專(zhuān)利名稱(chēng)：可用于靜脈途徑給藥的硫酸軟骨素及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基本不含雜質(zhì)的高純度硫酸軟骨素及其制備方法，以及含有該硫酸軟骨素作為有效成分用于靜脈途徑給藥的制劑。
背景技術(shù)：
硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate，CS)是哺乳動(dòng)物結(jié)締組織的主要成分之一，主要分布于軟骨、骨、肌腱、韌帶、肌膜和血管壁中，屬于大分子酸性粘多糖類(lèi)，工業(yè)上常以豬、牛、羊等動(dòng)物的軟骨組織和鯊魚(yú)等水產(chǎn)品的軟骨為原材料，利用生化提取工藝技術(shù)制得。
到目前為止，關(guān)于硫酸軟骨素地專(zhuān)利和文獻(xiàn)報(bào)道很多，但是關(guān)于對(duì)硫酸軟骨素提取粗品進(jìn)一步純化到極高純度的報(bào)道很少見(jiàn)。由于硫酸軟骨素為從生物組織中提取所得，生產(chǎn)過(guò)程中引入的動(dòng)物脂肪、蛋白、多肽及其它雜質(zhì)成了引發(fā)過(guò)敏、溶血及產(chǎn)生剌激性反應(yīng)的特異性物質(zhì)，因此把硫酸軟骨素制成靜脈直接給藥的劑型存在著巨大的技術(shù)問(wèn)題。迄今為止，沒(méi)有任何有效的將硫酸軟骨素用于臨床靜脈直接給藥的報(bào)道。
林國(guó)平等研究硫酸軟骨素精制工藝，采用氧化、過(guò)濾及沉淀等方法進(jìn)行精制，滿(mǎn)足滴眼劑的要求《食品與藥品，2005，6》。《中國(guó)生化藥物雜志》(2005年1)上公開(kāi)改進(jìn)硫酸軟骨素生產(chǎn)工藝，提高硫酸軟骨素產(chǎn)率和含量方法，采用廢胰渣清洗軟骨，用正交試驗(yàn)法設(shè)計(jì)控制酶水解的溫度、時(shí)間和pH值，在吸附去雜蛋白質(zhì)后加鹽等，提高了產(chǎn)率。
《鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)》(2005，01)發(fā)表了以豬喉、氣管軟骨和鼻軟骨為原料制備高純度的硫酸軟骨素的方法。以稀堿濃鹽提取豬喉、氣管軟骨和鼻軟骨組織，選擇相對(duì)分子質(zhì)量為10,000的切向流超濾膜進(jìn)行精制的方法制備。超濾后，以豬喉氣管軟骨和鼻軟骨為原料制得的硫酸軟骨素含量分別增加16.83％和11.75％。高華建立一種硫酸軟骨素生產(chǎn)的新工藝，以牛鼻軟骨為原料，采用增大堿濃度提取、復(fù)合酶水解及濃縮后酒精沉淀的方法探討了工藝條件。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，得到硫酸軟骨素為白色粉末，其純度達(dá)95.2％(《青島大學(xué)學(xué)報(bào)(工程技術(shù)版)》2003，04)。
上海大學(xué)生命科學(xué)院提出了雙酶生產(chǎn)硫酸軟骨素的新工藝，使質(zhì)量穩(wěn)定和收率提高，王世中采用了軟骨中硫酸軟骨素與蛋白質(zhì)結(jié)合成蛋白多糖，并與膠原蛋白結(jié)合在一起。采用先高溫蒸煮，后加稀堿與酶解相結(jié)合提取該藥物，TCA沉淀蛋白質(zhì)后，高嶺土吸附，再用氯仿連續(xù)反萃取，使產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到優(yōu)級(jí)純(《藥學(xué)學(xué)報(bào)》1980，03)。
CN1733809A報(bào)道了一種低分子量的硫酸軟骨素制備方法，利用市售硫酸軟骨素粗品，經(jīng)過(guò)硫酸軟骨素酶降解、超濾膜進(jìn)行濃縮、95％的乙醇結(jié)晶等特殊工藝得到分子量為10000～15000道爾頓之間的分子量的硫酸軟骨素。CN1699428A發(fā)明涉及了一種硫酸軟骨素的制備方法，經(jīng)過(guò)蒸煮處理、保溫或溫和浸出、酶解、過(guò)濾除蛋白、超濾純化、真空濃縮、噴霧干燥處理等方法。CN1654670A，包括物料處理，浸提、過(guò)濾去渣、濾液濃縮的步驟得到的含量較高的硫酸軟骨素。
所有這些上述學(xué)術(shù)報(bào)道或公開(kāi)專(zhuān)利方法，對(duì)所得的產(chǎn)品的純度和收率提高是非常有限的，因此這些產(chǎn)品存在相當(dāng)高的雜質(zhì)引發(fā)過(guò)敏、溶血及產(chǎn)生刺激性反應(yīng)而影響硫酸軟骨素的臨床使用，目前所有這些產(chǎn)品的原料應(yīng)用到藥學(xué)方面，都只能用于口服或者肌肉注射。
