專利名稱：：一種治療用a型肉毒毒素凍干粉針劑新型凍干保護劑配方的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及A型肉毒毒素的藥物制劑，在加入優(yōu)選的一種凍干保護劑以凍千粉針劑的固體形式在室溫下可穩(wěn)定貯藏至少12個月，在4'C可穩(wěn)定儲存36個仏
背景技術(shù)：
：-肉毒神經(jīng)毒素(botulinumneurotoxin,BoNT)，也稱肉毒毒素(botulinumtoxin)，是肉毒梭菌在厭氧條件下分泌的多肽神經(jīng)毒素。神經(jīng)毒素通過抑制神經(jīng)肌肉接合處的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放，影響神經(jīng)沖動的傳遞，導(dǎo)致肌肉松弛性麻痹。A型BoNT是目前己知的最劇毒物質(zhì)之一，但是近年來，已經(jīng)將其應(yīng)用于對斜視、眼瞼痙攣、面肌痙攣及痙攣性斜視等疾病進行治療，并取得滿意療效。1989年A型BoNT被美國食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于12歲以上12歲以上的由肌肉張力障礙引起的斜視、眼瞼痙攣等疾病(http://www.garlandscience.com/cW/pdfltorary/botoxJmeline.p鄰。這是世界上第1個被批準(zhǔn)為治療藥物的微生物毒素。在自然狀態(tài)下或人工培養(yǎng)基上A型BoNT通常以一種復(fù)合體形式存在，即神經(jīng)毒素和血凝素或非血凝活性蛋白的復(fù)合體。象許多生物活性蛋白一樣，BoNT的生物活性與它的空間形態(tài)結(jié)構(gòu)有關(guān)，血凝素在保持BoNT三維結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性起著重要作用(Sugiyama1980;Schantz&Johnson1992)。BoNT很容易被8CTC以上的高溫所破壞，特別是在堿性條件下；空氣/液體界面形成的氣泡能引起神經(jīng)毒素的伸展和形態(tài)改變，進而使BoNT溶液失去毒性，在有氮氣和二氧化碳的環(huán)境中也能使BoNT變性，稀釋至過低濃度(ng/ml)能使BoNT的穩(wěn)定性降低，失去部分活性。由于BoNT是一個約150kDa的大分子物質(zhì)，失去活性的BoNT即成為無毒的類毒素蛋白，該類毒素蛋白是一種很好的免疫原性物質(zhì)，使注射者產(chǎn)生抗體，進而影響B(tài)oNT制劑的進一步治療效果。如何在稀釋過低濃度BoNT制劑過程中保證其穩(wěn)定性，便成為一個十分重要的措施。試驗研究表明，通過用含其它蛋白如明膠、牛或人血清白蛋白的緩沖液(pH<6.8)稀釋BoNT原液才能增強其穩(wěn)定性(Goodnough&Johnson1992)。性物質(zhì)保護劑(楊仲1997)，但明膠主要來源于牛對人來說屬于異源物質(zhì)，同時還存在著有病毒污染的危險(例如瘋牛病)日本及一些歐美國家已經(jīng)禁止此類在的不足設(shè)計了一種新型的配方用來作為A型BoNT的的凍干保護液，使產(chǎn)品安全性更高，更具有市場競爭力。人血白蛋白是人的血漿中富含的蛋白，人血清白蛋白的分子量約69kDa，經(jīng)常被用做蛋白藥物保護劑(Kurano1982;Tarelli1998)，白蛋白主要是通過(1)減少蛋白活性成分與表面的粘附(2)減少活性成分低稀釋度溶液制備過程中可發(fā)生的活性成分變性來穩(wěn)定蛋白活性成分，除了能夠穩(wěn)定藥物組合中的蛋白活性成分，與明膠及牛血白蛋白相比，人血白蛋白還具有注射給患者時，通?？珊雎云涿庖咴缘暮褪褂酶影踩葍?yōu)點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過在A型BoNT的藥物制劑中，加入一種經(jīng)過優(yōu)選的凍干保護劑，達到穩(wěn)定A型BoNT的目的，與已上市的A型BoNT藥物制劑不同，本發(fā)明制品是由藥學(xué)上可接受的凍干保護劑和A型BoNT結(jié)晶復(fù)合物組成，其特征在于，其中的凍干保護劑由人用人血白蛋白和乳糖、或由人用人血白蛋白和蔗糖按一定比例組成。