專利名稱：龍葵總堿的抗腫瘤作用及其藥物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于龍葵總堿在抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用及其藥物制劑，屬于中藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
現(xiàn)代社會癌癥已成為威脅人類生命健康的主要問題之一，世界衛(wèi)生組織(WHO)報告表明，根據(jù)目前癌癥的發(fā)病趨勢，2020年全世界癌癥發(fā)病率將比現(xiàn)在增加50％，全球每年新增癌癥患者人數(shù)將達到1500萬人。醫(yī)療界迫切需求安全有效的癌癥治療藥物。
本發(fā)明所述的龍葵總堿來源于單味藥材——龍葵(其中含有多種生物堿，有澳洲茄邊堿、澳洲茄堿、茄微堿及茄達堿等，生物堿以果實總含量最高)，我們結(jié)合文獻資料，運用現(xiàn)代科學(xué)方法，在制備工藝、質(zhì)量標準、藥效、毒理及穩(wěn)定性等方面進行了研究，以龍葵總堿為原料制成藥物制劑，用于癌癥輔助治療。目前，尚未見龍葵總堿及其制劑應(yīng)用于在抗腫瘤藥物方面的報道，國內(nèi)尚沒有有關(guān)龍葵總堿的制劑在SFDA注冊，國內(nèi)外專利(中國專利、日本專利、韓國專利、歐洲專利、美國專利等)均未出現(xiàn)與本發(fā)明相近的專利保護內(nèi)容。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種抗腫瘤療效顯著、毒副作用小、使用安全的以龍葵為原料提取而得的龍葵總堿及其藥物制劑。
本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的 本發(fā)明中龍葵總堿提取物中，龍葵總堿含量為50.0％以上。
龍葵總堿提取步驟如下 取龍葵全草與/或果實，加入50％～90％乙醇溶液提取2～3次，每次6～8倍量，回收乙醇，濃縮至相對密度1.25，濃縮液中加入2～4倍量的0.1mol/l酸性溶液，充分攪拌，冷藏，過濾，濾渣用鹽酸溶液洗滌1～3次，合并濾液和洗滌液，以弱極性或中等極性樹脂吸附。樹脂吸附后先用水沖洗樹脂柱/床至流出液近中性；再以0.1mol/l堿性溶液沖洗樹脂柱/床至流出液近無色，再以含醇量30％～40％乙醇液沖洗樹脂柱/床至流出液近無色。棄去。再以50～90％乙醇進行洗脫，至洗脫液顯無色，收集洗脫液，回收乙醇至無醇味，以0.5～1.5mol/l的堿性溶液調(diào)PH值至8～10，靜置，冷藏，收集沉淀。自然晾干，即可得龍葵總堿提取物。
以上所述的堿性溶液選自氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鉀、氫氧化鎂和氨水溶液；所述的酸性溶液選自醋酸、鹽酸、硫酸和檸檬酸溶液；所述的方法1洗脫用有機溶劑為甲醇、無水乙醇、正丁醇、氯仿、苯的一項或者兩項或者三項以任意比例形成的混合相；所述的方法2用有機溶劑為甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、苯的一項或者兩項或者三項以任意比例形成的混合相。
本發(fā)明的藥物制劑含有1％～99％的龍葵總堿含量為50％～99％的龍葵總堿提取物和99％～1％的藥用賦形劑(包括其它配伍用的藥物)，優(yōu)選含有45％～95％的龍葵總堿含量為50％～99％的龍葵總堿提取物和55％～5％的藥用賦形劑(包括其它配伍用的藥物)，最好含有75％～90％的龍葵總堿含量為50％～99％的龍葵總堿提取物和25％～10％的藥用賦形劑(包括其它配伍用的藥物)。
按藥劑學(xué)方法，可以將本發(fā)明的龍葵總堿提取物制備成多種臨床藥物劑型作為抗腫瘤藥物，包括口服制劑或非腸道給藥的劑型。所述口服制劑為片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、丸劑、混懸劑、口服液體制劑等；所述非腸道給藥劑型為注射液、輸液劑、凍干注射劑、注射乳劑、氣霧劑、栓劑等。
本發(fā)明的抗腫瘤藥物中的輔料是指常規(guī)的賦形劑，如溶劑、崩解劑、矯味劑、粘合劑、著色劑、防腐劑等。本發(fā)明抗腫瘤藥物中的其它配伍用的藥物，指的是以有效劑量的澳洲茄堿提取物為一定的藥物原料，再配伍其它已允許合用的中藥或化學(xué)藥品。
本發(fā)明的龍葵總堿及其藥物制劑具有抗腫瘤作用，是通過以下的藥效學(xué)實驗得到證實的。
實驗例1注射用龍葵總堿體外對腫瘤的抑制作用 注射用龍葵總堿分為五組劑量(0.4、2、10、40、120μg·ml-1)，分別體外作用于10種腫瘤細胞。從整個實驗可以看出，在120μg/ml及40μg/ml劑量下，注射用龍葵總堿對于10種腫瘤細胞的均表現(xiàn)出很強的抑制作用，隨著注射用龍葵總堿濃度的降低，腫瘤抑制率逐漸下降，當(dāng)注射用龍葵總堿濃度降至0.4μg/ml時，腫瘤細胞基本不受影響。注射用龍葵總堿對各種腫瘤細胞的半數(shù)抑制率經(jīng)計算分別為11.69μg/ml(SMMC-7721)、17.22μg/ml(BGC-803)、14.63μg/ml(A549)、14.58μg/ml(LOVO)、13.19μg/ml(B16)、7.39μg/ml(NCI-H460)、13.40μg/ml(KETR-3)、32.42μg/ml(PC-12)、6.99μg/ml(ECA-109)、143.01μg/ml(S180)。
從腫瘤細胞形態(tài)上看，在120μg/ml及40μg/ml劑量作用下，腫瘤細胞結(jié)構(gòu)均遭到破壞，細胞數(shù)量稀少；隨著注射用龍葵總堿劑量的降低，腫瘤細胞形態(tài)趨于完整，但數(shù)量仍較少；在0.4μg·ml-1劑量下，注射用龍葵總堿對腫瘤的抑制作用消失，細胞形態(tài)完整，數(shù)量較多。
綜上所述，注射用龍葵總堿對于各種腫瘤細胞在體外均有較強的抑制作用，能明顯抑制腫瘤細胞在體外的生長，改變腫瘤細胞的形態(tài)，引起腫瘤細胞的死亡。結(jié)果見表1～10。
表1注射用龍葵總堿體外對SMMC-7721的抑制作用(x±S，n＝12)
注與正常對照組相比＊＊P＜0.01 表2注射用龍葵總堿體外對BGC-803的抑制作用(x±S，n＝12)
注與正常對照組相比＊＊P＜0.01 表3注射用龍葵總堿體外對A549的抑制作用(x±S，n＝12)
注與正常對照組相比＊＊P＜0.01 表4注射用龍葵總堿體外對LOVO的抑制作用(x±S，n＝12)
注與正常對照組相比＊＊P＜0.01 表5注射用龍葵總堿體外對B16的抑制作用(x±S，n＝12)
注與正常對照組相比＊＊P＜0.01 表6注射用龍葵總堿體外對NCI-H460的抑制作用(x±S，n＝12)

