專利名稱：蛋白質(zhì)－多糖玻璃體微粒緩釋微球的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的制備方法。特別是一種蛋白質(zhì)-多糖玻璃體微粒緩釋微球的制備方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)結(jié)構(gòu)脆弱的生物活性試劑，如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、病毒、疫苗、抗體、或脂質(zhì)體等被包埋在生物相容性高分子材料中時，一般不可避免的接觸有機溶劑(因為這些材料是脂溶性)，往往導(dǎo)致這些試劑變性失活。為了避免這種由于接觸油水界面導(dǎo)致的變性失活，這些試劑通常在包埋前，制備成試劑-多糖或小糖的固體顆粒。為了達(dá)到緩釋目的和避免嚴(yán)重的突釋效應(yīng)，蛋白-糖或多糖的顆粒通常要求小于10μm。蛋白質(zhì)量或多肽預(yù)先包在水溶性的高分子粒子中，再包埋在可降解聚合物的裝置也可以提高釋放動力學(xué)曲線、減少不完全釋放和突釋。把蛋白質(zhì)擔(dān)載到好的多糖粒子中是一件非常堅決任務(wù)，由于報道顆粒的制備方法通常藥用到有機溶劑、界面張力(如油水界面或水空氣界面，親水和疏水界面)、高剪切力、高溫條件和其它因素嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的活性。不過最近在此領(lǐng)域有些進(jìn)步。
現(xiàn)有技術(shù)中的專利[CHEN，Li；ZHU，Hua；JIN，Tuo THE PREPARATION METHODOF A STABLE POLYMER AQUEOUS PHASE-AQUEOUS PHASE EMULSION AND ITS USE，Publication Number InternationalWO/2002/000778 Application No.PCT/CN2001/001033](穩(wěn)定的高分子水相-水相乳液的制備及其應(yīng)用公開號為，WO/2002/000778國際申請?zhí)朠CT/CN2001/001033)，該技術(shù)揭示了一種新型的穩(wěn)定的乳液(高分子水相-水相乳液)及其制備方法和在制藥及生物技術(shù)中的應(yīng)用。該乳液與常規(guī)乳液的根本區(qū)別在于其分散相和連續(xù)相均為水溶液。這一乳液的主要用途在于對于有機溶劑敏感的化學(xué)及生物藥物的劑型制備。其中生物藥物包括蛋白，多肽，DNA，及活病毒。與常規(guī)乳液相比，主要優(yōu)點在于上述敏感的治療試劑不會因為與有機溶劑的接觸而變性失活。對于上述治療試劑的制備，保存，運輸和釋放提供了獨到的優(yōu)化機制，不過這個體系有點缺陷。如需要相對高的兩種親水性的高分子(一種是多糖和聚乙二醇)還需要第三種水溶性的聚合物(帶有負(fù)電荷骨架聚電解質(zhì))形成一個穩(wěn)定的乳液，聚電解質(zhì)有穩(wěn)定分散相多糖的效果防止其融合，如果蛋白質(zhì)的溶解度小，多糖和蛋白質(zhì)的比例太高，以至擔(dān)載蛋白質(zhì)的能力太低，因為多糖必須足夠高才能發(fā)生相分離)。另外有些蛋白質(zhì)可能和聚電解質(zhì)(形成穩(wěn)定的乳液必須的)發(fā)生作用，以至形成離子性的聚集。因此，需要一個更好方法把蛋白質(zhì)擔(dān)載在多糖玻璃體中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種蛋白質(zhì)-多糖玻璃體微粒緩釋微球的制備方法。使其在降溫過程中發(fā)生相分離并使多糖成為分散相，然后凍干并除去連續(xù)相得到多糖玻璃體微粒過程中，不需使用有機相(或稱油相)乳化，不需使用交聯(lián)劑、固化劑、表面活性劑穩(wěn)定，不存在水-油、水-氣等強界面張力的界面。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟①把蛋白質(zhì)加入多糖溶液，通過水相-水相冷凍分離使蛋白質(zhì)被分配在多糖分散相中；②將載有蛋白分子的多糖和聚乙二醇溶液冷凍相分離，再將體系冷凍干燥，得干粉；③將所得的凍干粉加入可溶聚乙二醇的有機溶液洗滌，除去聚乙二醇，得到載有蛋白的多糖玻璃體微粒的直徑在0.06微米-10微米；④將含有多糖玻璃體微粒分散在緩釋注射的高分子；⑤將蛋白以外的試劑用同樣的方法擔(dān)載于多糖玻璃體微粒中；⑥通過將蛋白-多糖玻璃體微粒分散在油溶的高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在水相中形成復(fù)乳即水/油/固體(S/O/W)的方法，或者通過將多糖玻璃體微粒分散在油溶的可降解高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在另一油相中形成復(fù)乳即油/油/固體(S/O/O)的方法，或者通過噴霧干燥法制備微球，或者添加到各種凝膠中。