本發(fā)明優(yōu)先的凍干保護劑的配方如下人用人血白蛋白0.5%10%乳糖或蔗糖0.5%10%其余為注射用水本發(fā)明的凍干保護劑的配方，更優(yōu)選的為以下配方-人用人血白蛋白1o/。5%乳糖或蔗糖1%5%其余為注射用水本發(fā)明的凍干保護劑的配方，最優(yōu)選的為以下配方人用人血白蛋白2.5%乳糖或蔗糖2.5%其余為注射用水配方中的人用人血白蛋白選擇經(jīng)過國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的可以在市場上流通的人用人血白蛋白，乳糖和蔗糖選擇選擇經(jīng)過國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的藥用乳糖或蔗糖。本發(fā)明中所涉及的BoNT可以選自A、B、C、D、E、F、G血清型，可通過文獻所報道的辦法來制備，具體可以通過以下一種方法制備I、產(chǎn)毒培養(yǎng)基成分-酶水解酪素1%10%酵母浸粉1%10%硫代乙醇酸鈉0.01%0.05%半胱氨酸鹽酸鹽0.01%0.1%1%2%n、產(chǎn)毒培養(yǎng)基形成(1)將酪蛋白水解物、酵母浸粉、硫代硫乙醇酸鈉、半胱氨酸鹽酸鹽溶于蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7.1-7.5，121。C滅菌30分鐘備用。(2)另配20%葡萄糖溶液112'(:滅菌30分鐘。接種前按比例加入。m、產(chǎn)毒培養(yǎng)將經(jīng)適應(yīng)培養(yǎng)后的A型肉毒梭菌接種在產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)4天，培養(yǎng)結(jié)束后用小白鼠測毒力，其毒力不低于1x105LD50/ml.IV、毒素的提純(1)酸沉淀將產(chǎn)毒培養(yǎng)液用3N硫酸調(diào)pH至3.4左右。28'C過夜。(2)毒素提純棄上清，沉淀用蒸餾水洗兩次。加適量pH6.0、0.2M磷酸鹽緩沖液，分兩次溶解、提取。離心后將上清合并。(3)酶處理及濃縮加入核糖核酸酶34'C溫育3小時。加硫酸銨至60%飽和，28'C過夜，離心，沉淀用適量pH5.5、0.05M檸檬酸緩沖液溶解后，透析。(4)層析透析液經(jīng)DEAE-A50離子交換層析，收集、合并OD260/OD280為0.50.6的過柱液。(5)結(jié)晶合并液家硫酸銨至60。/。飽和，28X:過夜，離心，沉淀用適量pH6.8、0.05M磷酸鹽緩沖液溶解，再在含0.9M硫酸銨的上述緩沖液中透析，自然形成結(jié)晶，亦可重復(fù)上述過程，以形成第二次結(jié)晶；V、毒素的稀釋、凍干(1)稀釋a)用磷酸鹽緩沖液溶解及透析結(jié)晶毒素，除菌過濾后測定毒力；b)用磷酸鹽緩沖液將已知毒力的毒素溶液稀釋至適當(dāng)溶度(105106LD50/ml);c)將適量的稀釋毒素液加入到定量的凍干保護液中，使每毫升凍干保護液中毒素含量在效價要求的范圍(100-800LD50/ml);(2)分裝、凍干每瓶定量分裝上述含凍干保護液的毒素稀釋液0.5ml，以蛋白質(zhì)制品的凍干曲線對其進行凍干，凍干成品應(yīng)無菌、水分含量不超過3%。用本發(fā)明實例的方法制備的A型BoNT制劑稀釋到240LD5o/ml,并按0.5毫升等分量裝入2ml西林瓶中，按照蛋白質(zhì)的凍干曲線凍干，于4。C貯藏長達并包括36個月。從開始貯藏起的O、6、12、18、24、30、36個月，隨機取樣，并作小鼠LDso分析以測試效力及無菌、水分。表1、表2列出不同時間點取出的樣品的測定結(jié)果。這些結(jié)果顯示，根據(jù)本發(fā)明制備的A型BoNT制劑是穩(wěn)定的。表1說明，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明制備的A型BoNT制劑，在4。C貯藏至少36個月時，A型BoNT制劑效價還在貯藏時間為0時所記錄的效價范圍內(nèi)。(在分裝前按240U/ml稀釋，理論上應(yīng)為120U/0.5ml即一瓶為120U，凍干后測量的實際值為110U/瓶，這是因為凍干過程中所造成的損失，另外由于用動物來測定效價，因此其測定值在一定范圍內(nèi)變動)。表14'C時A型BoNT制劑的穩(wěn)定性(1U-1LD50)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2說明，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明制備的A型BoNT制劑，在25'C貯藏至少12個月時，A型BoNT制劑效價還在貯藏時間為O時所記錄的效價范圍內(nèi)。