專(zhuān)利名稱(chēng)：一種燕麥蛋白ace抑制肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種燕麥蛋白ACE抑制肽的制備方法，屬于燕麥深加工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
燕麥?zhǔn)且活?lèi)重要的禾谷類(lèi)糧食作物。與其它的各類(lèi)谷物相比，燕麥具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能，被譽(yù)為是谷類(lèi)食品中最好的全價(jià)食品之一。隨著人們對(duì)自身飲食健康的日益重視，全球燕麥消費(fèi)量持續(xù)增長(zhǎng)，國(guó)際市場(chǎng)對(duì)燕麥的需求量很大。然而目前我國(guó)燕麥深加工技術(shù)相對(duì)比較落后，市場(chǎng)上燕麥類(lèi)食品品種單一，導(dǎo)致我國(guó)燕麥供人食用部分不足總產(chǎn)量的4％，這種情況不僅造成了資源的極大浪費(fèi)，而且限制了我國(guó)燕麥產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。
燕麥蛋白不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，能滿足人體需求，此外還具有潛在的降血壓功能，因此本發(fā)明以燕麥麩為原料，充分利用燕麥蛋白的特有功效進(jìn)行燕麥蛋白ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑制肽的研制，并作為一種新型的食品配料添加于食品中，以望達(dá)到營(yíng)養(yǎng)與保健的雙重目的，同時(shí)實(shí)現(xiàn)燕麥資源的綜合利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種燕麥蛋白ACE抑制肽的制備方法，所得產(chǎn)品具有營(yíng)養(yǎng)和保健兩方面的優(yōu)越性。
本發(fā)明的技術(shù)方案以燕麥麩為原料，經(jīng)粉碎，加水和復(fù)合多糖酶ViscozymeL進(jìn)行酶法預(yù)處理后，調(diào)節(jié)提取液至堿性環(huán)境提取燕麥麩蛋白，離心分離，上清液等電點(diǎn)沉淀，所得沉淀加水均質(zhì)后，再添加堿性蛋白酶進(jìn)行水解反應(yīng)，離心分離，上清液中的肽組分經(jīng)色譜技術(shù)進(jìn)行分離純化，最終得到四種單一的燕麥蛋白ACE抑制肽組分，分別為燕麥蛋白ACE抑制肽A、B、C和D。
(1)原料的粉碎要求對(duì)原料燕麥麩進(jìn)行粉碎，并過(guò)40目篩網(wǎng)。原料粉碎效果越好，越有利于燕麥麩中蛋白的提取。
(2)燕麥麩的酶法預(yù)處理料液比燕麥麩與水的質(zhì)量比例為1∶10，減小用水量會(huì)導(dǎo)致燕麥蛋白提取率偏低，增加用水量又會(huì)導(dǎo)致成本過(guò)高，生產(chǎn)負(fù)荷加大。因此比較適宜的料液比為1∶10。
酶反應(yīng)的溫度和時(shí)間原料酶法預(yù)處理過(guò)程采用復(fù)合多糖酶Viscozyme L(120FBG/mL)，加酶量300FBG/100g燕麥麩，調(diào)節(jié)pH為4.5～5.0，酶的最適反應(yīng)溫度40～45℃。延長(zhǎng)酶預(yù)處理時(shí)間有利于反應(yīng)完全，但反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加生產(chǎn)周期，故本發(fā)明的酶反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)。
(3)燕麥麩蛋白的提取原料燕麥麩酶法預(yù)處理后有利于下一步蛋白的溶出。燕麥麩蛋白較好的溶出條件為堿性條件與較高的溫度下。但pH不宜過(guò)高，否則容易導(dǎo)致有毒物質(zhì)生成；同時(shí)溫度也不能過(guò)高，否則容易導(dǎo)致淀粉糊化影響蛋白溶出。因此適宜的蛋白提取條件為pH值9.5，50℃下攪拌浸提30min。
(4)離心分離采用三足式離心機(jī)能將蛋白提取液有效分離，離心條件為3000r/min、20min，取上清液。
(5)上清液處理燕麥蛋白的等電點(diǎn)在pH4.5左右，因此將上一步所得的蛋白提取液pH值調(diào)至4.5后能最大程度上實(shí)現(xiàn)燕麥蛋白的沉淀。調(diào)pH過(guò)程采用HCl溶液，提取液很快變混濁，懸濁液離心分離(3000r/min、20min)，得沉淀。