所述的蛋白-多糖玻璃體，其蛋白質(zhì)0.01％-50％、多糖為0.01％-50％，保護(hù)劑0％-10％，聚乙二醇為20％-80％。
所述的保護(hù)劑為緩沖物質(zhì)、鹽類和小分子糖類物質(zhì)，其濃度為多糖的重量百分比的0-10％。
所述的保護(hù)劑為Mg(OH)2、ZnCO3、及MgCO3，鹽類為Zn(AC)2、ZnCl2、CaSO4、MgSO4，小分子糖類為海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。
所述的高分子，指聚酯、聚酸酐、或骨架非肽鍵的聚氨基酸，其中包括聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸及其組合；還包括硅像膠、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、卡波母、透明質(zhì)酸、明膠、膠原蛋白、聚乙交酯、聚己內(nèi)酯、聚氰基丙烯酸酯、聚膦腈、聚磷酸酯、纖維蛋白原、纖維蛋白、凝膠包括聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚羥基乙酸、聚羥基乙酸-聚乙二醇-聚羥基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸溫敏型水凝膠、糖敏型凝膠和酸敏型凝膠。
所述的蛋白質(zhì)為促紅細(xì)胞生成素(EPO)、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、疫苗、干擾素(INF)、生長激素(GH)、胰島素(Insulin)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、胰島素樣生長因子(IGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、血小板生長因子(PDGF)、內(nèi)皮生長因子(ECGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、骨衍生性生長因子(BDGF)、骨形成蛋白(BMP)、組織多肽抗原(TPA)、抗體(antibody)、凝血因子VIII(VIII)及IX遺傳因子和用于治療的蛋白質(zhì)或多肽。
所述的蛋白以外的試劑為反義核苷酸(anti-RNA)、小分子RNA(RNAi)、基因(DNA)、抗體、疫苗、或脂質(zhì)體。
所述的微粒其特征為蛋白質(zhì)0.01％-50％、多糖為0.01％-50％、保護(hù)劑0％-10％、高分子為20％-80％。
所述的溫敏型凝膠，載于多糖玻璃體微?；蚨嗵侨芤褐械牡鞍妆贿x擇性地分配在多糖相中處于熱力學(xué)上更穩(wěn)定的狀態(tài)。此外，熱敏液-膠體系在升溫相變(從液體到膠狀)過程中發(fā)生脫水收縮引起的突釋，而分配在多糖相中的蛋白則可以在相當(dāng)程度上避免這類突釋。制備熱敏液-膠體系時，本發(fā)明的方法制備的多糖玻璃體或者未經(jīng)乳化凍干的含有蛋白的多糖溶液可以被直接加入低溫下處于液體狀態(tài)的溫敏型凝膠。
所述的蛋白質(zhì)所制備的多糖玻璃體或者未經(jīng)乳化凍干的含有蛋白的多糖溶液中的蛋白可以是溶液狀態(tài)或者納米粒狀態(tài)。
多糖玻璃體的除了在制劑過程中保護(hù)蛋白外，通過本發(fā)明中的方法所制備的多糖玻璃體微粒還具有在體溫及水合條件下長時間地保持蛋白活性，并且改善蛋白釋放動力學(xué)的作用。冷凍相分離是將低濃度(低于8％)的多糖溶液和PEG溶液混合形成均一的溶液，然后冷凍(避免液氮、干冰等速凍條件下)。冷凍過程中多糖相與PEG相發(fā)生相分離，多糖相成為分散相，PEG相成為連續(xù)相，而蛋白通過傾向于多糖的分配而存在于分散相中。冷凍相分離的樣品冷凍干燥，并用有機溶劑洗去PEG連續(xù)相同樣得到0.06-10微米的蛋白-多糖玻璃體微粒，即蛋白-多糖玻璃體微粒。