(在分裝前按240U/ml稀釋，理論上應(yīng)為120U/0.5ml即一瓶為120U，凍干后測量的實際值為110U/瓶，這是因為凍干過程中所造成的損失，由于用動物來測定效價，因此其測定值在一定范圍內(nèi)變動)。表225'C時A型BoNT制劑的穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本發(fā)明的凍干保護劑能提供pH6.8緩沖范圍及由液體溶液凍干制成可貯藏的粉針劑時使A型BoNT制劑在凍干時效價損失率為(120-110)/120-8.3。/。遠遠低于文獻報道中40%的損失率。本發(fā)明的藥物制劑能以固體形式在在4'C貯藏至少36個月時，25-C貯藏至少12個月A型BoNT制劑效價還在貯藏時間為0時所測定的效價范圍內(nèi)(110U士200/。，即88U-132U)。本發(fā)明的制劑，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有穩(wěn)定性更強，副作用更少，配制簡單，原料易得，使用方便，安全性更高，療效更加優(yōu)良。具體實施例方式下列實例以本發(fā)明范圍內(nèi)特別優(yōu)選的方法供給本領(lǐng)域普通熟練人員以便實施本發(fā)明，并不是有意限制本發(fā)明人的發(fā)明范圍。實施例1本發(fā)明的A型BoNT，具體可以通過以下方法制備I、產(chǎn)毒培養(yǎng)基成分酶水解酪素1%10%酵母浸粉1%10%硫代乙醇酸鈉0.01%0.05%半胱氨酸鹽酸鹽0.01%0.1%葡萄糖1%2%其余為水n、產(chǎn)毒培養(yǎng)基形成(1)將酪蛋白水解物、酵母浸粉、硫代硫乙醇酸鈉、半胱氨酸鹽酸鹽溶于蒸餾7K，調(diào)節(jié)pH至7.2-7.3。121。C滅菌30分鐘備用。(2)另配20%葡萄糖溶液112^滅菌30分鐘，接種前按比例加入。m、產(chǎn)毒培養(yǎng)將經(jīng)適應(yīng)培養(yǎng)后的A型肉毒梭菌接種在產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)4天。IV、毒素的精致提純(1)酸沉淀將毒素液用3N硫酸調(diào)pH至3.4左右。28。C過夜。(2)毒素提純棄上清，沉淀用蒸餾水洗兩次。加適量pH6.0、0.2M磷酸鹽緩沖液，分兩次溶解、提取。離心后將上清合并。(3)酶處理及濃縮加入核糖核酸酶3CTC34"C溫育3小時。加硫酸銨至60%飽和，28'C過夜，離心，沉淀用適量pH5.2-5.8、0.05M檸檬酸緩沖液溶解后，透析。(4)層析透析液經(jīng)DEAE-A50離子交換層析，收集、合并OD26Q/OD280為0.50.6的過柱液。(5)結(jié)晶合并液加硫酸銨至60。/。飽和，28'C過夜，離心，沉淀用適量pH6.8、0.05M磷酸鹽緩沖液溶解，再在含0.9M硫酸銨的上述緩沖液中透析，自然形成結(jié)晶，亦可重復(fù)上述過程，以形成第二次結(jié)晶；V、毒素的稀釋、凍干(1)稀釋a)用磷酸鹽緩沖液溶解及透析結(jié)晶毒素，除菌過濾后測定毒力；b)用磷酸鹽緩沖液將己知毒力的毒素溶液稀釋至適當(dāng)濃度(105106LD50/ml);c)將適量的稀釋毒素加入到定量的凍干保護液中，使每毫升凍干保護液中毒素含量在效價要求的范圍(240LD50/ml);實施例2(1)凍干保護液成份20%人用人血白蛋白125ml蔗糖25g注射用水加水至875ml(2)配置方法a)按配制量量取人血白蛋白；b)按配制量稱取蔗糖，加入注射用水溶解后，調(diào)pH為6.8，121°C，20分鐘高壓滅菌。a)將a與b溶液混勻后，然后加入一定量的A型BoNT稀釋液，用0.22微孔濾膜過濾，按照0.5ml/支分裝于西林瓶中。b)以蛋白質(zhì)制品的凍干曲線對其進行凍干，凍干成品無菌合格，水分含量不超過3%。實施例3(1)凍干保護液成分20%人用人血白蛋白125ml乳糖25g注射用水加至875ml(2)配置方法a)按配制量量取人血白蛋白；b)按配制量稱取乳糖，加注射用水溶解后，調(diào)pH為6.8，121°C，20分鐘高壓滅菌；c)將a與b溶液混勻后，然后加入一定量的A型BoNT稀釋液，用0.22微孔濾膜過濾，按照0.5ml/支分裝于西林瓶中；d)以蛋白質(zhì)制品的凍干曲線對其進行凍干，凍干成品無菌，水分含量不超過3%。