注與正常對照組相比＊＊P＜0.01 表7注射用龍葵總堿體外對KETR-3的抑制作用(x±S，n＝12)
注與正常對照組相比＊＊P＜0.01 表8注射用龍葵總堿體外對S180的抑制作用(x±S，n＝12)
注與正常對照組相比＊＊P＜0.01 表9注射用龍葵總堿體外對PC12的抑制作用(x±S，n＝12)

注與正常對照組相比＊＊P＜0.01 表10注射用龍葵總堿體外對ECA109的抑制作用(x±S，n＝12)
注與正常對照組相比＊＊P＜0.01 實驗例2注射用龍葵總堿對Hep肝癌移植性腫瘤的影響 實驗方法無菌條件下抽取ICR小鼠腹腔內(nèi)生長8天的腹水癌細胞懸液，癌細胞懸液和滅菌生理鹽水按1∶3稀釋，取ICR小鼠70只，♀♂各半，體重18～22g，接種稀釋后的癌細胞懸液0.2ml于腋部皮下。24h后隨機分為7組，即模型組、5-Fu組(25mg/kg)、華蟾素組(3g/kg)和注射用龍葵總堿小、中、大劑量組(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)及口服組(2mg/kg)，每組10只，分別靜脈注射給予相應(yīng)藥物(模型組注射等容積生理鹽水，口服組灌胃給藥)，給藥容積均為10ml/kg。給藥8天后處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤，稱重，按下面公式計算抑瘤率。實驗重復(fù)2次。

實驗結(jié)果小鼠接種Hep肝癌腫瘤后，4天皮下即可觸到腫瘤，8天后解剖腫瘤平均重量均大于1g，注射用龍葵總堿三個劑量組小鼠腫瘤浸潤范圍均小于模型組，瘤體易剝離，腫瘤重量明顯減輕(P＜0.01)。注射用龍葵總堿對小鼠體重增長率、胸腺指數(shù)、脾指數(shù)無明顯影響。注射用龍葵總堿靜脈注射三個劑量組的抑瘤率均大于口服組。結(jié)果見表11～15。
表11注射用龍葵總堿對Hep肝癌移植性實體瘤抑瘤率的影響(x±S，n＝10)
注和模型組相比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表12對Hep肝癌移植性實體瘤小鼠體重增長率的影響(第一次實驗)(x±S，n＝10)
注和模型組相比較，＊＊P＜0.01。
表13對Hep肝癌移植性實體瘤小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響(第一次實驗)(x±S)
注和模型組相比較，＊＊P＜0.01。
表14對Hep肝癌移植性實體瘤小鼠體重增長率的影響(第二次實驗)(x±S，n＝10)
注和模型組相比較，＊＊P＜0.01。
表15對Hep肝癌移植性實體瘤小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響(第二次實驗)(x±S)
注和模型組相比較，＊＊P＜0.01。
實驗例3注射用龍葵總堿對S180移植性實體瘤抑瘤率的影響 實驗方法無菌條件下抽取ICR小鼠腹腔內(nèi)生長8天的腹水癌細胞懸液，癌細胞懸液和滅菌生理鹽水按1∶3稀釋，取ICR小鼠70只，♀♂各半，體重18～22g，接種稀釋后的癌細胞懸液0.2ml于腋部皮下。24h后隨機分為7組，即模型組、5-Fu組(25mg/kg)、華蟾素組(3g/kg)和注射用龍葵總堿小、中、大劑量組(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)及口服組(2mg/kg)，每組10只，分別靜脈注射給予相應(yīng)藥物(模型組注射等容積生理鹽水，口服組灌胃給藥)，給藥容積均為10ml/kg。給藥8天后處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤，稱重，按下面公式計算抑瘤率。實驗重復(fù)2次。

試驗結(jié)果小鼠接種S180移植性實體瘤后，3天皮下即可觸到腫瘤，8天后解剖腫瘤平均重量均大于1g，注射用龍葵總堿三個劑量組小鼠腫瘤浸潤范圍均小于模型組，瘤體易剝離，腫瘤重量明顯減輕(P＜0.01)。注射用龍葵總堿對小鼠體重增長率、胸腺指數(shù)、脾指數(shù)無明顯影響。注射用龍葵總堿靜脈注射三個劑量組的抑瘤率均大于口服組。結(jié)果見表16～20。
表l6注射用龍葵總堿對S180移植性實體瘤抑瘤率的影響(x±S，n＝10)
注和模型組相比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表17對S180移植性實體瘤小鼠體重增長率的影響(第一次實驗)(x±S，n＝10)
注和模型組相比較，＊＊P＜0.01。
表18對S180移植性實體瘤小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響(第一次實驗)(x±S)

注和模型組相比較，＊＊P＜0.01。
表19對S180移植性實體瘤小鼠體重增長率的影響(第二次實驗)(x±S，n＝10)
注和模型組相比較，＊＊P＜0.01。
表20對S180移植性實體瘤小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響(第二次實驗)(x±S)
注和模型組相比較，＊＊P＜0.01。
實驗例4注射用龍葵總堿對Walker-256移植性鼠肝癌的影響 實驗方法將模型大鼠隨機分為5組，每組10只。即即模型組、華蟾素組(25mg/kg)和注射用龍葵總堿小、中、大劑量組(0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg)。各組大鼠分別給予相應(yīng)受試藥物，給藥容積為10ml/kg，連續(xù)給藥10天。給藥10日后，脫頸椎處死大鼠，記錄重量大小，按照下面公式計算腫瘤體積。腫瘤組織用10％甲醛固定，待做組織病理學(xué)觀察。