本發(fā)明提供了一種簡便且有效的方案，使蛋白大分子緩釋劑型的研發(fā)過程中長期存在的技術(shù)難題一并得到更好的解決。
具體實施例方式
實施例的基本條件蛋白質(zhì)-多糖玻璃體的制備和微球的制備或載蛋白質(zhì)-多糖玻璃體的敏感型凝膠。
實施例1微球的制備一.制備蛋白多糖玻璃體用超純水分別制備5％的聚乙二醇和10％的多糖水溶液，精確稱取5克PEG和5克多糖水分別放在100毫升的燒杯里加水95克，然后把兩個燒杯放在加熱的磁力攪拌30min，待聚乙二醇和5％的多糖全部溶解取下來冷卻待用。用電子天平精確稱取5毫克蛋白溶于9.5毫升水中待用。
將上述的多糖、蛋白和聚乙二醇水溶液按照體積比分別為1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶旋渦30s-60s充分混勻，形成水相-水相乳液；或稱取按照多糖和聚乙二醇的質(zhì)量比為1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶先混勻再加水溶解，再按照多糖和蛋白的重量比為1∶1加入，使之形成形成水相-水相溶液。
將制備蛋白、聚乙二醇和多糖形成水相-水相溶液，一些沒有分配到多糖相的蛋白質(zhì)，在降溫過程中再分配到多糖分散相中，冷凍過夜。再在真空冷凍干燥機凍干；得到干粉用二氯甲烷洗滌三次除去聚乙二醇連續(xù)相獲得載蛋白多糖玻璃體。
得到的載蛋白多糖分散相玻璃體的粒徑大都在300nm-5μm，得到這些玻璃體光滑圓整，粒徑分布均勻?？梢允沟鞍椎慕Y(jié)構(gòu)得到好的保護(hù)，避免了在劑型制備過程失活。還可以直接用于吸入劑型。
二.載有蛋白質(zhì)-多糖玻璃體的微球制備稱取一定比例的PVA和NaCl，加超純水，同時加熱、攪拌，至PVA完全溶脹，停止加熱，繼續(xù)緩慢攪拌，待溶液呈澄清透明且無氣泡后，停止攪拌，放于4℃冰箱待用。該溶液濃度為1％PVA(W/W)和5％NaCl(W/W)。
精確稱取PLGA適量，加二氯甲烷適量，漩渦振蕩，使PLGA溶于二氯甲烷中，得PLGA的二氯甲烷溶液，濃度為20％(W/W)，現(xiàn)用現(xiàn)配，以防二氯甲烷揮發(fā)。
稱取蛋白-多糖玻璃體微粒10mg，均勻分散于0.5g的PLGA的二氯甲烷溶液中，PLGA的濃度為20％(W/W)，磁力攪拌15分鐘，轉(zhuǎn)速1800rpm，充分?jǐn)嚢枋沟玫鞍?多糖玻璃體微粒均勻分散于PLGA溶液中，將所得初乳再次分散于含1％PVA和10％氯化鈉的溶液中，以2200rpm的轉(zhuǎn)速勻漿成復(fù)乳(S/O/W)，于一分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)移到4℃的10％氯化鈉水溶液中，攪拌3～4小時后收集陳化的蛋白微球，用超純水洗滌三次，在冰相預(yù)凍過夜，再真空冷凍干燥，制得粒徑為50μm～120μm的微球。
制備的微球可以用于皮下注射，起到緩釋和治療作用。
實施實例2制備控釋和緩釋PLGA微球一、制備蛋白-多糖玻璃體按照實例1方法二、載有蛋白-多糖玻璃體的微球制備稱取聚乳酸-聚羥基乙酸(PLGA)100mg，使之在漩渦混合器的作用下充分溶解在1ml的乙腈中，然后稱取10mg的一步顆粒加入乙腈的溶液中，并在磁力攪拌下充分分散。在一定量的外油相溶液中加入200ml棉子油的表面活性劑span80，在電力攪拌器以200rpm攪拌下充分混勻。把分散有一步顆粒的乙腈溶液逐滴加入攪拌中的外油相溶液中，攪拌固化5個小時，抽濾，得到的微球顆粒用50ml石油醚洗三次，減壓干燥10個小時，收集微球，在現(xiàn)微鏡觀察微球的粒徑為50μm～120μm的微球，符合皮下注射的要求。還可以控制條件制得1μm-10μm用于疫苗制劑。
制備的微球可以用于皮下注射，起到緩釋和治療作用。
實施實例3載有蛋白-多糖玻璃體溫敏型凝膠制備一、制備載蛋白多糖玻璃體按照實例1方法二、載有蛋白-多糖玻璃體熱敏液-膠體制備稱取蛋白蛋白-多糖玻璃體微粒10mg，在4℃均勻分散于0.5g的PLGA-PEG-PLGA的水溶液中，PLGA-PEG-PLGA的濃度為20％(W/W)，磁力攪拌15分鐘，轉(zhuǎn)速1800rpm，充分?jǐn)嚢枋沟玫鞍譇queSpheres微粒均勻分散于PLGA-PEG-PLGA溶液中，將所得均勻分散于PLGA-PEG-PLGA的混懸液加熱到37℃固化，做體外釋放。而臨床應(yīng)用則現(xiàn)配現(xiàn)用。
