專利名稱：一種生物活性肽及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物活性肽及其制備方法和在抗腫瘤方面的應用，該生物活性肽是一種來自海洋的、具有抗腫瘤活性的五元大環(huán)環(huán)酯肽。
背景技術：
海洋環(huán)肽大多來自海綿、海鞘、海藻和海兔等，其新穎的結構和顯著的生物活性引起了合成化學家和藥物化學家的極大興趣。然而，海洋環(huán)肽中多富含N-甲基氨基酸、含噻唑(啉)/噁唑(啉)雜壞的氨基酸及其它高度變異的氨基酸，這給合成化學家?guī)砗艽蟮穆闊?br> Obyanamide是Moore小組(Williams，P.G.；Yoshida，W.Y.；Moore，R.E.；Paul，V.J.J.Nat.Prod.2002，65，29-31.)從海洋藻青菌Lyngbyaconfervoides中分離到的一個結構新穎的環(huán)酯肽。其對KB和LoVo細胞的IC50值分別為0.58和3.14mg/mL，最初推定該活性肽的結構如下圖所示，立體絕對構型為(3S，10S，13S，23S，29S)。
然而，隨著對該活性物質的深入研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)上述推定的結構并不正確，該生物活性肽正確的立體絕對構型為(3R，10S，13S，23S，29S)。因此合成具有正確結構的生物活性肽對了解和進行活性肽類藥物的構效關系研究是非常重要的。另外由于天然產(chǎn)物的量過少，純化、分離、鑒定都較為困難，大大限制了海洋活性肽的活性研究進展。其中化學合成就是一種替代方法，因此發(fā)展一種有效的制備活性肽的方法是非常必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生物活性肽及其有效的制備方法和應用，它能為抗腫瘤藥物的研究提供足夠的原料和有效合成路線。
一種生物活性肽，其特征是它的分子式為C30H41N5O6S，立體絕對構型為(3R，10S，13S，23S，29S)，結構式為 上述的生物活性肽的制備方法，其特征是首先制備三肽醇使N-芐氧羰基L-苯丙氨酸在堿性條件下進行氮甲基化得到甲基化產(chǎn)物N-(芐氧羰基)-N-甲基苯丙氨酸，N-(芐氧羰基)-N-甲基苯丙氨酸與叔丁醇反應，所得的N-(芐氧羰基)-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯用鈀制劑催化氫解去除芐氧羰基保護基，隨后與N-(芐氧羰基)-N-甲基纈氨酸用縮合劑縮合得到二肽片段N-(芐氧羰基)-N-甲基纈氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯，該二肽片段用鈀制劑催化氫解去除芐氧羰基保護基，然后用縮合劑與(S)-2-芐氧基乳酸縮合得到三肽片段(2S，12S，18S)-O-(芐基)乳酰-N-甲基纈氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯，將該三肽片段用鈀制劑催化氫解去除芐醚保護基得三肽醇(2S，12S，18S)-乳酰-N-甲基纈氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯；再制備二肽酸以叔丁氧羰基保護(R)-2-氨基丁酸的氨基，將所得(R)-2-(N-叔丁氧羰基)氨基丁酸進行阿恩特-艾司特重氮化和武爾夫重排得(R)-3-(N-叔丁氧羰基)氨基戊酸甲酯，隨后去除叔丁氧羰基保護基并與2-[1-(叔丁氧羰基氨基)乙基]噻唑-4-甲酸縮合得相應的二肽酸甲酯，在堿液中水解該二肽酸甲酯得到二肽酸N-叔丁氧羰基-2-噻唑丙氨酰-(R)-3-氨基戊酸；然后將上述三肽醇與二肽酸在2，4，6-三氯苯甲酰氯及N，N-二甲基-4-甲氨基吡啶催化下進行酯化偶連反應，得到線型五肽N-叔丁氧羰基-2-噻唑丙氨酰-(R)-3-氨基戊酰-乳酰-N-甲基纈氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯；最后以三氟乙酸脫除線形五肽的叔丁氧羰基保護基和叔丁酯保護基，并環(huán)合得到本發(fā)明的化合物生物活性肽。
