專利名稱：一種中藥滴眼液及其制備工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于中藥制藥領域，涉及一種中藥滴眼液及其制備工藝。
背景技術：
目前用于治療外眼部感染疾病的藥物較多，主要是喹諾酮類、氨基糖苷類、激素類以及核苷類等，如氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、磺胺醋酰鈉、醋酸可的松、氫化可的松、利福平、三氮唑核苷、阿昔洛韋、卡那霉素、妥布霉素、氯霉素等，此類藥物在目前臨床上使用廣泛，療效確切，在很大程度上緩解了患者臨床用藥的需要，但同時也存在許多復雜的問題。如由病原微生物所致的急、慢性結膜炎，上述藥物的治療效果較好，但對非病原微生物所致及病情遷延反復的慢性結膜炎，往往效果不甚理想，且病程較長，費用較高，患者難以接受；采用糖皮質激素類藥物治療眼部的各種炎癥和變態(tài)反應性疾患時，雖可在迅速消除炎癥、保護視功能等方面發(fā)揮重要作用，但是無論全身或局部給予激素類藥物都能引起許多嚴重并發(fā)癥，臨床治療副作用較大；氨基糖苷類藥物對革蘭氏陰性菌的抗菌作用較好，價格便宜，但存在制劑刺激性較大，細菌耐藥性上升等問題，且長期應用可能導致視網膜的損害；磺胺類藥物由于刺激性較強，療效一般，目前臨床用量日趨減少；氯霉素因細菌對其耐藥性增加，已很少用于嚴重感染；臨床應用很廣的利福平滴眼液對沙眼衣原體有抑制作用，可用于沙眼以及敏感菌引起的角膜炎、結膜炎的治療，但因配制后的藥液性質不穩(wěn)定，室溫僅可保存2周，不利于患者的使用；其他抗病毒類藥物無論從臨床療效還是種類數量來看，均未見突破性的進展。與此同時，一些純中藥制劑如魚腥草滴眼液、復方熊膽滴眼液以及板藍根滴眼液等，以其獨特的清熱解毒，消炎止痛止癢之功效，使用安全副作用小等優(yōu)勢，尤其是中藥復方制劑以其抗菌、抗病毒的雙重作用應用于臨床，治療效果增強，應用便捷，已逐漸成為未來我國眼用制劑研究開發(fā)的焦點和熱點。
清開靈注射液由傳統(tǒng)名方安宮牛黃丸化裁而成，組成合理，譴藥精當，符合中醫(yī)傳統(tǒng)理論認識。作為我國首創(chuàng)的中藥復方注射液，清開靈注射液具有清熱解毒、清營涼血、化痰通絡、鎮(zhèn)靜安神、醒腦開竅之功效，在臨床上主要用于熱病神昏、中風偏癱、神志不清。亦可用于急、慢性肝炎，乙型肝炎，上呼吸道感染，肺炎，高燒，以及腦血栓形成、腦出血等諸多證候者。隨著清開靈注射液在臨床上的廣泛的應用，將其靜脈注射用于治療眼科疾病，已有不少報道。如郭承偉等使用清開靈注射液治療病毒性角膜炎28例，其結果為32只眼中，治愈26只，顯效4只，有效2只，總有效率100％。亦有將清開靈注射液直接滴眼使用治療病毒感染引起的流行性出血性結膜炎的報道，其治療結果為痊愈114例，有效6例，總有效率100％，明顯優(yōu)于對照組藥物。通常認為清開靈注射液毒性較低，使用安全。但是隨著其在臨床上的廣泛應用，不良反應的發(fā)生也時有報道，其以皮疹、發(fā)熱、過敏最為常見。藥理研究表明清開靈注射液中含有水牛角以及珍珠母提取物，內含多肽及蛋白質等，屬大分子物質具有完全抗原性，如通過靜脈輸注進入體內，則機體會受到抗體刺激產生抗原-抗體反應，從而導致不良反應的發(fā)生。
目前，清開靈注射液廣泛應用于臨床，將其靜脈注射用于治療眼科疾病，已有較多報道。如急性流行性結膜炎為臨床常見疾病，好發(fā)于夏季，臨床用清開靈注射液以全身給藥的方式(注射)治療急性流行性結膜炎，效果顯著；或用清開靈注射液以局部給藥的方式(直接滴眼使用)治療流行性出血性結膜炎，亦取得顯著的治療效果?，F代醫(yī)學研究認為此疾病是由細菌或病毒直接接觸感染所致，清開靈注射液具有殺菌、抑制病毒復活和活血化瘀等作用。故用于此疾病能切合病因病機，藥能中證而獲良效。但是，從制劑學角度而言，上述兩種方式均存在一定的問題，如用清開靈注射液以靜脈注射的給藥方式治療外眼部感染性疾病，其結果為眼感染部位藥物濃度低，療效下降，與此同時過敏、皮疹、發(fā)熱等不良反應的發(fā)生率卻大幅度提高；如以清開靈注射液直接滴眼使用，雖然可保持較高的局部藥物濃度，提高療效，但藥物對眼部的刺激性相應增加，同樣無法保證藥物臨床使用的安全性。
鑒于目前抗生素滴眼液的長期廣泛應用已引起菌株耐藥性以及環(huán)境污染日益加劇等諸多因素的影響，臨床外眼部感染性疾病有混合感染的趨勢，而單純大量使用抗生素治療效果不甚理想，因此，研制開發(fā)清開靈滴眼液品種意義重大。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種使用方便，安全有效的中藥滴眼液。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述中藥滴眼液的制備方法。
本發(fā)明的目的是通過下列措施實現的一種中藥滴眼液，該滴眼液由治療有效量的藥效組分及輔料組成，其中構成藥效組分的原料藥處方與輔料處方中含有下列重量份的物質構成藥效組分的原料藥處方膽酸3-4份，珍珠母(粉)45-55份，豬去氧膽酸3-4份，梔子20-30份，水牛角(粉)20-30份，板藍根190-210份，黃芩苷4-6份，金銀花80-90份；輔料處方依地酸二鈉2-8份、維生素C鈉5-25份、尼泊金甲酯0.5-3份，尼泊金丙酯0.5-3份。
所述的中藥滴眼液，該滴眼液中構成藥效組分的原料藥處方與輔料處方中含有下列重量份的物質構成藥效組分的原料藥處方膽酸3.25份，珍珠母(粉)50份，豬去氧膽酸3.75份，梔子25份，水牛角(粉)25份，板藍根200份，黃芩苷5份，金銀花87.5份；輔料處方依地酸二鈉5份、維生素C鈉10份、尼泊金甲酯2份和尼泊金丙酯1份。
所述的中藥滴眼液的制備方式，該方法包括以下步驟a.按處方取各原輔料備用；b.金銀花加金銀花重量10-14倍量的水，煎煮2-3次，每次0.5-1小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至70℃時相對密度為1.12～1.13，加乙醇使含醇量達70-80％，濾過，濾液調節(jié)pH值至7.5-8.5，冷藏，濾過，濾液回收乙醇并濃縮至70℃時相對密度為1.14～1.15，再加乙醇使含醇量達80-90％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加適量水，得金銀花提取液，冷藏備用；c.板藍根加板藍根重量7-9倍量的水，煎煮2-3次，每次0.5-1.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至70℃時相對密度為1.09～1.10，加乙醇使含醇量達55-65％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加適量水，得板藍根提取液，冷藏備用；d.梔子加梔子重量7-9倍量的水，煎煮2-3次，每次0.5-1.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至70℃時相對密度為1.03～1.04，加乙醇使含醇量達55-65％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加適量水，得梔子提取液，冷藏備用；e.水牛角粉加水牛角粉重量7-9倍量的1mol/L氫氧化鋇溶液、珍珠母粉加珍珠母粉重量7-9倍量的1mol/L硫酸溶液，于85℃條件分別水解7-9小時，濾過，合并濾液，調節(jié)pH值至3.5～4.0，濾過，濾液濃縮至70℃時相對密度為1.03～1.04，加乙醇使含醇量達55-65％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加適量水，得水牛角與珍珠母的水解混合液，冷藏備用；f.將梔子提取液、板藍根提取液和水牛角與珍珠母的水解混合液合并后，溶液濃縮至70℃時相對密度為1.05～1.06，加到膽酸、豬去氧膽酸的70-80％乙醇溶液中，混勻，加乙醇使含醇量達70-80％，調節(jié)pH值至6.5-7.5，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加適量水，得混合溶液I，冷藏備用；g.黃芩苷用注射用水溶解，調pH值至6.5-7.5，加入金銀花提取液，混勻，與上述混合溶液I合并，混勻，制得混合溶液II；