硫酸軟骨素為硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C兩種構(gòu)型的混合物，具有多種生理功能，用途廣泛，主要用在治療頭疼，偏頭痛、冠心病、心絞痛等神經(jīng)性疼痛，在維持組織和免疫機(jī)能上起著重要作用，也可以用于防治關(guān)節(jié)炎、改善老年型關(guān)節(jié)功能退化等。
目前硫酸軟骨素制劑在國(guó)內(nèi)外均已有生產(chǎn)，國(guó)內(nèi)已上市的注射劑型，其臨床給藥途徑為肌內(nèi)注射，一次1支，每日1～2次。由于其純度低，給藥途徑存在一定的局限性，在針對(duì)各類(lèi)神經(jīng)性疼痛和需要快速或持續(xù)治療的疾病時(shí)應(yīng)用都受到很大限制。
本發(fā)明涉及一種高純度硫酸軟骨素及其制備方法，以及含有該硫酸軟骨素作為有效成分用于靜脈途徑給藥的制劑，臨床前試驗(yàn)表明，高純度的硫酸軟骨素，由于其含量提高、分子量集中在30,000～50,000、雜質(zhì)相對(duì)少，制成的制劑通過(guò)靜脈途徑給藥減少了刺激和毒副作用、活性和療效得到提高，同時(shí)也擴(kuò)大了給藥途徑，增加患者的順應(yīng)性。通過(guò)靜脈途徑直接給藥不經(jīng)過(guò)吸收過(guò)程直接進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，增加了療效、縮短了起效時(shí)間、方便臨床使用，減少了頻繁注射的痛苦，而且由于去除了雜質(zhì)，不會(huì)產(chǎn)生過(guò)敏、溶血及刺激性反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目在于提供高純度的硫酸軟骨素。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述硫酸軟骨素的制備方法，通過(guò)這種方法制備的硫酸軟骨素，分子量分布在30,000～50,000道爾頓。
本發(fā)明另一目的是在于提供用于靜脈注射這一給藥途徑的硫酸軟骨素制劑。
本發(fā)明是通過(guò)提高硫酸軟骨素原料的純度，對(duì)其分子量范圍進(jìn)行控制，提高對(duì)硫酸軟骨素制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)所含雜質(zhì)進(jìn)行嚴(yán)格的控制，降低臨床副反應(yīng)的發(fā)生，并通過(guò)臨床前試驗(yàn)證實(shí)，制備出能夠安全有效的用于靜脈注射給藥途徑的硫酸軟骨素制劑。
本發(fā)明如下
可供靜脈途徑給藥的硫酸軟骨素
其硫酸軟骨素的含量大于96％，
本方法的優(yōu)點(diǎn)是獲得硫酸軟骨素的分子量范圍為30,000～50,000道爾頓，分布寬度(Mw/Mn)應(yīng)小于1.8。這顯著地增加了藥效，降低了副作用，方便患者使用。
以下對(duì)高純度硫酸軟骨素的制備方法進(jìn)行詳述。
采用生物提取的硫酸軟骨素粗品為原料，經(jīng)過(guò)10～20％(質(zhì)量比)的苛性堿水溶液加熱處理1h～2h，溫度控制在25～35℃，然后將所得液體進(jìn)行固液分離，將所得固態(tài)部分溶解于有機(jī)酸水溶液，向其中加入醇或苛性堿至pH為10以上，產(chǎn)生沉淀，將該沉淀洗滌、干燥，得到硫酸軟骨素的沉淀。
本發(fā)明所采用的原料是通過(guò)各種方法提取分布于軟骨、骨、肌腱、韌帶、肌膜和血管壁中的硫酸軟骨素，屬于大分子酸性粘多糖類(lèi)，生物上提取通常以豬、牛、羊等動(dòng)物的軟骨組織和鯊魚(yú)等水產(chǎn)品的軟骨為原材料，利用生化提取工藝技術(shù)制得。
當(dāng)利用這種硫酸軟骨素粗品為原料時(shí)，對(duì)純度沒(méi)有特別的要求，這是本發(fā)明具有的又一優(yōu)點(diǎn)對(duì)不同純度硫酸軟骨素粗品進(jìn)行提純，都可以得到高純度的產(chǎn)品。
苛性堿水溶液加熱處理是為了將多糖中大分子多糖水解為小分子多糖，因此苛性堿水溶液的濃度對(duì)提高多糖的分子量的范圍很重要，優(yōu)選的范圍為10～20％，更優(yōu)選范圍為12～16％。
本發(fā)明使用的苛性堿溶液，反應(yīng)器可以是不銹鋼器皿、瓷器。加熱處理可以在常壓下進(jìn)行，也可以在加壓或減壓的環(huán)境下進(jìn)行。