實驗結(jié)果注射用龍葵總堿中、大劑量組的腫瘤體積和模型組相比，顯著縮小，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。病理學(xué)檢查評分顯示注射用龍葵總堿中、大劑量組可以減小腫瘤體積，抑制腫瘤生長(P＜0.05)。
病理檢查顯示 (1)Walker-256癌性腹水種植到肝臟后，在肝臟內(nèi)形成腫塊，腫塊內(nèi)瘤細胞異型性明顯，大小、形態(tài)不一，核大、深染、核分裂相易見。腫瘤細胞排列緊密，部分區(qū)域有壞死及出血。腫瘤無包膜，向周邊部肝細胞呈浸潤性生長。
(2)應(yīng)用注射用龍葵總堿后荷瘤大鼠數(shù)目減少，形成的腫瘤體積減小，壞死明顯。腫瘤周邊出現(xiàn)部分結(jié)締組織包膜，并見單個核細胞浸潤。上述結(jié)果說明注射用龍葵總堿中、大劑量藥物對種植性Walker-256肝癌有抑制作用。結(jié)果見表21～22。
表21對Walker-256移植性鼠肝癌腫瘤體積的影響(x±S)
注和模型組相比較，＊＊P＜0.01。
表22對Walker-256移植性鼠肝癌病理評分的影響(x±S)
注和模型組相比較，＊＊P＜0.01。
實驗例5注射用龍葵總堿對荷Hep肝癌小鼠白細胞、血小板的影響 實驗方法無菌條件下抽取ICR小鼠腹腔內(nèi)生長8天的腹水癌細胞懸液，癌細胞懸液和滅菌生理鹽水按1∶3稀釋，取ICR小鼠70只，接種稀釋后的癌細胞懸液0.2ml于腋部皮下。24h后隨機分為7組，即模型組、5-Fu組(25mg/kg)、華蟾素組(3g/kg)和注射用龍葵總堿小、中、大劑量組(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)及口服組(2mg/kg)，每組10只，分別靜脈注射給予相應(yīng)藥物(模型組注射等容積生理鹽水，口服組灌胃給藥)，給藥容積均為10ml/kg。給藥8天后處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤，稱重，按下面公式計算抑瘤率。

實驗結(jié)果小鼠接種Hep肝癌腫瘤后，4天皮下即可觸到腫瘤，8天后解剖腫瘤平均重量均大于1g，注射用龍葵總堿三個劑量組小鼠腫瘤浸潤范圍均小于模型組，瘤體易剝離，腫瘤重量明顯減輕(P＜0.01)。注射用龍葵總堿對小鼠白細胞、血小板、體重增長率、胸腺指數(shù)、脾指數(shù)無明顯影響。注射用龍葵總堿靜脈注射三個劑量組的抑瘤率均大于口服組。結(jié)果見表23～26。
表23注射用龍葵總堿對Hep肝癌移植性實體瘤抑瘤率的影響(x±S，n＝10)
注和模型組相比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表24對Hep肝癌移植性實體瘤小鼠體重增長率的影響(第一次實驗)(x±S，n＝10)

注和模型組相比較，＊＊P＜0.01。
表25對Hep肝癌移植性實體瘤小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響(第一次實驗)(x±S)
注和模型組相比較，＊＊P＜0.01。
表26對Hep肝癌移植性實體瘤小鼠白細胞、血小板計數(shù)的影響(x±S)
注和模型組相比較，＊＊P＜0.01。
實驗例6注射用龍葵總堿對荷瘤(Hep)小鼠60Co放療的增效減毒作用 實驗方法無菌條件下抽取ICR小鼠腹腔內(nèi)生長8天的腹水癌細胞懸液，癌細胞懸液和滅菌生理鹽水按1∶3稀釋，取ICR小鼠70只，♀♂各半，體重18～22g，接種稀釋后的癌細胞懸液0.2ml于腋部皮下。24h后隨機分為7組，即模型組、放療組、放療加華蟾素組(3g/kg)和放療加注射用龍葵總堿小、中、大劑量組(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)及口服組(2mg/kg)，每組10只，除模型組外，其他各組小鼠接種24h后均用60Co照射一次，照射劑量為500Cgy，射后2h，放療加華蟾素組，放療加注射用龍葵總堿小、中、大劑量組分別靜脈注射給予相應(yīng)藥物，模型組注射等容積生理鹽水，口服組灌胃給藥。8天后眼眶取血，測定血常規(guī)。取血后處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤，稱重，按下面公式計算抑瘤率；取胸腺、脾臟，稱重，按照下面公式計算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。


實驗結(jié)果小鼠接種Hep肝癌移植性實體瘤后，模型組4天皮下即可觸到腫瘤，8天后解剖腫瘤平均重量大于1g，放療及放療加注射用龍葵總堿三個劑量組小鼠腫瘤浸潤范圍均小于模型組，瘤體易剝離，腫瘤重量明顯減輕(P＜0.01)。放療加注射用龍葵總堿三個劑量組瘤重均小于放療組(P＜0.05，P＜0.01)，表明注射用龍葵總堿對60Co放療具有一定的增效作用。放療加注射用龍葵總堿三個劑量組的白細胞和血小板計數(shù)均大于放療組，但無統(tǒng)計學(xué)意義。放療加注射用龍葵總堿三個劑量組小鼠體重增長率均高于放療組(P＜0.01)，放療加注射用龍葵總堿大劑量的胸腺指數(shù)高于放療組(P＜0.05)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表27～30。
表27對荷瘤(Hep)小鼠抑瘤率的影響(x±S)
注和模型組相比較△△P＜0.01；和放療組相比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表28對荷瘤(Hep)小鼠白細胞、血小板計數(shù)的影響(x±S)

注和模型組相比較，△△P＜0.01；放療組相比較，＊P＜0.05， 表29對荷瘤(Hep)小鼠體重增長率的影響(x±S，n＝10)
注和模型組相比較，△△P＜0.01；和放療組相比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表30對荷瘤(Hep)小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響(x±S)
注和模型組相比較，△△P＜0.01；和放療組比較＊P＜0.05。
實驗例7 注射用龍葵總堿對荷瘤(S180)小鼠CTX化療的增效減毒作用 實驗方法無菌條件下抽取ICR小鼠腹腔內(nèi)生長8天的腹水癌細胞懸液，癌細胞懸液和滅菌生理鹽水按1∶3稀釋，取ICR小鼠70只，♀♂各半，體重18～22g，接種稀釋后的癌細胞懸液0.2ml于腋部皮下。24h后隨機分為7組，即模型組、CTX組(10mg/kg)、CTX(10mg/kg)加華蟾素組(3g/kg)和CTX(10mg/kg)加注射用龍葵總堿小、中、大劑量組(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)及口服組(2mg/kg)，每組10只，分別靜脈注射給予相應(yīng)藥物(模型組注射等容積生理鹽水，口服組灌胃給藥)，8天后眼眶取血，測定血常規(guī)。取血后處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤，稱重，按下面公式計算抑瘤率；取胸腺、脾臟，稱重，按照下面公式計算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。


