衡之間出現不平衡有關癥是可能的。BiP多核苷酸或其片段、變異體、同系物或衍生物為診斷試驗提供了基礎。為診斷的目的，BiP多核苷酸序列或其任何部分可以用來檢測和量化BiP基因表達和/或活性。例如編碼BiP的多核苷酸序列，例如WO00/21995的SEQIDNo.3可以用于樣品雜交或PCR測定以檢測BiP表達的異常。這種定性或定量方法的形式包括Southern或Northern分析、斑點印跡或其他基于膜的技術；PCR技術；標尺、針或芯片技術；以及ELISA或其他多樣品形式技術。所有這些技術本領域已經熟知，而且他們實際上也是許多市場上可買到的診斷試劑盒的基礎。例如通過從受試者，例如人取樣可以實施診斷測定。從樣品中提取核酸，例如DNA、cDNA或RNA。利用PCR，例如實時定量PCR(qRT-PCR)可以檢測BiP表達?？梢栽O計PCR引物以檢測BiP。WO00/21995中列出了這些引物的實例。BiP診斷測定也可以包括利用抗體，優(yōu)選融合到標記上的抗體檢測包含，例如體液、細胞，例如來自或來源于骨的細胞(例如破骨細胞)、組織、這些組織的切片或提取物的樣品中的多肽的方法?？梢允褂眯揎椈蛭唇浶揎椀亩嚯暮涂贵w。通常通過共價或非共價地將多肽和抗體與報告分子連接來標記他們。多種報告分子是本領域普通技術人員己知的。BiP特異性抗體也可以用于診斷在此描述的疾病。利用具有確定的特異性的多克隆或單克隆抗體進行競爭性結合或免疫放射測定的多種操作規(guī)程在本領域已知的。這種免疫測定典型地包括BiP和它的特異性抗體(或類似的受體結合分子)之間形成復合物和測定復合物的形成。免疫測定可以是利用與BiP上的兩個互不干擾的表位反應的單克隆抗體的基于雙位點單克隆的免疫測定。也可以使用競爭性結合測定。MaddoxDE等(1983，JExpMed158:1211)中描述了這種測定的實例。這種診斷測定甚至適合于評估特殊治療方案的功效，而且也可以用于動物研究、臨床試驗或監(jiān)測病人個體的治療。為了提供診斷疾病的基礎，應如上所述建立BiP表達的正常、標準或對照圖譜。標準和受試者的數值間的偏差可以確定疾病狀態(tài)的存在。如果確立了一種或多種疾病狀態(tài)，那么就可以施用已有的治療劑，而且也可以產生治療譜或數值。最后，可以定期重復測定以判定所述數值是前進了，還是回到了正常或標準模式。連續(xù)的治療譜可以用來顯示幾天或幾個月期間的治療功效。因此，更進一步的方面提供了確定至少一種藥物或給藥方案預防或治療骨組織破壞或骨丟失的有效性的方法(優(yōu)選體外方法)，所述方法包括(a)測量存在所述藥物或給藥方案時的BiP活性；和(b)至少確定與對照相比所述藥物或給藥方式在預防或治療骨組織破壞或骨丟失方面是否有效。優(yōu)選的是，可能受骨破壞或骨丟失引起的疾病或與骨破壞或骨丟失有關的疾病影響的受試者體內的BiP表達和/或活性的水平或模式與從對照中獲得的標準值相比下降了。診斷方法甚至可以包括檢測破骨細胞成熟或骨吸收的可選步驟。樣品在此使用的術語"樣品"具有其通常的含義。樣品可以是依照本發(fā)明的方法測定BiP表達和/或活性水平和/或模式的任何物理實體。樣品可以是其中破骨細胞發(fā)育或骨吸收被測量的任何物理實體。樣品可以是或來源于生物材料，例如組織、細胞(例如破骨細胞)或液休。組織、細胞或液體可以是或來源于骨。樣品可以是或來源于活檢或尸檢。測定方法更進一步的方面，本發(fā)明提供了鑒定調節(jié)骨破壞或骨丟失試劑的測定方法。相應的，測定方法可以用來鑒定一種或多種試劑，其是BiP拮抗劑，其減少，降低或減低BiP表達和/或活性的水平或模式。本發(fā)明的測定方法優(yōu)選可以用來鑒定一種或多種試劑，其是BiP激動劑，其加強，增強或增加BiP表達和/或活性的水平和/或模式。激動劑通過加強，增強或增加BiP表達和/或活性可以調節(jié)與骨丟失或骨消化有關的紊亂，例如與骨質疏松癥有關或是骨質疏松癥導致的骨丟失或骨吸收。激動劑通過加強，增強或增加BiP表達和/或活性可以方便地抑制、減少或降低破骨細胞的成熟。融合蛋白質可以用于高通量篩選測定以鑒定調節(jié)BiP活性和/或表達的試劑(參見D.Bennettetal.,JMolRecognition,8:52-58(1995);andK,Johansonetal,JBiolChem,270(16):9459-9471(1995))。另一種篩選技術基于WO84/03564中詳細描述的方法，其提供了高通量篩選(HTS)具有適當結合親和力的試劑的方法。篩選的概要說明可以參見RamakrishnaSeethala，PrabhavathiB.Fernandes.NewYork,NY,MarcelDekker,2001編車葺的HandbookofDrugScreening(ISBN0-8247-0562-9)。預期本發(fā)明的測定方法適合于試劑的小規(guī)模和大規(guī)模篩選，以及定量測,丄，疋。篩選方法可以通過直接或間接與試劑有關的標記測量試劑與BiP的結合。另外，篩選方法包括與標記的競爭物的競爭?？梢院Y選多種試劑。當候選化合物是蛋白質，例如抗體或肽時，可以利用噬菌體顯示技術篩選候選化合物庫。噬菌體顯示是利用重組噬菌體的分子篩選規(guī)程。該技術包括用編碼候選化合物庫的基因轉化噬菌體，這樣每個噬菌體或噬菌顆粒都表達一個特定的候選化合物。轉化的噬菌體(優(yōu)選固定到固相載體上)表達適當的候選化合物并顯示在他們的噬菌體外殼上。通過以親合相互作用為基礎的選擇策略富集能夠與BiP相互作用的特異候選化合物。然后描述成功的候選試劑的特性。噬菌體顯示具有優(yōu)于標準親和配體篩選技術的優(yōu)點。噬菌體表面以與候選試劑的天然構象更相似的三維構型形式顯示候選試劑。這為實現篩選目標提供了更特異和更高親合力的結合。另一個篩選化合物庫的方法利用被表達化合物庫的重組DNA分子穩(wěn)定轉化的真核或原核宿主細胞?；畹幕蚬潭ㄐ问降倪@種細胞都可以用于標準結合配偶體測定。也參見描述檢測細胞反應的靈敏方法的Parceetal.(1989)Science246:243-247和Owickietal.(1990)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA87;4007-4011。競爭性測定特別有用，其中表達化合物庫的細胞用標記抗體，例如1251抗體和測試樣品，例如其對結合組合物的結合親合性正被測量的候選化合物，一起孵育。然后分離結合和游離的被標記的結合配偶體以評價結合程度。測試樣品結合的數值與結合的標記抗體的數值成反比。可以使用許多技術中的任何一種技術從游離的結合配偶體中分離結合的配偶體以評價結合的程度。分離步驟典型地可以包括例如，吸附到濾紙上然后進行洗滌、吸附到塑料上然后進行洗滌或離心細胞膜的過程。候選化合物篩選的另一個技術包括WO84/03564中詳細描述的提供高通量(HTS)篩選具有適當結合親和力的新化合物的方法。首先，在固體基片，例如塑料針或其它適當的表面上合成大量不同的小肽試劑。然后讓所有的針與溶解的蛋白質起反應，并進行洗滌。下一步包括檢測結合的蛋白質。可利用單克隆抗體完成檢測。因此可以鑒定特異地與蛋白質相互作用的化合物。可能與BiP相互作用的候選化合物的合理設計可以以蛋白質和/或它的體內結合配偶體的分子形態(tài)的結構研究為基礎。確定哪個位點與特定其他蛋白質相互作用的一種方式是物理結構測定，例如X射線結晶學或二維的NMR技術。這些將為哪個氨基酸殘基形成分子接觸區(qū)提供指導。蛋白質結構測定的詳細說明可以參見，例如BlundellandJohnson(1976)ProteinCrystallography,AcademicPress,NewYork。-一旦已經鑒定出調節(jié)BiP活性和/或表達的試齊IJ，就可以利用，例如在此描述的方法測量存在所述試劑時，破骨細胞成熟或骨吸收狀況。a)缺少試劑時的破骨細胞成熟或骨吸收與b)存在試劑時的破骨細胞成熟或骨吸收之間存在差異顯示試劑可以調節(jié)骨組織破壞。差異優(yōu)選是存在試劑時，破骨細胞成熟被降低或受抑制。差異優(yōu)選是存在試劑時，骨吸收被降低或受抑制。只通過舉例來說，可以利用沖擊研究(pulsestudies)來評價破骨細胞成熟或骨吸收，其中例如，在前體分化早期或形成多核細胞之后添加BiP。在適當的時間，固定培養(yǎng)物并，或者利用抗體，例如23C6抗體(例如，來自eBioscienceInc的產品目錄編號14-0519)和TRITC-毒傘素分別通過免疫定位的方法針對TRAP活性或者VnR和F-肌動蛋白環(huán)進行組織化學染色，并量化破骨細胞的數目。從牙本質切片中除去破骨細胞并利用甲苯胺藍染色后，可以量化吸收。通過分子技術，例如測量破骨細胞特異的標記基因，例如降鈣素受體和組織蛋白酶K表達的實時PCR可以另外確認破骨細胞的分化。調節(jié)在BiP以及骨吸收和破骨細胞成熟調節(jié)的上下文中，術語"調節(jié)"優(yōu)選地指利用BiP防止、制止、減輕、降低、抑制或防止骨吸收和破骨細胞的成熟。因此，本發(fā)明尤其涉及測定調節(jié)或影響B(tài)iP表達和/或活性的水平和/或模式的調節(jié)的方法、過程以及試劑。舉例來說，如果BiP表達和/或活性的水平和/或模式被防止、制止、減輕、降低、抑制或防止，那么破骨細胞的成熟和骨吸收就能夠恢復、升高或增加。