當(dāng)然苛性堿加熱處理的時(shí)間對(duì)多糖分子量的范圍也很重要，加熱時(shí)間長(zhǎng)會(huì)引起多糖分子水解完全，達(dá)不到所需要的分子量范圍，而時(shí)間太短會(huì)造成水解不完全，收率降低，因此優(yōu)選的時(shí)間范圍為1～2h。
苛性堿水溶液中加熱處理，加入水或酸，將溶液的粘度調(diào)節(jié)為3～20mPa·s，這會(huì)對(duì)多糖含量有較大影響。
將上一步所得的沉淀、溶解，配制成0.1～10％(重量體積比)溶液，進(jìn)行超濾純化。所述的超濾純化過(guò)程，其截流分子量為30,000～50,000。
在本發(fā)明中，用于溶解硫酸軟骨素的有機(jī)酸是藥學(xué)領(lǐng)域常用的，包括但不限于檸檬酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、草酸、琥珀酸、乳酸及醋酸中的一種或幾種。其中優(yōu)選的有機(jī)酸為檸檬酸、蘋(píng)果酸及它們的混合物。
粘性增高，會(huì)使以后的步驟處理困難，因此調(diào)節(jié)蒸餾水、有機(jī)酸的添加方法，使其粘度降低，這是非常重要的，添加有機(jī)酸時(shí)，優(yōu)選加入后使pH大于10。
藥液的濃度對(duì)超濾的影響很大，合適的濃度會(huì)加快超濾的過(guò)程，并使得所得到硫酸軟骨素的分子量范圍小，在這一過(guò)程中，一般1～25％的藥液均可進(jìn)行超濾，優(yōu)選的藥液濃度在1～10％。所選擇超濾純化設(shè)備的其截流分子量為30,000～50,000。
經(jīng)過(guò)這樣過(guò)程制備的硫酸軟骨素，其特征在于所述硫酸軟骨素的分子量范圍為30,000～50,000道爾頓。
通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，硫酸軟骨素的在30,000～50,000道爾頓的分子量能夠明顯降低一些副反應(yīng)，提高藥物作用的發(fā)揮，具體以下試驗(yàn)會(huì)對(duì)此進(jìn)行詳述。
此外，對(duì)于硫酸軟骨素的含量測(cè)定，采用了一種新的方法，目前國(guó)內(nèi)對(duì)硫酸軟骨素的質(zhì)量控制方法主要是水解比色法，經(jīng)水解后產(chǎn)生葡萄糖醛酸和氨基己糖，即建立在氨基己糖測(cè)定基礎(chǔ)上的Elson-Morgn法和葡萄糖醛酸基礎(chǔ)上的咔唑法，手續(xù)繁瑣且重現(xiàn)性較差，并不能很好反映硫酸軟骨素含量，從而使硫酸軟骨素的原料和制劑的質(zhì)量提高受到了限制，國(guó)內(nèi)大部分硫酸軟骨素原料的純度只能達(dá)到80～90％。在對(duì)硫酸軟骨素質(zhì)量檢測(cè)中，采用氯化十六烷基吡啶溶液(CPC)滴定方法控制其含量，含量大于96％。采用電泳法控制其有關(guān)物質(zhì)含量，含量小于2.0％。
硫酸軟骨素中的特異蛋白和過(guò)敏原物質(zhì)是引起臨床和藥理副反應(yīng)的主要原因，通過(guò)本制備方法，可以達(dá)到基本不含蛋白和過(guò)敏原的水平(＜2％)，如下表1所示，4批不同的硫酸軟骨素經(jīng)過(guò)純化后蛋白和過(guò)敏原的量(以蛋白量計(jì))。
表1本發(fā)明制備方法對(duì)蛋白和過(guò)敏原的去除比較
不言而喻，本發(fā)明提供的高純度硫酸軟骨素可以通過(guò)口腔或胃腸外給藥。特別地，口服制劑包括顆粒、粉劑、片劑(包括糖包衣片)、丸劑、膠囊、糖漿劑、乳劑和懸浮劑。胃腸外制劑包括注射劑(例如皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、腹膜內(nèi)注射)、滴劑、外用制劑(例如，鼻腔制劑、經(jīng)皮制劑、及軟膏)，及栓劑(例如，直腸栓劑和陰道栓劑)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域常用的方法，加入藥學(xué)可接受的載體來(lái)制備上述的制劑。
藥學(xué)可接受的載體包括賦形劑、粘合劑、稀釋劑、添加劑、芳香劑、緩沖劑、增稠劑、著色劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、分散劑、懸浮劑和防腐劑?？梢允褂孟铝械妮d體，例如碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、果膠、糊精、淀粉、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔點(diǎn)蠟、可可脂。