實驗結(jié)果小鼠接種S180移植性實體瘤后，3天皮下即可觸到腫瘤，8天后解剖腫瘤平均重量均大于1g，CTX及CTX加注射用龍葵總堿三個劑量組小鼠腫瘤浸潤范圍均小于模型組，瘤體易剝離，腫瘤重量明顯減輕(P＜0.01)。CTX加注射用龍葵總堿三個劑量組瘤重均小于CTX組，其中CTX加注射用龍葵總堿中、大劑量組和CTX組相比，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。表明注射用龍葵總堿對CTX具有一定的抗腫瘤增效作用。CTX加注射用龍葵總堿三個劑量組的白細胞和血小板和CTX組相比，無顯著差異。CTX加注射用龍葵總堿大劑量組小鼠的胸腺指數(shù)顯著高于CTX組(P＜0.05)，CTX加注射用龍葵總堿三個劑量組小鼠的體重增長率均顯著高于CTX組(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)果見表31～34。
表31對荷瘤(S180)小鼠抑瘤率的影響(x±S)
注和模型組相比較△△P＜0.01；和CTX組相比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表32對對荷瘤(S180)小鼠白細胞、血小板計數(shù)的影響(x±S)

注和模型組相比較，△△P＜0.01。
表33對對荷瘤(S180)小鼠體重增長率的影響(x±S，n＝10)
注和模型組相比較，△△P＜0.01；和CTX組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表34對對荷瘤(S180)小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響(x±S)
注和模型組相比較，△△P＜0.01；和CTX組比較＊P＜0.05。
實驗例8注射用龍葵總堿對荷瘤(Hep)小鼠MMC化療的增效減毒作用 實驗方法無菌條件下抽取ICR小鼠腹腔內(nèi)生長8天的腹水癌細胞懸液，癌細胞懸液和滅菌生理鹽水按1∶3稀釋，取ICR小鼠70只，♀♂各半，體重18～22g，接種稀釋后的癌細胞懸液0.2ml于腋部皮下。24h后隨機分為7組，即模型組、MMC組(1mg/kg)、MMC(1mg/kg)加華蟾素組(3g/kg)和MMC(1mg/kg)加注射用龍葵總堿小、中、大劑量組(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)及口服組(2mg/kg)，每組10只，分別靜脈注射給予相應(yīng)藥物(模型組注射等容積生理鹽水，口服組灌胃給藥)，8天后處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤，稱重，按下面公式計算抑瘤率。取胸腺、脾臟，稱重，按照下面公式計算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。


實驗結(jié)果小鼠接種Hep肝癌移植性實體瘤后，4天皮下即可觸到腫瘤，8天后解剖腫瘤平均重量均大于1g，MMC及MMC加注射用龍葵總堿三個劑量組小鼠腫瘤浸潤范圍均小于模型組，瘤體易剝離，腫瘤重量明顯減輕(P＜0.01)。MMC加注射用龍葵總堿三個劑量組瘤重均小于MMC組，其中MMC加注射用龍葵總堿中、大劑量組和MMC組相比，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。表明注射用龍葵總堿對MMC具有一定的抗腫瘤增效作用。MMC加注射用龍葵總堿三個劑量組的白細胞、血小板、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)和MMC組相比，無顯著差異。MMC加注射用龍葵總堿三個劑量組小鼠的體重增長率均顯著高于MMC組(P＜0.01)。結(jié)果見表35～38。
表35對荷瘤(Hep)小鼠小鼠抑瘤率的影響(x±S)
注和模型組相比較△△P＜0.01；和MMC組相比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表36對荷瘤(Hep)小鼠白細胞、血小板計數(shù)的影響(x±S)

注和模型組相比較，△△P＜0.01；和MMC組比較＊P＜0.05。
表37對荷瘤(Hep)小鼠體重增長率的影響(x±S，n＝10)
注和模型組相比較，△△P＜0.01；和MMC組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表38對荷瘤(Hep)小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響(x±S，n＝10)
注和模型組相比較，△△P＜0.01；和MMC組比較＊P＜0.05。
實驗例9注射用龍葵總堿對荷瘤(Hep)小鼠5-Fu化療的增效減毒作用 實驗方法無菌條件下抽取ICR小鼠腹腔內(nèi)生長8天的腹水癌細胞懸液，癌細胞懸液和滅菌生理鹽水按1∶3稀釋，取ICR小鼠70只，♀♂各半，體重18～22g，接種稀釋后的癌細胞懸液0.2ml于腋部皮下。24h后隨機分為7組，即模型組、5-Fu組(15mg/kg)、5-Fu(l5mg/kg)加華蟾素組(3g/kg)和5-Fu(15mg/kg)加注射用龍葵總堿小、中、大劑量組(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)和LK口服組(2mg/kg)，每組10只，分別靜脈注射給予相應(yīng)藥物(模型組注射等容積生理鹽水，5-Fu組隔日注射一次)，8天后處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤，稱重，按下面公式計算抑瘤率。

