專利名稱：菊芋凝集素在制備治療便秘和延緩胃腸老化藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種來自菊芋/Www^ L.塊莖的糖結合蛋白，其 具有體外促進家兔離體回腸蠕動活性，具體地說是菊芋凝集素在制備治療 便秘和延緩胃腸老化藥物中的應用。
背景技術：
菊芋(i/e//awAMl^w&m sL.)俗稱洋姜、鬼子姜，原產(chǎn)于北美洲，系 屬菊科(Compw/toe)向日葵屬的多年生草本植物(能形成地下塊莖的栽培 種)。菊芋是一個比較好的防風固沙、防止水土流失并具有一定開發(fā)利用價 值的植物種。其超強的繁殖能力以及在刻苦環(huán)境中生存的特性都歸功于它 發(fā)達的根系和含有諸多成分的塊莖。人們發(fā)現(xiàn)用牛羊在食用菊芋塊莖后，會出現(xiàn)腹瀉的癥狀，嚴重者還會 死亡。本專利首次通過實驗發(fā)現(xiàn)向不同濃度的菊芋粗提物對回腸的蠕動都 有刺激作用。粗提物經(jīng)過蛋白酶的酶解后，其蛋白質(zhì)片斷增強了刺激作用。 這種強烈的刺激作用很可能影響回腸的正常蠕動，造成牛羊的腹瀉，嚴重 時還可能造成回腸痙攣，使牛羊死亡。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種來自菊芋/w^ra^^ L.塊莖的具有體外促進 家兔離體回腸蠕動活性的糖結合蛋白。具體地說是菊芋凝集素在制備治療便秘和延緩胃腸老化藥物中的應用。所述的菊芋凝集素可參照文獻1 (文獻1.Characterization and molecular cloning of the lectin from Helianthus tuberosus ， E. J. M. Van Damme, Annick Barrel, Anne-Marie Mazardl, Peter Verhaert, Alistair Horman, Henri Debray, Pierre Rouge 1 and Willy J. Peumans， Eur. J. Biochem. 1999， 259， 135-142) 分離純化。其N末端^ TVVTSLTFQTNKKVYGPFGT。 SDS—PAGE鑒定 純度大于95%，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-MS)測定 此活性蛋白的分子量為15.4KDa。所述的糖結合蛋白，其可按如下方法制備獲得在3-5"C時，將200克 菊芋新鮮塊莖用100毫升0.01 MTris-HCl， 0.15M NaCl緩沖液，pH7.4，抽 提。靜置過夜后，80%硫銨沉淀，所得粗蛋白對二次水透析后凍干得粉末。 首先采用陰離子交換柱Sephacel-DEAE，柱溫為室溫，檢測波長為280腿， 流動相為0.01M Tris-HCl無鹽溶液到0.01M Tris-HCl， 1M NaCl線形梯度 洗脫。，脫液對二次水透析后凍干。將凍干粉溶于0.01MTris-HCl， 0.15M NaCl緩沖液，pH 7.4， 10毫升該溶液加到分子篩層析Sephadex G-200 (1.8X98cm)上，流動相為0.01MTris-HCl， 0.15MNaCl緩沖液，柱溫為室
溫，檢測波長為280nm，檢測洗脫峰的體外刺激回腸蠕動的活性，將具有 體外刺激回腸蠕動活性的洗脫成份凍干燥，制得20毫克該糖結合蛋白。最 后用高效液相Hypersil C18柱，流動相為10%乙腈-水溶液，檢測波長 205nm，柱溫為室溫，進樣體積20pl，采用梯度洗脫，按時間收集。經(jīng)SDS聚丙酰胺凝膠電泳檢測，糖結合蛋白分子量約為17 000道爾 頓?；w輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-MS)測定此活性蛋白的 分子量為15376道爾頓。所述菊芋凝集素可與充填劑形成的各種形式的散劑，顆粒劑，片劑，膠 囊，水溶液，懸浮液，乳化液，噴劑或粉劑，藥物可為口服藥物。所述藥 物可以添加到各種食品當中，作為預防便秘和延緩胃腸衰老的保健食品， 食品的形態(tài)可以是液體的比如像清涼飲料，乳酸飲料，調(diào)味品，湯類，或 固體的奶酪，火腿，點心等。本發(fā)明應用現(xiàn)代生物技術對菊芋塊莖粗蛋白進行分離純化，對純化得 到的蛋白質(zhì)進行家兔離體回腸蠕動的活性篩選。結果表明該蛋白具有很好 的刺激回腸蠕動的活性。因此，可將此蛋白或者其衍生物作為治療便秘患 者的藥物，或者作為食品添加劑制成保健食品。