本發(fā)明提供了一種生物活性肽有效的制備方法和應用，它能為抗腫瘤藥物的研究提供足夠的原料和有效的合成路線，制備中綜合使用多種有效的縮合劑以及阿恩特-艾司特重氮化和武爾夫重排反應等，有效地縮短了合成路線，制備方法簡便，條件易于控制，具有一定的通用性，可用于合成具有與本發(fā)明生物活性肽相似的結構的其它肽類化合物，為藥物篩選和進一步的構效關系研究等提供結構不同的多種化合物。


附圖1為立體構型為(3S，10S，13S，23S，29S)的Obyanamide與天然產(chǎn)物碳譜化學位移的差值圖。
附圖2為立體構型為(3R，10S，13S，23S，29S)的Obyanamide 1a與天然產(chǎn)物碳譜化學位移的差值圖。
具體實施例方式
本發(fā)明的生物活性肽Obyanamide 1a的制備方法包括以下步驟1.三肽醇(2S，12S，18S)-乳酰-N-甲基纈氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯(HO-Lac-MeVal-MePhe-OtBu)的制備，其具體步驟如下所示 首先使芐氧羰基(Z)苯丙氨酸在堿性條件下進行氮甲基化。操作時將2.99g(10.0mmol)芐氧羰基苯丙氨酸(Z-Phe-OH)、5.0mL(80.0mmol)CH3I溶于30mL無水四氫呋喃(THF)并降溫至0℃，劇烈攪拌下分批加入1.20g(30.0mmol)NaH(重量百分濃度為60％)，加畢使其自然升至室溫，并繼續(xù)攪拌24h。薄層層析(TLC)顯示反應結束后，滴加少許冰水破壞過量的NaH，然后減壓蒸去四氫呋喃。將殘余物溶于200mL蒸餾水中，并用正己烷洗滌三次，每次用20mL。水層用鹽酸調(diào)pH＝1后，以乙酸乙酯萃取5次，每次乙酸乙酯的體積為40mL。合并萃取液并用10％(重量百分比)的Na2S2O3水溶液洗三次，每次20mL，再用飽和食鹽水20mL洗滌一次后，使乙酸乙酯有機層濃縮得N-(芐氧羰基)-N-甲基苯丙氨酸(Z-MePhe-OH)2.87g，收率91.7％。
然后以叔丁醇將Z-MePhe-OH酯化。操作時將3.13g(10.0mmol)Z-MePhe-OH溶于60mL二氯甲烷，攪拌下加入叔丁醇28mL并降溫至0℃。依次加入2.88g(15.0mmol)1-[3-二甲基氨基]丙基-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[EDC·HCl，1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide hydrochloride]和0.61g(5.0mmol)N，N-二甲基-4-甲氨基吡啶(DMAP)。2h后使其自然升至室溫并繼續(xù)攪拌20h。將減壓濃縮后的殘余物溶于250mL乙酸乙酯，并用10％檸檬酸水溶液洗滌三次，每次25mL，然后用5％NaHCO3水溶液洗滌三次，每次25mL，再用飽和食鹽水洗滌三次，每次25mL。將乙酸乙酯有機層干燥濃縮進行硅膠柱層析，用乙酸乙酯-石油醚(二者的體積比為1∶8)進行洗脫得N-(芐氧羰基)-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯(Z-MePhe-OtBu)3.14g，收率85.1％。
接著用鈀制劑催化氫解去除芐氧羰基保護基，所得氫解產(chǎn)物與N-(芐氧羰基)-N-甲基纈氨酸縮合得到二肽片段。操作時將739mg(2.0mmol)Z-MePhe-OtBu溶于3mL乙酸乙酯并加入0.2mmol的鈀-碳于常溫常壓下進行氫解，TLC顯示2h反應完畢。用硅藻土助濾除去鈀-碳，并用乙酸乙酯淋洗濾餅三次，每次5mL。濾液合并后濃縮，經(jīng)真空干燥4h后將濃縮物溶于5mL二氯甲烷，然后與N-(芐氧羰基)-N-甲基纈氨酸(Z-MeVal-OH)縮合，即將531mg(2.0mmol)Z-MeVal-OH加入到上述二氯甲烷溶液中后降溫至0℃，依次加入EDC·HCl 460mg(2.4mmol)、327mg(2.4mmol)1-羥基苯并三氮唑(HOAt)。在0℃下反應2h后使其自然升至室溫并繼續(xù)攪拌18h。減壓濃縮去二氯甲烷，將殘余物溶于100mL乙酸乙酯，并用10％檸檬酸水溶液洗滌三次，每次25mL，然后用5％NaHCO3水溶液洗滌三次，每次25mL，再用飽和食鹽水洗滌三次，每次25mL。將乙酸乙酯有機層干燥濃縮進行硅膠柱層析，用乙酸乙酯-石油醚(二者的體積比為1∶8)進行洗脫得得二肽片段無色油狀物N-(芐氧羰基)-N-甲基纈氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯(Z-MeVal-MePhe-OtBu)750mg，收率77.7％。