h.將上述混合溶液II補加適量水，分別加入2-8份的依地酸二鈉、5-25份的維生素C鈉、0.5-3份的尼泊金甲酯和0.5-3份的尼泊金丙酯，加熱攪拌使溶解，用pH為7.38的沙氏磷酸鹽緩沖液調節(jié)pH為6.8-7.5，加入0.5-5份的活性炭處理后，過濾，于濾液中加入適量甘露醇，攪拌使溶解，加適量水定容，調節(jié)甘露醇加入量使成等滲溶液，經0.22μm的微孔濾膜除菌濾過，分裝即可。
本發(fā)明有益效果本發(fā)明將原清開靈注射液改為滴眼液(以下稱清開靈滴眼液)，不僅可以方便疾病患者的使用，更加確保了制劑使用時的安全性，同時具有理想的抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)痛、明目等作用，與外眼部感染疾病的主要病理改變相吻合。本發(fā)明在研制過程中參照了原清開靈注射液的制備工藝，并結合滴眼液自身的劑型特點，采用現代藥理學研究手段，在保持原方臨床功效的基礎上，科學的進行二次開發(fā)研究，使之發(fā)揮更大的臨床治療作用，具有更為廣闊的市場開發(fā)前景。本品的研制對我國名優(yōu)中成藥的二次開發(fā)起到良好的示范和引導作用。
一、清開靈滴眼液主要藥效實驗1、實驗材料1.1實驗用藥物及試劑清開靈滴眼液 金陵藥業(yè)股份有限公司技術中心提供(按實施例1制備，以下同)，批號20050822。
RPMI Medium 1640 GIBCO公司，批號050723胰蛋白酶上海伯奧生物技術有限公司，批號050822HEPES 江蘇科威技術服務有限公司，H3375L-谷氨酰胺 上海康達氨基酸廠，批號050523氯化鈉 中國太倉化工二廠，批號050213磷酸氫二鈉 南京化學試劑廠，批號041124磷酸二氫鉀 廣西西隴化工廠，批號051102葡萄糖 上?；瘜W試劑站分裝廠，批號041227碳酸氫鈉上海虹光化工廠，批號031101氫氧化鈉南京化學試劑廠，批號050408小牛血清杭州江濱生物技術有限公司，批號050621苯酚紅 上海試劑三廠，批號010815阿昔洛韋滴眼液 湖北東盛制藥有限公司，批號050809
營養(yǎng)肉湯 上海醫(yī)學化驗所 批號050922營養(yǎng)瓊脂 上海醫(yī)學化驗所 批號050229氯化鈉 江蘇太倉化工廠 批號050711雙黃連注射液 河南浙川制藥集團有限公司 批號041027冰醋酸 南京試劑廠 批號060315伊文思藍 上海醫(yī)藥采購供應站 批號020803二甲苯 如皋市華瑞試劑廠 批號0507011.2實驗用儀器CO2培養(yǎng)箱(BB16) Heraeus公司，德國倒置顯微鏡(XSZ-D2) 重慶光學儀器廠微孔濾膜上海醫(yī)藥工業(yè)研究院細胞培養(yǎng)板 丹麥NUNC公司凈化工作臺(SW-CJ-1F)蘇州安泰空氣技術有限公司裂隙燈顯微鏡蘇州醫(yī)療器械廠FA1004電子分析天平 上海天平廠孵箱上海分析儀器廠756PC紫外分光光度計 上海光譜分析儀器廠打孔器(8cm)1.3實驗用病毒株、細胞株、實驗菌株單純皰疹病毒標準病毒株I型(HSV-1質控株Sm44)，單純皰疹病毒標準病毒株II型(HSV-II質控株 333株)，由衛(wèi)生部生物制品藥品檢驗所提供；單純皰疹病毒臨床分離株(HSV-I，HSV-II)，由中國科學院南京皮膚病研究所提供。
非洲綠猴腎傳代細胞(vero細胞)，由中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫提供。
標準菌株金黃色葡萄球菌25927，銅綠假單孢菌27853，由衛(wèi)生部微生物鑒定所提供。
臨床分離球菌金黃色葡萄球菌-2、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、變形桿菌、乙型鏈球菌、肺炎雙球菌、中葡萄球菌-2、溶葡萄球菌、金黃色葡萄球菌-3，由江蘇省人民醫(yī)院微生物室分離鑒定提供。
1.4實驗動物和飼料新西蘭白兔2.0-2.5kg，南京青龍山動物飼養(yǎng)場提供，合格號SCXK(蘇)2002-0027。
ICR小鼠由南京青龍山動物繁殖廠提供，合格批號SCXK2002-0018。
全價顆粒飼料南京青龍山動物飼養(yǎng)場提供。批號060621。
1.5實驗條件給藥前后，實驗白兔分籠飼養(yǎng)，飼喂全價顆粒飼料，自由飲水，室溫22±2℃，濕度55-60％。
1.6統(tǒng)計方法資料統(tǒng)計采用t檢驗，Reed-Muench法，孫氏綜合法。
1.7試劑配制RPMI-1640培養(yǎng)液取RPMI-1640粉末10.4g，加入已滅菌的雙蒸水中，攪拌混勻后依次加入Hepes3.0g，NaHCO32.0g，L-谷氨酰胺0.6g，10％慶大霉素1ml，加水至100ml，過濾滅菌，加小牛血清使其成為含10％血清的培養(yǎng)液，4℃保存。
Hank’s液NaCl80.0g，KCl4.0g，Na2HPO4·12H2O1.52g，KH2PO40.60g，葡萄糖10.0g，0.4％酚紅50ml溶于1000ml雙蒸水中，高壓滅菌凍存。
工作液貯存液1份加雙蒸水9份，混勻后分裝，高壓滅菌，臨用時用5.6％Na2CO3調節(jié)PH7.2左右。
0.25％胰蛋白酶配制稱取0.25g胰蛋白酶加到100ml的Hank’s液中，過濾滅菌，-20℃凍存。
5.6％Na2CO3稱取5.6g Na2CO3加入到100ml雙蒸水中，混勻后高壓滅菌，4℃保存。
2、實驗方法和結果2.1清開靈滴眼液體外抗單純皰疹病毒的作用(標準病毒株HSV-I和HSV-II，臨床分離病毒株HSV-I和HSV-II)2.1.1vero細胞的培養(yǎng)取已長滿的細胞，倒掉瓶內培養(yǎng)液，用Hank′s液沖洗兩次，加入適量(1-2ml)0.25％胰蛋白酶，置培養(yǎng)箱內消化，顯微鏡下觀察當細胞出現圓縮，細胞內間隙增大時，立即終止消化，倒掉消化液，加入適量含血清1640液，用吸管吸取培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液。按1∶2或1∶3比例接種到新的培養(yǎng)瓶內。
2.1.2病毒傳代取已長成單層的細胞，棄去瓶內的生長液，再取病毒吹打后吸取0.1ml病毒液加入到細胞培養(yǎng)瓶內，用1640培養(yǎng)液加至1ml，5％CO2培養(yǎng)箱37℃繼續(xù)培養(yǎng)，觀察特異性細胞病變。當細胞出現“+++～++++”的細胞病變時，收獲病毒液-70℃凍存。以上增毒3～4次后，即可用于實驗。
2.1.3病毒毒力TCID50測定(標準病毒株I型和II型，臨床分離病毒株I型和II型)①單純皰疹病毒標準病毒株I型(HSV-I，SM44)的TCID50測定將凍存的HSV-I病毒液快速凍融后，按10倍稀釋法稀釋成10-1～10-9的不同稀釋度，接種到vero細胞培養(yǎng)板中，每個濃度4孔，每孔接種100μl病毒，于5％CO2培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)，同時設細胞對照，觀察細胞病變情況，以CPE不再進展時(48小時內)按Reed-Muench法計算病毒滴度，結果見表1(n＝2)表1用CPE法測定標準HSV-I病毒TCID50結果

