專利名稱：芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖苷－4＇－O－α－L－鼠李糖苷的新應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷-4′-O-α-L-鼠李糖苷的新應(yīng)用，特別是在防治缺血性疾病方面的新用途。
背景技術(shù)：
芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷-4′-O-α-L-鼠李糖苷(結(jié)構(gòu)式如式I所示)， 式I英文名為apigenin-7-O-β-D-glucopyranosyl-4′-O-α-L-rhamnopyranosid，為黃酮苷類化合物，可從毛茛屬植物、如揚(yáng)子毛茛(Ranunculus sieboldii)及石龍芮毛莨(R.sceleratus)中提取分離到，在體外初步測(cè)試具有抗癌、及抗HBV和HSV-1病毒活性(潘云雪，周長(zhǎng)新等.揚(yáng)子毛茛中的化學(xué)成分研究.中國(guó)中藥雜志2001，26(8)546-548；Li H，Zhou C，et al.Evaluation of antiviralactivity of compounds isolated from Ranunculus sieboldii and Ranunculussceleratus.Planta Med 2005，71(12)1128-1133)。目前尚未見其有其他方面應(yīng)用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種式I化合物芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷-4′-O-α-L-鼠李糖苷的新用途，特別是在制備防治缺血性疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所說(shuō)的缺血性疾病是指由于供血系統(tǒng)循環(huán)障礙、特別是動(dòng)脈輸入的血量減少而造成生物體組織、器官缺血缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致其功能障礙的一類疾病。常見的缺血性疾病包括冠心病、腦供血不足、腦梗塞等心、腦血管缺血性疾病。近年來(lái)，這類疾病發(fā)病率及病死率一直高居首位，研究挖掘防治其的新藥是醫(yī)藥行業(yè)的重點(diǎn)之一。
本發(fā)明通過(guò)垂體后葉素引起大鼠心肌缺血模型、異丙腎上腺素(ISO)引起大鼠心肌缺血模型、豚鼠離體心臟模型研究了式I化合物對(duì)心肌缺血的預(yù)防作用以及對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示式I化合物10-7-10-5g/ml可使離體豚鼠心臟的心率顯著性降低、心肌收縮力顯著性降低、心輸出量顯著性降低，影響的最大幅度均在10％左右，且各作用均與給藥濃度正相關(guān)，故式I化合物10-7-10-5g/ml可使離體豚鼠心臟的心肌耗氧量有明顯的降低，預(yù)期對(duì)心肌缺血有保護(hù)作用。靜脈注射式I化合物2.5-5mg/kg可以非常顯著性降低0.25、0.5分鐘時(shí)由垂體后葉素引起的心電圖J點(diǎn)位移(p＜0.01)，顯著性降低1分鐘時(shí)由垂體后葉素引起的心電圖J點(diǎn)位移(p＜0.05)；式I化合物5mg/kg可以顯著性降低0.25、0.5、1分鐘時(shí)由垂體后葉素引起的心電圖T波振幅變大(p＜0.05)；故靜脈注射式I化合物2.5-5mg/kg對(duì)由垂體后葉素所引起的大鼠心肌缺血有明顯的抑制作用。預(yù)先靜脈注射式I化合物2.5mg/kg可以顯著性降低ISO引起的大鼠心電圖J點(diǎn)位移和血漿中LDH水平(p＜0.05)；5mg/kg可以非常顯著性降低ISO引起的大鼠心電圖J點(diǎn)位移和血漿中LDH水平(p＜0.01)，式I化合物各劑量組均呈現(xiàn)抗心肌缺血作用，并與劑量正相關(guān)；故預(yù)先靜脈注射式I化合物2.5-5mg/kg對(duì)ISO引起的大鼠心肌缺血有顯著的抑制作用，并可減輕缺血心肌的損傷。因此，式I化合物對(duì)心肌有顯著的缺血保護(hù)作用。
另外，本發(fā)明通過(guò)以光化學(xué)法致大鼠局部性腦缺血模型進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，初步證明靜脈注射式I化合物2.5～5mg/kg對(duì)腦缺血性疾病有一定治療作用。
可見，本發(fā)明人通過(guò)上述諸多的研究及藥物篩選試驗(yàn)，意外地發(fā)現(xiàn)上述式I化合物具有防治缺血性疾病、特別是心、腦血管缺血性疾病的作用；而且該化合物從天然植物中提取，具有更低的毒性。
具體實(shí)施例方式
下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。