但是特別優(yōu)良地，本發(fā)明一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)在于提供一種根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)無(wú)法制備的硫酸軟骨素的靜脈給藥制劑?？晒╈o脈注射給藥的制劑硫酸軟骨素包括注射液、注射用粉針、氯化鈉輸液、葡萄糖輸液溶液型注射液和其他可用于靜脈滴注的膠束或微粒給藥系統(tǒng)。
現(xiàn)有的硫酸軟骨素注射制劑臨床用藥途徑僅有肌肉注射一種，在針對(duì)各類(lèi)神經(jīng)性疼痛和需要快速治療的疾病時(shí)應(yīng)用受到限制的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明為患者提供一種可以供靜脈注射用的硫酸軟骨素制劑。當(dāng)然本發(fā)明制備的硫酸軟骨素制備的制劑，同樣也可以進(jìn)行肌肉或皮下注射。
以靜脈注射途徑給藥應(yīng)用本發(fā)明的硫酸軟骨素作為活性成分時(shí)，可以根據(jù)需要，制成不同的給藥形式，應(yīng)用于靜脈注射。制成這些不同的給藥形式，可以廣泛使用本領(lǐng)域以往公知的載體和試劑。例如凍干粉針的賦性劑如甘露醇、乳糖、果糖、葡萄糖糖、阿糖中的一種或幾種)，抗氧劑(如亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、抗壞血酸、甲硫氨酸、乙二胺四醋酸二鈉、磷酸、枸櫞酸等中的一種或幾種)，以及調(diào)節(jié)等滲的葡萄糖、氯化鈉、山梨醇等，調(diào)節(jié)pH的有機(jī)酸或有機(jī)堿(乳酸、鹽酸、蘋(píng)果酸、氫氧化鈉等)。如果需要，還可以加入例如增溶劑(例如，水楊酸鈉和醋酸鈉)，穩(wěn)定劑(例如，人血清白蛋白)，無(wú)痛劑(例如苯扎氯胺和鹽酸普魯卡因)。
以靜脈注射途徑給藥應(yīng)用本發(fā)明的硫酸軟骨素作為活性成分時(shí)，有效的劑量范圍10～200mg之間，這一點(diǎn)在隨后臨床前試驗(yàn)中得以證實(shí)，在制劑中的含量(重量比)0.1％～50％，，優(yōu)選0.5～20％。
本發(fā)明的目的是通過(guò)下述方法實(shí)現(xiàn)的采用生物提取的硫酸軟骨素粗品為原料，經(jīng)過(guò)10～20％(質(zhì)量比)的苛性堿水溶液加熱處理1h～2h，溫度控制在25～35℃，然后將所得液體進(jìn)行固液分離，將所得固態(tài)部分溶解于有機(jī)酸水溶液，向其中加入醇或苛性堿至pH為10以上，產(chǎn)生沉淀，將該沉淀洗滌、干燥，得到硫酸軟骨素的沉淀。將上一步所得的沉淀、溶解，配制成0.1～10％(重量體積比)溶液，進(jìn)行超濾純化。所述的用于靜脈注射的硫酸軟骨素，采用氯化十六烷基吡啶溶液滴定方法(下一段說(shuō)明該方法的操作過(guò)程或者提供記載該方法的文獻(xiàn))控制其含量，含量大于96％。電泳法控制其雜質(zhì)含量小于2％。
實(shí)施例
以下，實(shí)施例是為了更詳細(xì)的說(shuō)明本發(fā)明的硫酸軟骨素制備方法及作為靜脈注射途徑所包含的一些劑型，而不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明做出任何限制。
實(shí)施例1
生物提取的硫酸軟骨素粗品為60.0g，加入12％(質(zhì)量比)的苛性堿水溶液3.0L，溶解、加熱1.5h處理，溫度控制在30℃，然后將所得液體進(jìn)行固液分離，將所得固態(tài)部分溶解于檸檬酸水溶液，向其中加入乙醇50ml或苛性堿8.5ml至pH為10以上，產(chǎn)生沉淀43.2g，將該沉淀洗滌、干燥，得到硫酸軟骨素的沉淀40.6g。
將所得沉淀加水2L，攪拌溶解，進(jìn)行超濾純化。所述的超濾純化過(guò)程，其截流分子量為30,000-50,000，即得硫酸軟骨素精制品溶液，經(jīng)測(cè)定硫酸軟骨素精制品的含量98.9％以上(CPC法測(cè)定)。蛋白等其他雜質(zhì)的含量小于2％。
將精制的硫酸軟骨素加入適量注射用水，調(diào)節(jié)pH值為6.0左右，按照注射劑的常規(guī)方法制備成注射液。
實(shí)施例2
生物提取的硫酸軟骨素粗品為60.0g，加入12％(質(zhì)量比)的苛性堿水溶液3.5L，溶解、加熱1.0h處理，溫度控制在35℃，然后將所得液體進(jìn)行固液分離，將所得固態(tài)部分溶解于乳酸水溶液，向其中加入乙醇60ml、苛性堿9.5ml至pH為10以上，產(chǎn)生沉淀41.2g，將該沉淀洗滌、干燥，得到硫酸軟骨素的沉淀40.8g。