優(yōu)選的情形是，BiP表達和/或活性的水平和/或模式恢復、升高或增加，因此破骨細胞的成熟和骨吸收就能夠被防止、制止、減輕、降低、抑制或防止。試劑試劑可以是有機化合物或其他化學試劑。試劑可以是從任何適當來源獲得的或通過任何適當來源生產的天然或人工化合物。試劑可以是氨基酸分子、多肽或其化學衍生物或者它們的組合。試劑甚至可以是多核苷酸分子，其中多核苷酸分子可以是有義或反義分子，或抗體，例如多克隆抗體、單克隆抗體或單克隆人源化抗體。已經研發(fā)了生產具有人特性的單克隆抗體的多種策略，其繞過了對生產抗體的人細胞系的需要。例如通過連接嚙齒類動物的可變區(qū)和人恒定區(qū)已經將有用的鼠單克隆抗體"人源化"(Winter,G.andMilstein,C.(1991)Nature349,293-299)。這種方式降低了抗體的人抗鼠免疫原性，但由于外來的V區(qū)域框架而保留了剩余的免疫原性。而且，抗原結合特異性基本上是鼠供體的抗原結合特異性。CDR嫁接和框架操作(EP0239400)已經將抗體操作改善和改進到能生產人體治療性應用可接受的人源化鼠抗體的程度。利用本領域眾所周知的其他方法可以獲取人源化抗體(例如，US-A-239400中描述的方法)。通過可水解的雙功能銜接物可以將試劑附著于實體(例如有機分子)上?？梢栽O計或者從包括肽及其他化合物，例如小有機分子的化合物庫中獲取實體。舉例來說，實體可以是天然物質、生物高分子、從生物材料，例如細菌、真菌或動物(特別是哺乳動物)細胞或組織制備的提取物、有機或無機分子、合成劑、半合成試劑、結構或功能模擬物、肽、肽模擬物、切割完整蛋白質所得到的肽、合成的肽(例如，利用肽合成器或重組技術或其組合合成)、重組試劑、抗體、天然或非天然試劑、融合蛋白質或其等效物和突變體、衍生物或其組合。實體典型地是有機化合物。在一些實例中，有機化合物包括兩個或更多個烴基。術語"烴基"在在此指至少包含C和H的并且可選地包含一個或多個其他適當的取代基的基團。這種取代基的實例可以包括卣素、烷氧基、硝基、烷基、環(huán)狀基團等等。除取代基是環(huán)狀基團這種可能性之外，取代基的組合也可以形成環(huán)狀基團。如果烴基包含一個以上C，那么那些碳不必彼此連接。例如至少兩個碳可以通過適當的元件或基團連接。因此，烴基基團可以包含雜原子。適當的雜原子對本領域熟練技術人員來說是顯而易見的，例如，包括硫、氮和氧。在一些應用中，實體優(yōu)選包含至少一個環(huán)狀基團。環(huán)狀基團可以是多環(huán)基團，例如未融合的多環(huán)基團。在一些應用中，實體包含所述環(huán)狀基團中的至少一個與另一個烴基連接。實體可以包含鹵素基團，例如氟、氯、溴或碘基團。如上所述，試劑可以是抗體。本領域眾所周知的方法可以用來生產BiP的抗體。這種抗體包括，但不局限于多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和通過Fab表達庫產生的片段。診斷和治療特別優(yōu)選中和抗體，即調節(jié)BiP生物活性的那些抗體。為了生產抗體，可以通過注射一種或多種在此描述的多肽或其任何部分、變異體、同系物、片段或衍生物或保留免疫原特性的寡肽免疫包括山羊、兔子、大白鼠、小白鼠等等的各種宿主。取決于宿主物種，可以用多種佐劑增強免疫反應。這種佐劑包括，但不局限于弗氏佐劑、礦物凝膠，例如氫氧化鋁，表面活性物質，例如溶血卵磷脂、復合多元醇、多聚陰離子、肽、油乳膠、鑰孔血藍素和二硝基酚?？梢允褂玫腂CG(卡介苗)和短棒狀桿菌是可能有用的人佐劑?？贵w優(yōu)選是單克隆抗體。利用能通過培養(yǎng)傳代細胞系產生抗體分子的任何技術可以制備單克隆抗體。這些技術包括，但不局限于KoehlerandMilstein(1975Nature256:495-497)最先描述的雜交瘤技術、人B細胞雜交瘤技術(Kosboretal(1983)ImmunolToday4:72;Coteetal(1983)ProcNatlAcadSci80:2026-2030)和EBV雜交瘤Inc,pp77-96)。另外，可以使用為產生"嵌合抗體"而研發(fā)的，可以將小白鼠抗體基因與人抗體基因拼接以獲取具有適當抗原特異性和生物活性的分子的技術(Morrisonetal(1984)ProcNatlAcadSci81:6851-6855;Neubergeretal(1984)Nature312:604-608;Takedaetal(1985)Nature314:452-454)。另外，可以改動己描述的產生單鏈抗體的技術(美國-A-4，946,779)以產生抑制劑特異的單鏈抗體。通過Orlandi等(1989,ProcNatlAcadSci86:3833-3837)，以及WinterG和MilsteinC(1991;Nature349:293-299)公開的體內誘導淋巴細胞群體產生，或者通過篩選重組免疫球蛋白庫或高度特異結合試劑組也可以產生抗體。也可以產生包含BiP特異結合部位的抗體片段。例如這種片段包括，但不局限于可以通過胃蛋白酶消化抗體分子產生的F(ab')2片段和可以通過還原F(ab')2片段的二硫鍵而產生的Fab片段?；蛘?，可以構建允許迅速和容易鑒定具有想要特異性的單克隆Fab片段的Fab表達庫(HuseWDetal(1989)Science256:1275-1281)。一種可替換的技術包括篩選噬菌體顯示庫，例如他們的膜表面上表達具有多種互補決定區(qū)(CDRs)的scFv片段。該技術在本領域為大家所熟知?？贵w優(yōu)選是人源化抗體。通過用人蛋白質替換小白鼠抗體的恒定區(qū)，并利用人蛋白質替換部分抗體可變區(qū)已經獲得人源化抗體。通常，人源化抗體的5-10%來源于小白鼠，90-95%來源于人。開發(fā)人源化抗體以對抗鼠和嵌合抗體會出現的免疫反應。臨床試驗中使用的人源化抗體的數據顯示人免疫系統(tǒng)對人源化抗體產生最低限度的應答或者不產生應答。人源化抗體的一個更復雜的方法不僅包括提供從人衍生得到的恒定區(qū)，而且也包括修飾可變區(qū)。這種方式允許盡可能以接近人抗體形式改造抗體。重鏈和輕鏈的可變區(qū)都包含三個根據所討論的抗原和決定結合能力而變化的互補決定區(qū)(CDRs)，其側面連接有在給定的物種中相對保守的并推定為CDRs提供支架的四個框架區(qū)(FRs)。當制備出針對特殊抗原的非人抗體時，可以通過將來源于非人抗體的CDRs嫁接到被修飾的人抗體的FRs上以"改造"或"人源化"可變區(qū)。例如，CancerRes(1993)53:851-856，Nature(1988)332:323-327,Science(1988)239:1534-1536,ProcNatlAcadSciUSA(1991)88:4181-4185和JImmunol(1992)148:1149-1154中己經報道了這種方法。依照本發(fā)明的試劑可以結合編碼BiP的核苷酸序列、或與核苷酸編碼序列有關的控制區(qū)域或它的對應RNA轉錄產物以調節(jié)(例如增加)BiP轉錄或翻譯的速度。例如通過調節(jié)BiPmRNA的轉錄或調節(jié)mRNA的處理過程等等可以調節(jié)BiP的表達。也可以將調節(jié)BiPmRNA翻譯BiP的過程作為調節(jié)蛋白質表達的方式。這種調節(jié)可以利用本領域已知的方法，例如利用影響轉錄或翻譯的試劑。這種試劑甚至可以調節(jié)更進一步的實體的活性。特別優(yōu)選增加、增強或上調BiP表達和/或活性的試劑。從這方面來講，試劑可以是通過，例如同源重組插入的調節(jié)序列，例如增加、增強或上調BiP表達的啟動子或增強子。優(yōu)選在插入調節(jié)序列后，可操作地連接BiP和調節(jié)序列。通過這種方式將"可操作地連接的"調節(jié)序列連接到BiP編碼序列上以實現編碼序列能夠在與對照序列相適合的條件下表達。前體藥物本領域熟練技術人員應理解實體可能來源于前體藥物。前體藥物的實例包括不具有藥理學活性的某些被保護的基團，但是在某些情況下，可以施用(例如口服或胃腸外施用)它們，它們隨后在體內能夠代謝形成有藥理學活性的實體。適當的前體藥物包括，但不局限于阿霉素、絲裂霉素、石炭酸芥末、密都錠、抗葉酸劑、氯霉素、喜樹堿、5-氟尿嘧啶、氰化物、奎寧、潘生丁和紫杉醇。試劑(例如，抗體或其片段)可以通過化學方法與敢興趣的酶連接。另外，連接物可以是利用重組DNA技術生產的融合蛋白質，其具有抗體可變區(qū)基因和酶編碼基因。前體藥物優(yōu)選是無毒的對內源性酶作用具有抗性的藥物，只能由靶酶將其轉變?yōu)橛谢钚缘乃幬铩enetr&Springer(2001)AdvancedDrugDeliveryReviews53,247-264中綜述了mAb-酶連接物選擇性激活抗癌前體藥物的情形。應更進一步地理解某些被稱為"前部分"的部分，例如H.Bundgaard,Elsevier,1985的"DesignofProdrugs"中描述的部分可以被放置在該試劑的適當功能區(qū)。這種前體藥物也包括在本發(fā)明的范圍內。該試劑可以以藥學可接受的鹽，例如添加酸的鹽或堿性鹽，或其溶劑化物，包括其水合物的形式存在。關于適當的鹽的綜述參見Bergeetal，J.Pharm.ScL，1977,66,1-19。