所得二肽片段催化氫解去除芐氧羰基保護基，然后與(S)-2-芐氧基乳酸縮合得到三肽片段。操作時將965mg(2.0mmol)Z-MeVal-MePhe-OtBu溶于5mL乙酸乙酯并以10％(重量百分比，下同)鈀-碳氫解反應2h。以硅藻土助濾去除鈀碳，用乙酸乙酯淋洗濾餅3次，每次5mL。將所得濾液濃縮并真空干燥4h后，將濃縮物溶于5mL二氯甲烷，加入360mg(2.0mmol)(S)-2-芐氧基乳酸(BnO-Lac-OH)后降溫至0℃。依次加入EDC·HCl 460mg(2.4mmol)、HOAt 327mg(2.4mmol)。在0℃下反應2h后使反應體系自然升至室溫，繼續(xù)攪拌12h。TLC顯示反應結束后，將殘余物溶于100mL乙酸乙酯并用10％檸檬酸水溶液洗滌三次，每次25mL，然后用5％NaHCO3水溶液洗滌三次，每次25mL，再用飽和食鹽水洗滌三次，每次25mL。將乙酸乙酯有機層干燥濃縮進行硅膠柱層析，用乙酸乙酯-石油醚(二者的體積比為1∶5)得無色油狀物(2S，12S，18S)-O-(芐基)乳酰-N-甲基纈氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯(BnO-Lac-MeVal-MePhe-OtBu)950mg，收率93.0％。
再次催化氫解去除芐醚保護基即得三肽醇。操作時將709mgBnO-Lac-MeVal-MePhe-OtBu溶于5mL乙酸乙酯，加入0.01mmol鈀-碳于常溫常壓下進行氫解4h后反應完畢。以硅藻土助濾去除鈀-碳并以乙酸乙酯淋洗濾餅3次，每次5mL，將所得濾液濃縮并真空干燥后得白色蠟狀固體三肽醇(2S，12S，18S)-乳酰-N-甲基纈氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯572mg，收率98.0％。三肽醇的結構表征如下遷移值為Rf＝0.39(1乙酸乙酯∶石油醚)；比旋光度為[a]D20=]]>-103.8]]>(c＝1.0，CH3OH)；核磁共振氫譜數(shù)據(jù)為1H NMR(600MHz，CDCl3)d0.75(d，J＝6.8Hz，3H，H-14)，0.94(d，J＝6.8Hz，3H，H-15)，1.05(d，J＝6.4Hz，3H，H-19)，1.47(s，9H，C(CH3)3)，2.27-2.31(m，1H，H-13)，2.33(s，3H，N-CH3)，2.79(s，3H，N-CH3)，2.39-2.97(m，1H，H-3a)，3.39(dd，J＝4.6，15.1Hz，1H，H-3b)，3.63(br，1H，Lac OH)，4.27-4.31(m，1H，-18)，4.99(d，J＝10.5Hz，1H，H-12)，5.52(dd，J＝4.1，11.9Hz，1H，H-2)，7.16-7.33(m，5H，Ar H)；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)為13C NMR(CDCl3)d17.8(C-14)，19.6(C-15)，20.9(C-19)，27.9(C(CH3)3)，29.0(C-13)，29.5(N-CH3)，31.4(N-CH3)，34.2(C-3)，57.8(C-2)59.0(C-12)，64.3(C-18)，82.0(C(CH3)3)，126.6(C-7)，128.8and 129.4(C-5，C-6，C-8and C-9)，137.1(C-4)，169.5，169.6and 175.3(C＝0×3)；質譜數(shù)據(jù)為ESI-MS(m/z)calcd.M＝420.3，[M-H]-＝419.3，found 421.0，420.0。