實驗結(jié)果小鼠接種Hep肝癌移植性實體瘤后，4天皮下即可觸到腫瘤，8天后解剖腫瘤平均重量均大于1g，5-Fu及5-Fu加注射用龍葵總堿三個劑量組小鼠腫瘤浸潤范圍均小于模型組，瘤體易剝離，腫瘤重量明顯減輕(P＜0.01)。5-Fu加注射用龍葵總堿三個劑量組瘤重均小于5-Fu組，其中5-Fu加注射用龍葵總堿大劑量組和5-Fu組相比，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。表明注射用龍葵總堿對5-Fu具有一定的抗腫瘤增效作用。5-Fu加注射用龍葵總堿三個劑量組的白細胞、血小板、脾指數(shù)和5-Fu組相比，無顯著差異。5-Fu加注射用龍葵總堿大劑量組小鼠的胸腺指數(shù)顯著高于5-Fu組(P＜0.05)，5-Fu加注射用龍葵總堿三個劑量組小鼠的體重增長率均顯著高于5-Fu組(P＜0.05)。結(jié)果見表35～38。
表35對荷瘤(Hep)小鼠抑瘤率的影響(x±S)
注和模型組相比較△△P＜0.01；和CTX組相比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表36對荷瘤(Hep)小鼠白細胞、血小板計數(shù)的影響(x±S)
注和模型組相比較，△△P＜0.01。
表37對荷瘤(Hep)小鼠體重增長率的影響(x±S，n＝10)
注和模型組相比較，△△P＜0.01；和5-Fu組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表38對荷瘤(Hep)小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響(x±S，n＝10)
注和模型組相比較，△△P＜0.01；和5-Fu組比較＊P＜0.05。
實驗例10注射用龍葵總堿對荷瘤小鼠TNF-α，IL-2的影響 實驗方法無菌條件下抽取ICR小鼠腹腔內(nèi)生長8天的腹水癌細胞懸液，癌細胞懸液和滅菌生理鹽水按1∶3稀釋，取ICR小鼠70只，♀♂各半，體重18～22g，接種稀釋后的癌細胞懸液0.2ml于腋部皮下。24h后隨機分為7組，即模型組、5-Fu組(25mg/kg)、華蟾素組(3g/kg)和注射用龍葵總堿小、中、大劑量組(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)及口服組(2mg/kg)，每組10只，另取10只小鼠作為正常對照組。分別靜脈注射給予相應(yīng)藥物(正常對照組和模型組注射等容積生理鹽水，口服組灌胃給藥)。給藥容積均為10ml/kg。給藥8天后，眼眶取血，常規(guī)分離血清，-20℃保存，待測TNF-α和IL-2；脫頸椎處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤，稱重，按照下面公式計算抑瘤率；取胸腺、脾臟，稱重，按下面公式計算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。


實驗結(jié)果小鼠接種S180移植性實體瘤后，3天皮下即可觸到腫瘤，8天后解剖腫瘤平均重量均大于1g，注射用龍葵總堿三個劑量組小鼠腫瘤浸潤范圍均小于模型組，瘤體易剝離，腫瘤重量明顯減輕(P＜0.01)。模型組小鼠血清TNF-α、IL-2含量均低于正常對照組，注射用龍葵總堿各組均可以升高血清TNF-α、IL-2含量，其中注射用龍葵總堿中、大劑量組和模型組相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)果見表39～41。
表39注射用龍葵總堿對S180移植性實體瘤抑瘤率的影響(x±S)
注和模型組相比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表40注射用龍葵總堿對S180移植性實體瘤小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響(x±S)
注和正常對照組組相比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
表41對S180移植性實體瘤小鼠血清TNF-α和IL-2含量的影響(x±S)
注和正常對照組相比較，△△P＜0.01；和模型組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
實驗例11注射用龍葵總堿對小鼠血清溶血素量的影響 實驗方法ICR小鼠70只，體重20～24g，雌雄各半。然后隨機分為7組，每組10只，即正常對照組、模型組、黃芪注射液組(6.7g/kg)和注射用龍葵總堿小、中、大劑量組(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)和LK口服組(2mg/kg)。各組小鼠靜脈注射給予相應(yīng)受試藥物(正常對照組和模型組靜脈注射給予等容積生理鹽水，口服組灌胃給藥)，給藥容積為10ml/kg，連續(xù)給7日。給藥后第4、6日，除正常對照組其余各組分別腹腔注射30mg/kg環(huán)磷酰胺，正常對照組注射等容積生理鹽水。各組小鼠從第3日開始分別腹腔注射5％綿羊紅細胞生理鹽水懸液0.2ml進行免疫，共4日。
末次灌胃給藥后30min，小鼠眼眶取血，分離血清50μl，生理鹽水稀釋500倍。取稀釋血清1ml，加入5％綿羊紅細胞0.5ml以及10％補體(新鮮豚鼠混合血清經(jīng)SRBC<10∶1>于4℃吸收30min后置于-20℃?zhèn)溆?1ml，混勻后置于37℃恒溫水浴中30min，然后移至冰浴中終止反應(yīng)。1500rpm離心5min，取上清液1ml，加都氏試劑(碳酸氫鈉1.0g、高鐵氰化鉀0.2g、氰化鉀0.05g加入蒸餾水1000ml)3ml，放置10min后，于540nm處測吸收度值。
SRBC半數(shù)溶血時的吸收度值取5％SRBC0.25ml加都氏液至4ml，放置10min后，比色讀取吸收光度值。按下面公式計算每只小鼠樣晶的半數(shù)溶血值(HC50)。

實驗結(jié)果造模后小鼠血清溶血素量下降，模型組與正常對照組比較有顯著性差異(p＜0.05)，表明小鼠經(jīng)造模后血清血溶素水平明顯下降；注射用龍葵總堿三個劑量組均能明顯升高小鼠血清血溶素量水平，與模型組比較有顯著性差異(p＜0.05)。結(jié)果見表42。
表42對小鼠血清溶血素的影響(x±S)
注和正常對照組相比，△△P＜0.01；和模型組相比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
實驗例12注射用龍葵總堿對小鼠炭粒廓清的影響 實驗方法ICR小鼠90只，體重18～22g，雌雄各半。然后隨機分為6組，每組15只，即正常對照組、黃芪注射液組(6.7g/kg)和注射用龍葵總堿小、中、大劑量組(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg)和LK口服組(2mg/kg)。靜脈注射給予相應(yīng)受試藥物(正常對照組和模型組靜脈注射給予等容積生理鹽水，口服組灌胃給藥)，給藥容積為10ml/kg，連續(xù)給5日。末次給藥后30min，尾靜脈注射25％的印度墨汁0.1ml/10g，于2min和10min分別眼眶取血20μl，加入盛有2ml的碳酸鈉溶液(濃度1mg/ml)試管中，在680nm出測吸光度值OD2min和OD10min，將采完血液的小鼠處死，取肝、脾臟稱重。按下列公式計算廓清指數(shù)k及吞噬指數(shù)a。結(jié)果進行組間t檢驗。