本發(fā)明的試劑能顯示出其他的治療特性。該試劑可以與一種或多種其他藥學活性劑組合使用。如果施用活性劑組合，那么可以同時、分別或依次地施用活性劑組合。立體和幾何異構體實體可以以立體異構體和/或幾何異構體存在，例如實體可以具有一個或多個不對稱中心和/或幾何中心，因此可以存在兩種或多種立體異構形式和/或幾何異構形式。本發(fā)明意圖利用那些實體的所有單獨的立體異構體和幾何異構體，以及他們的混合物。藥物的鹽本發(fā)明的試劑可以以藥學可接受的鹽的形式施用。藥學可接受的鹽為本領域熟練技術人員所熟知，例如，包括Berge等在丄Pharm.Sci.,66,1-19(1977)中提到的那些鹽。適當的添加酸的鹽由形成無毒鹽的酸形成，包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、醋酸鹽、三氟醋酸鹽、葡糖酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、抗壞血酸、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、葡糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯碘酸鹽和苯甲磺酸i卜jm。當存在一種或多種酸部分時，形成無毒鹽的堿可以形成適當的藥學可接受的添加堿的鹽，包括鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉、鋅，和藥學上有活性的胺，例如二乙醇胺鹽。將試劑的溶液與想要的酸或堿一起混合可以適當地很容易地制備試劑的藥學可接受鹽。鹽可以從溶液中沉淀出來，通過過濾可以收集鹽，或者可以通過蒸發(fā)溶劑回收鹽。試劑可以以多晶型存在。本發(fā)明的試劑可以包含一個或多個不對稱的碳原子，因此它存在兩個或多個立體異構形式。試劑包含鏈烯基或亞鏈烯基基團時，也可能出現順式(E)和反式(Z)異構現象。本發(fā)明包括試劑獨立的立體異構體，以及其獨立的互變異構形式和其混合物。通過常規(guī)技術，例如通過試劑的立體異構混合物或其適當的鹽或衍生物的分步結晶、色譜法或H.P.L.C.可以實現分離非對映異構體或順反異構體。從對應的光學純的中間物或者通過利用適當的手性支持的對應的外消旋物的分辨，例如通過H.P丄.C.，或者通過對應的外消旋物與視情況而定的光學活性的酸或堿反應形成的非對映異構的鹽的分步結晶也可以制備試劑獨立的對映體。試劑也可以包括試劑或其藥學可接受的鹽所有適當的同位素變異體。試劑或其藥學可接受的鹽的同位素變異體被定義為其中至少一個原子被具有相同原子序號，但原子質量不同于自然界中通常發(fā)現的原子質量的原子替代。可以包含到到試劑和其藥學可接受的鹽中的同位素實例包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，例如分別為2H,3H,'3C/4C,15N,170，180,31P,32P,35S，18F和36C1。試劑和其藥學可接受的鹽的某些同位素變異體，例如其中包含了放射性同位素，例如3H或14C的同位素變異體可用于藥物和/或底物組織分布研究中。同位素氚，即SH和碳14，即"C因為容易制備和檢測，所以是特別優(yōu)選的。另外，用同位素，例如氖，即"H進行替換可以提供由更高的代謝穩(wěn)定性帶來的某些治療優(yōu)點，例如體內半衰期增加或降低的給藥量，因此在某些情況下是優(yōu)選的。通常，通過常規(guī)程序利用適當試劑的合適的同位素變異體可以制備本發(fā)明的試劑和其藥學可接受的鹽的同位素變異體。藥學上有活性的鹽可以以藥學可接受的鹽施用試劑。典型地，利用視情況而定的想要的酸或堿可以很容易地制備藥學可接受的鹽。鹽可以從溶液中沉淀出來，通過過濾可以收集鹽，或者可以通過蒸發(fā)溶劑回收鹽?；瘜W合成方法通過化學合成技術可以制備試劑。在合成本發(fā)明的化合物期間，敏感的功能基團需要保護和去保護，這--點對本領域熟練技術人員來說是顯而易見的。通過常規(guī)技術，例如"ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis"byTWGreeneandPGMWuts,JohnWileyandSonshie.(1991)禾口PJ.Kocienski,in"ProtectingGroups",GeorgThiemeVerlag(1994)中描述的技術可以實現這一過程。在一些反應期間，存在的任何立構中心在一定條件下被外消旋化是可能的，例如，如果在與具有旋光中心的底物的反應中使用堿就可以導致上述情形發(fā)生，其中旋光中心包含堿敏感基團。例如，在鳥苷酸化(guanylatkm)步驟期間是可能發(fā)生的。例如，通過選擇反應序列、條件、試劑、保護/去保護方式等等避免潛在問題發(fā)生是可能的，這一點本領域已經公知。利用常規(guī)方法可以分離和純化化合物和鹽。通過常規(guī)方法，例如通過分子式(I)的化合物的立體異構混合物或其適當的鹽或衍生物的分步結晶、色譜法或H.P丄.C.可以實現分離非對映體的過程。從對應的光學純的中間物或者通過利用適當地手性支持對應的外消旋物的分辨，例如通過H.P.L.C.的分辨，或者通過對應的外消旋物與適當的光學活性的酸或堿反應形成的非對映鹽的分步結晶也可以制備分子式(I)的化合物的獨立的對映體。利用化學方法合成試劑的整體或部分可以生產試劑或其變異體、同系物、衍生物、片段或模擬物。例如如果試劑包含肽，那么可以通過固相技術合成這種肽，從樹脂上可以切割分離肽，最后可以通過預備的高效液相色譜法纟4H七月太(伊j々卩，Creighton(1983)ProteinsStructuresAndMolecularPrinciples,WHFreemanandCo,NewYorkNY)。通過氨基酸分析或測序(例如，上文的theEdmandegradationprocedure;Creighton)可以確認合成肽的纟且成。利用各種固相技術可以實現合成肽抑制劑(或其變異體、同系物、衍生物、片段或模擬物)的過程(RobergeJYetal(1995)Science269:202-204)并進行自動合成，例如依照廠家提供的說明書利用ABI431APeptideSynthesizer(PerkinElmer)。另外，在直接合成和/或與化學方法組合合成期間，可以利用來自其他亞單位的序列或其任何部分改變包含試劑的氨基酸序列以產生變異體試劑?；瘜W衍生物在此使用的術語"衍生物"或"衍生化"包括試劑的化學修飾。這種化學修飾的例證說明可以是氫被鹵素基團、垸基、?；虬被鎿Q。化學修飾試劑可以是修飾試劑，例如，但不限于化學修飾試劑。試劑的化學修飾可以增強或降低氫鍵鍵合相互作用、電荷相互作用、疏水性相互作用、VanDerWaals相互作用或偶極子相互作用。--方面，該試劑可以作為開發(fā)其他化合物的模型(例如模板)。藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物可以包含治療有效量的試劑。本發(fā)明的藥物組合物可以包含治療有效量的BiP。本發(fā)明的藥物組合物可以包含治療有效量的試劑和BiP。藥物組合物可以在人藥品和獸醫(yī)藥品中供人或動物使用，而且典型地包括任何一種或多種藥學可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。供治療使用的可接受的載體或稀釋劑在藥物領域為大家所熟知，而且在例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.(A.R.Gennaroedit.1985)中已經進行了描述?？梢愿鶕A定的給藥途徑和標準的制藥實踐選擇藥物載體、賦形劑或稀釋劑。藥物組合物可以包括作為載體、賦形劑或稀釋劑的任何適當的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣衣料、增溶劑或除載體、賦形劑或稀釋劑之外的任何適當的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣衣料、增溶劑?？梢栽谒幬锝M合物中提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料，甚至調味劑。防腐劑的實例包括苯甲酸鈉、山梨酸和p-羥基苯甲酸酯。也可以使用抗氧化劑和懸浮劑。可以有不同的組合物/劑型要求，這取決于不同的遞藥系統(tǒng)。舉例來說，本發(fā)明的藥物組合物可以配制成利用小泵或通過粘膜途徑進行施用，例如，鼻腔噴霧劑或供吸入的氣溶膠或可吸收的溶液、或配制成以可注射形式遞送的胃腸外組合物，例如，通過靜脈內、肌內或皮下途徑?；蛘?，可以將劑型設計成能通過許多途徑施用。如果通過胃腸粘膜以粘膜式施用試劑，那么試劑應該在穿過胃腸道期間保持穩(wěn)定；例如它應該對蛋白水解引起的降解有抵抗力，在酸性pH中保持穩(wěn)定，而且對膽汁的去污效應具有抵抗力。在適當時候，可以通過吸入、以栓劑或陰道栓劑形式、以表皮乳液、溶液、乳膏、軟膏或撲粉形式、使用皮膚貼片、以包含賦形劑，例如淀粉或乳糖的片劑、單獨或與賦形劑混合的膠囊或胚珠形式口服、或者以包含調味劑或著色劑的酏劑、溶液或懸浮液形式施用藥物組合物，或者可以胃腸外注射，例如靜脈內、肌內或皮下注射該藥物組合物。