2.二肽酸甲酯N-叔丁氧羰基-2-噻唑丙氨酰-(R)-3-氨基戊酸甲酯[Boc-Ala(Thz)-(R)-Apa-OMe]的制備，其反應步驟如下所示 將451mg(1.5mmol)N-叔丁氧羰基-2-噻唑丙氨酰乙酯[Boc-Ala(Thz)-OEt]溶于4mL THF、1mL MeOH和2mL H2O的混合液中并降溫至0℃。向上述溶液中加入一水合氫氧化鋰126mg(3.0mmol)，并于20min后撤去冰浴。TLC顯示原料消失后，將溶液減壓濃縮并以40mL飽和食鹽水稀釋。所得水溶液用鹽酸調(diào)pH＝2~3后，以乙酸乙酯萃取5次，每次20mL。將萃取液合并濃縮真空干燥后得2-[1-(叔丁氧羰基氨基)乙基]噻唑-4-甲酸(也可以命名為N-叔丁氧羰基-2-噻唑丙氨酸，Boc-Ala(Thz)-OH)備用。
然后以(R)-2-氨基丁酸為原料，以叔丁氧羰基保護氨基，接著進行阿恩特-艾司特(Arndt-Eistert)重氮化和武爾夫(Wolff)重排，得(R)-3-氨基戊酸甲酯，去除芐氧羰基保護基，并與Boc-Ala(Thz)-OH縮合得相應的二肽酸甲酯。操作中將347mg(1.5mmol)(R)-3-(N-叔丁氧羰基)氨基戊酸甲酯[Boc-(R)-Apa-OMe]溶于1.5mL二氯甲烷，降溫至0℃后，向其中緩緩滴入三氟乙酸(TFA)1.5mL。15min后撤去冰浴使其自然升至室溫。1.5h后TLC顯示原料消失。低溫下減壓濃縮，將所得殘余物溶于2mL二氯甲烷后再次濃縮。如此操作3次并將之在高真空下干燥4h，然后溶于5mL二氯甲烷。加入2-[1-(叔丁氧羰基氨基)乙基]噻唑-4-甲酸(Boc-Ala(Thz)-OH)后將溶液降溫至0℃。依次加入288mg(1.5mmol)EDC·HCl、204mg(1.5mmol)HOAt、524mL(3.0mmol)二異丙基乙基胺(DIPEA)。反應液保持0℃，2h后撤去冰浴使之自然升至室溫并繼續(xù)攪拌6h。TLC顯示反應結束后，以80mL乙酸乙酯稀釋反應液并用10％檸檬酸水溶液洗滌三次，每次25mL，然后用5％NaHCO3水溶液洗滌三次，每次25mL，再用飽和食鹽水洗滌三次，每次25mL。將乙酸乙酯有機層干燥濃縮進行硅膠柱層析，用乙酸乙酯-石油醚(二者的體積比為1∶5)得無色油狀物二肽酸甲酯N-叔丁氧羰基-2-噻唑丙氨酰-R-3-氨基戊酸甲酯[Boc-Ala(Thz)-(R)-Apa-OMe]566mg，收率98.1％。二肽酸甲酯的結構表征如下遷移值為Rf＝0.30(EtOAc-petroleum ether＝1∶1)；比旋光度為[a]29D＝-24.5(c0.28，MeOH)；核磁共振氫譜數(shù)據(jù)為1H NMR(600MHz，CDCl3)d 0.98(t，J＝7.3Hz，3H，H-5)，1.47(s，9H，tBu)，1.62(d，J＝6.6Hz，3H，H-11)，1.67-1.73(m，2H，H-4)，2.64(dd，J＝16.1，5.9Hz，1H，H-2a)，2.67(dd，J＝15.8，5.5Hz，1H，H-2b)，3.70(s，3H，CO2CH3)，4.32-4.38(m，1H，H-3)，5.08(br，1H，H-10)，5.14(br，1H，NH)，7.64(d，J＝8.8Hz，1H，NH)，8.00(s，1H，H-8)；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)為13C NMR(CDCl3)d10.7(C-5)，21.6(C-11)，27.3(C-4)，28.3((CH3)3COC＝O)，38.4(C-2)，47.5(C-3)，48.7(C-10)，51.7(CO2CH3)，80.3((CH3)3COC＝O)，123.0(C-8)，149.9(C-7)，155.0，160.6，171.9 and 174.0(4quat.C)；高分辨質譜數(shù)據(jù)為HRESIMScalcd for C17H27N3O5SNa[M+Na]+408.1569，found 408.1586。
3.生物活性肽Obyanamide 1a的制備，具體步驟如下所示 將88mg(0.23mmol)二肽酸甲酯Boc-Ala(Thz)-(R)-Apa-OMe脫去甲酯并真空干燥后得到二肽酸，然后溶于2mL無水四氫呋喃。攪拌下依次注入156mLDIPEA和105mL 2，4，6-三氯苯甲酰氯。反應5hTLC顯示原料消失后，在氬氣保護下將THF減壓蒸除，將殘余物迅速溶于2mL無水甲苯，依次加入84mg(0.20mmol)三肽醇HO-Lac-MeVal-MePhe-OtBu、110mg DMAP，反應4h后TLC顯示反應結束。