將所的沉淀加水3L，攪拌溶解，進(jìn)行超濾純化。所述的超濾純化過(guò)程，其截流分子量為35,000～45,000，即得硫酸軟骨素精制品溶液，經(jīng)測(cè)定硫酸軟骨素精制品的含量99.4％以上(CPC法)測(cè)定。蛋白等其他雜質(zhì)的含量小于1.5％。
將精制的硫酸軟骨素加入適量注射用水和賦性劑，調(diào)節(jié)溶液pH值為6.0左右，按照注射劑的常規(guī)方法制備成凍干粉針。
實(shí)施例3
生物提取的硫酸軟骨素粗品為60.0g，加入過(guò)20％(質(zhì)量比)的苛性堿水溶液3.0L，溶解、加熱1.0h處理，溫度控制在25℃，然后將所得液體進(jìn)行固液分離，將所得固態(tài)部分溶解于蘋(píng)果酸水溶液，向其中加入乙醇50ml或苛性堿8.5ml至pH為10以上，產(chǎn)生沉淀43.7g，將該沉淀洗滌、干燥，得到硫酸軟骨素的沉淀41.2g。
將所得沉淀加水2L，攪拌溶解，進(jìn)行超濾純化。所述的超濾純化過(guò)程，其截流分子量為40,000～50,000，即得硫酸軟骨素精制品溶液，經(jīng)測(cè)定硫酸軟骨素精制品的含量99.1％以上(CPC法測(cè)定)。蛋白等其他雜質(zhì)的含量小于2％。
將精制的硫酸軟骨素加入適量注射用水和賦性劑，加入等滲量的氯化鈉，調(diào)節(jié)溶液pH值為7.0左右，按照注射劑的常規(guī)方法制備硫酸軟骨素成氯化鈉注射液。
實(shí)施例4
生物提取的硫酸軟骨素粗品為60.0g，加入13％(質(zhì)量比)的苛性堿水溶液4.0L，溶解、加熱1.5h處理，溫度控制在25℃，然后將所得液體進(jìn)行固液分離，將所得固態(tài)部分溶解于有機(jī)酸水溶液，向其中加入乙醇50ml或苛性堿8.5ml至pH為10以上，產(chǎn)生沉淀40.8g，將該沉淀洗滌、干燥，得到硫酸軟骨素的沉淀38.4g。
將所的沉淀加水2L，攪拌溶解，進(jìn)行超濾純化。所述的超濾純化過(guò)程，其截流分子量為30,000～40,000，即得硫酸軟骨素精制品溶液，經(jīng)測(cè)定硫酸軟骨素精制品的含量99.3％(CPC法測(cè)定)。蛋白等其他雜質(zhì)的含量小于2％。
將精制的硫酸軟骨素加入適量注射用水和賦性劑，加入等滲量的氯化鈉，調(diào)節(jié)溶液pH值為7.0左右，按照注射劑的常規(guī)方法制備硫酸軟骨素成氯化鈉注射液。
本發(fā)明所提供的靜脈途徑給藥硫酸軟骨素，制備成制劑與市售普通硫酸軟骨素注射液比較，起效迅速，藥理毒理和安全性試驗(yàn)結(jié)果表明其安全穩(wěn)定性高，對(duì)靜脈刺激性小。
(一)藥效學(xué)試驗(yàn)
通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，檢測(cè)硫酸軟骨素對(duì)家兔凝血機(jī)能和血流變指標(biāo)的影響，對(duì)大鼠血栓形成的影響以及對(duì)大鼠和小鼠的抗炎作用。本發(fā)明所述之可以靜脈注射的硫酸軟骨素的制劑，通過(guò)靜脈注射含有純度為96％以上硫酸軟骨素20～100mg。
結(jié)果顯示，觀(guān)察硫酸軟骨素對(duì)家兔凝血機(jī)能和血液流變學(xué)的影響，以56.0、28.0和14.0mg/kg(人常用量的8、4和2倍)的劑量靜脈推注給藥，可明顯改善凝血機(jī)能，延長(zhǎng)凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)、部分活化凝血活酶時(shí)間(APTT)和血漿纖維蛋白原(FIB)時(shí)間；明顯改善血流變指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表2～3。
通過(guò)血栓法檢測(cè)藥物對(duì)大鼠血栓形成的影響，表明硫酸軟骨素對(duì)大鼠的血小板凝集具有抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表4。
通過(guò)大鼠足墊腫脹法和小鼠耳腫脹法檢測(cè)藥物的抗炎作用，表明硫酸軟骨素具有明顯的抗炎作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，硫酸軟骨素具有改善凝血機(jī)能、改善血液流變學(xué)指標(biāo)、抑制血小板凝集和抗炎作用。