實施實例4載有蛋白-多糖玻璃體凝膠的微球一、制備載蛋白多糖玻璃體按照實例1方法二、載有蛋白-多糖玻璃體水凝膠的微球本發(fā)明合成了兩嵌段mPEG(5K)-PLGA、三嵌段PLGA-PEG(6K)-PLGA、PEG-DTC、PEG-ε-CL的高分子材料制備了裝載了多糖蛋白的水凝膠顆粒，發(fā)現(xiàn)釋放的時間縮短和釋放速度加快。
具體制備方法如下1溶液的配制(1)PVA、NaCl水溶液稱取一定比例的PVA和NaCl，加超純水，同時加熱、攪拌，至PVA完全溶脹，停止加熱，繼續(xù)緩慢攪拌，待溶液呈澄清透明且無氣泡后，停止攪拌，放于4℃冰箱待用。該溶液濃度為1％PVA(W/W)和5％NaCl(W/W)。
(2)PLGA的二氯甲烷溶液分別稱取mPEG(5K)-PLGA、三嵌段PLGA-PEG(6K)-PLGA、PEG-DTC、PEG-ε-CL適量，加二氯甲烷適量，漩渦振蕩，使它們分別溶于二氯甲烷中，得mPEG(5K)-PLGA、三嵌段PLGA-PEG(6K)-PLGA、PEG-DTC、PEG-ε-CL的二氯甲烷溶液，濃度為20％(W/W)，現(xiàn)用現(xiàn)配，以防二氯甲烷揮發(fā)。
2微球的制備稱取蛋白AqueSpheres微粒10mg，均勻分散于0.5g上述的二氯甲烷溶液中，mPEG(5K)-PLGA、三嵌段PLGA-PEG(6K)-PLGA、PEG-DTC、PEG-ε-CL的濃度為20％(W/W)，磁力攪拌15分鐘，轉(zhuǎn)速1800rpm，充分?jǐn)嚢枋沟玫鞍譇queSpheres微粒均勻分散于mPEG(5K)-PLGA、三嵌段PLGA-PEG(6K)-PLGA、PEG-DTC、PEG-ε-GL溶液中，將所得初乳再次分散于含1％PVA和10％氯化鈉的溶液中，以2200rpm的轉(zhuǎn)速勻漿成復(fù)乳(S/O/W)，于一分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)移到4℃的10％氯化鈉水溶液中，攪拌3～4小時后收集陳化的蛋白微球，用超純水洗滌三次，在冰相預(yù)凍過夜，再真空冷凍干燥，制得粒徑為50μm～120μm的微球。
實施實例5微球的制備一、制備載蛋白多糖玻璃體按照實例1方法三、載有蛋白-多糖玻璃體的微球制備精確稱取PLGA適量，加二氯甲烷適量，漩渦振蕩，使PLGA溶于二氯甲烷中，得PLGA的二氯甲烷溶液，濃度為20％(W/W)，現(xiàn)用現(xiàn)配，以防二氯甲烷揮發(fā)。稱取蛋白-多糖玻璃體微粒10mg，均勻分散于0.5g的PLGA的二氯甲烷溶液中，PLGA的濃度為20％(W/W)，磁力攪拌15分鐘，轉(zhuǎn)速1800rpm，充分?jǐn)嚢枋沟玫鞍?多糖玻璃體微粒均勻分散于PLGA溶液中，然后通過噴霧儀器，把之噴到液氮和乙醇中，再通過程序升溫硬化微球。制備的微球粒徑為50μm～120μm的微球。
這些微球可以皮下注射，形成儲庫，然后持續(xù)緩釋放蛋白藥物。這些微球中的多糖相不僅可以在制劑過程中保護(hù)蛋白，還可以用來改善其釋放動力學(xué)。對于給定蛋白擔(dān)載量的微球來說，多糖的用量是一個方便的因素可用來調(diào)控蛋白分子的釋放速率和釋放模式。增加多糖的用量，則釋放速率提高，不完全釋放的問題得到改善，但突釋的可能性增大。減小多糖的用量則起到相反的效果。仔細(xì)地選擇多糖的用量同時結(jié)合可降解高分子的分子量及親水-疏水性能可以達(dá)到既控制突釋，又避免不完全釋放的目的。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)-多糖玻璃體微粒緩釋微球的制備方法，其特征在于，包括如下步驟①把蛋白質(zhì)加入多糖溶液，通過水相-水相冷凍分離使蛋白質(zhì)被分配在多糖分散相中；②將載有蛋白分子的多糖和聚乙二醇溶液冷凍相分離，再將體系冷凍干燥，得干粉；③將所得的凍干粉加入可溶聚乙二醇的有機溶液洗滌，除去聚乙二醇，得到載有蛋白的多糖玻璃體微粒的直徑在0.06微米-10微米；④將含有多糖玻璃體微粒分散在緩釋注射的高分子；⑤將蛋白以外的試劑用同樣的方法擔(dān)載于多糖玻璃體微粒中；⑥通過將蛋白-多糖玻璃體微粒分散在油溶的高分子溶液中形成初乳，再分散在水相中形成復(fù)乳，或者通過將多糖玻璃體微粒分散在油溶的可降解高分子溶液中形