為了進行腸胃外給藥，最好以無菌水溶液形式使用組合物，其可包含其他物質，例如使溶液與血液等滲的足量鹽或單糖。為了進行口腔或舌下給藥，可以以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑形式施用組合物。試劑可以與環(huán)糊精組合使用。已知環(huán)糊精能與藥物分子形成包埋和非包埋的復合物。藥物環(huán)糊精復合物的形成可以改變藥物分子的溶解性、溶解速率、生物利用率和/或穩(wěn)定性。藥物環(huán)糊精復合物通常對大多數劑型和給藥途徑都是有用的。環(huán)糊精直接與藥物絡合的另一種方式是用作輔助添加劑，例如作為載體、稀釋劑或溶解劑(solubiliser)。使用最常使用的環(huán)糊精是a-、0_禾。7-環(huán)糊精，WO-A-91/11172，WO-A-94/02518和WO-A-98/55148中描述了適當的實例。如果試劑是蛋白質，那么可以在待治療的受試者體內原位制備所述蛋白質。在這方面，可以通過利用非病毒技術(例如，通過利用脂質體)和/或病毒技術(例如，通過利用逆轉錄病毒載體)遞送編碼所述蛋白質的核苷酸序列，從而從所述核苷酸序列表達所述蛋白質，下文已經描述這一點。施用在此使用的術語"施用"指通過病毒或非病毒技術的遞送。非病毒遞送裝置包括，但不局限于轉染、脂質介導的轉染、脂質體微脂粒、免疫脂質體、脂質轉染、陽離子面部親水脂分子(CFAs)和其組合。將核酸物理性地注射到細胞中代表了最簡單的基因遞送系統(tǒng)(Vile&Hart(1994)Ann.Oncol,suppl.5，59)。因此，包含核苷酸序列的載體可以直接以"裸核酸構建體"形式施用，其可以更進一步地包含與宿主細胞基因組同源的側接序列。注射后，核酸進入細胞中并轉移到細胞核中，在細胞核中它可以從附著位置短暫表達，若已經整合到宿主基因組中，則可以穩(wěn)定表達。編碼BiP的基因置于啟動子控制下。物理干預，例如聚焦超聲(focusedultrasound)可以增加轉染效率。用基因槍注射包被了金顆粒的DNA可以增加體內的細胞轉染效率(Fyanetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sd.USA90,11478)。脂質體是由可以包裝各種物質，包括核酸的磷脂雙層膜組成的小囊。脂質和核酸的混合物會形成可以體外和體內轉染細胞的復合物(脂質體復合物lipoplexes)。脂質介導的基因遞送具有不需要與特異受體的相互作用就能夠轉染各種不同的細胞的能力，具有脂質組分最小限度的免疫原性從而便于多次給藥，具有大容量載體因此能夠遞送大的DNA序列，而且容易生產。將聚乙二醇衍生物插入到脂膜中或聚乙二醇化(pegylation)可以提高給藥后脂質體的循環(huán)半衰期。改變脂膜的組分可以改變脂質體的藥物動力學、生物分布和融合(ftisogenicity)。特別是在脂質體的某些陽離子脂質，例如DMRIE、DOSPA禾口DOTAP中摻入中性或輔助共同脂質，例如膽固醇或DOPE可以提高他們融合細胞膜和遞送內含物到細胞中的能力。許多非脂質聚陽離子聚合物與核酸形成促進核酸遞送到細胞中的復合物(LiandHuang(2000)GeneTher.7,31)。優(yōu)選的非脂質聚陽離子聚合物包括，但不局限于聚-L-賴氨酸、聚氮丙啶(polyethylenimine)、聚葡萄糖胺(polyglucosamines)和類肽。聚氮丙啶可以保護形成復合物的核酸避免在內涵體內降解，而且它也提供了一種促進核酸從內涵體腔釋放并隨后移位到細胞核的方式(Boussifetal.(1995)Proc.Natl,Acad.ScLUSA92，7297)。聚乙二醇化的聚氮丙啶聚合物可以降低與血清蛋白的相互作用，并能夠延長循環(huán)半衰期，而且可以在不產生明顯毒性的情形下將基因遞送到細胞中。也可以使用經過遺傳加工的能釋放生物治療分子的細胞的移植，這些細胞例如，自體同源細胞、同種異體細胞和異種基因細胞?？梢杂猛耆⒈Ｗo被移植的細胞不受宿主免疫系統(tǒng)攻擊的選擇性滲透膜圍繞被移植的細胞。這種包囊方法允許實施同種異體來源和異體基因來源的初級細胞或細胞系的神經移植。各種類型的包囊技術在本領域已知。微包囊方法允許將小細胞群俘獲在薄的球形半透薄膜內，其中半透薄膜典型地由聚合電解質構成。病毒遞送裝置是吸引人的基因遞送載體，因為它們已經發(fā)展成為進入人細胞和表達它們的基因的特異有效的方式。優(yōu)選對病毒基因組迸行修飾以除去病毒復制和致病性所需要的序列。用外源基因，例如BiP替換病毒編碼序列是更優(yōu)選的。病毒遞送裝置包括，但不局限于逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、痘病毒、慢病毒載體、桿狀病毒、呼腸孤病毒、新城疫病毒、(x病毒(aviruse)和水泡性口膜炎病毒載體。逆轉錄病毒是單鏈二倍體RNA病毒，其通過env基因編碼的表面膜蛋白的結合進入細胞。進入細胞后，pol基因編碼的逆轉錄酶將病毒基因組轉錄成雙鏈DNA拷貝，其可以進入分裂細胞的細胞核并隨機整合到宿主基因組中。優(yōu)選通過除去逆轉錄病毒的gag、pol和env基因使他們不能復制從而加工成用于病毒遞送的逆轉錄病毒。因此，在包裝細胞系中可以產生感染性的非復制逆轉錄病毒顆粒，其中包裝細胞系由缺乏包裝序列的質粒表達逆轉錄病毒gag、pol禾口env基因。逆轉錄病毒的亞型-慢病毒代表逆轉錄病毒的另一種可選擇方式。慢病毒，例如HIV、猿和貓免疫缺陷病毒可以感染非分裂細胞，而且能夠按照與其他逆轉錄病毒相同的方式進行整合。已經顯示復制缺陷和多重減毒的慢病毒載體能導致嚙齒類動物和靈長目動物的CNS中長期表達多種轉基因(Bensadounetal.(2000)Exp.Neurol.164,15-24;Kordoweretal.(2000)Exp.Neurol.160,1-16)。慢病毒載體可以從注射部位擴散2-3mm，從而可以轉換數目眾多的神經元可以持續(xù)的表達基因達至少一年。其他的病毒還可以是包含雙鏈DNA病毒的腺病毒。己經鑒定出在6群(A-F)中40種以上的腺病毒血清型。對C群病毒(血清型Ad2和Ad5)作為基因遞送的候選物進行了最廣泛地評價(Zhang(1999)CancerGeneTher.6,11)。腺病毒通過結合柯薩奇病毒和腺病毒受體進入細胞，這種結合有助于病毒精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列與細胞整合素(integrins)相互作用。內化后，病毒從細胞內涵體中脫離，部分分解并移位到細胞核中，并在此開始表達病毒基因。優(yōu)選不能復制的腺病毒。通過刪除一個或多個腺病毒基因，例如早期腺病毒基因E1-E4可以實現這一目的。這可以進一步擴展除去腺病毒基因組完整的編碼序列。這種病毒可以用來包裝BiP基因，但它必須在存在輔助病毒的在生產細胞系中生長，其中輔助病毒可以提供所有必需的病毒基因功能以幫助包裝包含BiP基因的具有感染性的不能復制的腺病毒。腺相關病毒是單鏈DNA病毒，它是天然人病毒并未發(fā)現它能引起任何疾病。他們通過結合硫酸乙酰肝素進入細胞，但他們需要與所謂的輔助病毒，例如腺病毒或皰疹病毒的協同感染才能復制。腺相關病毒載體具有許多潛在的優(yōu)點。他們能感染非分裂細胞，而且能穩(wěn)定地整合并維持在宿主基因組中；整合作用優(yōu)選發(fā)生在染色體19上的一個位點依賴基因座(sitedependentlociis)，因此能降低插入突變的風險。但是，為了降低出現能復制的腺相關病毒的風險而缺失rep蛋白質，會導致腺相關病毒載體的這種特征性的整合作用的喪失。單純皰疹病毒是大病毒，具有編碼70種以上病毒蛋白質的大約150kbp的線性雙鏈DNA基因組。這些病毒通過將病毒糖蛋白結合到細胞表面的硫酸乙酰肝素殘基上進入細胞。優(yōu)選通過失活少量基因，例如快速早期基因ICPD、ICP4、10P22和ICP27使單純皰疹病毒成為復制缺陷病毒。因為可以刪除許多單純皰疹病毒基因而不影響產生病毒載體的能力，因此包含多基因和他們的調節(jié)元件的大核酸序列可以包裝在單純皰疹病毒載體內。痘病毒是包括牛痘苗和金絲雀痘或ALVAC的雙鏈DNA病毒。痘病毒優(yōu)選是包含BiP基因的重組痘病毒?？梢詥为毷┯迷摻M分，但通常以藥物組合物的形式施用，例如，當組分處于包含有適當的依據預定的給藥途徑和標準的制藥實踐而選擇的藥物賦形劑、稀釋劑或載體的混合物中時，就是以組合物的形式施用的。例如該組分可以以包含調味劑或著色劑的片劑、膠囊、胚珠、酏劑、溶液或懸浮液的形式施用，可采用速溶、延遲釋放、緩釋、持續(xù)釋放、脈沖釋放或控制釋放模式。如果藥物是片劑，那么片劑可以包含賦形劑，例如微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫鈣和甘氨酸；崩解劑，例如淀粉(優(yōu)選玉米、馬鈴薯或木薯淀粉)、羥基乙酸淀粉鈉、交聯甲羧纖維素鈉和特定的復合硅酸酯；以及制粒粘合劑，例如聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙纖維素(HPC)、蔗糖、明膠和阿拉伯膠。