實(shí)施例1式I化合物的提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定1.提取和分離可以根據(jù)上述文獻(xiàn)公開的方法進(jìn)行提取和分離，本發(fā)明稍作改良，采用下列步驟干燥揚(yáng)子毛茛藥材(市售，產(chǎn)地四川成都)以70％乙醇浸泡后滲漉，滲漉液減壓濃縮后過(guò)D101型大孔樹脂(天津正天成澄清技術(shù)有限公司)，依次以水、30％乙醇、60％乙醇、95％乙醇洗脫。收集60％乙醇洗脫部分，減壓濃縮后進(jìn)行反復(fù)硅膠柱(層析硅膠200-300目，山東煙臺(tái)芝罘黃務(wù)硅膠開發(fā)試驗(yàn)廠)層析，洗脫劑為氯仿∶甲醇(體積比6∶1～4∶1)，得單體化合物I。
2.結(jié)構(gòu)鑒定化合物I淡黃色粉末，MP212-214℃，ESI-MS譜顯示m/z 579為[M+1]+，417，274，157，確定其分子量為578。其13C-NMR譜顯示該化合物有27個(gè)碳信號(hào)，DEPT譜顯示有1個(gè)甲基、1個(gè)亞甲基、17個(gè)次甲基和8個(gè)季碳信號(hào)，確定其分子式為C27H30O14，為黃酮苷類化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δppm12.89(-OH)為5位羥基氫信號(hào)，8.07(2H，d，J＝9Hz，H-2’，6’)，7.23(2H，d，J＝9Hz，H-3’，5’)，6.94(1H，s，H-3)，6.86(1H，d，J＝1Hz，H-8)，6.47(1H，d，J＝1Hz，H-6)，5.55(1H，s，H-1″，Rha-1)，表明該鼠李糖為α構(gòu)型，5.09(1H，d，J＝7Hz，H-1″，Glc-1)，表明該葡萄糖為β構(gòu)型，3.0-4.0(m)為糖上氫信號(hào)，1.13(3H，d，J＝6Hz，H-6″，Rha-6)。
13C-NMR(DMSO-d6)δppm163.62(C-2)，104.10(C-3)，181.98(C-4)，161.07(C-5)，99.58(C-6)，163.02(C-7)，94.89(C-8)，156.95(C-9)，105.39(C-10)，123.79(C-1’)，128.33(C-2’，C-6’)，116.70(C-3’，C-5’)，159.09(C-4’)，99.91(C-1-glc)，73.06(C-2-glc)，76.39(C-3-glc)，69.53(C-4-glc)，77.13(C-5-glc)，60.56(C-6-glc)，98.17(C-1-rha)，69.94(C-2-rha)，70.33(C-3-rha)，71.64(C-4-rha)，69.75(C-5-rha)，17.82(C-6-rha)。
在HMBC譜中顯示葡萄糖的端基質(zhì)子5.09(1H，d，J＝7Hz，H-1″，Glc-1)與163.02的碳(C-7)有相關(guān)，表明該葡萄糖連于7位上；鼠李糖的端基質(zhì)子5.55(1H，s，H-1″，Rha-1)與159.09的碳(C-4’)有相關(guān)，表明該鼠李糖連于4’位上。
化合物的1H-NMR、13C-NMR譜、MS譜與文獻(xiàn)(PAN Yun-xue，ZHOUChang-xin，ZHANG Shui-li，et al.Constituents from Ranunculus sieboldii Miq.[J].Journal of Pharmaceutical Sciences.2004，13(2)92-96)報(bào)道一致，確定此化合物為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖-4’-O-α-L-鼠李糖苷(apigenin-7-O-β-D-glucopyranosyl-4’-O-α-L-rhamnopyranoside)。
效果實(shí)施例1式I化合物對(duì)豚鼠離體心臟模型心率、心肌收縮力、心輸出量的影響1.1、受試藥物精確稱量實(shí)施例1制得的式I化合物300mg后用1M的Na2CO3溶液逐滴溶解，用Krebs-Henseleit營(yíng)養(yǎng)液(每1000ml含CaCl20.28g、NaCl 6.29g、KCl 0.35g、NaHCO32.1g、KH2PO40.16g、MgSO4·7H2O0.29g、葡萄糖2.1g)配至3ml，調(diào)pH至7.0，濃度為10-1g/ml，取該樣品液再依次稀釋成10-6g/ml、10-7g/ml、10-8g/ml濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。
1.2、試驗(yàn)動(dòng)物豚鼠(上海市松江區(qū)車墩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物良種)，250～350g，雄性，飼養(yǎng)于恒溫凈化通風(fēng)動(dòng)物房，自由進(jìn)食與飲水，25±2℃。
1.3、實(shí)驗(yàn)儀器LH586-1A恒溫水浴，上海市科樂(lè)理化機(jī)械廠制造；LMS-2B型二道生理記錄儀，成都儀器廠。