圖1為蛋白粗提物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；圖2為純化蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳； 圖3為回腸在加樣前后的收縮振幅變化； 圖4為不同濃度下回腸在加樣前后的收縮振幅變化； 圖5為胃蛋白酶加酶前后回腸平滑肌收縮的振幅變化； 圖6為胃蛋白酶消化后，回腸平滑肌收縮的振幅變化； 圖7為胰蛋白酶加酶前后回腸平滑肌收縮的振幅變化； 圖8為胰蛋白酶消化后，回腸平滑肌收縮的振幅變化。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的闡述 實施例1在3-5。C時，將200克菊芋新鮮塊莖用100毫升O.OlMTris-HCl， 0.15M NaCl緩沖液，pH 7.4，抽提。首先采用陰離子交換柱Sephacel-DEAE，流 動相為0.01M Tris-HCl無鹽溶液到0.01M Tris-HCl， 1M NaCl線形梯度洗 脫。洗脫液對二次水透析后凍干。將凍干粉溶于0.01MTris-HCl，0.15MNaCl 緩沖液，pH 7.4。 10毫升該溶液加到分子篩層析Sephadex G-200 (1.8X98cm) 上。檢測洗脫峰的體外刺激回腸蠕動的活性，將具有體外剌激回腸蠕動活 性的洗脫成份冷凍干燥，制得20毫克該糖結合蛋白。最后用高效液相 Hypersil C18柱，流動相為10%乙腈的水溶液，進一步純化該蛋白。實施例2蛋白粗提物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，文獻2(汪家政，范明.蛋白 質(zhì)技術手冊[M].北京科學出版社，2000. 42-100).結果如圖1所示。 實施例3經(jīng)離子交換分離出的蛋白提取物SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳見圖2，結 果如圖2所示。 實施例4家兔禁食24小時，用木棒猛擊家兔頭部致昏，迅速剖開腹腔暴露小腸， 在距回盲部15 cm處取一部分回腸，去除腸系膜，剪成數(shù)段，每段約1.5 cm， 沖洗內(nèi)容物，浸泡在臺氏液中放于4"C的冰箱中備用。取一段回腸平滑肌標 本，將其下端固定，上端與機械電換能器相連，懸掛于裝有25ml臺氏液的 麥氏浴槽中，麥氏浴槽與37。C的恒溫水浴鍋相連，機械電換能器與生物機 能實驗系統(tǒng)相連，用以記錄回腸平滑肌的收縮情況。向麥氏恒溫浴槽中通 混合氣體(95%的02和5。/。的C02)，每20min更換一次臺氏液，穩(wěn)定平 衡lh后換新鮮臺氏液開始實驗。實驗所用濃度均按最終浴槽濃度計算。文 獻3 (H.D. Wang, C.Y.Tan, X.F.Bai， Y.G.D， B.C丄in， Pharmacological studies of anti-diarrhoeal activity of Gentianopsis paludosa, Journal of Ethnopharmacology, 2006,105， 114-117);回腸在加樣前后的收縮振幅見圖3。實施例5分別用濃度為0.00625 mg/ml， 0.0125 mg/ml， 0.025 mg/ml， 0.05 mg/ml， 0.1 mg/ml， 0.2mg/ml， 0.4mg/ml， 0.8 mg/ml和1.6 mg/ml的該蛋白加樣， 同時對回腸平滑肌的收縮振幅進行檢測。不同濃度下回腸在加樣前后的收 縮振幅變化見圖4。實施例6:經(jīng)過胃蛋白酶處理的該蛋白對回腸平滑肌收縮的影響。開始只加入胃蛋白酶，加酶前后回腸平滑肌收縮的振幅變化見圖5。然后再將胃蛋白酶和 該蛋白37'C下混合2小時后，將混合液加入試驗體系，加樣前后回腸平滑 肌收縮的振幅變化見圖6。 實施例7經(jīng)過胰蛋白酶處理的該蛋白對回腸平滑肌收縮的影響。開始只加入胰 蛋白酶，加酶前后回腸平滑肌收縮的振幅變化見圖7。然后再將胰蛋白酶和 該蛋白37t:下混合2小時后，將混合液加入試驗體系，加樣前后回腸平滑 肌收縮的振幅變化見圖8。
權利要求
1. 菊芋凝集素在制備治療便秘和延緩胃腸老化藥物中的應用。
2、 按照權利要求l所述的應用，其特征在子所述菊芋凝集素可與充 填劑形成的各種形式的散劑，顆粒劑，片劑，膠囊，水溶液，懸浮液，乳 化液，噴劑或粉劑。
3、 按照權利要求l所述的應用，其特征在于所述藥物為口服藥物。
4、 按照權利要求l所述的應用，其特征在于所述藥物可以添加到各 種食品當中，作為預防便秘和延緩胃腸衰老的保健食品。
5、 按照權利要求l所述的應用，其特征在于所述保健食品的形態(tài)可 以是液體的或是固體的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來自菊芋Helianthus tuberosus L.塊莖的糖結合蛋白，其具有體外促進家兔離體回腸蠕動活性，具體地說是菊芋凝集素在制備治療便秘和延緩胃腸老化藥物中的應用。本發(fā)明應用現(xiàn)代生物技術對菊芋塊莖粗蛋白進行分離純化，對純化得到的蛋白質(zhì)進行家兔離體回腸蠕動的活性篩選。結果表明該蛋白具有很好的刺激回腸蠕動的活性。因此，可將此蛋白作為治療便秘患者的藥物，或者作為食品添加劑制成保健食品。
文檔編號A61K38/16GK101209342SQ20061013511
公開日2008年7月2日 申請日期2006年12月27日 優(yōu)先權日2006年12月27日
發(fā)明者杜昱光, 熊川男, 王佳培, 白雪芳 申請人:中國科學院大連化學物理研究所