另夕卜，也可以包括，潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石粉。也可以使用相似類型的固體組合物作為明膠膠囊填充劑。從這方面來說，優(yōu)選的賦形劑包括乳糖、淀粉、纖維素、乳糖或高分子量聚乙二醇。對水懸浮液和/或酏劑來說，試劑可以與多種甜味劑或調味劑、色素或染料、乳化劑和/或懸浮劑和稀釋劑，例如水、乙醇、丙二醇和甘油，以及其組合進行組合使用。給藥(遞送)途徑包括，但不局限于一種或多種口服形式(例如，以片劑、膠囊、或可吸收溶液形式)、表皮給藥、粘膜給藥(例如，以鼻腔噴霧劑或氣溶膠形式吸入)、鼻給藥、腸胃外給藥(例如，通過可注射的形成)、胃腸給藥、脊柱內給藥、腹腔內給藥、肌內給藥、靜脈內給藥、子宮內給藥、眼內給藥、真皮內給藥、顱內給藥、氣管內給藥、陰道內給藥、腦室內給藥、腦內給藥、皮下給藥、眼(包括玻璃體內或前房內)給藥、透皮給藥、直腸給藥、面頰給藥、陰道給藥、硬膜外給藥、舌下給藥。劑量水平典型地，由內科醫(yī)師決定最適合于個體受試者的實際劑量。任何特定病人用藥量的具體劑量水平和頻率可能會不同，它們取決于多種因素，包括使用的具體化合物的活性、化合物的代謝穩(wěn)定性和作用時間的長度、年齡、體重、總體健康、性別、飲食、給藥的模式和時間、排泄的速度、藥物組合、特定狀況的嚴重性，以及個體所經受的治療。給藥量通過常規(guī)實驗可以確定，而且在臨床醫(yī)師的判斷能力范圍之內。通常，有效量為0.01mg/kg-50mg/kg;更優(yōu)選為0.01mg/kg-40mg/kg;更優(yōu)選為0.01mg/kg-30mg/kg;更優(yōu)選為0.01mg/kg-20mg/kg;更優(yōu)選為0.01mg/kg-10mg/kg;最優(yōu)選為0.05mg/kg-10mg/kg。配制組分可以配制到藥物組合物中，例如，可以利用本領域己知的技術將組分與一種或多種適當的載體、稀釋劑或賦形劑混合進行配制。片段/變異體/同系物/衍生物本發(fā)明包括BiP片段、變異體、同系物和衍生物的用途。術語"變異體"用來指不同于野生型序列的天然多肽或核苷酸序列。術語"片段"指包含野生型序列的一部分的多肽或核苷酸序列。它可以包含序列的一個或多個較大的連續(xù)部分或許多較小的部分。該序列也可以包含序列的其他元件，例如，它可以是與另一種蛋白質的融合蛋白。序列優(yōu)選包含野生型序列的至少50%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少80%、最優(yōu)選至少90%。術語"同系物"指與受試的氨基酸序列和核苷酸序列具有一定同源性的實體。在在此，術語"同源性"可以等同于"同一性"。在本發(fā)明的上下文中，認為同源序列包括與受試序列至少75、85或90%相同，優(yōu)選至少95、96、97或98%相同的氨基酸序列。同系物典型地包含與受試的氨基酸序列相同的活性部位等等。雖然也可以按照相似性(即具有相似的化學性能/功能的氨基酸殘基)來考慮同源性，但是在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選的按照序列同一性來表述同源性。在本發(fā)明的上下文中，認為同源序列包括與受試序列至少75、85或90%相同，優(yōu)選至少95、96、97或98%相同的核苷酸序列。同系物典型地包含與受試序列具有相同的編碼活性部位等等的序列。雖然也可以按照相似性(即具有相似的化學性能/功能的氨基酸殘基)來考慮同源性，但是在本發(fā)明的上下文中，按照序列同一性來表述同源性是優(yōu)選的?？梢酝ㄟ^眼睛來進行同源性比較，但更常見的是借助于容易獲得的序列比較程序進行同源性比較。這些市場上可買到的計算機程序可以計算兩個或更多個序列之間的百分比同源性?？梢杂嬎闩R近序列的百分比同源性，即將一個序列與另一個序列進行比對，一個序列中的每個氨基酸直接地與另一個序列中的對應氨基酸進行比較，每次比較一個殘基。這被稱作"無空位(ungapped)"比對。一般只能對相對短數Fl的殘基進行這種無空位比對。雖然這是非常簡單和連貫的方法，但它沒有考慮到，例如在其他方面相同的一對序列中，一個插入或缺失將使后面的氨基酸殘基的比對走樣，因此可能導致進行總體比對時，百分比同源性大大降低。因此，大多數序列比較方法考慮了可能的插入和缺失，不會過度地對整個同源性罰分而設計，從而能產生最佳比對。通過在序列比對中插入"空位"使局部同源性最大化可以實現這一點。但是，這些更復雜的方法對存在于比對中的每個空位處以"空位罰分"，這樣對相等數量的相同氨基酸來說，具有盡可能少的空位的序列比對-反映兩個比較的序列之間有更高相關性，與具有許多空位的比對相比將能得到更高的分數。典型地使角"仿射缺口成本(Affinegapcosts)"，其中對一個空位算計為相對高的罰分，而該空位中的每個后續(xù)的殘基計為較小的罰分。這是最常使用的空位評分系統(tǒng)。當然高的空位罰分將會產生具有較少空位的優(yōu)化比對。大多數比對程序允許修飾空位罰分。但是，當利用這種軟件進行序列比較時，優(yōu)選使用缺省值。例如當利用GCGWisconsinBestfit程序包時，氨基酸序列的空位罰分是一個空位計為-12分，每個延伸計為-4分。因此，最大百分比同源性的計算首先需要進行考慮了間隔罰分的最佳比對。實施這種比對的適當的計算機程序是GCGWisconsinBestfit程序包(UniversityofWisconsin,U.S.A.;Devereuxetal,1984，NucleicAcidsResearch12:387)。能夠實行序列比較的其他軟件的實例包括，但不局限于BLAST程序包(參見Ausubdetal.,1999ibid-Chapter18)，FASTA(Atschuletal.,1990,J.Mol.Biol.,403-410)和比較工具GENEWORKS套件。BLAST和FASTA都可用于脫機和聯機搜索(參見Ausubeletal,1999ibid,pages7-58to7-60)。但是，在一些應用中，更優(yōu)選使用GCGBestfit程序。稱為BLAST2Sequences的新工具也可用于比較蛋白質和核苷酸序列(參見FEMSMicrobiolLett1999174(2):247-50;FEMSMicrobiolLett1999177(1):187-8)。雖然最終的百分比同源性能夠以同一性進行測算，但比對過程本身典型地不是以全或無配對比較為基礎的。通常改為使用規(guī)模相似性得分矩陣(scaledsimilarityscorematrix),其根據化學相似性或進化距離給每個成對比較分配得分。通常使用的這種模型的實例是BLOSUM62模型--BLAST程序套件的缺陷模型。GCGWisconsin程序通常使用公共缺省值或定制的符號比較表，如果提供符號比較表的話(參見用戶手冊了了解更多細節(jié))。在一些應用中，對GCG程序包來說，使用公共缺省值是優(yōu)選的，在其他軟件情況下，使用缺省矩陣，例如BLOSUM62是優(yōu)選的。一旦軟件產生了最佳比對，那么就可能計算百分比同源性，優(yōu)選的百分比序列同一性。軟件一般將這一過程作為序列比較的一部分來并產生數值結果。序列也可以具有產生沉默變化和功能等效物質的氨基酸殘基的缺失、插入或替換。只要保留了物質的第二結合活性，就可以基于殘基的極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性和/或中極兩性性質方面的相似性來產生仔細考慮的氨基酸替換。例如帶負電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；有不帶電荷的極性頭部基團的具有相似的親水性值的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。例如，可以依照下表進行保守替換。第二列相同區(qū)，優(yōu)選的第三列中同行的氨基酸可以彼此替換:<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>本發(fā)明也包括發(fā)生的同源替換(在此使用的替換和替換都指現有氨基酸殘基與替換殘基的互換)，即相似-對-相似的替換方式，例如堿性氨基酸殘基替換堿性氨基酸殘基、酸性氨基酸殘基替換酸性氨基酸殘基、極性氨基酸殘基替換極性氨基酸殘基等等。也可能發(fā)生非同源替換，即從一類殘基替換為另一類，或者涉及包含非天然氨基酸，例如鳥氨酸(以下簡稱z)、二氨基丁酸鳥氨酸(以下簡稱B)、正亮氨酸鳥氨酸(以下簡稱O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸的情形。也可以用非天然氨基酸進行替換，非天然氨基酸包括a*和a-二基取代*氨基酸、N-垸基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的鹵化物衍生物，例如三氟酪氨酸*、p-Cl-苯丙氨酸*、p-Br-苯丙氨酸*、p-1-苯丙氨酸*、L-烯丙-甘氨酸*、(3-丙氨酸*、L-a-氨基丁酸*、L-Y-氨基丁酸*、L-a-氨基異丁酸*、L-s-氨基異己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜^、L-正亮氨酸*、L-正纈氨酸*、p-硝基丄-苯丙氨酸*、L-羥基脯氨酸^L-硫雜脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物，例如4-甲基-苯丙氨酸*、5-甲基-苯丙氨酸*、L-苯丙氨酸(4-氨基)#、L-酪氨酸(甲基)*、L-苯丙氨酸(4-異丙基)*、L-Tic(1，2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸，nL-苯丙氨酸(4-苯甲基)*。