以20mL乙酸乙酯稀釋反應液并用10％檸檬酸水溶液洗滌三次，每次2mL，然后用5％NaHCO3水溶液洗滌三次，每次2mL，再用飽和食鹽水洗滌三次，每次2mL。將含有乙酸乙酯的有機層干燥濃縮進行硅膠柱層析，用乙酸乙酯-石油醚(二者的體積比為1∶5)得白色泡狀固體線型五肽N-叔丁氧羰基-2-噻唑丙氨酰-R-3-氨基戊酰-乳酰-N-甲基纈氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯[Boc-Ala(Thz)-(R)-Apa-Lac-MeVal-MePhe-OtBu]146mg，收率94.2％。線型五肽的結構表征如下遷移值為Rf＝0.11(EtOAc-petroleum ether＝3∶2)；比旋光度為[a]27D＝-96.6(c 0.15，MeOH)，核磁共振氫譜數(shù)據(jù)為為1H NMR(CDCl3，one main rotamer)d 0.77(d，J＝6.5Hz，3H，H-14)，0.91(d，J＝6.2Hz，3H，H-15)，0.95(t，J＝7.4Hz，3H，H-24)，1.15(d，J＝6.6Hz，3H，H-19)，1.46(s，9H，tBu)，1.47(s，9H，Boc)，1.49(d like，overlaped，3H，H-30)，1.56-1.65(m，2H，H-23)，2.23-2.28(m，1H，H-13)，2.44(s，3H，N-CH3)，2.64-2.76(dd and dd like，overlaped，2H，H-21a and H-21b)，2.79(s，3H，N-CH3)，2.90-2.95(m，1H，H-3a)，3.38(dd，J＝15.0，4.4Hz，1H，H-3b)，4.33-4.38(m，1H，H-22)，4.95(d，.J＝10.6Hz，1H，H-12)，5.05-5.11(m，overlaped，2H，H-29 and H-18)，5.53(dd，J＝12.0，4.0Hz，1H，H-2)，7.17-7.28(m，5H，Ar H)，7.82(d，J＝8.8Hz，1H，22-NH)，8.00(s，1H，H-27)；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)為為13C NMR(CDCl3，one main rotamer)d 10.7(C-24)，16.1(C-19)，17.8(C-15)，19.7(C-14)，21.5(C-30)，26.8(C-13)，27.2(C-23)，28.0((CH3)3C)，28.3((CH3)3COC＝O)，29.2(N-CH3)，31.4(N-CH3)，34.3(C-3)，38.3(C-21)，47.6(C-22)，48.7(C-29)，57.6(C-12)，58.3(C-2)，67.0(C-18)，80.3((CH3)3COC＝O)，81.9((CH3)3COC＝O)，122.9(C-27)，126.6(C-7)，128.4 and 128.8(C-5，C-6，C-8 and C-9)，137.2(C-4)，150.1(C-26)，154.9，160.6，169.6，170.0，170.8(quat.C)；高分辨質譜數(shù)據(jù)為HRESIMScalcd for C39H59N5O9SNa[M+Na]+796.3931，found 796.3962。
然后以三氟乙酸脫除保護基叔丁氧羰基和叔丁酯保護基并環(huán)合得到本發(fā)明的化合物生物活性肽。具體操作時，將65.0mg(0.084mmol)線型五肽溶于0.5mL二氯甲烷并降溫至0℃，向其中緩緩加入0.5mL TFA。20min后撤去冰浴并在室溫下繼續(xù)攪拌4h。TLC顯示反應結束后，低溫下將反應液減壓濃縮至干。將殘余物溶于1mL二氯甲烷后再次濃縮。如此操作3次，并將濃縮物在高真空下干燥4h后溶于170mL無水THF(濃縮物的濃度為5×10-4mol/L)并降溫至0℃。依次加入96mg O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-O)-N，N，N’，N’-四甲基脲六磷酸酯[HATU，2-(azobenzotriazolyl-1-oxy)-N，N，N’，N’-tetramethyluronium hexafluoroborate]和117mL DIPEA。