實驗結(jié)果和正常對照組相比，注射用龍葵總堿中、大劑量組均可以增加小鼠的碳粒廓清指數(shù)及吞噬指數(shù)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，表明注射用龍葵總堿可以增強小鼠單核巨噬細胞的吞噬功能。結(jié)果見表43。
表43對小鼠碳粒廓清率的影響(x±S，n＝15)
△△p＜0.01，與空白對照組比較；＊p＜0.05，＊＊p＜0.01與模型組比較。
本發(fā)明的龍葵總堿及其藥物制劑具有毒副作用低的特點，是通過以下的一般藥理學(xué)、毒理學(xué)及安全性實驗得到證實的。
實驗例13注射用龍葵總堿急性毒性實驗 1、注射用龍葵總堿一次靜脈注射給藥的小鼠LD50為42.5mg/kg，其95％的置信限為38.0～47.6mg/kg，擬臨床人用劑量為0.2mg/kg，LD50是臨床人用劑量的212.5倍。
2、注射用龍葵總堿一次腹腔注射給藥的小鼠LD50為31.4mg/kg，其95％的置信28.8～34.2mg/kg，擬臨床人用劑量為0.2mg/kg，LD50是臨床人用劑量的157倍。
3、注射用龍葵總堿一次靜脈注射給藥的大鼠LD50為12.8mg/kg，其95％的置信限為11.5～14.3mg/kg，擬臨床人用劑量為0.2mg/kg，LD50是臨床人用劑量的64倍。
4、注射用龍葵總堿一次腹腔注射給藥的大鼠LD50為36.1mg/kg，其95％的置信限為32.9～39.7mg/kg，擬臨床人用劑量為0.2mg/kg，LD50是臨床人用劑量的180.5倍。
5、6月齡左右Beagle犬6條，體重約7kg左右，3♀3

，采用近似致死量法觀察Beagle犬單次靜脈滴注注射用龍葵總堿急性毒性反應(yīng)，按50％遞增法間隔一個劑量給藥，劑量為1.2、2.7、6.0mg/kg。給藥后6.0mg/kg組雄性、雌性Beagle犬均出現(xiàn)活動減少、精神沉郁，24小時內(nèi)進食量下降，其它未見異常反應(yīng)。因此估計犬單次靜脈滴注注射用龍葵總堿近似致死量(ALD)約大于6.0mg/kg。
實驗例14注射用龍葵總堿長期毒性實驗 40只Beagle犬，雌雄各半，體重6kg左右隨機分為4組，每組10只(5雌5雄)，靜脈滴注注射用龍葵總堿。設(shè)0.75、1.50和3.00mg/kg/day 3個劑量組和1個對照組，分別為擬臨床人日用量的3.75、7.5、15倍，給藥期為26周，停藥后恢復(fù)4周，連續(xù)給藥2周，停藥2周為一個周期。
給藥后26周結(jié)果顯示，0.75、1.50和3.00mg/kg組Beagle犬體征、進食量、體重、外觀行為、活動、糞便形狀與對照組類似，均未見明顯異常反應(yīng)。3.00mg/kg組谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和肌酸激酶(CK)給藥6周、14周、26周逐漸升高，血清白蛋白(ALB)于給藥14周、26周低于對照組，伴有γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GGT)和甘油三脂(TG)的一過性增高，與對照組比較均有顯著性或極顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.01，p＜0.05)，其中ALT較AST升高幅度大(ALT/AST＞1)；1.50mg/kg組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和肌酸激酶(CK)給藥14周、26周均高于對照組，有顯著性或極顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.01，P＜0.05)，結(jié)合自身前后比較，提示ALT呈劑量依賴和時間-毒性反應(yīng)關(guān)系，1.50、3.00mg/kg劑量下肝細胞輕度損傷；但停藥4周血清生化檢查結(jié)果正常，表明停藥4周恢復(fù)良好。血液學(xué)、心電圖、凝血因子、體溫以及尿液檢查各劑量組指標與對照組相似，均在正常值范圍內(nèi)波動，提示腎功能無損傷，蛋白質(zhì)、脂肪、糖代謝基本正常。
Beagle犬靜脈滴注注射用龍葵總堿0.75～3.00mg/kg 26周，3.00、1.50mg/kg劑量組除給藥部位有血管內(nèi)皮細胞增生等刺激性反應(yīng)外，可引起肝細胞可逆性輕度損傷以及生精細胞可逆性減少，3.00mg/kg劑量組還可引起卵泡的可逆性減少，顯示中毒的靶器官為肝臟、睪丸、卵巢。0.75mg/kg劑量組給藥26周可見雄性Beagle犬生精細胞減少，提示該劑量下仍具有一定的生殖毒性，恢復(fù)4周給藥組生精細胞恢復(fù)正常，肝細胞水腫呈良好恢復(fù)趨勢，其他未見與藥物有關(guān)的毒性表現(xiàn)。提示Beagle犬靜脈滴注注射用龍葵總堿≤0.75mg/kg/day，以mg/kg計算，達到擬人臨床用量(0.2mg/kg)3.75倍，在該用藥條件下，除出現(xiàn)生精細胞可逆性減少外，用藥26周是安全的。同時提示人臨床應(yīng)用注射用龍葵總堿應(yīng)注意該藥對生殖系統(tǒng)的毒性作用，以及注意監(jiān)測肝功能指標；另考慮到用藥期間出現(xiàn)不同程度的給藥局部血管刺激性，提請人臨床應(yīng)用注意控制給藥速度，緩慢滴注。