注觀察標準以“-～++++”表示，其中-表示無細胞病變，+表示25％細胞病變，++表示50％細胞病變，+++表示75％細胞病變，++++表示100％細胞病變。表1～表11均以此方式表示。
實驗結果表明LgTCID50＝LgB+(b-50)/(b-a)*d＝-5+(100-50)/(100-25)*Lg10-1＝-5.67 TCID50＝10-5.67。提示單純皰疹病毒標準病毒株I型(HSV-I，SM44)的TCID50為10-5.67。
②單純皰疹病毒標準病毒株II型(HSV-II，333株)的TCID50測定將凍存的病毒液快速凍融后，按10倍稀釋法稀釋成10-1～10-9的不同稀釋液，接種到vero細胞培養(yǎng)板中，每個濃度4孔，每孔接種0.1ml病毒液，于5％CO2培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)，同時設細胞對照，觀察細胞病變情況，以CPE不再進展時(48小時內)按Reed-Muench法計算病毒滴度(TCID50)。結果見表2(n＝2)表2 用CPE法測定標準HSSV-II病毒TCID50結果

實驗結果表明LgTCID50＝LgB+(b-50)/(b-a)*d＝-6+(75-50)/(75-0)*Lg 10-1＝-6.33TCID50＝10-6.33提示單純皰疹病毒標準病毒株II型(HSV-II，333株)的TCID50為10-6.33
③單純皰疹病毒臨床分離HSV-I的TCID50測定將凍存的病毒液快速凍融后，按10倍稀釋法稀釋成10-1～10-9的不同稀釋液，接種到vero細胞培養(yǎng)板中，每個濃度4孔，每孔接種0.1ml病毒液，于5％CO2培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)，同時設細胞對照，觀察細胞病變情況，以CPE不再進展時(48小時內)按Reed-Muench法計算病毒滴度(TCID50)。結果見表3(n＝2)表3用CPE法測定臨床分離HSV-I的TCID50結果

實驗結果表明LgTCID50＝LgB+(b-50)/(b-a)*Lg10-1＝-5+(75-50)/(75-0)(-1)＝-5.33 TCID50＝10-5.33提示單純皰疹病毒臨床分離HSV-I型的TCID50為10-5.33。
④單純皰疹病毒臨床分離株II型(HSV-II)的TCID50測定將凍存的病毒液快速凍融后，按10倍稀釋法稀釋成10-1～10-9的不同稀釋液，接種到vero細胞培養(yǎng)板中，每個濃度4孔，每孔接種0.1ml病毒液，于5％CO2培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)，同時設細胞對照，觀察細胞病變情況，以CPE不再進展時(48小時內)按Reed-Muench法計算病毒滴度(TCID50)。結果見表4表4用CPE法測定臨床分離HSV-II的TCID50結果

實驗結果表明LgTCID50＝LgB+(100-50)/(100-25)(-1)＝-6.67；TCID50＝10-6.67。提示單純皰疹病毒臨床分離HSV-II型的TCID50為10-6.67。
2.1.4清開靈滴眼液對vero細胞最大無毒濃度測定用1640培養(yǎng)液將藥物稀釋成20、16、12.8、10.24、8.19、6.55mg/ml的不同濃度，(劑量間距為1∶0.8)，取100μl加入到已長成單層的vero細胞，每個濃度4孔，同時設正常細胞對照組，置5％CO2培養(yǎng)箱37℃繼續(xù)培養(yǎng)(48h內)，以觀察細胞生長情況，以不出現細胞變暗，變圓，融合，脫落等特征性病變的最大藥物濃度為該藥物的無毒性濃度。按孫氏綜合法計算，結果見表5
表5清開靈滴眼液對vero細胞最大無毒濃度測定

實驗結果顯示清開靈滴眼液濃度于20mg/ml，使細胞變圓，萎縮，脫落，對細胞有一定的毒性作用。而藥物濃度在10mg/ml及以下濃度對細胞無任何毒性，細胞生長良好。提示清開靈滴眼液對vero細胞的最大無毒劑量為10mg/ml，TC50為17.398mg/ml。
2.1.5阿昔洛韋滴眼液對vero細胞最大無毒濃度測定用1640培養(yǎng)液將藥物稀釋成0.3、0.24、0.192、0.154、0.123、0.098、0.079mg/ml的不同濃度，(劑量間距為1∶0.8)，取100μl加入到已長成單層的vero細胞，每個濃度4孔，同時設正常細胞對照組，置5％CO2培養(yǎng)箱37℃繼續(xù)培養(yǎng)(48h內)，以觀察細胞生長情況，以不出現細胞變暗，變圓，融合，脫落等特征性病變的最大藥物濃度為該藥物的無毒性濃度。按孫氏綜合法計算，結果見表6表6阿昔洛韋滴眼液對vero細胞最大無毒濃度測定

實驗結果顯示阿昔洛韋滴眼液濃度高于0.192mg/ml，使細胞變圓，萎縮，脫落，對細胞有一定的毒性作用。而藥物濃度在0.123mg/ml及以下濃度對細胞無任何毒性，細胞生長良好。提示阿昔洛韋滴眼液對vero細胞的最大無毒劑量為0.123mg/ml，TC50為0.1720mg/ml。
2.1.6清開靈滴眼液體外抗單純皰疹病毒的作用(標準病毒株1型和2型，臨床分離病毒株1型和2型)①清開靈滴眼液體外抗單純皰疹病毒標準病毒株I型(SM44)的作用用1640培養(yǎng)液將清開靈滴眼液稀釋成濃度10、7、4.9、3.43、2.401mg/ml不同濃度待用。(劑量間距為1∶0.7)取已長成單層的細胞培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，每孔加100μl(100TCID50)病毒懸液，于5％CO2培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)2h，然后棄去病毒液，每孔加上述藥液100μl，每個濃度4孔。同時設細胞對照組，病毒對照組和阿昔洛韋滴眼液對照組(阿昔洛韋滴眼液用其最大無毒劑量0.123mg/ml。)。5％CO2培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)，待病毒對照組出現“+++-++++”細胞病變時，停止培養(yǎng)，觀察并記錄各組結果。按孫氏綜合法計算，結果見表7。
表7清開靈滴眼液體外抗單純皰疹標準病毒株HSV-I的作用

實驗結果所示10mg/ml清開靈滴眼液對標準病毒株HSV-I(Sm44)病毒損傷的細胞有明顯保護作用；7mg/ml藥物對病毒損傷的保護作用減弱；2.401mg/ml清開靈滴眼液幾乎無保護作用。提示10mg/ml清開靈滴眼液具有抗單純皰疹標準病毒株HSV-I(Sm44)的作用，清開靈滴眼液對標準病毒株(HSV-I，Sm44)的IC50為4.1002mg/ml，TI為4.2432mg/ml。
②清開靈滴眼液體外抗單純皰疹病毒標準病毒株II型的作用用1640培養(yǎng)液將清開靈滴眼液稀釋成濃度10、7、4.9、3.43、2.401mg/ml不同濃度待用。(劑量間距為1∶0.7)取已長成單層的細胞培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，每孔加100μl(100TCID50)病毒懸液，于5％CO2培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)2h，然后棄去病毒液，每孔加上述藥液100μl，每個濃度4孔。同時設細胞對照組，病毒對照組，及阿昔洛韋滴眼液對照組(阿昔洛韋滴眼液用其最大無毒劑量0.123mg/ml。)。5％CO2培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)，待病毒對照組出現“+++-++++”細胞病變時，停止培養(yǎng)，觀察并記錄各組結果。按孫氏綜合法計算，結果見表8表8清開靈滴眼液體外抗單純皰疹病毒標準病毒株II型的作用