(6)沉淀加水混勻后均質(zhì)按1∶20的比例在沉淀中加水混勻并均質(zhì)，均質(zhì)過(guò)程有利于蛋白分子的分散，有利于下一步的酶解過(guò)程；(7)蛋白酶解燕麥麩蛋白酶解生產(chǎn)ACE抑制肽過(guò)程使用的蛋白酶最佳為堿性蛋白酶(Alcalase 3.0T酶活為3.0AU/g)，該酶的最佳作用溫度和pH分別為60℃和7.5，酶底比E/S＝1.33％條件下作用90min所得產(chǎn)物的ACE抑制活性能達(dá)到最佳。酶解反應(yīng)結(jié)束后，為了阻止蛋白酶的進(jìn)一步作用，對(duì)殘余酶活力進(jìn)行滅酶處理，將酶解液升溫至90℃，并保持10min滅酶。
(8)離心分離酶解液中可溶性的小肽組分具有很強(qiáng)的ACE抑制活性，為達(dá)到活性組分的富集，要對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行離心分離。酶解液冷卻至室溫后采用三足式離心機(jī)離心分離(3000r/min、30min)回收上清液；(9)上清液中活性組分的分離純化離子交換色譜分離所得上清液直接上離子交換色譜進(jìn)行第一步分離，色譜條件為分離介質(zhì)DEAE Sepharose Fast Flow；起始緩沖液0.02mol/L、pH4.0HAc-NaAc緩沖液，含0～1mol/L的NaCl緩沖溶液線性梯度洗脫；凝膠過(guò)濾色譜分離收集離子交換色譜分離所得高ACE抑制活性組分上凝膠過(guò)濾色譜進(jìn)行第二步分離，色譜條件為分離介質(zhì)Sephadex G-25；蒸餾水洗脫；反相高效液相色譜分離收集凝膠過(guò)濾色譜分離所得高ACE抑制活性組分上反相液相色譜進(jìn)行第三步分離色譜條件為L(zhǎng)ichrospher C18反相柱，洗脫條件，0～10min，0～20％B；10～20min，20～35％B；20～30min，35～100％B；30～34min，100～0％B；34～40min，100％A；(A5％乙腈+0.05％三氟乙酸和其余為水；B80％乙腈+0.05％三氟乙酸和其余為水)。
經(jīng)三步純化工藝后，共得到四種單一的高ACE抑制活性肽組分，分別為燕麥蛋白ACE抑制肽A、B、C和D。
(10)肽片段結(jié)構(gòu)鑒定對(duì)四種新發(fā)現(xiàn)的肽段利用MALDI-TOF/TOF進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，氨基酸序列分別為AYKPIRSK、APRGF、GGDIIRPG和EGGYR，其半抑制率IC50值分別為10.6μM、31.6μM、113.8μM和77.3μM。
本發(fā)明的有益效果采用本發(fā)明方法制備的燕麥蛋白ACE抑制肽活性強(qiáng)，能有效地起到降壓作用，可以同時(shí)發(fā)揮出營(yíng)養(yǎng)和保健兩方面的作用。


圖1燕麥蛋白ACE抑制肽制備工藝流程示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1取經(jīng)過(guò)粉碎、過(guò)40目篩的15kg燕麥麩，加入150L水?dāng)嚢杌靹?，加熱?5℃，調(diào)pH至4.5～5.0，加復(fù)合多糖酶Viscozyme L 0.375L，酶解反應(yīng)2h，升溫至50℃，并調(diào)pH至9.5，繼續(xù)攪拌30min后，離心分離(3000r/min、20min)，收集上清液調(diào)pH至4.5，離心分離(3000r/min、20min)得沉淀1.35kg，加27L水混勻后均質(zhì)，調(diào)溫度和pH分別至60℃和7.5，加堿性蛋白酶Alcalase 3.0T 18g反應(yīng)90min，升溫至90℃，并保持10min滅酶，冷卻至室溫后，離心分離(3000r/min、30min)得上清液，依次上離子交換色譜、凝膠過(guò)濾色譜和反相高效液相色譜進(jìn)行分離，共得到四種強(qiáng)ACE抑制活性的肽組分。
實(shí)施例2取經(jīng)過(guò)粉碎、過(guò)40目篩的10kg燕麥麩，加入100L水?dāng)嚢杌靹?，加熱?0℃，調(diào)pH至4.5～5.0，加復(fù)合多糖酶Viscozyme L 0.25L，酶解反應(yīng)2h，升溫至50℃，并調(diào)pH至9.5，繼續(xù)攪拌30min后離心分離(3000r/min、20min)，收集上清液調(diào)pH至4.5，離心分離(3000r/min、20min)，得沉淀0.9kg，加18L水混勻后均質(zhì)，調(diào)溫度和pH分別至60℃和7.5，加堿性蛋白酶Alcalase 3.0T 12g反應(yīng)90min，升溫至90℃，并保持10min滅酶，冷卻至室溫后，離心分離(3000r/min、30min)，得上清液，依次上離子交換色譜、凝膠過(guò)濾色譜和反相高效液相色譜進(jìn)行分離，共得到四種強(qiáng)ACE抑制活性的肽組分。
