專利名稱：核桃油在防治皮膚衰老藥物制劑中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及核桃油在制備用于防治皮膚衰老及保健美容的藥物制劑中的應用。
背景技術：
健康和長壽是生命科學永恒的主題。隨著世界人口的加速老齡化，抗衰老研究已成為迅速崛起的一門應用科學。人體衰老的最早部位是骨組織和皮膚。醫(yī)學研究證明人在20歲以后骨的衰老就慢慢開始了，直到50歲以后，骨質疏松癥大大加快，并容易造成骨折。骨質疏松癥使衰老的重要標志之一，另一個就是皮膚衰老，皮膚老化是機體老化的一部分，機體的老化在皮膚上表現(xiàn)得最為清楚。防治骨質疏松癥與皮膚老化已成為醫(yī)學科學研究的熱點，但很少有人把這兩者聯(lián)系起來。我們在抗衰老及抗骨質疏松的研究過程中，發(fā)現(xiàn)紫蘇子油具有良好的預防骨質疏松的作用，同時也有很好的預防皮膚衰老的功能。

發(fā)明內容
本項目研究組發(fā)現(xiàn)幾種植物油核桃油、麥胚芽油、月見草油、紫蘇仔油、紅花油具有防治骨質疏松癥的作用，同時，又具有預防皮膚衰老的作用，可用于制備防治骨質疏松癥的藥物制劑，也可用于制備預防皮膚衰老的制劑。
核桃油可制成片劑，膠囊劑，顆粒劑，沖劑，口服液，外用制劑，注射劑和任何可供臨床應用的的藥物制劑。
具體實施例方式實施例一1.實驗方法1.1實驗動物及飼養(yǎng)條件三月齡普通級Sprangue-Dawley(SD)雌性大鼠70只(廣東醫(yī)學院實驗動物中心提供)，體重225±12g。飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)室內溫度保持24℃~28℃，濕度在50％~60％。分籠普通喂養(yǎng)。每籠兩只，自由攝食攝水，專室飼養(yǎng)，專人負責，每周稱體重一次。動物飼養(yǎng)及實驗共三個月。
1.2研究藥物及配制方法(1)己烯雌酚廣東彼迪藥業(yè)有限公司；配制方法己烯雌酚2mg，蒸餾水1000ml，加溫溶解即可。
(2)四種植物油精制月見草油，精制紫蘇子油，精制麥胚芽油，精制核桃油均購于大連濃華生物工程有限公司，這幾種油的主要組成成分見表1
表1幾種油的主要組成成分的含量

1.3.實驗方法用卵巢切除法建立雌激素缺乏的老年性骨質疏松與皮膚衰老的大鼠動物模型，對照大鼠采用假手術方法，即實驗時同樣做手術，但不切除卵巢，作為實驗對照。實驗分組給藥情況見表1表1藥物抗骨質疏松與皮膚衰老研究實驗分組及給藥情況