實驗結果所示7mg/ml和10mg/ml清開靈滴眼液對標準病毒株HSV-II333株病毒損傷的細胞有明顯保護作用；4.9mg/ml藥物對病毒損傷的保護作用減弱；3.43mg/ml藥物幾乎無保護作用。提示10mg/ml清開靈滴眼液具有抗單純皰疹標準病毒株HSV-II的作用，清開靈滴眼液對標準病毒株(HSV-II333株)的IC50為4.0095mg/ml，TI為4.3392mg/ml。
③清開靈滴眼液體外抗單純皰疹臨床分離病毒株I型的作用用1640培養(yǎng)液將清開靈滴眼液稀釋成濃度10、7、4.9、3.43、2.401mg/ml不同濃度待用。(劑量間距為1∶0.7)取已長成單層的細胞培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，每孔加100μl(100TCID50)病毒懸液，于5％CO2培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)2h，然后棄去病毒液，每孔加上述藥液100μl，每個濃度4孔。同時設細胞對照組，病毒對照組，及阿昔洛韋滴眼液對照組(阿昔洛韋滴眼液用其最大無毒劑量0.123mg/ml。)。5％CO2培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)，待病毒對照組出現“+++-++++”細胞病變時，停止培養(yǎng)，觀察并記錄各組結果。按孫氏綜合法計算，結果見表9表9藥物體外抗臨床分離病毒株HSV-I的作用

實驗結果所示10mg/ml清開靈滴眼液對臨床分離病毒株(HSV-I)病毒損傷的細胞有明顯保護作用；7mg/ml藥物對病毒損傷的細胞仍有較好的保護作用；3.43mg/ml藥物的保護作用減弱；提示7mg/ml和10mg/ml清開靈滴眼液具有抗單純皰疹臨床分離病毒株(HSV-I)的作用，清開靈滴眼液對單純皰疹臨床分離病毒株(HSV-I)的IC50為2.5105mg/ml，TI為6.9289mg/ml。(附圖
)④清開靈滴眼液體外抗單純皰疹臨床分離病毒株II型的作用用1640培養(yǎng)液將清開靈滴眼液稀釋成濃度10、7、4.9、3.43、2.401mg/ml不同濃度待用。(劑量間距為1∶0.7)取已長成單層的細胞培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，每孔加100μl(100TCID50)病毒懸液，于5％CO2培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)2h，然后棄去病毒液，每孔加上述藥液100μl，每個濃度4孔。同時設細胞對照組，病毒對照組，及阿昔洛韋滴眼液對照組(阿昔洛韋滴眼液用其最大無毒劑量0.123mg/ml。)。5％CO2培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)，待病毒對照組出現“+++-++++”細胞病變時，停止培養(yǎng)，觀察并記錄各組結果。按孫氏綜合法計算，結果見表10表10藥物體外抗臨床分離病毒株HSV-II的作用


實驗結果所示7mg/ml和10mg/ml清開靈滴眼液對單純皰疹病毒臨床分離病毒株(HSV-II)病毒損傷的細胞有明顯保護作用，其效果與阿昔洛韋滴眼液相似；3.43mg/ml清開靈滴眼液對單純皰疹病毒臨床分離病毒株所損傷的細胞仍有保護作用，但相對減弱，2.401mg/ml藥物幾乎無保護作用。提示7mg/ml和10mg/ml清開靈滴眼液具有抗單純皰疹臨床分離病毒株(HSV-II)的作用，清開靈滴眼液對單純皰疹臨床分離病毒株(HSV-II)的IC50為3.4300mg/ml，TI為5.0723mg/ml。(附圖)2.2、清開靈滴眼液體內抗單純皰疹標準病毒株I型(SM44)的作用。
2.2.1vero細胞的培養(yǎng)取已長滿的細胞，倒掉瓶內培養(yǎng)液，用Hank′s液沖洗兩次，加入適量0.25％胰蛋白酶，置培養(yǎng)箱內消化，顯微鏡下觀察，當細胞出現圓縮，細胞內間隙增大時，立即終止消化，倒掉消化液，加入適量含血清1640液，用吸管吸取培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液。接種到新的培養(yǎng)瓶內。
2.2.2單純皰疹標準病毒株I型(SM44)病毒傳代取已長成單層的細胞，棄去瓶內的生長液，再取病毒吹打后吸取0.1ml病毒液加入到細胞培養(yǎng)瓶內，用1640培養(yǎng)液加至1ml，5％CO2培養(yǎng)箱37℃繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細胞病變。當細胞出現“+++～++++”的細胞病變時，收獲病毒液-70℃凍存。以上病毒增毒3次后，即可測定病毒毒力TCID50。
2.2.3單純皰疹標準病毒株I型(SM44)病毒毒力TCID50測定將凍存的病毒液快速凍融后，按10倍稀釋法稀釋成10-1～10-9的不同稀釋液，接種到vero細胞培養(yǎng)板中，每個濃度4孔，每孔接種0.1ml病毒液，于5％CO2培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)，同時設細胞對照，觀察細胞病變情況，以CPE不再進展時(48小時內)按Reed-Muench氏法計算病毒滴度(TCID50)。結果見表11表11用CPE法測定標準HSV-I病毒TCID50結果

實驗結果表明LgTCID50＝LgB+(b-50)/(b-a)*d＝-5+(100-50)/(100-25)*Lg 10-1＝-5.67 TCID50＝10-5.67提示單純皰疹病毒標準病毒株I型(Sm44)(HSV-I，SM44)的TCID50為10-5.672.2.4清開靈滴眼液體內抗單純皰疹標準病毒株(HSV-I，Sm44))型作用取健康新西蘭白兔36只，體重2.0-2.5kg，(實驗前用裂隙燈下觀察雙眼無眼疾的健康新西蘭白兔用于實驗)♀♂各半，隨機分6組，每組6只，正常飼養(yǎng)2天后用于實驗。
(1)正常對照組等量基質1ml/只(2)病毒對照組(模型組)等量基質1ml/只(3)陽性對照(阿昔洛韋滴眼液)1mg/ml 1mg/只(4)清開靈滴眼液小劑量組10mg/ml10mg/只(5)清開靈滴眼液中劑量組20mg/ml 20mg/只(6)清開靈滴眼液大劑量組40mg/ml 40mg/只以上各組家兔給藥前用5號針頭作井字劃痕家兔左右角膜，長度4mm，深為0.5mm，(除正常對照組外)各組取30μl 100TCID50單純皰疹標準病毒株I型在家兔下眼瞼內滴入，閉合眼瞼按摩30秒鐘(約30次)，左眼為給藥組，右眼為病毒對照組，正常對照組和病毒對照組給予等量基質，感染18h后，開始點眼給藥，8次/日，次/1h，每次0.125ml，連續(xù)給藥14d，比較各組家兔感染單純皰疹標準病毒株I型后，家兔體重變化，角膜上皮缺損和恢復情況，14d后各組家兔取左眼作病理組織學檢查。觀察標準≠感染后48h，角膜上皮熒光素染色，用裂隙燈觀察角膜變化，并每隔2d觀察一次，記錄并比較。
≡角膜上皮缺損指數評分標準(Trousdale的0-4級法)+角膜上皮缺損面積 ＜25％，記1分++角膜上皮缺損面積 25％～50％，記2分+++角膜上皮缺損面積 50％～75％，記3分++++角膜上皮缺損面積 ＞75％，記4分-角膜上皮缺損面積，記0分2.2.5實驗結果見表12、13表12清開靈滴眼液對標準HSV-1(Sm44)致家兔病毒性角膜炎體重的影響


*p＜0.05 與病毒模型組比較實驗結果所示模型組家兔體重下降，與空白組比較具有顯著性差異，清開靈滴眼液大劑量組可使家兔體重增加，與模型組比較具有顯著性差異，提示清開靈滴眼液對單純皰疹標準病毒株I型致家兔眼損傷可防止體重下降的作用。
表13清開靈滴眼液對標準HSV-1(Sm44)致家兔眼角膜上皮缺損指數評分

*P＜0.05 **P＜0.01與病毒模型組比較實驗結果所示模型組家兔眼角膜上皮缺損較嚴重，其缺損高峰期為6-10天之間?？梢娢饭?、眼分泌物增多、角膜發(fā)炎，眼腫脹、充血和晶狀體渾濁，并逐漸加重，有點狀和樹枝狀病灶?？瞻捉M角膜上皮因劃痕缺損于4天后基本痊愈。采用清開靈滴眼液治療后，清開靈大劑量組于第6天起即可明顯減輕眼分泌物增多、角膜發(fā)炎，眼腫脹、充血和角膜上皮缺損等癥狀，與模型組比較差異顯著，清開靈中劑量組和小劑量組分別從治療第8天和第14天也可減輕對HSV-1致家兔眼角膜上皮缺損。提示清開靈滴眼液對單純皰疹標準病毒株I型感染家兔眼角膜上皮缺損具有減輕癥狀，延緩病情發(fā)展的作用，對單純皰疹標準病毒株I型(Sm44)感染家兔眼致病毒性角膜炎具有一定的治療作用。(附家兔眼照片)2.2.6病理組織學檢查結果(附病理組織學照片)表14清開靈滴眼液對標準HSV-1(Sm44)致兔眼損傷組織病理學評分