4h后撤去冰浴使之自然恢復至室溫并繼續(xù)攪拌3d。減壓濃縮去四氫呋哺，并將殘余物溶于20mL乙酸乙酯，反應液用10％檸檬酸水溶液洗滌三次，每次2mL，然后用5％NaHCO3水溶液洗滌三次，每次2mL，再用飽和食鹽水洗滌三次，每次2mL。將含有乙酸乙酯有機層干燥濃縮進行硅膠柱層析，用氯仿-甲醇(二者的體積比開始為150∶1然后梯度遞增到60∶1)洗脫后，再以SephadexLH-20純化，(流動相為氯仿-甲醇，二者的體積之比為1∶1)純化得白色固體即為本發(fā)明的化合物生物活性肽，亦稱為Obyanamide 1a 29.3mg，收率58.1％。該生物活性肽Obyanamide 1a的結構表征如下遷移值為Rf＝0.45(CHCl3-MeOH＝20∶1)；比旋光度為[a]27D＝+22.2(c 0.07，MeOH)；核磁共振氫譜數(shù)據(jù)為1H NMR(CDCl3)d 0.50(d，J＝6.4Hz，3H，H-25)，0.86(d，J＝6.9Hz，3H，H-26)，1.07(t，J＝7.3Hz，3H，H-5)，1.24(d，J＝6.8Hz，3H，H-30)，1.43(d，J＝6.9Hz，3H，H-11)，1.61-1.69(m，2H，H-4)，2.28-2.34(m，1H，H-24)，2.41(dd，J＝11.9，2.8Hz，1H，H-2a)，2.79(dd，J＝11.9，5.0Hz，1H，H-2b)，2.90(dd，J＝13.7，6.4Hz，1H，H-14a)，3.13(s，3H，H-27)，3.14(s，3H，H-21)，3.28(dd，J＝13.7，8.2Hz，1H，H-14b)，4.40-4.46(m，1H，H-3)，5.04-5.07(m，overlaped，1H，H-10)，5.07(d，J＝10.1Hz，1H，H-23)，5.20(q，J＝6.8Hz，1H，H-29)，5.45(t like，J＝8.2，6.9Hz，1H，H-13)，7.08(t，J＝7.3Hz，1H，H-18)，7.17(d，J＝7.8Hz，1H，H-16 and H-20)，7.19-7.22(dd like，2H，H-17 and H-19)，7.94(d，J＝6.0Hz，1H，10-NH)，8.02(s，1H，H-8)，9.14(d，J＝10.1Hz，1H，3-NH)；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)為13C NMR(CDCl3)d 11.2(C-5)，15.8(C-30)，18.5(C-25 and C-26)，24.1(C-11)，25.9(C-4)，27.4(C-24)，29.0(C-21)，29.8(C-27)，37.0(C-14)，38.8(C-2)，47.3(C-3)，48.0(C-10)，57.8(C-23)，60.7(C-13)，67.5(C-29)，123.1(C-8)，127.0(C-18)，128.7(C-16 and C-20)，129.1(C-17 and C-19)，136.3(C-15)，148.6(C-7)，160.4(C-6)，168.0(C-12)，169.5(C-9)，169.9(C-22)，170.3(C-1)，172.9(C-28)；高分辨質譜數(shù)據(jù)為HRESIMS calcd for C30H42N5O6S[M+H]+600.2856，found 600.2875。
本發(fā)明中所述的催化氫解的鈀制劑為鈀-碳或氫氧化鈀。所述的與N-(芐氧羰基)-N-甲基纈氨酸縮合用的縮合劑為N，N-二環(huán)己基亞胺、1-[3-二甲氨基]-丙基-3-乙基碳二酰亞胺鹽酸鹽或7-氮雜苯并唑-1-基-氧(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸鹽。所述的在堿液中水解得到二肽酸的堿液為氫氧化鈉或氫氧化鋰水溶液，二肽片段與堿的摩爾比范圍為1∶1~1∶2。所述的三肽醇與二肽酸進行酯化偶連反應時摩爾比為1∶1.2~1∶5.0。