主要參考文獻Goo加oughMCandJohnsonEA.StabilizationofbotulinumtoxintypeAduringly鄰hilization.ApplEnvironMicrobiol,1992，58:3426-3428.KuronoY,OhtaN，lkedaK.UtilizationofhumanserumalbuminasdrugadditivesI.Stabilizerofprostacyclin.ChemPharmBull(Tokyo).1982,30:2635-2638.SchantzEJandJohnsonEA.Propertiesanduseofbotulinumtoxinandothermicrobialneurotoxinsinmedicine.Microbiol,Rev.1992,56:80-92.Sugi^miaH.Clostridiumbotulinumneurotoxin.Microbiol,Rev.1980,44:419—448.Tare很E，Mire-SluisA,TivnannHA，etal.Recombinanthumanalbuminasastabilizerforbiologicalmaterialsandforthepreparationofinternationalreferencereagents.Bto,ogicals.1998，26:331-346.楊仲，薛峰，肖在瀅等.治療用A型肉毒毒素的制備及其質(zhì)量控制.微生物學(xué)免疫學(xué)進展.1997,27(3):4144.權(quán)利要求1.A型肉毒毒素(BoNT)的藥物制劑，是由藥學(xué)上可接受的凍干保護劑和肉毒毒素組成，其特征在于，其中的凍干保護劑由人用人血白蛋白、蔗糖或者人用人血白蛋白、乳糖按一定比例和水制成。2.權(quán)利要求1的制劑，其中的凍干保護劑由人血白蛋白，蔗糖或者人血白蛋白、乳糖和水制成，各組分之間的重量配比如下人血白蛋白0.5﹪10﹪蔗糖或乳糖0.5﹪10﹪其余為注射用水。3.權(quán)利要求1的制劑其中的凍干保護劑各組分之間的重量配比如下人血白蛋白1﹪5﹪蔗糖或乳糖1﹪5﹪其余為注射用水。4.權(quán)利要求1的制劑其中的凍干保護劑各組分之間的重量配比如下人血白蛋白2.5﹪蔗糖或乳糖2.5﹪其余為注射用水。5.權(quán)利要求1的制劑特征在于，其中的凍干保護劑提供的pH6.8緩沖范圍及由溶液凍干制成可貯藏的粉針劑時使BoNT效價損失低于20﹪。6.權(quán)利要求1的制劑，是凍干粉針劑，其中所述制劑能以固體形式，在4穩(wěn)℃定貯藏36個月，在25℃能穩(wěn)定貯藏12個月。權(quán)利要求1一6的制劑，其中所述BoNT選自A、B、C、D、E、F和G血清型。7.權(quán)利要求1的制劑，其中所述BoNT是以10CMOOLD50/ml范圍濃度存在的A型BoNT。8.權(quán)利要求1的制劑的制備方法，其特征在于，經(jīng)過以下步驟a)按配制量量取人血白蛋白；b)按配制量稱取乳糖或蔗糖，加入注射用水溶解后，調(diào)pH為6.8，121℃，20分鐘高壓滅菌；c)將a與b混勻中，然后加入一定量的A型BoNT稀釋液，用0.22微孔濾膜過濾后，按照0.5/支分裝于西林瓶中；d)以蛋白質(zhì)制品的凍干曲線對其進行凍干，凍干成品無菌、熱原合格，水分含量不超過3%。全文摘要本發(fā)明涉及A型肉毒毒素的藥物制劑，在加入優(yōu)選的一種凍干保護劑以凍干粉針劑的固體形式在室溫下可穩(wěn)定貯藏至少12個月，在4℃可穩(wěn)定儲存36個月。凍干保護劑由人用人血白蛋白、蔗糖或者人用人血白蛋白、乳糖按一定比例和水制成。A型肉毒毒素的藥物制劑應(yīng)用于對斜視、眼瞼痙攣、面肌痙攣及痙攣性斜視等疾病進行治療。與以前配方相比，利用本發(fā)明獲得的A型肉毒毒素的制品質(zhì)量好，穩(wěn)定性高。文檔編號A61K9/19GK101204377SQ200610167769公開日2008年6月25日申請日期2006年12月21日優(yōu)先權(quán)日2006年12月21日發(fā)明者劉建凱,張小伶,王景林,鄭海發(fā),姍高申請人:北京民海生物科技有限公司;中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所