1.4.動物的去勢和給藥動物的去勢除假手術組大鼠外，余各組大鼠用3％戊巴比妥麻醉(0.12ml/kg)，在嚴格消毒條件下，行大鼠去卵巢手術，一星期后拆線。假手術組大鼠在相同部位(兩側腹部)打開腹腔不摘除卵巢立即縫合。
給藥假手術組和卵巢切除組每天經口灌喂生理鹽水5ml*kg-1*d-1，己烯雌酚組每天經口灌喂己烯雌酚10ug kg-1*d-1；月見草油組、紫蘇仔油組、麥胚芽油組、核桃油組每天經口分別灌喂月見草油、紫蘇仔油、麥胚芽油、核桃油5ml*kg-1*d-1。連續(xù)給藥三個月。
1.5.取材連續(xù)給藥三個月后，在3％戊巴比妥麻醉下，右心室抽血處死大鼠，分離血清作血清Ca測定。取左側尺骨，除凈肌肉和軟組織，80℃烘烤48h至恒重得骨干重，然后于6mol·L-1HCl，108℃溫度下消化16h后過濾取過濾液，用ICP(電感偶合等離子體直讀光譜儀)測定骨中鈣(Ca)、磷(P)含量，以及骨羥脯氨酸(Hyp)含量(羥脯氨酸試劑盒為南京建成生物工程公司產品)。分離右側脛骨，用慢速鋸在近端作矢狀打開髓腔，放入10％福爾馬林緩沖液固定，然后脫水，脫脂作塑料包埋。用硬組織切片機分別切下不脫鈣4μm和8μm切片，4μm切片用Goldner’s Trichrome染色封片，進行骨計量學靜態(tài)參數(shù)(static parameters)測量。8μm切片不染色封片作熒光觀察進行骨計量學動態(tài)參數(shù)(dynamic parameters)測量。此外，動物處死當時即取背部正中皮膚，用脫毛劑脫去鼠毛，取一1cm×1cm大小皮膚迅速放入10％中性甲醛液中固定，擬作組織切片進行組織形態(tài)學觀察及定量分析；另取余部位背部皮膚迅速冰凍保存，擬作皮膚組織勻漿測皮膚SOD、羥脯氨酸及MDA含量。
1.6.皮膚組織制備(1)10％皮膚勻漿的制備①取脫毛后的皮膚組織塊0.5g左右，經冷生理鹽水漂洗，除去皮下脂肪和其它結締組織，濾紙拭干，稱重，放入10ml的小燒杯中。
②用量筒取該組織塊重量9倍的預冷的生理鹽水，取2/3倒入裝有組織塊的燒杯中，用眼科小剪盡快剪碎組織塊，然后倒入勻漿管中將剩余的1/3生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的組織塊，一起倒入勻漿管，用內切式組織勻漿機攪拌制成10％組織勻漿(勻漿時間10次/秒，間歇3秒，連續(xù)7~10次，在冰水中進行)。
③取少量組織勻漿直接涂片，在顯微鏡下觀察細胞的破碎情況，若破碎不全，則反復凍溶三次，使其完全破碎，使胞內容物完全游離在液相中。
(2)組織切片染色彈力纖維染色 采用Weigert間苯二酚-堿性品紅染色法操作方法①石蠟切片，脫蠟至水，蒸餾水洗。
②0.25％高錳酸鉀氧化10分鐘。
③0.5％草酸漂白為止。
④蒸餾水洗后95％酒精洗一次。
⑤直接浸入Weigert溶液20~60分鐘。
⑥0.5％鹽酸酒精分化，觀察背景無色彈力纖維清楚為好。
⑦水洗，快洗后進二甲苯透明，中性樹膠封固。
(結果彈力纖維呈黑藍色。)膠原纖維染色采用Van Gieson染色法，操作方法如下①組織固定10％福爾馬林液，常規(guī)脫水包埋。
②切片脫落至蒸餾水。
③用Weigert鐵蘇木素液染10~20分鐘。
④流水稍沖洗。
⑤1％鹽酸酒精迅速分化。
⑥流水沖洗后蒸餾水沖洗。
⑦用Van Gieson液染3~5分鐘。
⑧傾去染液，直接用95％酒精分化和脫水。
⑨無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。
(結果膠原纖維呈紅色，肌纖維、胞質及紅細胞呈黃色，細胞核呈藍黑色。)表皮細胞染色采用HE染色法染色。操作方法略。
1.7、統(tǒng)計學分析運用SAS軟件進行單因素分析，先采用SAS中的UNIVARIATE過程檢驗方差齊性，若方差相等采用方差分析，組間比較再采用SNK-q檢驗；若方差不齊則采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，再用Nemenyi檢驗比較兩組間差別。
2.實驗結果2.1去卵巢大鼠皮膚衰老的結果2.1.1去卵巢大鼠皮膚組織病理學形態(tài)變化及計算機圖像定量分析(1)表皮結構的變化去卵巢大鼠與假手術大鼠表皮結構的皮膚組織病理學形態(tài)變化具有明顯的不同特點，卵巢切除大鼠的皮膚表皮厚度明顯變薄，細胞層數(shù)減少，基底細胞排列散亂，細胞大小不一。對照組(假手術組)表皮厚度較厚，由3～5層細胞組成，棘細胞散在分布，基底細胞呈立方形，排列整齊。大鼠皮膚表皮厚度計算機圖像分析系統(tǒng)定量分析結果見表2表2大鼠皮膚表皮厚度計算機圖像分析系統(tǒng)定量分析結果