為了說明以上討論(與同源或非同源替換有關)，利用注釋*表示衍生物的疏水性，而用#表示衍生物的親水性，#*表示兩親特性。變異體氨基酸序列可以包括在序列的任何兩個氨基酸殘基之間插入的適當的間隔基團，間隔基團除氨基酸間隔物，例如甘氨酸或(3-丙氨酸殘基之外，還包括垸基，例如甲基、乙基或丙基。變異更進一步的形式包括類肽形式中存在的一個或多個氮基酸殘基，本領域熟練技術人員很容易理解這一點。為了避免引起疑問，"類肽形式"用來指其中(X-碳取代基位于殘基的氮原子上，而不是位于(X-碳上的變異體氨基酸殘基。制備類肽形式的肽的工藝是本領域已知的，例如參見SimonRJetal，PNAS(1992)89(20),9367-9371和HorwellDC,TrendsBiotechnol.(1995)13(4),132-H4。供本發(fā)明使用的核苷酸序列可以在其內部包含合成或修飾的核苷酸。寡核苷酸的許多不同修飾類型是本領域已知的。其中包括膦酸甲酯和磷硫酰骨架，和/或在分子的3'和/或5'末端添加吖啶或聚賴氨酸鏈。應認識到，為實現本發(fā)明的目的可以利用本領域任何己有方法修飾核苷酸序列。這種修飾可以用來增強在本發(fā)明中有用的核苷酸序列的體內活性或延長其有效期限。片段優(yōu)選是功能性片段。在此使用的術語"功能性片段"指能夠引發(fā)全長BiP蛋白質的至少部分活性的BiP片段。功能性片段特別地具有下列功能中的至少一種使CD14+細胞釋放IL-10;刺激CD8+細胞增殖并釋放IL-10;抑制記憶抗原反應；激活單核細胞中一系列抗炎基因，包括游走抑制因子(MIF)、可溶性TNF受體II和TIMPs的表達；抑制破骨細胞成熟；抑制骨吸收。功能性片段的長度優(yōu)選是至少20個氨基酸，更優(yōu)選至少50個氨基酸，最優(yōu)選至少IOO個氨基酸。特別優(yōu)選的片段包含保守區(qū)，已經發(fā)現該保守區(qū)與許多天然發(fā)生的BiP蛋白質同源。認為這種保守區(qū)具有特定功能。在此使用的術語"功能性同系物"指保留全長BiP蛋白質的至少部分活性的同系物。尤其是，優(yōu)選的功能性同系物具有下列功能中的至少一種使CD14+細胞釋放IL-10;刺激CD8+細胞增殖并釋放IL-10;抑制記憶抗原反應；激活單核細胞中一系列抗炎基因，包括游走抑制因子(MIF)、可溶性TNF受體II和TIMPs的表達；抑制破骨細胞成熟；抑制骨吸收?；蛑委煴景l(fā)明更進一歩地涉及體內調節(jié)編碼BiP的核苷酸序列的基因治療。例如通過施用結合核苷酸編碼序列、或與BiP的核苷酸編碼序列有關的控制區(qū)域、或它對應的RNA轉錄產物從而修飾，優(yōu)選提高轉錄或翻譯的速度的試劑可以完成對表達的調節(jié)。舉例來說，編碼BiP的核苷酸序列可以受同源或異源表達調節(jié)元件，例如啟動子或啟動子和增強子的控制。增強子和/或啟動子甚至可以在特定組織中有活性，因此，可以優(yōu)先表達編碼BiP的核苷酸序列。產生調節(jié)性表達的增強子元件或其他元件可以以多拷貝形式存在。同樣，或者此外，增強子和/或啟動子可以優(yōu)先在一種或多種細胞類型，例如一種或多種骨細胞類型，例如破骨細胞表現出活性。通過操作啟動子區(qū)域可以調節(jié)編碼核苷酸序列的表達水平。例如啟動子區(qū)域內部的不同結構域可以具有不同的基因調節(jié)活性。典型地，利用具有不同的啟動子變異體，其啟動子的特定區(qū)域被刪除(即缺失分析)的載體構建物可以評價這些不同區(qū)域的作用。通用的重組DNA方法技術除非另有陳述，否則本發(fā)明使用在本領域普通技術人員能力范圍內的化學、分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規(guī)方法。文獻中對這些技術進行了解釋。例如，參見J.Sambrook,E.RFritsch,andT.Maniatis，1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,Books1-3，ColdSpringHarborLaboratoryPress;Ausubel,F.M.etal.(1995andperiodicsupplements;CurrentProtocolsinMolecularBiology,ch.9,13,and16,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.);B.Roe,J.Crabtree，andA.Kalm，1996,DNAIsolationandSequencing:EssentialTechniques,JohnWiley&Sons;M.J.Gait(Editor),1984,OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,HPress;and,D.M.J.LilleyandJ.E.Dahlberg，1992,MethodsofEnzymology:DNAStructurePartA:SynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress。在此通過引用將這些通用教科書中的每一篇都合并在內。更進一歩的應用本發(fā)明優(yōu)選被用于防止或者抑制破骨細胞的發(fā)育和/或破骨細胞的功能。通過實施例對本發(fā)明進行更進一步的描述，實施例的目的是幫助本領域普通技術人員實施本發(fā)明，無意用實施例來限制發(fā)明的范圍。實施例實施例1s/尸^/激誘導卓^:智應^^fi^^^^眾譜。BiP或葡萄糖調節(jié)蛋白質78(grp78)是功能上負責蛋白質正確折疊的內質網(ER)伴侶蛋白。當通過葡萄糖饑餓、缺氧或活性氧簇干擾ER的功能時，會導致BiP上調，最終引起未折疊蛋白質的積聚。這些也是在發(fā)炎的關節(jié)中普遍存在的影響類風濕性關節(jié)炎(RA)發(fā)病機理的因素。我們利用蛋白組學，在RA中分離和鑒定了作為自身抗原的BiP。隨后，我們證明從RA病人的滑膜液(SF)中分離的單核細胞(MC)在存在重組人(rhu)BiP的情況下能夠增殖，而在RA周圍血液(PB)MC和來自OIJDPB和SFMC中的結果則相反。這些細胞幾乎沒有產生IFNy。來自BiP剌激的PBMC的上清液的細胞因子分析顯示高濃度的IL-IO，少許TNFa、IFNy和IL-1P，沒有IL-2或者IL-15。在RA動物模型中，先用BiP疫苗顯示出可以防止小白鼠中膠原誘導的關節(jié)炎(CIA)的發(fā)作。靜脈內或皮下施用BiP也對小白鼠的CIA早期有治療作用。為了研究BiP的作用機制，利用兩種不同的基因陣列技術進行了更進一步的體外試驗來分析用rhuBiP刺激的純化單核細胞的細胞因子譜。方法利用免疫磁珠負分離純化單核細胞。從未經BiP刺激和用BiP刺激(20pg/ml)24小時的這些細胞中分離總RNA。然后依照廠家的說明書，在Affymetrix基因陣歹lJ(U95version2)或R&D細胞因子基因陣列中使用RNA。在Affymetrix陣列中使用了來自受試者的一式雙份樣品，在R&D基因陣列中使用了兩個正常對照受試樣品。結果結果顯示在表1和圖6中。結論BiP誘導了在炎性反應的單核細胞中激活的許多基因下調。這些基因包括那些參與抗原提呈、粘附和細胞遷移、細胞信號傳導和破骨細胞分化的基因。利用R&D細胞因子基因活化陣列和Affymetrix陣列獲得的結果是一致的。單核細胞基因活化的這些變化的全部產生了了抗炎譜。已經顯示BiP通過受體樣分子結合人單核細胞，其中受體樣分子不象HSP60或70和grp94使用的那些分子。為了研究BiP激活單核細胞的后果，使用了兩種基因陣列。利用375個細胞因子/趨化因子，以及他們的受體的限制性基因陣列針對來自兩個正常個體的單核細胞(未經刺激或用BiP刺激24h)進行了分析。之后，用Affymetrix基因陣列對單個樣品進行一式兩份的實驗，并利用Genespring軟抖二進行分析。Affymetrix陣列顯示900個基因受BiP影響并下調>75%。三個陣列的結果都顯示il-10降低了，而il-i受體拮抗體增高了。hla-dr、cd40、cd86，以及c-fos、IKKa、粘附分子CD54、avP3、CD18和CDllc都下調了。雖然，幾個趨化因子受體隨之出現了下調(CCR1、ccr2禾nCXCR4)，但趨化因子groa、0、y，以及il-6、mcp-i和rantes都增強了。用BiP刺激人單核細胞后出現的基因活化方面的變化會影響抗原提呈、細胞遷移和炎性細胞因子的生產。實施例2乂,V、/^嵐系統(tǒng)^歷p齊動游被骨潘應f成游潘應厲f沐//#^游#/0^夕緣"^7汰眾。