①正常對照組結膜瞼結膜和球結膜結構清晰，結膜上皮排列整齊，無明顯變性、壞死，固有層內無明顯炎細胞浸潤，瞼板腺無破壞，結膜下無明顯充血。
角膜各層結構完整，層次清晰，前上皮復層扁平上皮細胞排列整齊，無明顯變性、壞死及潰瘍形成；前界膜為透明均質膜，無明顯變薄或明顯增生；固有層膠原纖維排列整齊無損傷及瘢痕形成亦無基質水腫；后界膜為透明均質膜，無明顯變薄或明顯增生；后上皮的單層扁平上皮細胞無明顯變性、壞死，角膜緣血管無明顯充血及炎細胞浸潤。
虹膜各層結構完整，層次清晰，前緣層和色素上皮層細胞無明顯變性、壞死，基質內血管無明顯擴張充血及中性粒細胞及淋巴細胞浸潤。
睫狀體結構清晰，其內血管無明顯擴張充血及炎細胞浸潤。
視網膜各層細胞形態(tài)清晰，無明顯變性壞死。
②模型組眼球病變主要為角膜炎、虹膜睫狀體炎和結膜炎。表現為瞼結膜和球結膜充血水腫，炎細胞浸潤，嚴重者結膜上皮變性壞死；角膜前上皮復層扁平上皮細胞變性、壞死甚至脫落，上皮及固有層內炎細胞(嗜酸性粒細胞)彌漫性浸潤。角膜緣處血管亦明顯充血及炎細胞浸潤。虹膜前緣層和上皮層細胞無明顯變性、壞死，基質內血管明顯擴張組織結構疏松，有少許炎細胞浸潤，睫狀體內血管明顯擴張充血，有少許炎細胞浸潤。其余結構脈絡膜和視網膜組織形態(tài)學與正常對照組相同，各層細胞形態(tài)清晰，無明顯變性壞死。
③阿昔洛韋滴眼液組與模型組相比，眼球病變明顯減輕，角膜炎癥已經消退，前上皮復層扁平上皮細胞已經增生修復，結膜炎癥也基本消退，虹膜睫狀體炎明顯減輕，角膜緣處血管有輕度充血及少許炎細胞浸潤，虹膜及睫狀體內血管輕度擴張，個別仍有少許炎細胞浸潤。
④清開靈滴眼液組低劑量組與模型組相比，眼球病變減輕，角膜炎癥已經消退，前上皮復層扁平上皮細胞已經增生修復，結膜炎癥也基本消退，個別炎細胞浸潤仍較明顯，虹膜睫狀體炎明顯減輕，角膜緣處血管有輕至中度充血及少許炎細胞浸潤，虹膜及睫狀體內血管輕至中度擴張，個別仍有少許炎細胞浸潤。
中劑量組與模型組相比，眼球病變明顯減輕，眼球病變與低劑量組相似。
高劑量組與模型組相比，眼球病變明顯減輕，角膜炎癥已經消退，前上皮復層扁平上皮細胞已經增生修復，結膜炎癥也基本消退，個別炎細胞浸潤仍較明顯，虹膜睫狀體炎明顯減輕，角膜緣處血管有輕度充血及少許炎細胞浸潤，虹膜及睫狀體內血管輕度擴張，個別仍有少許炎細胞浸潤。
⑤結論采用標準單純皰疹病毒(HSV-I，Sm44)加劃痕成功復制了兔病毒性角膜炎模型，兔眼球損傷主要表現為嚴重的角膜炎、虹膜睫狀體炎和結膜炎。與模型組相比，清開靈滴眼液各劑量組眼球病變均有減輕，甚至病變消退，以高劑量組略優(yōu)。上述結果提示清開靈滴眼液具有一定的抗單純皰疹病毒(HSV-I，Sm44)致病毒性角膜炎作用。
2.3、清開靈滴眼液體外抗菌作用。
2.3.1培養(yǎng)基配制取18g營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，加1000ml蒸餾水加熱至溶后。分裝至三角燒瓶內20ml，試管內分別為4.5ml、1.6ml、1.0ml，總量1000ml，放置116℃高壓滅菌20min。備用2.3.2增菌培養(yǎng)取上述菌株菌落少許，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)瓶中。37℃培養(yǎng)18h。取出后，實驗前用NS稀釋至10-5備用。
2.3.3實驗方法和結果體外抗菌活性MIC的測定(試管法)取18h培養(yǎng)的各菌株營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物。用營養(yǎng)肉湯(或NS)稀釋10-5用于實驗，取滅菌試管11支，于第1管加入營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基1.6ml，其余每管1ml。取清開靈滴眼液(200mg/ml)0.4ml加入第1管，混勻后取1ml至第2管，依次稀釋。第10管吸出1ml棄去。第11管不加藥液作為對照。每管加入菌液0.1ml。37℃培養(yǎng)20h。取出觀察MIC結果見表15(n＝2)表15清開靈滴眼液的體外抗菌活性(MIC)(n＝2)

實驗結果提示清開靈滴眼液對肺炎雙球菌、變形球菌、金黃色葡萄球菌-2、金黃色葡萄球菌-3、中葡萄球菌-2、表皮葡萄球菌、溶葡萄球菌、人葡萄球菌、標準金黃色葡萄球菌具有較好的抗菌活性。MIC為2.5-80mg/ml。
2.4、清開靈滴眼液的抗炎作用。
2.4.1清開靈滴眼液對醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增高的影響2.4.1.1實驗分組空白對照組等量NS雙黃連組 20ml/kg清開靈低劑量組0.2g/kg清開靈中劑量組0.4g/kg清開靈大劑量組0.8g/kg2.4.1.2試劑配制0.5％伊文思藍-NS溶液精密稱取伊文思藍0.15g，加NS30ml溶解混勻后用。
0.6％HAc-NS溶液(新鮮配制)精密吸取0.06mlHAc，加生理鹽水10ml混勻后用。
2.4.1.3實驗方法和結果取ICR小鼠50只，雌雄各半，體重18-22g，隨機分5組，每組10只。
(1)空白對照組等量NS(2)雙黃連組20ml/kg
(3)清開靈低劑量組0.2g/kg(4)清開靈中劑量組0.4g/kg(5)清開靈高劑量組0.8g/kg以上各組小鼠均灌胃給藥，給藥容量20ml/kg，1次/d*5d。末次給藥45min后，尾靜脈注入0.5％伊文思藍-NS溶液0.1ml/10g鼠重。隨即腹腔注入0.6％HAc溶液0.2ml/只。20min后，脫頸椎處死，剪腹部肌層一小口，用6mlNS分次洗滌腹腔，吸取洗滌液，合并。加生理鹽水10ml離心，離心10min.2000rpm。取上清液與590nm處測OD值，比較各組間差異。結果見表16表16 清開靈滴眼液對醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增高的影響

實驗結果所示清開靈滴眼液低、中、高劑量組均可降低醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增高的作用，與空白組比較具有顯著性差異，(P＜0.01)提示清開靈滴眼液具有較好的抗炎作用。
2.4.2、清開靈滴眼液對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響2.4.2.1實驗分組空白對照組等量NS雙黃連組 20ml/kg清開靈低劑量組0.2g/kg清開靈中劑量組0.4g/kg清開靈高劑量組0.8g/kg2.4.2.2實驗方法和結果取ICR小鼠50只，雌雄各半，體重18-22g，隨機分5組，每組10只。
(1)空白對照組等量NS(2)雙黃連組20ml/kg(3)清開靈低劑量組0.2g/kg(4)清開靈中劑量組0.4g/kg(5)清開靈高劑量組0.8g/kg
以上各組小鼠均灌胃給藥，給藥容量20ml/kg，1次/d*5d。末次給藥30min后，每組動物右耳兩側涂二甲苯30μl。45min后，脫頸椎處死小鼠，用8cm打孔器等面積取下右耳和左耳同一部位耳片，于電子分析天平上稱重，比較各組兩耳差值，計算腫脹抑制率(％)。結果見表17。
表17清開靈滴眼液對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