注*P＜0.01從表2可見，卵巢切除組表皮厚度較假手術組減少了22％，差別有顯著性(P＜0.01)。
(2)去卵巢大鼠真皮彈力纖維形態(tài)學觀察去卵巢大鼠真皮彈力纖維Weigert間苯二酚-堿性品紅染色形態(tài)學觀察可見，卵巢切除組彈力纖維變短、減少，排列散亂。假手術組彈力纖維較細長，有輕微彎曲度，排列相對有序，纏繞在膠原束中間，毛囊周圍呈環(huán)形排列。大鼠皮膚彈力纖維面積計算機圖像分析系統(tǒng)定量分析結果見表3
表3大鼠皮膚彈力纖維面積計算機圖像分析系統(tǒng)定量分析結果

注*P＜0.01從表3可見，卵巢切除組彈力纖維面積較假手術組減少了29％，差別有顯著性(P＜0.01)。
(3)去卵巢大鼠真皮膠原纖維形態(tài)學觀察真皮膠原纖維Van Gieson染色法形態(tài)學觀察可見，卵巢切除組皮膚膠原層厚度變薄，膠原束斷裂甚至破碎，走向平直，排列疏松且紊亂。假手術組膠原纖維束細長，胞體豐富，呈束狀排列，走向與皮面平行，呈波紋狀，在毛囊周圍纖維纖細且排列疏松。
(4)去卵巢大鼠皮膚生化指標的檢測①大鼠皮膚組織MDA含量的檢測見表4表4大鼠皮膚組織MDA含量

注*P＜0.01從表4可見，卵巢切除組MDA含量較假手術組升高了35％，差別有顯著性(P＜0.01)。
②大鼠皮膚組織中SOD活性的檢測見表5表5大鼠皮膚組織中SOD活性

注*P＜0.01從表5可見，卵巢切除組SOD活性較假手術組降低了18％，差別有顯著性(P＜0.01)。
③大鼠皮膚組織羥脯氨酸含量的檢測見表6
表6大鼠皮膚組織羥脯氨酸含量檢測結果

注*P＜0.01從表6可見，卵巢切除組羥脯氨酸含量較假手術組降低了37％，差別有顯著性(P＜0.01)。
2.1.2小結正常3月齡大鼠行卵巢切除后，可造成雌性大鼠皮膚SOD活力降低、羥脯氨酸含量堿少、MDA含量增加；表皮層厚度變薄，彈力纖維減少。說明了采用卵巢切除術建立雌激素缺乏大鼠皮膚衰老模型是可行的。
2.2五種藥物抗皮膚衰老的結果3.2.1藥物對大鼠皮膚組織病理形態(tài)學的影響及計算機圖像定量分析(1)表皮結構的變化表皮結構的皮膚組織病理學形態(tài)變化可見，己烯雌酚組表皮較假手術組和卵巢切除組明顯增厚，細胞層數(shù)增多，排列相對有序，基底細胞胞體大，排列規(guī)整。月見草油組、紫蘇子油組、麥胚芽油組、核桃油組表皮較假手術組和卵巢切除組顯著增厚，細胞層數(shù)增多，排列有序，胞間基質豐富，基底細胞胞體大，排列更加規(guī)整。計算機圖像定量分析見表7。
表7大鼠皮膚表皮厚度計算機圖像分析系統(tǒng)定量分析結果

注(1)*P＜0.01；(2)變化比例1與假手術組比較，變化比例2與卵巢切除組比較，變化比例3與己烯雌酚組比較。
(2)真皮彈力纖維染色形態(tài)學觀察真皮彈力纖維Weigert間苯二酚-堿性品紅染色形態(tài)學觀察可見，己烯雌酚組彈力纖維較假手術組和卵巢切除組明顯增多，彈力纖維細長。月見草油組、紫蘇子油組、麥胚芽油組、核桃油組彈力纖維較假手術組和卵巢切除組顯著增多，彈力纖維細長。計算機圖像定量分析見表8。
表8大鼠皮膚彈力纖維面積計算機圖像分析系統(tǒng)定量分析結果