利用人和小白鼠細胞實施所有的體外實驗。通過分離單核細胞的密度離心(27)從外周血分離人細胞。按照以前的描述(28)，從5-8周齡的成年小白鼠的股骨和脛骨分離小白鼠細胞。通過計數TRAP陽性細胞的數目(小白鼠)，或表達玻璃體結合蛋白受體(VnR)和/或F肌動蛋白環(huán)(人)的細胞數目對兩個系統(tǒng)中的破骨細胞分化進行了評價。在牙本質切片上培養(yǎng)細胞后，通過量化骨吸收陷窩的形成評價兩個系統(tǒng)的吸收功能。在實驗條件下4-5天(小白鼠)，或10-12天(人)后收集破骨細胞培養(yǎng)物，分別在7天和14天后對小白鼠和人破骨細胞進行吸收測定。在M-CSF(25ng/ml)中培養(yǎng)過夜后，制備PBMC(人)或BMM(小白鼠)。為了產生破骨細胞，隨后用M-CSF(25ng/ml)和RANKL(10ng/ml)在連續(xù)存在和缺少一定濃度范圍(0.02-20(ig/ml)的BiP的條件下培養(yǎng)依賴M-CSF的非粘附細胞。也可以利用沖擊研究(pulsestudies)來評價BiP對破骨細胞分化不同階段的影響，其中沖擊研究是在前體分化早期或形成多核細胞之后添加BiP。在適當的時間,固定培養(yǎng)物并針對TRAP活性進行組織化學染色(mouse),或者通過利用23C6抗體和TRITC-毒傘素免疫定位分別對VnR和F-肌動蛋白環(huán)進行染色(人)，并量化破骨細胞的數目。從牙本質切片中除去破骨細胞并利用甲苯胺藍染色后，量化吸收。通過分子技術，利用實時PCR測量破骨細胞特異的標記基因，例如降鈣素受體和組織蛋白酶K表達可以另外確認破骨細胞分化的數據，特別是可以確認小白鼠細胞內的數據。因為BiP刺激PBMC(19)產生IL-IO，IL-10抑制破骨細胞分化(29)。培養(yǎng)24h后，可以通過ELISA在蛋白水平或通過實時PCR在tnRNA水平測量小白鼠和人破骨細胞前體產生的IL-10。利用抗IL-10或抗IL-10受體的中和單克隆抗體的附加實驗可以評價在使用BiP中觀察到的任何抑制效果是單獨由IL-10引起的，還是應歸于其他因素。也解釋說明了凋亡引起破骨細胞數目減少的可能性，并利用DAPI染色從形態(tài)上以及TUNEL測定從生物化學角度研究用BIP處理過的細胞的凋亡。實施例3BiP對參與被骨潘應生成^7骨級欲游主要潘應,號遂徑游f拔。從細胞表面到轉錄因子(例如，RANK和c-Fms、TRAFs、c-Fos、NFATcI、MAPK[p38，jun禾DERK1/2〗、IKK和NF-KB和Akt)，通過磷酸化的抑制和分子的激活可以直接調查這一過程，或者可以通過抑制性細胞因子，例如IL-10的釋放進行間接調查。利用人和小白鼠細胞實施所有的體外實驗。通過分離單核細胞的密度離心(27)從外周血分離人細胞。按照以前的描述(28)，從5-8周齡的成年小白鼠的股骨和脛骨分離小白鼠細胞。通過計數TRAP陽性細胞的數目(小白鼠)，或表達玻璃體結合蛋白受體(VnR)和/或F肌動蛋白環(huán)(人)的細胞數目對兩個系統(tǒng)中的破骨細胞分化進行了評價。在牙本質切片上培養(yǎng)細胞后，通過量化骨吸收陷窩的形成評價兩個系統(tǒng)的吸收功能。在實驗條件下4-5天(小白鼠)，或10-12天(人)后收集破骨細胞培養(yǎng)物，分別在7天和14天后對小白鼠和人破骨細胞進行吸收測定。研究了RANKL/RANK和M-CSF/c-Fms結合下游的細胞信號級聯中的幾個關鍵蛋白質的表達。這些蛋白質包括，例如RANK和c-Fms、TRAF6、c-Fos、NFATcI、MAPK、IKK、NF-kB和Akt。最近己經顯示這些蛋白質在破骨細胞生成中非常重要，因此，這為分析產生BiP抑制效果的機制提供了起點。在不希望受任何特定理論束縛的情形下，預計BiP具有對破骨細胞前體和成熟破骨細胞發(fā)揮其抑制效果的潛能。因此，在存在M-CSF和RANXL的情況下制備BMM和PBMC，可以在例如破骨細胞前體的培養(yǎng)開始時，或者多核破骨細胞明顯出現的培養(yǎng)接近結束時的24~72h期間內添加最高有效濃度(根據實施例2確定)的BiP。在適當時間收獲培養(yǎng)物，制備用于定量實時PCR和Western印跡分析的RNA或蛋白質提取物，分析針對包括c-Fms、RANK、c-Fos、NFATcI、TRAF6、IKK和Akt的信號分子/轉錄因子的表達。在一些情況下，利用針對pERK1/2、pp38和pJNK的特異性磷酸抗體來查看暴露在BiP中5-60min后給這些MAPK家族成員所帶來的影響。在實時PCR中使用了適當的陽性和陰性對照，而且設計和使用了針對所有基因的特異性引物和熒光探針。利用之前描述的蛋白酶抑制因子(30;31)制備用于Western印跡的蛋白質溶解產物。測量蛋白質含量，以保證聚丙烯酰胺凝膠的上樣量相等，并在變性條件下電泳樣品。蛋白質被吸印到硝酸纖維上，并利用特異的第一和第二抗體標記，最后通過增強的化學發(fā)光顯像。從Chemicon,SantaCruz禾卩Sigma可以獲f尋所有抗j本。這些實驗可用于確定在破骨細胞分化和激活中起重要作用的主要信號路徑中的哪個信號路徑受BiP調節(jié)。而且這些研究也將弄清楚BiP調節(jié)前體細胞分化的作用機制是否不同于激活成熟破骨細胞的作用機制。實施例4薦^力炬遂嫂:ft智應分眾沒牙i游動激瀠:^W秀S/P沐/^澄#在發(fā)骨潘應形成/〃費級欲方i游資力卵巢切除的CD1小白鼠會自發(fā)地過度產生破骨細胞，并發(fā)展形成骨質疏松癥樣疾病，其將在疾病的不同階段用BiP治療。利用人疾病模型確定BiP體內作用機制。在用動物模型的炎癥細胞內的骨損失研究骨中，可以表達RANKL和導致骨吸收的T淋巴細胞和激活的成纖維細胞等等(9;10)，，以及細胞因子，例如TNFa和IL-ie(32)的產生會使實驗復雜化。另外，T細胞細胞因子，IL-17(7)可以增強這一活性。詳細研究了來自原始的預防和治療CIA的BiP研究來源的小白鼠材料中的破骨細胞的存在情況。對切片TRAP染色，評估每組中破骨細胞/切片的數目，或者通過破骨細胞標記基因，例如利用本領域熟練技術人員已知的常規(guī)技術鑒定的組織蛋白酶K或MMP-9，對破骨細胞進行原位雜交。這為抗原驅動的關節(jié)炎模型中破骨細胞的發(fā)育提供了數據，抗原驅動關節(jié)炎模型中免疫細胞和細胞因子以與RA相似的方式發(fā)揮作用。在不依賴炎性反應的破骨細胞激活和骨丟失獨立模型中，可以使用促進骨組織破壞和破骨細胞成熟卵巢切除小白鼠(33)模型。首先，使用BiP預防CIA的操作規(guī)定，其中在誘導疾病之前使用了可防止在誘導后一個月測量的癥狀的單劑量BiP(17)。因此，在卵巢切除(ovx)模型中，可以在三個時間點靜脈施用BiP并將6只小白鼠分組ovx前1周、ovx時或ovx后每隔一星期，以確定BiP是否可以防止在撤除雌激素后對破骨細胞骨吸收的誘導。處死小白鼠，ovx后每隔一周對骨進行檢査，直至ovx后6周。使用載體或不相干的蛋白質，例如人血清白蛋白處理的平行對照小白鼠組和假對照組。通過顯微CT(microCT)和組織分析評價和量化骨礦物密度和骨吸收，并利用TRAP染色來顯示破骨細胞的數目。這些實驗可以用來更進一步地研究BiP在防止卵巢切除術誘導的骨丟失中的作用。總結BiP是具有破骨細胞激活的風濕性疾病的全新生物療法，體外和體內實驗證據支持在體外的破骨細胞生成系統(tǒng)中，BiP抑制人和鼠破骨細胞生成的斷言。表i:通過光密度法分析的細胞因子基因陣列數據。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>分離外周血單核細胞，并用BiP(20mg/ml)刺激細胞(MO+BiP)或不刺激細胞(MO)，持續(xù)24h。通過光密度法分析細胞因子基因陣列放射自顯影圖，并將其標準化以產生最大(100%)或者沒有檢測到基因活化(ND)的表達百分比。所示結果來源于兩個受試者的用BiP刺激的單核細胞和一個受試者的未經過刺激的單核細胞。與對照細胞相比，結果顯示，兩個樣品中BiP刺激的細胞因子的mRNA上調或下調。參考文獻(1)BoyleWJ，SimonetWS,LaceyDL.Osteoclastdifferentiationandactivation.Nature2003;423(6937):337-342.(2)ChambersTJ.Regulationofthedifferentiationandfiinctionofosteoclasts.JPathol2000;192(1):4-13.(3)P、oodmarLGD.Cellbiologyoftheosteoclast.ExpHematol1999;27(8):1229-1241.(4)SudaT,TakahashiN,UdagawaN，JimiE,GillespieMT，MartinTJ.tumornecrosisfactorreceptorandligandfamilies.EndocrRev1999;20(3):345-357.(5)WagnerEF，KarsentyG.Geneticcontrolofskeletaldevelopment.CurtOpinGenetDev2001;11(5):527-532.