權(quán)利要求
1.一種燕麥蛋白ACE抑制肽的制備方法，其特征是以燕麥麩為原料，經(jīng)粉碎，加水和復(fù)合多糖酶Viscozyme L進(jìn)行酶法預(yù)處理后，調(diào)節(jié)提取液至堿性環(huán)境提取燕麥蛋白，離心分離，上清液等電點(diǎn)沉淀，所得沉淀加水均質(zhì)后，再添加堿性蛋白酶進(jìn)行水解反應(yīng)，離心分離，所得上清液經(jīng)色譜分離技術(shù)，得到高活性的燕麥蛋白ACE抑制肽，工藝為(1)原料粉碎原料燕麥麩進(jìn)行粉碎，過(guò)40目篩網(wǎng)；(2)酶法預(yù)處理粉碎后的燕麥麩按1∶10的質(zhì)量比例加水，調(diào)節(jié)pH值至4.5～5.0、溫度40～45℃后，加入復(fù)合多糖酶Viscozyme L，加酶量300FBG/100g燕麥麩，酶解時(shí)間為2h；(3)堿性環(huán)境提取燕麥麩蛋白酶法預(yù)處理后提取液調(diào)節(jié)pH值至9.5，50℃下攪拌浸提30分鐘；(4)離心分離將反應(yīng)料液經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分鐘、離心分離20分鐘，取上清液；(5)上清液等電點(diǎn)沉淀上清液用HCl調(diào)pH值至4.5后，將所得懸濁液經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分鐘、離心分離20分鐘，得沉淀；(6)沉淀加水均質(zhì)按1∶20的比例在沉淀中加水混勻并均質(zhì)；(7)加蛋白酶水解均質(zhì)后的溶液調(diào)pH值7.5，溫度60℃，按酶底比E/S＝1.33％的比例添加堿性蛋白酶Alcalase 3.0T作用90分鐘；酶解結(jié)束后升溫至90℃、10分鐘滅酶；(8)離心分離酶解液冷卻至室溫后3000轉(zhuǎn)/分鐘、離心分離30分鐘，取上清液；(9)純化離心后上清液采用離子交換色譜、凝膠過(guò)濾色譜和反相高效液相色譜分離純化出四種單一的燕麥蛋白ACE抑制肽組分，分別為燕麥蛋白ACE抑制肽A、B、C和D。(10)對(duì)純化出的燕麥蛋白ACE抑制肽A、B、C和D組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，得出燕麥蛋白ACE抑制肽的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述燕麥蛋白ACE抑制肽的制備方法，其特征是過(guò)程中所用復(fù)合多糖酶Viscozyme L酶活為120FBG/mL，堿性蛋白酶Alcalase 3.0T酶活為3.0AU/g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述燕麥蛋白ACE抑制肽的制備方法，其特征是所制備得到的燕麥蛋白ACE抑制肽A、B、C和D組分進(jìn)行半抑制率IC50值測(cè)定，分別為10.6μM、31.6μM、113.8μM和77.3μM。
全文摘要
一種燕麥蛋白ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑制肽的制備方法，屬于燕麥精深加工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以燕麥麩為原料，經(jīng)粉碎、酶法預(yù)處理、堿法提取、離心分離、上清液等電點(diǎn)沉淀、沉淀加水均質(zhì)后再添加堿性蛋白酶水解、離心后上清液經(jīng)離子交換色譜、凝膠過(guò)濾色譜和反相高效液相色譜分離，得到四種新的燕麥蛋白ACE抑制肽A、B、C和D，并利用串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，并測(cè)定其半抑制率IC
文檔編號(hào)A61P9/00GK1944663SQ20061009720
公開(kāi)日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2006年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月24日
發(fā)明者姚惠源, 張暉, 管驍, 郭曉娜, 王立 申請(qǐng)人:江南大學(xué)