注(1)*P＜0.01；(2)變化比例1與假手術組比較，變化比例2與卵巢切除組比較，變化比例3與己烯雌酚組比較。
(3)真皮膠原纖維形態(tài)學觀察真皮膠原纖維Van Gieson染色法形態(tài)學觀察可見，己烯雌酚組膠原纖維較假手術組和卵巢切除組排列致密、規(guī)整，呈波浪狀，與皮面平行。月見草油組、紫蘇子油組、麥胚芽油組、核桃油組較假手術組和卵巢切除組膠原纖維明顯增厚，膠原束排列規(guī)整、更為致密。
(4)皮膚生化指標的檢測①大鼠皮膚組織MDA含量的檢測見表9表9大鼠皮膚組織MDA含量檢測結果

注(1)*P＜0.01；(2)變化比例1與假手術組比較，變化比例2與卵巢切除組比較，變化比例3與己烯雌酚組比較。
②大鼠皮膚組織羥脯氨酸含量的檢測見表10
表10大鼠皮膚組織羥脯氨酸含量檢測結果

注(1)*P＜0.01；(2)變化比例1與假手術組比較，變化比例2與卵巢切除組比較，變化比例3與己烯雌酚組比較。
③大鼠皮膚組織SOD含量的檢測見表11表11大鼠皮膚組織SOD含量檢測結果

注(1)*P＜0.01；(2)變化比例1與假手術組比較，變化比例2與卵巢切除組比較，變化比例3與己烯雌酚組比較。
2.2小結己烯雌酚組大鼠表皮層厚度增厚，彈力纖維明顯增多；己烯雌酚組皮膚SOD活性增強、皮膚羥脯氨酸含量增加及皮膚MDA含量下降。月見草油組、紫蘇子油組、麥胚芽油組、核桃油組大鼠表皮層厚度增厚，彈力纖維明顯增多；月見草油組、紫蘇子油組、麥胚芽油組、核桃油組皮膚SOD活性增強、皮膚羥脯氨酸含量增加及皮膚MDA含量下降。實驗結果顯示己烯雌酚、月見草油、麥胚芽油、紫蘇子油及核桃油均具有抗卵巢切除引起的皮膚衰老的作用，且月見草油、麥胚芽油、紫蘇子油及核桃油作用優(yōu)于己烯雌酚。
2.3骨計量學參數(shù)的測量骨計量學靜態(tài)參數(shù)的結果可見，去卵巢大鼠與對照大鼠相比，90天后骨量明顯丟失，骨小梁數(shù)目降低(P＜0.01)，骨小梁分離度增加(P＜0.01)，破骨細胞數(shù)目增加(P＜0.01)。己烯雌酚使去卵巢大鼠的骨量及骨小梁數(shù)目明顯增加(P＜0.01)、骨小梁分離度及破骨細胞數(shù)目明顯減少。月見草油，紫蘇子油，麥胚芽油，核桃油均可使去卵巢大鼠的骨量有增加(P＜0.05)，但與己烯雌酚組無差別。
骨計量學動態(tài)參數(shù)的結果可見，去卵巢組大鼠骨形成指標明顯增加礦化沉積率增加(P＜0.05)、骨形成率BFR/BV增加(P＜0.05)。己烯雌酚能抑制去卵巢大鼠的骨形成率(BFR/BV，P＜0.05)。月見草油，紫蘇子油，麥胚芽油，核桃油均對去卵巢大鼠骨形成指標無明顯影響。
以上研究表明，月見草油，紫蘇子油，麥胚芽油，核桃油對實驗性動物骨質疏松有明顯的防治作用。
權利要求
1.核桃油在制備用于防治皮膚衰老的藥物制劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了核桃油具有預防皮膚衰老的作用，可用于制備防治皮膚衰老及保健美容的制劑。核桃油可在制備防治骨質疏松癥及皮膚衰老的藥物制劑中應用，可制成片劑，膠囊劑，顆粒劑，沖劑，口服液，外用制劑，注射劑和任何可供臨床應用的藥物制劑。
文檔編號A61P17/16GK1927261SQ200610110560
公開日2007年3月14日 申請日期2005年6月8日 優(yōu)先權日2005年6月8日
發(fā)明者吳鐵, 崔燎, 石麗君, 劉曉青, 劉鈺瑜 申請人:廣東醫(yī)學院