本發(fā)明的生物活性肽Obyanamide 1a的結構如下式所示 為了進一步確定本發(fā)明所合成的生物活性肽的立體絕對構型為(3R，10S，13S，23S，29S)，本發(fā)明人也合成了立體絕對構型為(3S，10S，13S，23S，29S)的Obyanamide環(huán)肽，兩者的制備方法相同，只在合成二肽酸的過程中后者采用(S)-2-氨基丁酸為原料，而本發(fā)明的生物活性肽Obyanamide 1a采用(R)-2-氨基丁酸為原料。合成的Obyanamide環(huán)肽的結構表征如下遷移值為Rf＝0.46(CHCl3∶MeOH＝20∶1)；比旋光度為[a]D28＝-96.3(c＝0.06，MeOH)；核磁共振氫譜數(shù)據(jù)為1H NMR(600MHz，CDCl3)d0.59(d，J＝6.6Hz，3H，H-25)，0.88(d，J＝6.6Hz，3H，H-26)，1.02(t，J＝7.3Hz，3H，H-5)，1.46(d，J＝6.6Hz，3H，H-11)，1.50(d，J＝6.6Hz，3H，H-30)，1.69-1.77(m，1H，H-4a)，1.94-2.01(m，1H，H-4b)，2.26-2.31(m，1H，H-24)，2.74(dd，J＝4.4，16.5Hz，1H，H-2a)，2.80-2.84(m，2H，H-2b and H-14a，overl aped)，3.08(s，3H，H-21)，3.21(s，3H，H-27)，3.44(dd，J＝8.8，13.6Hz，1H，H-14b)，4.10-4.15(m，1H，H-3)，5.02(d，J＝10.6Hz，1H，H-23)，5.16(dd，J＝5.8，8.8Hz，1H，H-13)，5.31-5.35(m，1H，H-10)，5.42(q，J＝7.0Hz，1H，H-29)，7.15-7.25(m，5H，Ar H)，7.96(s，1H，H-8)，8.00(d，J＝7.7Hz，1H，10-NH)，8.82(d，J＝9.1Hz，1H，3-NH)；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)為13C NMR(150MHz，CDCl3)d11.4(C-5)，16.2(C-30)，18.7(C-26)，18.9(C-25)，23.3(C-11)，27.57(C-24)，27.61(C-4)，29.0(C-21)，30.1(C-27)，36.4(C-14)，37.7(C-2)，46.6(C-10)，47.8(C-3)，57.2(C-23)，60.9(C-13)，67.4(C-29)，122.3(C-8)，127.0(C-18)，128.7(C-17 and C-19)，129.4(C-16 and C-20)，136.3(C-15)，150.4(C-7)，160.4(C-6)，167.2(C-12)，168.9(C-9)，170.0(C-1)，170.4(C-22)，171.9(C-28)；高分辨質譜數(shù)據(jù)為HRESIMS calcd.[M+Na]+622.2675.found622.2665。
將合成的Obyanamide環(huán)肽的譜圖數(shù)據(jù)和本發(fā)明的生物活性肽Obyanamide1a與天然產(chǎn)物的碳譜比較，如附圖所示，其中圖1為(3S，10S，13S，23S，29S)Obyanamide環(huán)肽與天然產(chǎn)物碳譜化學位移的差值，圖2為(3R，10S，13S，23S，29S)Obyanamide 1a與天然產(chǎn)物碳譜化學位移的差值，標準值為天然產(chǎn)物的化學位移值。由附圖1可以看出Obyanamide與天然產(chǎn)物碳譜化學位移值的相差無較大，由附圖2可以看出Obyanamide 1a與天然產(chǎn)物碳譜化學位移值的相差無幾，由此可見天然產(chǎn)物的真實立體絕對構型應為(3R，10S，13S，23S，29S)，即為本發(fā)明的生物活性肽Obyanamide 1a。
生物活性肽Obyanamide 1a抗腫瘤生物活性體外篩選試驗篩選方法采用四氮唑鹽(MTT)還原法和磺酰羅丹明B(SRB)蛋白染色法，所用的腫瘤細胞株包括LOVO(大腸癌細胞株)、KB(鱗癌細胞株)和HL-60(白血病細胞株)，作用時間均為72h。本發(fā)明的生物活性肽Obyanamide 1a對上述各腫瘤細胞株的抑制率如下表所示。各表中均給出本發(fā)明的生物活性肽的濃度與各腫瘤細胞株生長抑制率之間的關系。
對LOVO腫瘤細胞生長的抑制率

對KB腫瘤細胞生長的抑制率

對HL-60*腫瘤細胞生長的抑制率