成初乳，再分散在另一油相中形成復(fù)乳，或者通過噴霧干燥法制備微球，或者添加到各種凝膠中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)-多糖玻璃體微粒緩釋微球的制備方法，其特征是，所述的蛋白-多糖玻璃體，其蛋白質(zhì)0.01％-50％、多糖為0.01％-50％，保護(hù)劑0％-10％，聚乙二醇為20％-80％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)-多糖玻璃體微粒緩釋微球的制備方法，其特征是，所述的保護(hù)劑為緩沖物質(zhì)、鹽類和小分子糖類物質(zhì)，其濃度為多糖的重量百分比的0-10％。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)-多糖玻璃體微粒緩釋微球的制備方法，其特征是，所述的保護(hù)劑為Mg(OH)2、ZnCO3、及MgCO3，鹽類為Zn(AC)2、ZnCl2、CaSO4、MgSO4，小分子糖類為海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)-多糖玻璃體微粒緩釋微球的制備方法，其特征是，所述的高分子，指聚酯、聚酸酐、或骨架非肽鍵的聚氨基酸，其中包括聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸及其組合；還包括硅像膠、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、卡波母、透明質(zhì)酸、明膠、膠原蛋白、聚乙交酯、聚己內(nèi)酯、聚氰基丙烯酸酯、聚膦腈、聚磷酸酯、纖維蛋白原、纖維蛋白、凝膠包括聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚羥基乙酸、聚羥基乙酸-聚乙二醇-聚羥基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸溫敏型水凝膠、糖敏型凝膠和酸敏型凝膠。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)-多糖玻璃體微粒緩釋微球的制備方法，其特征是，所述的蛋白質(zhì)為促紅細(xì)胞生成素、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、疫苗、干擾素、生長激素、胰島素、表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素樣生長因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、血小板生長因子、內(nèi)皮生長因子、神經(jīng)生長因子、骨衍生性生長因子、骨形成蛋白、組織多肽抗原、抗體、凝血因子VIII及IX遺傳因子和用于治療的蛋白質(zhì)或多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)-多糖玻璃體微粒緩釋微球的制備方法，其特征是，所述的蛋白以外的試劑為反義核苷酸、小分子RNA、基因、抗體、疫苗、或脂質(zhì)體。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的蛋白質(zhì)－多糖玻璃體微粒緩釋微球的制備方法。包括如下步驟①把蛋白質(zhì)加入多糖溶液，通過冷凍分離，使蛋白質(zhì)被分配在多糖分散相中；②將溶液冷凍相分離，再將體系冷凍干燥，得干粉；③將有機溶液洗滌，除去聚乙二醇，得到微粒；④將微粒分散在緩釋注射的高分子；⑤將蛋白以外的試劑用同樣的方法擔(dān)載于多糖玻璃體微粒中；⑥通過將微粒分散在溶液中形成初乳，再分散在水相中形成復(fù)乳，或者通過微粒分散在溶液中形成初乳，再分散在另一油相中形成復(fù)乳，或者通過噴霧干燥法制備微球，或者添加到各種凝膠中。本發(fā)明對蛋白大分子藥物的制劑方法適用于諸如多肽、DNA、疫苗、抗體、或脂質(zhì)體等其他結(jié)構(gòu)脆弱的試劑。
文檔編號A61K38/37GK1887274SQ200610029128
公開日2007年1月3日 申請日期2006年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月20日
發(fā)明者金拓, 袁偉恩, 吳飛 申請人:上海交通大學(xué)