表2.硫酸軟骨素對(duì)家兔凝血機(jī)能的影響
表3.硫酸軟骨素對(duì)家兔血流變指標(biāo)的影響
n＝8，#P＜0.05，與對(duì)照組同期比較；*P＝0.05，與給藥前比較
表4.硫酸軟骨素對(duì)小鼠血小板凝集作用的影響
(二)一般藥理試驗(yàn)
一般藥理學(xué)研究是指觀(guān)察主要藥效學(xué)以外的藥理作用，主要觀(guān)察精神神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)三個(gè)方面，為藥物臨床應(yīng)用提供安全性依據(jù)。
精神神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)表明，硫酸軟骨素240、480和960mg·kg-1各劑量組對(duì)小鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)及行為分級(jí)無(wú)明顯影響，各組小鼠評(píng)分均在正常范圍內(nèi)；對(duì)由戊巴比妥鈉致小鼠睡眠持續(xù)時(shí)間無(wú)明顯影響；對(duì)小鼠一般活動(dòng)亦無(wú)明顯影響，各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物均未見(jiàn)有活動(dòng)遲鈍、姿勢(shì)步態(tài)異常、嘶叫、跳躍、激怒、嗜睡、豎毛等現(xiàn)象，提示硫酸軟骨素各劑量對(duì)動(dòng)物精神神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)明顯影響，結(jié)果見(jiàn)表5～7。
心血管和呼吸系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)表明，正常麻醉家貓，腹腔注射71.5、143和286mg·kg-1的硫酸軟骨素，給藥前后比較以及與對(duì)照組比較，血壓、心電、呼吸頻率及深度均無(wú)顯著性差異，提示硫酸軟骨素對(duì)家貓心血管和呼吸系統(tǒng)無(wú)明顯影響，結(jié)果見(jiàn)表8～12。
表5硫酸軟骨素對(duì)小鼠爬桿能力的影響
表6硫酸軟骨素對(duì)小鼠Irwin行為分級(jí)的影響
表7硫酸軟骨素對(duì)小鼠睡眠時(shí)間的影響
表8硫酸軟骨素對(duì)貓心率的影響
表9硫酸軟骨素對(duì)貓平均動(dòng)脈壓的影響
表10硫酸軟骨素對(duì)貓呼吸頻率的影響(單位次/min，X±SD，n＝6)
表11硫酸軟骨素對(duì)貓心電圖之T波的影響
表12硫酸軟骨素對(duì)貓呼吸深度的影響
綜上所述，硫酸軟骨素各劑量對(duì)動(dòng)物精神神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)均無(wú)明顯影響，表明本品有較高的安全性。
(三)急性毒性試驗(yàn)
對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物小鼠進(jìn)行了急性毒性試驗(yàn)。通過(guò)檢測(cè)小鼠一次性腹腔注射給藥后的各種毒性反應(yīng)，測(cè)算本品的LD50及其可信限。以硫酸軟骨素的最大溶解濃度400mg/ml和最大給藥體積50ml/kg，一次性腹腔注射給藥，未見(jiàn)明顯毒性反應(yīng)，并未能引起受試動(dòng)物死亡，結(jié)果見(jiàn)表13所示。
表13受試動(dòng)物體重及變化(單位g)
(四)長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)
對(duì)非嚙齒類(lèi)動(dòng)物犬進(jìn)行了長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)。通過(guò)觀(guān)察犬靜脈給藥26周機(jī)體所發(fā)生的各種反應(yīng)，以評(píng)估安全性。高、中、低劑量組劑量分別為400、200和100mg·kg-1·d-1，加上對(duì)照組共4組，每組8只動(dòng)物。給藥中期、給藥期結(jié)束時(shí)及恢復(fù)期結(jié)束時(shí)剖殺動(dòng)物，觀(guān)察受試動(dòng)物的一般狀況(包括精神狀態(tài)、反應(yīng)、行為活動(dòng)、進(jìn)食量及體重變化)，并進(jìn)行心電圖、血液細(xì)胞學(xué)指標(biāo)、血液生化學(xué)指標(biāo)、尿常規(guī)檢查及各重要臟器的組織學(xué)檢查。結(jié)果表明，未見(jiàn)明顯延遲性毒性反應(yīng)。