實驗結果所示清開靈滴眼液中劑量和高劑量組均可降低二甲苯致小鼠耳廓腫脹的作用，與空白組比較具有顯著性差異，(P＜0.05，P＜0.01)腫脹抑制率分別為25.6％和37.8％。提示清開靈滴眼液具有較好的抗炎作用。
二、動物急性毒性試驗----最大給藥量測定(MTD)清開靈滴眼液經口服一次給藥未測出小鼠的LD50，因此改做其最大給藥量(MTD)試驗。結果表明20只小鼠給藥后均無明顯的毒性反應，一周內亦無死亡。因此，清開靈滴眼液經口服一次給藥的小鼠最大給藥量為54.0g/kg，如按臨床成人每日口服劑量20mg/kg計算，該劑量相當于臨床成人一日口服劑量的2700倍。
1試驗目的清開靈滴眼液一次灌胃給藥的小鼠毒性反應。
2實驗材料2.1受試藥物清開靈滴眼液，棕褐色液體，金陵藥業(yè)股份有限公司技術中心提供，批號20050812。
2.2受試動物昆明種小鼠，體重18-22g，雌雄各半，由上海斯萊克實驗動物責任有限公司供給。合格證SCXK(滬)-2003-0003。
2.3實驗條件給藥前后，實驗小鼠用配合飼料(南京江寧青龍山動物繁殖場提供)喂養(yǎng)，自由飲水，室溫22±2℃，濕度50-70％。
3實驗方法和結果
3.1試驗方法經預試驗，未能測出清開靈滴眼液的LD50，故改做最大給藥量試驗。取健康昆明種小鼠40只。隨機分為兩組(1)清開靈滴眼液組；(4)空白對照組。實驗前禁食(不禁水)12小時后，清開靈滴眼液組用1.54g/ml(最大濃度)一次灌胃給藥，每次0.35ml/10g；空白對照組給予等量生理鹽水。連續(xù)觀察7天，記錄受試小鼠行為、活動、攝食量、體重、糞便、死亡等情況(見表18、19)，未死亡小鼠于7天后處死進行尸檢。
3.2試驗結果清開靈滴眼液組20只小鼠，給藥當天見小鼠毛色光滑、糞便為褐色，質地較稀軟，攝食、活動較少，第二天后小鼠活動、攝食量、體重增長、糞便等均恢復正常，與空白對照組比較無明顯差異；且7天內無死亡及其它異常發(fā)生，兩組同時處死后進行尸檢，各主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)經肉眼觀察未見異常改變，與空白對照組比較無明顯差異。
表18 清開靈滴眼液一次給藥對小鼠體重的影響(X±SD)

表19 清開靈滴眼液一次給藥小鼠死亡分布表


4毒性評價清開靈滴眼液灌胃給藥的最大給藥量試驗結果表明20只小鼠給藥后均無明顯的毒性反應，7天內亦無死亡。因此清開靈滴眼液灌胃給藥的小鼠最大給藥量為54.0g/kg。如按臨床成人每日口服劑量20mg/kg計算，則該藥的小鼠一日灌胃劑量給藥量為臨床成人一日口服量的2700倍。
三、清開靈滴眼液長期毒性試驗——家兔眼局部給藥一個月長期毒性試驗用清開靈滴眼液40mg/kg、80mg/kg和160mg/kg三個劑量組連續(xù)給家兔眼局部給藥一個月，給藥后，每天對家兔進行一般狀況觀察。一般觀察發(fā)現高劑量組家兔有給藥后暫時性的充血、偶有家兔稀便、自發(fā)活動減少等現象，其余各劑量組未見明顯異常反應?；謴推诟鲃┝拷M家兔自發(fā)活動良好，行動正常。給藥前、給藥一個月及恢復期的家兔體重顯示，三個劑量組家兔的體重增長正常，與對照組比較無差異(P＞0.05)。各組動物攝食量無明顯差異。
凝血時間檢查結果表明清開靈滴眼液給藥一個月，雄性家兔高劑量組凝血時間PT值較對照組明顯減小，雌性家兔高、中劑量組凝血時間PT值較對照組明顯減小，恢復期雄性家兔中劑量組凝血時間FIB值增高，高劑量組凝血時間PT值減小，雌性家兔中劑量組凝血時間PT值減小。除恢復期雄性家兔中劑量組凝血時間FIB值外其余各指標均在實驗室正常范圍內波動，其余指標無明顯差異。
血常規(guī)檢查結果表明清開靈滴眼液給藥一個月后，雄性家兔高、中劑量組紅細胞、高劑量組血紅蛋白含量較對照組明顯減少；雌性家兔高劑量組血紅蛋白及中性細胞含量較對照組明顯減少(P＜0.05，P＜0.01)。除恢復期雄性低劑量組單核細胞含量和雌性中劑量組單核細胞含量外其余各指標均在實驗室正常范圍內波動。其余各項指標無明顯差異。
血液生化檢查結果表明清開靈滴眼液給藥一個月后，雄性中劑量組BUN、TCH明顯升高，與對照組比較有顯著差異(P＜0.01)；雌性中劑量組TBIL、TP含量降低，高劑量組GLU含量升高，與對照組比較差異顯著(P＜0.01)?；謴推谛坌愿邉┝緼ST含量較高。除恢復期雄性高劑量AST含量外其余各指標均在本實驗室正常值范圍內，其余各項指標均未見明顯變化。
尿常規(guī)檢查，各項指標未見明顯異常。
給藥一個月及恢復期，清開靈滴眼液三個劑量組的臟器系數，與對照組比較無明顯差異(P＞0.05)。
尸檢及病理組織學檢查結果表明經清開靈滴眼液給藥一個月后，恢復期各家兔心、肝、脾、肺、腎、眼、消化道、神經系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等器官均未出現明顯的組織病理學改變，與對照組相比，結果無明顯差異。
四、清開靈滴眼液對兔多次眼刺激試驗目的觀察家兔眼睛多次接觸清開靈滴眼液后所產生的刺激反應情況和恢復情況1、實驗材料1.1實驗用藥物及試劑清開靈滴眼液由金陵藥業(yè)股份有限公司技術中心提供，批號20050822賦形劑由金陵藥業(yè)股份有限公司技術中心提供，與清開靈滴眼液所用賦形劑相同。
1.2實驗動物新西蘭白兔由南京青龍山動物繁殖廠提供，合格證號SCXK2002-00271.3實驗飼料全價顆粒飼料由江蘇協同醫(yī)藥技術有限責任公司提供，合格證號蘇A飼字2002(009)，批號0601101.4實驗條件新西蘭白兔，雌雄兼用。2.0kg-2.5kg，給藥前后分籠飼養(yǎng)，喂全價顆粒飼料，自由飲水，室溫20±2℃，濕度55-65％1.5實驗統(tǒng)計方法采用t檢驗1.6實驗分組與劑量1賦形劑組0.1ml/次，5次/日2清開靈滴眼液組0.1ml/次，5次/日2、實驗方法采用同體自身對照，每組家兔6只，體重2.0kg-2.5kg，每只眼睛滴入0.1ml，5次/日，清開靈滴眼液或賦形劑于家兔眼結膜囊內，另一側作空白對照。清開靈滴眼液或賦形劑滴入后，使眼睛被動閉合5-10s，觀察給藥后眼部局部反應情況，連續(xù)給藥7天。按表20的評分標準對角膜、虹膜和結膜分別進行評分，算出平均分值，并與同一動物的對照眼睛進行比較，記錄刺激反應消退及恢復的時間。
結果評價列表記錄各組各時間的角膜、虹膜和結膜的平均分值，以及眼刺激反應的綜合平均分值(三種平均分值的總和)。按表21評分標準，判斷藥物的眼刺激性，必要時，給予組織學檢查結果。
表20眼刺激反應評分

表21眼刺激性評價標準

實驗結果見表22、表23、表24、表25
表22清開靈滴眼液對家兔體重的影響(給藥期)

P＞0.05 與賦形劑組比較表23清開靈滴眼液對家兔體重的影響(恢復期)

P＞0.05 與賦形劑組比較表24清開靈滴眼液對眼刺激反應評分(給藥或賦形劑)