本發(fā)明的生物活性肽Obyanamide 1a對各腫瘤細胞株的的抑制率IC50值分別為6.8mM(LOVO)，6.7mM(KB)，19.0mM(HL-60*)，均具有較強的抗腫瘤活性。
權利要求
1.一種生物活性肽，其特征是它的分子式為C30H41N5O6S，立體絕對構型為(3R，10S，13S，23S，29S)，結構式為
2.權利要求1所述的生物活性肽的制備方法，其特征是首先制備三肽醇使N-芐氧羰基L-苯丙氨酸在堿性條件下進行氮甲基化得到甲基化產(chǎn)物N-(芐氧羰基)-N-甲基苯丙氨酸，N-(芐氧羰基)-N-甲基苯丙氨酸與叔丁醇反應，所得的N-(芐氧羰基)-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯用鈀制劑催化氫解去除芐氧羰基保護基，隨后與N-(芐氧羰基)-N-甲基纈氨酸用縮合劑縮合得到二肽片段N-(芐氧羰基)-N-甲基纈氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯，該二肽片段用鈀制劑催化氫解去除芐氧羰基保護基，然后用縮合劑與(S)-2-芐氧基乳酸縮合得到三肽片段(2S，12S，18S)-O-(芐基)乳酰-N-甲基纈氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯，將該三肽片段用鈀制劑催化氫解去除芐醚保護基得三肽醇(2S，12S，18S)-乳酰-N-甲基纈氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯；再制備二肽酸以叔丁氧羰基保護(R)-2-氨基丁酸的氨基，將所得(R)-2-(N-叔丁氧羰基)氨基丁酸進行阿恩特-艾司特重氮化和武爾夫重排得(R)-3-(N-叔丁氧羰基)氨基戊酸甲酯，隨后去除叔丁氧羰基保護基并與2-[1-(叔丁氧羰基氨基)乙基]噻唑-4-甲酸縮合得相應的二肽酸甲酯，在堿液中水解該二肽酸甲酯得到二肽酸N-叔丁氧羰基-2-噻唑丙氨酰-(R)-3-氨基戊酸；然后將上述三肽醇與二肽酸在2，4，6-三氯苯甲酰氯及N，N-二甲基-4-甲氨基吡啶催化下進行酯化偶連反應，得到線型五肽N-叔丁氧羰基-2-噻唑丙氨酰-(R)-3-氨基戊酰-乳酰-N-甲基纈氨酰-N-甲基苯丙氨酸叔丁酯；最后以三氟乙酸脫除線形五肽的叔丁氧羰基保護基和叔丁酯保護基，并環(huán)合得到本發(fā)明的化合物生物活性肽。
3.如權利要求2所述生物活性肽的制備方法，其特征是所述的鈀制劑為鈀-碳或氫氧化鈀。
4.如權利要求2所述的生物活性肽的制備方法，其特征是所述的與N-(芐氧羰基)-N-甲基纈氨酸縮合用的縮合劑為N，N-二環(huán)己基亞胺、1-[3-二甲氨基]-丙基-3-乙基碳二酰亞胺鹽酸鹽或7-氮雜苯并唑-1-基-氧(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸鹽。
5.如權利要求2所述生物活性肽的制備方法，其特征是所述的在堿液中水解得到二肽酸的堿液為氫氧化鈉或氫氧化鋰的水溶液，二肽片段與堿的摩爾比范圍為1∶1～1∶2。
6.如權利要求2所述生物活性肽的制備方法，其特征是所述的三肽醇與二肽酸進行酯化偶連反應時的摩爾比為1∶1.2～1∶5.0。
7.權利要求1所述的生物活性肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
一種生物活性肽及其制備方法和應用，制備時先制備三肽醇，再制備二肽酸，然后將三肽醇與二肽酸在2，4，6－三氯苯甲酰氯及N，N－二甲基－4－甲氨基吡啶催化下進行酯化偶連反應，得到線型五肽N－叔丁氧羰基－2－噻唑丙氨酰－(R)－3－氨基戊酰－乳酰－N－甲基纈氨酰－N－甲基苯丙氨酸叔丁酯；最后以三氟乙酸脫除線形五肽的叔丁氧羰基保護基和叔丁酯保護基，并環(huán)合得到本發(fā)明的化合物生物活性肽。本發(fā)明能為抗腫瘤藥物的研究提供足夠的原料和有效的合成路線，制備方法簡便，條件易于控制，具有一定的通用性，為藥物篩選和進一步的構效關系研究等提供結構不同的多種化合物。
文檔編號A61K38/07GK1919865SQ20061006844
公開日2007年2月28日 申請日期2006年8月29日 優(yōu)先權日2006年8月29日
發(fā)明者李英霞, 張偉, 李春霞, 王鵬 申請人:中國海洋大學