對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物大鼠進(jìn)行了長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)，分對(duì)照組(等量蒸餾水)，低劑量組(350.0mg·kg-1)，中劑量組(700.0mg·kg-1)及高劑量組(1400.0mg·kg-1)，每組動(dòng)物40只，雌雄各半。試驗(yàn)設(shè)計(jì)為26周，于給藥中期、給藥期結(jié)束時(shí)及2周恢復(fù)期結(jié)束時(shí)剖殺動(dòng)物。觀(guān)察大鼠靜脈給藥后機(jī)體所發(fā)生的各種反應(yīng)，以評(píng)估本品的安全性。試驗(yàn)中觀(guān)察了動(dòng)物的一般狀況，血液細(xì)胞學(xué)及血液生物化學(xué)指標(biāo)，大體解剖及組織病理學(xué)指標(biāo)。結(jié)果表明，嚙齒類(lèi)動(dòng)物大鼠腹腔注射長(zhǎng)期硫酸軟骨素?zé)o明顯延遲性毒性反應(yīng)
(五)安全性試驗(yàn)
在一項(xiàng)由中國(guó)藥科大學(xué)進(jìn)行硫酸軟骨素靜脈注射液安全性試驗(yàn)評(píng)價(jià)中，其中包括靜脈刺激性試驗(yàn)、致敏試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)，并和上市的普通硫酸軟骨素注射液進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果表明，該制劑符合靜脈滴注要求，安全性顯著高于普通的硫酸軟骨素注射液。
(1)靜脈刺激性試驗(yàn)
以無(wú)菌操作方法分別向家兔右、左耳緣靜脈注硫酸軟骨素注射液(按臨床使用濃度用20％葡萄糖注射液配制成0.6mg/ml溶液(劑量為6ml/3.6mg/kg)及等量20％葡萄糖注射液，靜脈連續(xù)推注3次，每日一次。結(jié)果表明未發(fā)現(xiàn)硫酸軟骨素注射液有明顯刺激作用，與20％葡萄糖注射液相比，未見(jiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、變性、壞死，管腔內(nèi)無(wú)明顯血栓形成。
(2)溶血試驗(yàn)
注射液溶血試驗(yàn)表明，試管內(nèi)終濃度為2mg/ml時(shí)對(duì)家兔不引起溶血和凝集作用，而濃度為0.4mg/ml的市售制劑在3h有溶血現(xiàn)象，在2mg/ml的濃度在60min就出現(xiàn)溶血，結(jié)果如表14～15。
表14本發(fā)明的硫酸軟骨素注射液溶血試驗(yàn)表(5％葡萄糖注射液)
表15普通硫酸軟骨素注射液溶血試驗(yàn)表(5％葡萄糖注射液)
注-不溶血；+完全溶血
(3)過(guò)敏性試驗(yàn)
觀(guān)察兩種硫酸軟骨素注射液(本發(fā)明方法制備和普通硫酸軟骨素注射液)對(duì)豚鼠有無(wú)過(guò)敏反應(yīng)，為臨床安全用藥提供依據(jù)。取健康豚鼠18只，隨機(jī)分成3組，每組6只(雌雄各半)。分為陰性對(duì)照組(20％葡萄糖注射液致敏，并以該注射液進(jìn)行攻擊)、陽(yáng)性對(duì)照組(以4％的雞蛋清致敏，并以該試劑進(jìn)行攻擊)、受試藥組(以0.6mg/ml的硫酸軟骨素注射液致敏，并以該藥進(jìn)行攻擊)。
每組首先隔日腹腔注射上述的藥液0.5ml/只，共注射3次。然后將每組豚鼠均分為兩小組，其中一小組豚鼠在第一次腹腔注射藥液后第14天由前肢靜脈注射原藥液1ml/只；另一小組豚鼠在第一次腹腔注射藥液后第21天由前肢靜脈注射原藥液1ml/只。觀(guān)察靜脈注射后30分鐘內(nèi)的豚鼠過(guò)敏反應(yīng)癥狀，并按表2評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。
給予受試藥按照本專(zhuān)利方法制備的硫酸軟骨素注射液的兩小組豚鼠分別于第一次腹腔注射藥液后第14天和第21天用原藥液進(jìn)行攻擊，均未發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)；而陽(yáng)性對(duì)照組豚鼠于注射后1分鐘內(nèi)出現(xiàn)呼吸困難，抽搐倒下，而后死亡，豚鼠死亡均發(fā)生在注射后1-2分鐘內(nèi)。另外，陰性對(duì)照組6只豚鼠也均未發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，給予受試藥普通硫酸軟骨素注射液的兩小組豚鼠分別于第一次腹腔注射藥液后第14天和第21天用原藥液進(jìn)行攻擊，發(fā)生輕微的過(guò)敏反應(yīng)；結(jié)果見(jiàn)表16～17。