注射用龍葵總堿1.5mg/kg、3mg/kg、6mg/kg三個劑量組和一個對照組，分別為擬臨床人日用量的7.5、15、30倍，大鼠腹腔注射給藥26周(給藥期間給藥二周、停藥二周，恢復(fù)期4周)，檢測一般情況以及相關(guān)指標 1、給藥與停藥期間，三個劑量組及對照組大鼠健康狀況良好，大鼠精神狀況、行為活動及外觀體征等方面均無異常變化；體重增長正常，體重較同期對照組大鼠略低，但無顯著性差異。
2、血液學(xué)指標檢查結(jié)果顯示，26周檢測中，中、高劑量組PT延長，與對照組比較有顯著性差異；其它指標與對照組比較無顯著性差異。停藥4周檢測中，三個劑量組大鼠血液學(xué)各指標與對照組比較均無顯著性差異。
3、血液生化指標檢查結(jié)果顯示，注射用龍葵總堿13周、26周檢測中，三個劑量組ALT、AST有不同程度升高，呈劑量依賴關(guān)系，其中高劑量組與對照組比較有顯著性差異；26周中、高劑量組CK濃度略升高，高劑量組與對照組比較有顯著性差異；其它血液生化指標無異常，與對照組比較無顯著性差異。
4、臟器系數(shù)檢查結(jié)果顯示，給藥組肝、脾臟器系數(shù)較對照組增大，其中26周高劑量組與對照組比較有顯著性差異，其它心、肺、腎、腦、胸腺、腎上腺、卵巢、子宮、睪丸、附睪等主要臟器指數(shù)與對照組比較無顯著差異。
5、臟器組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，13周、26周檢查中個別大鼠出現(xiàn)了輕度、中度肝臟水腫，26周檢查中極個別大鼠睪丸呈現(xiàn)輕度至重度萎縮，提示藥物對肝臟、肺臟及睪丸有一定的毒副作用；肝、脾，消化管道及胰腺漿膜面纖維結(jié)締組織增生、纖維化，說明藥物經(jīng)腹腔注射時對局部有刺激作用。上述這些毒副作用及腹膜刺激反應(yīng)隨藥物劑量的降低而減輕，并且在停藥后病變可逆性恢復(fù)或有恢復(fù)的傾向。其它所檢臟器包括心臟、腎臟、食道、唾液腺、氣管、甲狀腺、甲狀旁腺、胸腺、腎上腺、大腦、小腦、腦干、頸段脊髓、胸段脊髓、腰段脊髓、腦垂體、坐骨神經(jīng)、膀胱、前列腺、附睪、卵巢、子宮、乳腺、主動脈、胸骨及骨髓、淋巴結(jié)、用藥局部等臟器，光學(xué)顯微鏡下未見受試藥物引起實質(zhì)細胞變性壞死，間質(zhì)血管擴張、充血、炎細胞浸潤等病理變化。
實驗例15注射用龍葵總堿一般藥理學(xué)實驗 1、注射用龍葵總堿靜脈注射2、4、8mg/kg三個劑量后，對小鼠自主活動次數(shù)與正常對照組比較無明顯差異(p＞0.05)； 2、注射用龍葵總堿靜脈注射后并立即腹腔注射戊巴比妥鈉，注射用龍葵總堿4、8mg/kg可以顯著縮短小鼠入睡潛伏期(P＜0.01)，對睡眠時間及入睡率無明顯影響。提示注射用龍葵總堿在受試劑量范圍內(nèi)對戊巴比妥鈉致小鼠催眠具有協(xié)同作用。
3、注射用龍葵總堿藥靜脈注射1、2、4mg/kg后對大鼠協(xié)調(diào)平衡運動均無明顯影響。大鼠在轉(zhuǎn)棒上掉落次數(shù)與正常對照組比較無明顯差異(p＞0.05)。提示注射用龍葵總堿在受試劑量范圍內(nèi)對大鼠協(xié)調(diào)平衡運動無明顯影響。
4、注射用龍葵總堿靜脈滴注0.64、1.28、2.56mg/kg三個劑量后，家犬血壓、心電圖、呼吸與正常對照組比較無明顯差異(p＞0.05)。提示該藥在受試劑量范圍內(nèi)對家犬心血管系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)基本無明顯影響。
綜上所述，本品在受試劑量范圍內(nèi)除對小鼠有一定的鎮(zhèn)靜作用外，對小鼠自主活動、大鼠協(xié)調(diào)平衡運動、家犬心血管系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)基本無明顯影響。
實驗例16注射用龍葵總堿的過敏性、溶血性和局部刺激性等安全性實驗研究 1、溶血性實驗結(jié)果表明，注射用龍葵總堿濃度在0.05mg/ml濃度以下可供靜脈注射用； 2、血管刺激性實驗結(jié)果表明，注射用龍葵總堿以(0.05mg/ml)5ml靜脈注射給藥3次后，具有輕微血管刺激性反應(yīng)，但是恢復(fù)14日后血管內(nèi)皮刺激反應(yīng)可以恢復(fù)； 3、肌肉刺激性實驗結(jié)果表明，注射用龍葵總堿(0.05mg/ml)1ml肌肉注射3次后，不引起肌肉刺激性反應(yīng)； 4、熱原實驗結(jié)果表明，注射用龍葵總堿2.0ml/kg(0.05mg/ml)靜脈注射符合不致熱注射劑的要求； 5、豚鼠主動全身過敏實驗表明，注射用龍葵總堿1.0mg/kg、2.0mg/kg未引起豚鼠主動全身過敏反應(yīng)； 6、大鼠被動皮膚過敏實驗表明，注射用龍葵總堿1.0mg/kg，3.0mg/kg靜脈注射未引發(fā)大鼠被動皮膚過敏反應(yīng)； 7、異常毒性實驗表明，注射用龍葵總堿以0.05mg/ml濃度靜脈注射，小鼠異常毒性實驗合格。