(6)Degli-EspostiM.Todieornottodie-thequestoftheTRAILreceptors.JLeukocBiol1999;65(5):535-542.(7)LubbertsE,vandenBL,Oppers-WalgreenB,SchwarzenbergerP，Coenen-deRooCJ,KollsJKetal.IL-17promotesboneerosioninmurinecollagen-inducedarthritisthroughlossofthereceptoractivatorofNP-kappaBligand/osteoprotegerinbalance.JImmunol2003;170(5》2655-2662.(8)UdagawaN.Themechanismofosteoclastdifferentiationfrommacrophages:possiblerolesofTlymphocytesinosteoclastogenesis.JBoneMinerMetab2003;21(6):337-343.(9)RifasL,ArackalS,WeitzmannMN.InflammatoryTcellsrapidlyinducedifferentiationofhumanbonemarrowstromalcellsintomatureosteoblasts.JCellBiochem2003;88(4):650-659.(10)TakayanagiH,IizukaH,JujiT,NakagawaT，YamamotoA，MiyazakiTetal.InvolvementofreceptoractivatorofnuclearfactorkappaBligand/osteoclastdifferentiationfactorinosteoclastogenesisfromsynoviocytesinrheumatoidarthritis.ArthritisRheum2000;43(2):259-269.(11)JimiE,AokiK,SaitoH,D'AcquistoF,MayMJ，NakamumIetal.SelectiveinhibitionofNF-kappaBblocksosteoclastogenesisandpreventsinflammatorybonedestructioninvivo.NatMed2004;10(6):617-624.(12)EferlR,WagnerEF.AP-I:adouble-edgedswordintumorigenesis.NatRevCancer2003;3(11):859-868.(13)GrigoriadisAE，WangZQ,CecchiniHofstetterW,FelixR,FleischHAetal.c-Fos:akeyregulatorofosteoclast-macrophagelineagedeterminationandboneremodeling.Science1994;266(5184):443-448.(14)LeeZH,KimHH.SignaltransductionbyreceptoractivatorofnuclearfactorkappaBinosteoclasts.BiochemBiophysResCommun2003;305(2):211-214.(15)TakayanagiH，KimS,KogaT，NishinaH，IsshikiM,YoshidaHetal.InductionandactivationofthetranscriptionfactorNFATcI(NFAT2)integrateRANKLsignalinginterminaldifferentiationofosteoclasts.DevCell2002;3(6):889德.(16)WalshNC,GravalleseEM.Bonelossininflammatoryarthritis:mechanismsandtreatmentstrategies.CurrOpinRheumatol2004;16(4》419-427.(17)CorrigallVM,Bodman-SmithMD,FifeMS,CanasB,MyersLK,WooleyPetal.ThehumanendoplasmicreticulummolecularchaperoneBiPisanautoantigenforrheumatoidarthritisandpreventstheinductionofexperimentalarthritis.JImmunol2001;166(3):1492-1498.(18)Bodman-SmithMD,CorrigallVM，KemenyDM，PanayiGS.BiP,aputativeautoantigeninrheumatoidarthritis,stimulatesIL-10-producingCD8-positiveTcellsfromnormalindividuals.Rheumatology(Oxford)2003;42(5):637隱644.(19)CorrigallVM，Bodman-SmithMD,BrunstM,CornellH,PanayiGS.Thestressprotein,BiP，stimulateshumanperipheralbloodmononuclearcellstoexpressananti-inflammatorycytokineprofileandtoinhibitantigenpresentingcellfunction:relevancetothetreatmentofinflammatoryarthritis.ArthritisRheum2004;50:1167-1171.(20)MiossecP,ChomaratP,DechanetJ，Moreau'JF，RouxJP，DelmasPetal.Interleukin-4inhibitsboneresorptionthroughaneffectonosteoclastsandproinflammatorycytokinesinanexvivomodelofboneresorptioninrheumatoidarthritis.ArthritisRheum1994;37(12):1715-1722.(21)YangSY,WuB,MaytonL,MukherjeeP,RobbinsPD，EvansCHetal.ProtectiveeffectsofIL-IRaorvIL-10genetransferonamurinemodelofweardebris-inducedosteolysis.GeneTher2004;11(5):483-491.(22)VittecoqO,CorrigallVM,Bodman-SmithMD,PanayiGS.ThemolecularchaperoneBiP(GRP78)inhibitsthediffereniationofnormalhumanmonocytesintoimmaturedendriticcells.Rheumatology(Oxford)2003;42suppl:43.(23)NairSP，MeghjiS，ReddiK,PooleS,MillerAD,HendersonB.Molecularchaperonesstimulateboneresorption.CalcifTissueInt1999;64(3):214-218.(24)TetiA，MigliaccioS,BaronR.TheroleoftheaV(33integrininthedevelopmentofosteolyticbonemetastases:apharmacologicaltargetforalternativetherapyCalcifTissueInt2002;71(4):293-299.(25)VigneryA.Osteoclastsandgiantcells:macrophage-macrophagefusionmechanism.IntJExpPathol2000;81(5):291-304.(26)SodekJ，ZhuB，HuynhMH,BrownTJ，RinguetteM.NovelfunctionsofthematriceJlularproteinsosteopontinandosteonectin/SPARC.ConnectTissueRes2002;43(2-3):308-319.(27)CorrigallVM,Solau-GervaisE,PanayiGS.LackofCD80expressionbyfibroblast-likesynoviocytesleadingtoanergyinTlymphocytes.ArthritisRheum2000;43(7):1606-1615.(28)UX,UdagawaN,TakamiM，SatoN,KobayashiY，TakahashiN.p38Mitogen-activatedproteinkinaseiscruciallyinvolvedinosteoclastdifferentiationbutnotincytokineproduction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