(六)試驗(yàn)結(jié)論
在本次試驗(yàn)條件下，表明按照本發(fā)明制備的硫酸軟骨素注射液對(duì)受試動(dòng)物豚鼠無(wú)致敏作用，而市售的普通硫酸軟骨素具有一定的致敏作用，結(jié)果見(jiàn)表16～17。
表16全身過(guò)敏反應(yīng)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
表17兩種硫酸軟骨素注射液的過(guò)敏性反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果
這些靜脈刺激性試驗(yàn)、致敏試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)，結(jié)果表明按照本發(fā)明方法制備的硫酸軟骨素制備成制劑后，符合靜脈滴注要求，安全性顯著高于普通的硫酸軟骨素注射液。
權(quán)利要求
1、一種可用于靜脈途徑給藥的硫酸軟骨素，其特征在于基本不含引發(fā)過(guò)敏、溶血及產(chǎn)生剌激性反應(yīng)的特異性物質(zhì)。
2、權(quán)利要求1中硫酸軟骨素，其特征在于用如下方法獲得采用生物提取的硫酸軟骨素粗品經(jīng)過(guò)10～20％質(zhì)量的苛性堿水溶液加熱處理，然后固液分離、將所得固態(tài)部分溶解于有機(jī)酸水溶液，向其中加入醇或苛性堿至pH為10以上，產(chǎn)生沉淀，將該沉淀洗滌、干燥。
3、權(quán)利要求2中硫酸軟骨素，其中將所述的沉淀溶解，配制成0.1～10％w/v溶液，進(jìn)行超濾純化。
4、權(quán)利要求3中的硫酸軟骨素，在超濾純化過(guò)程中截流的分子量為30,000～50,000。
5、如權(quán)利要求4所述的硫酸軟骨素，其特征在于所述硫酸軟骨素的分子量范圍為30,000～50,000道爾頓，分布寬度(Mw/Mn)小于1.8。
6、如權(quán)利要求5所述的硫酸軟骨素，優(yōu)選的分子量范圍為35,000～45,000道爾頓。
7、如權(quán)利要求2中的硫酸軟骨素，其中苛性堿的濃度是12～16％。
8、如權(quán)利要求2中的硫酸軟骨素，用于溶解硫酸軟骨素的有機(jī)酸包括檸檬酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、草酸、琥珀酸、乳酸及醋酸中的一種或幾種。
9、權(quán)利要求1～2中所述的硫酸軟骨素，采用氯化十六烷基吡啶溶液滴定方法控制其含量，含量大于96％。
10、權(quán)利要求1～2所述的硫酸軟骨素，采用電泳法控制其有關(guān)物質(zhì)含量，含量小于2.0％。
11、包含如權(quán)利要求1～7所述的硫酸軟骨素作為活性成分的靜脈途徑給藥硫酸軟骨素制劑，包括注射液、注射用粉針、氯化鈉輸液、葡萄糖輸液溶液型注射液和其他可用于靜脈滴注給藥的膠束或微粒給藥系統(tǒng)。
12、如權(quán)利2中要求所述的制備方法，其中，苛性堿水溶液中加熱處理，加入水或酸，將溶液的粘度調(diào)節(jié)為3-20mPa·s。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了可用于靜脈注射途徑給藥的硫酸軟骨素及其制備方法，使用這種純化的硫酸軟骨素制成的制劑，既可以肌肉注射，也可以加到葡萄糖或生理鹽水的輸液中或直接推注等方法靜脈給藥，極大地方便了使用，減少了肌肉注射多次給藥的痛苦。這種用途的硫酸軟骨素克服了現(xiàn)有技術(shù)硫酸軟骨素注射液純度不高，具有免疫源性的缺點(diǎn)，直接注射進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，血藥濃度更高，起效更快，療效更好，副作用更低。
文檔編號(hào)A61K9/10GK1820761SQ20061003892
公開(kāi)日2006年8月23日 申請(qǐng)日期2006年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月17日
發(fā)明者李戰(zhàn) 申請(qǐng)人:李戰(zhàn)