具體實施例方式 實施例1龍葵總堿的制備方法 取龍葵全草與/或果實加入50％～90％乙醇溶液提取2～3次，每次6～8倍量，回收乙醇，濃縮至相對密度1.25，濃縮液中加入2～4倍量的0.1mol/l酸性溶液，充分攪拌，冷藏，過濾，濾渣用鹽酸溶液洗滌1～3次，合并濾液和洗滌液，以弱極性或中等極性樹脂吸附。樹脂吸附后先用水沖洗樹脂柱/床至流出液近中性；再以0.1mol/l堿性溶液沖洗樹脂柱/床至流出液近無色，再以含醇量30％～40％乙醇液沖洗樹脂柱/床至流出液近無色。棄去。再以50～90％乙醇進行洗脫，至洗脫液顯無色，收集洗脫液，回收乙醇至無醇味，以0.5～1.5mol/l的堿性溶液調(diào)PH值至8～10，靜置，冷藏，收集沉淀。自然晾干，即可得龍葵總堿提取物。
以上所述的堿性溶液選自氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鉀、氫氧化鎂和氨水溶液；所述的酸性溶液選自醋酸、鹽酸、硫酸和檸檬酸溶液；所述的柱層析洗脫用有機溶劑為甲醇、無水乙醇、正丁醇、氯仿、苯的一項或者兩項或者三項以任意比例形成的混合相。
實施例2注射劑的制備 稱取龍葵總堿含量在50％以上的龍葵總堿提取物10g，加入至10000ml注射用水中用0.1mol/l的鹽酸調(diào)節(jié)PH值至6～7，攪拌30分鐘，加入一定活性炭，繼續(xù)攪拌半個小時，過濾，過0.22μm濾膜后，灌裝即可。
實施例3凍干粉針劑的制備 稱取龍葵總堿含量在50％以上的龍葵總堿提取物10g，加1000ml注射用水，80℃～90℃保溫攪拌，完全溶解后，加入100g的甘露醇，攪拌使溶解；調(diào)節(jié)pH值至6～7，無菌精濾，定量分裝于管制玻璃瓶中，冷凍干燥，即得。
實施例4輸液劑的制備 稱取龍葵總堿含量在50％以上的龍葵總堿提取物10g，用適量生理鹽水溶解后，以0.1mol/l的鹽酸調(diào)節(jié)PH值至6～7，攪拌30分鐘，加入一定活性炭，繼續(xù)攪拌半個小時，過濾，過0.22μm濾膜后，加入適量生理鹽水至50L，攪拌灌裝即得每50ml含龍葵提取物10mg得輸液劑。
實施例5片劑的制備 稱取龍葵總堿含量在50％以上的龍葵總堿提取物1000g，藥用淀粉1000g，混合均勻，用淀粉漿制粒，干燥、整粒后，壓片，每片含龍葵總堿100mg。
實施例6丸劑的制備 稱取400g聚乙二醇4000，溶化，加入龍葵總堿含量在50％以上的龍葵總堿提取物100g，攪拌均勻，傾入保溫管中，恒溫，使藥液在80～90℃下滴入冷卻過的液體石蠟中，滴完后，將藥丸倒在濾紙上吸干石蠟油，即得。
實施例7膠囊劑的制備 稱取龍葵總堿含量在50％以上的龍葵總堿提取物1000g，藥用淀粉1000g，混合均勻，裝入2號膠囊，每粒含龍葵總堿100mg。
實施例8散劑的制備 稱取龍葵總堿含量在50％以上的龍葵總堿提取物1000g，淀粉1000g，混合均勻，分裝，即得。
權(quán)利要求
1.一種龍葵總堿提取物，其特征在于由龍葵全草與/或果實中提取、分離、純化而得，其步驟如下
取龍葵全草與/或果實加入50％～90％乙醇溶液提取2～3次，每次6～8倍量，回收乙醇，濃縮至相對密度1.25，濃縮液中加入2～4倍量的0.1mol/l酸性溶液，充分攪拌，冷藏，過濾，濾渣用鹽酸溶液洗滌1～3次，合并濾液和洗滌液，以弱極性或中等極性樹脂吸附。樹脂吸附后先用水沖洗樹脂柱/床至流出液近中性；再以0.1mol/l堿性溶液沖洗樹脂柱/床至流出液近無色，再以含醇量30％～40％乙醇液沖洗樹脂柱/床至流出液近無色，棄去。再以50～90％乙醇進行洗脫，至洗脫液顯無色，收集洗脫液，回收乙醇至無醇味，以0.5～1.5mol/l的堿性溶液調(diào)PH值至8～10，靜置，冷藏，收集沉淀。自然晾干，即可得龍葵總堿提取物。
以上所述的堿性溶液選自氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鉀、氫氧化鎂和氨水溶液；所述的酸性溶液選自醋酸、鹽酸、硫酸和檸檬酸溶液；所述的柱層析洗脫用有機溶劑為甲醇、無水乙醇、正丁醇、氯仿、苯的一項或者兩項或者三項以任意比例形成的混合相。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種龍葵總堿提取物，其特征在于該提取物中龍葵總堿含量為50.0％以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的一種龍葵總堿提取物，其特征在于該提取物和一種或幾種藥用賦形劑，或可與龍葵總堿提取物組方的其他藥物制備成抗腫瘤的口服藥物制劑或非腸道藥物制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物制劑，其特征在于含有1％～99％的龍葵總堿含量為50％～99％的龍葵總堿提取物和99％～1％的藥用賦形劑(包括其它配伍用的藥物)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物制劑，其特征在于含有45％～95％的龍葵總堿含量為50％～99％的龍葵總堿提取物和55％～5％的藥用賦形劑(包括其它配伍用的藥物)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物制劑，其特征在于含有75％～90％的龍葵總堿含量為50％～99％的龍葵總堿提取物和25％～10％的藥用賦形劑(包括其它配伍用的藥物)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于所述口服藥物制劑為片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、丸劑、混懸劑、口服液體制劑等；所述非腸道給藥劑型為注射液、輸液劑、凍干注射劑、注射乳劑、氣霧劑、栓劑等；所述藥用賦形劑為溶劑、崩解劑、矯味劑、粘合劑、著色劑、防腐劑等；所述的其它配伍用的藥物，指的是以有效劑量的龍葵總堿提取物為一定的藥物原料，再配伍其它已允許合用的中藥或化學(xué)藥品。
8.本發(fā)明用于抗腫瘤藥物的制備。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其特征在于動物實驗中大鼠的藥效學(xué)起效劑量為0.5mg/kg，長期毒性的安全劑量為1.5mg/kg，擬臨床人用量為0.2mg/kg。安全劑量為藥效學(xué)起效劑量的3倍，是擬臨床人用量的7.5倍。犬長期毒性的安全劑量為0.75mg/kg，為擬臨床人用量的3.75倍。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其特征在于所述的腫瘤細胞是指人小細胞肺癌、人乳腺癌細胞、人胃癌細胞、人肝癌細胞、人結(jié)腸癌細胞、人直腸癌細胞、人宮頸癌細胞、人黑色素瘤細胞、早幼粒白血病細胞、肉瘤180、肝癌腹水型、小鼠宮頸癌-14或艾氏腹水癌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗腫瘤療效顯著、使用安全、毒副作用較小的龍葵全草與/或果實提取物及其藥物制劑及制備方法。該龍葵全草與/或果實提取物中，龍葵總堿含量為50％以上。本發(fā)明的龍葵總堿提取物藥物制劑含有1％～99％的龍葵總堿含量為50％～99％的龍葵總堿提取物和99％～1％的藥用賦形劑(包括其它配伍用的藥物)。藥效學(xué)實驗結(jié)果表明龍葵總堿體外對各種腫瘤細胞均具有較強的抑制作用；對Hep、S180移植性實體瘤均具有較強的抑瘤作用；對動物移植性腫瘤放、化療具有顯著的抗腫瘤增效作用，說明該提取物具有很好的抑瘤作用。藥理、毒理學(xué)實驗亦證明其使用較安全。本發(fā)明工藝先進，工業(yè)實用性強，成本相對較低。
文檔編號A61K36/81GK101199666SQ20061016322
公開日2008年6月18日 申請日期2006年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月12日
發(fā)明者石 楊, 李明慧, 張軼倫 申請人:劉 陽