表25清開靈滴眼液對眼刺激反應評分

實驗結果表明1、清開靈滴眼液組連續(xù)點眼7天，未見對家兔體重有明顯影響，與賦形劑組比較未見有明顯差異。
2、賦形劑組連續(xù)點眼7天(右眼)，未見家兔角膜、虹膜和結膜有異常表現。停藥觀察7天，未見家兔眼睛有異常，提示賦形劑對家兔眼睛沒有明顯刺激性。
3、清開靈滴眼液組連續(xù)點眼7天(右眼)，未見家兔角膜、虹膜和結膜有異常表現。停藥觀察7天，未見家兔眼睛有異常，提示賦形劑對家兔眼睛沒有明顯刺激性。
4、病理組織學檢查結果所示給藥7天(1)賦形劑組結膜瞼結膜和球結膜結構清晰，結膜上皮排列整齊，無明顯變性、壞死，固有層內無明顯炎細胞浸潤，結膜下無明顯充血。
角膜各層結構完整，層次清晰，前上皮復層扁平上皮細胞排列整齊，無明顯變性、壞死及潰瘍形成；前界膜為透明均質膜，無明顯變薄或明顯增生；固有層膠原纖維排列整齊無損傷及瘢痕形成；后界膜為透明均質膜，無明顯變薄或明顯增生；后上皮的單層扁平上皮細胞無明顯變性、壞死，角膜緣血管無明顯充血及炎細胞浸潤。
虹膜各層結構完整，層次清晰，前緣層和上皮層細胞無明顯變性、壞死，基質內血管無明顯擴張充血及中性粒細胞及淋巴細胞浸潤。
鞏膜致密結締組織無損傷。
視網膜各層細胞形態(tài)清晰，無明顯變性壞死。
(2)清開靈滴眼液組結膜組織形態(tài)學與賦形劑組相同，瞼結膜和球結膜結構清晰，結膜上皮排列整齊，無明顯變性、壞死，固有層內無明顯炎細胞浸潤，結膜下無明顯充血。
角膜組織形態(tài)學與賦形劑組相同，各層結構完整，層次清晰，前上皮復層扁平上皮細胞排列整齊，無明顯變性、壞死及潰瘍形成；前界膜為透明均質膜，無明顯變薄或明顯增生；固有層膠原纖維排列整齊無損傷及瘢痕形成；后界膜為透明均質膜，無明顯變薄或明顯增生；后上皮的單層扁平上皮細胞無明顯變性、壞死，角膜緣血管無明顯充血及炎細胞浸潤。
虹膜組織形態(tài)學與賦形劑組相同，各層結構完整，層次清晰，前緣層和上皮層細胞無明顯變性、壞死，基質內血管無明顯擴張充血及中性粒細胞及淋巴細胞浸潤。
鞏膜組織形態(tài)學與賦形劑組相同，致密結締組織無損傷。
視網膜組織形態(tài)學與賦形劑組相同，各層細胞形態(tài)清晰，無明顯變性壞死。
恢復期(1)賦形劑組眼球各結構結膜、角膜、虹膜、鞏膜、視網膜與給藥7天相似，結構正常，無明顯損傷。
(2)清開靈滴眼液組眼球各結構結膜、角膜、虹膜、鞏膜、視網膜與給藥7天相似，結構正常，無明顯損傷。
結論給藥7天，與賦形劑組相比，給藥組對家兔眼組織的病理組織學改變無明顯差異，恢復期賦形劑組及給藥組均無明顯病理學改變，提示清開靈滴眼液對兔眼球無刺激性。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。
實施例1構成藥效組分的原料藥處方膽酸3.25g，珍珠母(粉)50g，豬去氧膽酸3.75g，梔子25g，水牛角(粉)25g，板藍根200g，黃芩苷5g，金銀花87.5g。
輔料處方依地酸二鈉5g，維生素C鈉10g，尼泊金甲酯2g，尼泊金丙酯1g。
共制成 1000瓶制備方法a.按處方取各原輔料備用；b.金銀花加金銀花12倍量的水，煎煮二次，每次0.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.12～1.13(70℃)，加乙醇使含醇量達75％，濾過，濾液調節(jié)pH值至8.0，冷藏，濾過，濾液回收乙醇并濃縮，至相對密度為1.14～1.15(70℃)，再加乙醇使含醇量達85％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加水，得金銀花提取液，冷藏備用。
c.板藍根加板藍根8倍量的水，煎煮二次，每次1小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.09～1.10(70℃)，加乙醇使含醇量達60％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加水，得板藍根提取液，冷藏備用。
d.梔子加梔子8倍量的水，煎煮二次，第一次1小時，第二次0.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.03～1.04(70℃)，加乙醇使含醇量達60％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加水，得梔子提取液，冷藏備用。
e.水牛角粉加水牛角粉8倍量的1mol/L氫氧化鋇溶液、珍珠母粉加珍珠母粉8倍量的1mol/L硫酸溶液，于85℃條件分別水解8小時，濾過，合并濾液，調節(jié)pH值至3.5～4.0，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.03～1.04(70℃)，加乙醇使含醇量達60％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加水，得水牛角與珍珠母水解混合液，冷藏備用。
f.將梔子提取液、板藍根提取液和水牛角與珍珠母水解混合液合并后，溶液濃縮至相對密度為1.05～1.06(70℃)，加到膽酸、豬去氧膽酸的75％乙醇溶液中，混勻，加乙醇使含醇量達75％，調節(jié)pH值至7.0，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加水，得混合溶液I，冷藏備用。
g.黃芩苷用注射用水溶解，調pH值至7.5，加入金銀花提取液，混勻，與上述各備用液合并，混勻，制得混合溶液II。
h.將上述混合溶液II補加適量注射用水，分別加入5g的依地酸二鈉、pH為7.38的沙氏磷酸鹽緩沖液、10g的維生素C鈉、2g的尼泊金甲酯和1g的尼泊金丙酯，加熱攪拌使溶解，加入2g的活性炭處理后，過濾，于濾液中加入適量甘露醇，攪拌使溶解，用注射用水定容至10000ml，調節(jié)甘露醇加入量使成等滲溶液，經0.22μm的微孔濾膜除菌濾過，分裝、加塞、加蓋，制得1000瓶，每瓶10ml。
實施例2構成藥效組分的原料藥處方膽酸4g，珍珠母(粉)45g，豬去氧膽酸3g，梔子20g，水牛角(粉)30g，板藍根210g，黃芩苷4g，金銀花90g。
輔料處方依地酸二鈉3g，維生素C鈉8g、尼泊金甲酯1g，尼泊金丙酯2g。
共制成 1000瓶制備方法
a.按處方取各原輔料備用；b.金銀花加金銀花重量10倍量的水，煎煮2次，每次0.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至70℃時相對密度為1.12～1.13，加乙醇使含醇量達75％，濾過，濾液調節(jié)pH值至7.5，冷藏，濾過，濾液回收乙醇并濃縮至70℃時相對密度為1.14～1.15，再加乙醇使含醇量達85％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加水，得金銀花提取液，冷藏備用；c.板藍根加板藍根重量9倍量的水，煎煮3次，每次0.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至70℃時相對密度為1.09～1.10，加乙醇使含醇量達55％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加水，得板藍根提取液，冷藏備用；d.梔子加梔子重量7倍量的水，煎煮3次，每次1小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至70℃時相對密度為1.03～1.04，加乙醇使含醇量達60％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加水，得梔子提取液，冷藏備用；e.水牛角粉加水牛角粉重量8倍量的1mol/L氫氧化鋇溶液、珍珠母粉加珍珠母粉重量7倍量的1mol/L硫酸溶液，于85℃條件分別水解9小時，濾過，合并濾液，調節(jié)pH值至3.5～4.0，濾過，濾液濃縮至70℃時相對密度為1.03～1.04，加乙醇使含醇量達55％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加水，得水牛角與珍珠母的水解混合液，冷藏備用；f.將梔子提取液、板藍根提取液和水牛角與珍珠母的水解混合液合并后，溶液濃縮至70℃時相對密度為1.05～1.06，加到膽酸、豬去氧膽酸的75％乙醇溶液中，混勻，加乙醇使含醇量達75％，調節(jié)pH值至7.0，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加水，得混合溶液I，冷藏備用；g.黃芩苷用注射用水溶解，調pH值至7.0，加入金銀花提取液，混勻，與上述混合溶液I合并，混勻，制得混合溶液II；h.將上述混合溶液II補加適量水，分別加入3g的依地酸二鈉、pH為7.38的沙氏磷酸鹽緩沖液、8g的維生素C鈉、1g的尼泊金甲酯和2g的尼泊金丙酯，加熱攪拌使溶解，加入1g的活性炭處理后，過濾，于濾液中加入適量甘露醇，攪拌使溶解，用注射用水定容至10000ml，調節(jié)甘露醇加入量使成等滲溶液，經0.22μm的微孔濾膜除菌濾過，分裝、加塞、加蓋，制得1000瓶，每瓶10ml。
實施例3構成藥效組分的原料藥處方
膽酸3g，珍珠母(粉)55g，豬去氧膽酸4g，梔子30g，水牛角(粉)20g，板藍根190g，黃芩苷6g，金銀花80g。
輔料處方依地酸二鈉4g，維生素C鈉15g，尼泊金甲酯0.5g，尼泊金丙酯2g。
共制成 1000瓶制備方法a.按處方取各原輔料備用；b.金銀花加金銀花重量14倍量的水，煎煮2次，每次1小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至70℃時相對密度為1.12～1.13，加乙醇使含醇量達80％，濾過，濾液調節(jié)pH值至8.5，冷藏，濾過，濾液回收乙醇并濃縮至70℃時相對密度為1.14～1.15，再加乙醇使含醇量達90％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加水，得金銀花提取液，冷藏備用；c.板藍根加板藍根重量7倍量的水，煎煮3次，每次0.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至70℃時相對密度為1.09～1.10，加乙醇使含醇量達65％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加水，得板藍根提取液，冷藏備用；d.梔子加梔子重量8倍量的水，煎煮2次，每次1小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至70℃時相對密度為1.03～1.04，加乙醇使含醇量達65％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加水，得梔子提取液，冷藏備用；e.水牛角粉加水牛角粉重量8倍量的1mol/L氫氧化鋇溶液、珍珠母粉加珍珠母粉重量8倍量的1mol/L硫酸溶液，于85℃條件分別水解8小時，濾過，合并濾液，調節(jié)pH值至3.5～4.0，濾過，濾液濃縮至70℃時相對密度為1.03～1.04，加乙醇使含醇量達60％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加水，得水牛角與珍珠母的水解混合液，冷藏備用；f.將梔子提取液、板藍根提取液和水牛角與珍珠母的水解混合液合并后，溶液濃縮至70℃時相對密度為1.05～1.06，加到膽酸、豬去氧膽酸的80％乙醇溶液中，混勻，加乙醇使含醇量達80％，調節(jié)pH值至6.5，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加水，得混合溶液I，冷藏備用；g.黃芩苷用注射用水溶解，調pH值至6.5，加入金銀花提取液，混勻，與上述混合溶液I合并，混勻，制得混合溶液II；h.將上述混合溶液II補加適量水，分別加入4g的依地酸二鈉、pH為7.38的沙氏磷酸鹽緩沖液、15g的維生素C鈉、0.5g的尼泊金甲酯和2g的尼泊金丙酯，加熱攪拌使溶解，加入3g的活性炭處理后，過濾，于濾液中加入適量甘露醇，攪拌使溶解，用注射用水定容至10000ml，調節(jié)甘露醇加入量使成等滲溶液，經0.22μm的微孔濾膜除菌濾過，分裝、加塞、加蓋，制得1000瓶，每瓶10ml。
權利要求
1.一種中藥滴眼液，其特征在于該滴眼液由治療有效量的藥效組分及輔料組成，其中構成藥效組分的原料藥處方與輔料處方中含有下列重量份的物質；構成藥效組分的原料藥處方膽酸3-4份，珍珠母(粉)45-55份，豬去氧膽酸3-4份，梔子20-30份，水牛角(粉)20-30份，板藍根190-210份，黃芩苷4-6份，金銀花80-90份；輔料處方依地酸二鈉2-8份、維生素C鈉5-25份、尼泊金甲酯0.5-3份，尼泊金丙酯0.5-3份。
2.根據權利要求1所述的中藥滴眼液，其特征在于該滴眼液中構成藥效組分的原料藥處方與輔料處方中含有下列重量份的物質構成藥效組分的原料藥處方膽酸3.25份，珍珠母(粉)50份，豬去氧膽酸3.75份，梔子25份，水牛角(粉)25份，板藍根200份，黃芩苷5份，金銀花87.5份；輔料處方依地酸二鈉5份、維生素C鈉10份、尼泊金甲酯2份和尼泊金丙酯1份。
3.如權利要求1或2所述的中藥滴眼液的制備方式，其特征在于該方法包括以下步驟a.按處方取各原輔料備用；b.金銀花加金銀花重量10-14倍量的水，煎煮2-3次，每次0.5-1小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至70℃時相對密度為1.12～1.13，加乙醇使含醇量達70-80％，濾過，濾液調節(jié)pH值至7.5-8.5，冷藏，濾過，濾液回收乙醇并濃縮至70℃時相對密度為1.14～1.15，再加乙醇使含醇量達80-90％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加適量水，得金銀花提取液，冷藏備用；c.板藍根加板藍根重量7-9倍量的水，煎煮2-3次，每次0.5-1.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至70℃時相對密度為1.09～1.10，加乙醇使含醇量達55-65％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加適量水，得板藍根提取液，冷藏備用；d.梔子加梔子重量7-9倍量的水，煎煮2-3次，每次0.5-1.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至70℃時相對密度為1.03～1.04，加乙醇使含醇量達55-65％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加適量水，得梔子提取液，冷藏備用；e.水牛角粉加水牛角粉重量7-9倍量的1mol/L氫氧化鋇溶液、珍珠母粉加珍珠母粉重量7-9倍量的1mol/L硫酸溶液，于85℃條件分別水解7-9小時，濾過，合并濾液，調節(jié)pH值至3.5～4.0，濾過，濾液濃縮至70℃時相對密度為1.03～1.04，加乙醇使含醇量達55-65％，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加適量水，得水牛角與珍珠母的水解混合液，冷藏備用；f.將梔子提取液、板藍根提取液和水牛角與珍珠母的水解混合液合并后，溶液濃縮至70℃時相對密度為1.05～1.06，加到膽酸、豬去氧膽酸的70-80％乙醇溶液中，混勻，加乙醇使含醇量達70-80％，調節(jié)pH值至6.5-7.5，冷藏，濾過，濾液回收至無醇，加適量水，得混合溶液I，冷藏備用；g.黃芩苷用注射用水溶解，調pH值至6.5-7.5，加入金銀花提取液，混勻，與上述混合溶液I合并，混勻，制得混合溶液II；h.將上述混合溶液II補加適量水，分別加入2-8份的依地酸二鈉、5-25份的維生素C鈉、0.5-3份的尼泊金甲酯和0.5-3份的尼泊金丙酯，加熱攪拌使溶解，用pH為7.38的沙氏磷酸鹽緩沖液調節(jié)pH為6.8-7.5，加入0.5-5份的活性炭處理后，過濾，于濾液中加入適量甘露醇，攪拌使溶解，加適量水定容，調節(jié)甘露醇加入量使成等滲溶液，經0.22μm的微孔濾膜除菌濾過，分裝即可。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種中藥滴眼液及其制備工藝。該中藥滴眼液由治療有效量的藥效組分及輔料組成，其中構成藥效組分的原料藥處方與輔料處方中含有下列重量份的物質構成藥效組分的原料藥處方為膽酸3－4份，珍珠母(粉)45－55份，豬去氧膽酸3－4份，梔子20－30份，水牛角(粉)20－30份，板藍根190－210份，黃芩苷4－6份，金銀花80－90份；輔料處方為依地酸二鈉2－8份、維生素C鈉5－25份、尼泊金甲酯0.5－3份，尼泊金丙酯0.5－3份。該中藥滴眼液使用方便，安全有效，其制備工藝簡單易行。
文檔編號A61K31/575GK1939456SQ200610096428
公開日2007年4月4日 申請日期2006年9月26日 優(yōu)先權日2006年9月26日
發(fā)明者謝俊, 楊俊 , 徐向陽, 蔡瑩, 孫燁, 張惠, 田麗娟, 夏云, 萬輝, 張慶曉 申請人:金陵藥業(yè)股份有限公司