1.4、試驗(yàn)方法試驗(yàn)前按Langendorff法準(zhǔn)備冠流裝置及儀器，冠流裝置啟動(dòng)并恒溫半小時(shí)后進(jìn)行試驗(yàn)。冠流營(yíng)養(yǎng)液為Krebs-Henseleit溶液，通入95％O2+5％CO2使飽和。將豚鼠擊頭至昏，迅速打開胸腔，暴露心臟，剪開心包膜，剪斷與外周的連接血管，取下心臟后放入預(yù)先用95％O2+5％CO2飽和的Krebs-Henseleit液中，輕擠心室，排出心臟內(nèi)的剩余血液，將心臟套管自主動(dòng)脈插入至主動(dòng)脈瓣外，用1#絲線固定，裝上冠流裝置，以37℃95％O2+5％CO2飽和的Krebs-Henseleit液進(jìn)行冠流，冠流液壓60cmH2O。用蛙心夾夾住心尖，連接機(jī)械力換能器，調(diào)節(jié)張力至1g左右，二道生理記錄儀記錄。穩(wěn)定20～30分鐘，測(cè)定冠脈流量，直至連續(xù)3次測(cè)定的讀數(shù)相同時(shí)，開始正式實(shí)驗(yàn)。
試驗(yàn)藥物經(jīng)心臟套管側(cè)支導(dǎo)管加入灌流液中，連續(xù)恒速冠流，速度為每分鐘1ml。連續(xù)給藥3分鐘，分別記錄給藥前及給藥開始后第1、2、3、5、7、10和15分鐘的冠脈流量、心肌收縮力和心率，計(jì)算各指標(biāo)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差及各指標(biāo)變化率的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差[各自與同一標(biāo)本給藥前數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，變化率％＝(給藥后某時(shí)間點(diǎn)的絕對(duì)值-給藥前的絕對(duì)值)/給藥前的絕對(duì)值×100％]，統(tǒng)計(jì)以給藥組變化率與同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組變化率進(jìn)行組間t-檢驗(yàn)。
1.5、試驗(yàn)結(jié)果如下表1～3所示?？梢姡?0-7-10-5g/ml的式I化合物可使離體豚鼠心臟的心率顯著性降低、心肌收縮力顯著性降低、心輸出量顯著性降低，影響的最大幅度均在10％左右，且各作用均與給藥濃度正相關(guān)。
1.6、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10-7-10-5g/ml的式I化合物可使離體豚鼠心臟的心肌耗氧量有明顯的降低，預(yù)期對(duì)心肌缺血有保護(hù)作用。
表1、式I化合物對(duì)豚鼠離體心臟心率的影響(n＝8，x±S)

*p＜0.05，**p＜0.01，與空白對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)的變化率比較表2、式I化合物對(duì)豚鼠離體心臟心肌收縮力的影響(n＝8，x±S)

*p＜0.05，**p＜0.01，與空白對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)的變化率比較表3、式I化合物對(duì)豚鼠離體心臟冠脈流量的影響(n＝8，x±S)

*p＜0.05，**p＜0.01，與空白對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)的變化率比較效果實(shí)施例2式I化合物對(duì)垂體后葉素引起的大鼠心肌缺血模型的預(yù)防作用2.1、供試樣品將實(shí)施例1制得的式I化合物稱量后用1M的Na2CO3溶液逐滴溶解后，加無(wú)菌雙蒸水配制終濃度為1.25mg/ml、2.5mg/ml和5mg/ml。
2.2、陽(yáng)性對(duì)照樣品硝苯地平(上海華氏制藥有限公司天平制藥廠，批號(hào)338015，規(guī)格10mg黃色糖衣片)，用0.5％西黃蓍膠溶液研磨，配成含量為1mg/ml混懸液。
2.3、其他藥品戊巴比妥鈉(中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司，批號(hào)F20020405，用0.9％生理鹽水配成3.0％溶液)；垂體后葉素(上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號(hào)021029，6U/ml)。
2.4、試驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司)，雄性，180-220克，動(dòng)物飼養(yǎng)于正壓凈化通風(fēng)動(dòng)物房?jī)?nèi)，室溫25±2℃，自由進(jìn)食與飲水。
2.5、儀器日本NIHON-KOHDEN生產(chǎn)的ECG-6511型心電圖機(jī)。
2.6、劑量設(shè)置式I化合物本試驗(yàn)采用1.25、2.5、5mg/kg三個(gè)劑量，陽(yáng)性對(duì)照藥為鈣拮抗劑硝苯地平，劑量為10mg/kg。
2.7、實(shí)驗(yàn)方法用3.0％戊巴比妥鈉(30mg/kg，ip)麻醉，仰臥位固定，四肢皮下插入針狀電極，調(diào)整心電圖機(jī)紙速50mm·s-1，標(biāo)準(zhǔn)電壓1mV為10mm，用垂體后葉素篩選合格動(dòng)物測(cè)給予垂體后葉素前心電圖，然后舌下靜脈注射垂體后葉素0.4U/kg(濃度為0.2U/ml，0.2ml/100g)，觀察心電圖變化情況，選取對(duì)垂體后葉素敏感大鼠用于實(shí)驗(yàn)(T波明顯抬高，ST段抬高超過(guò)0.1mv)，不敏感及心電圖不正常大鼠淘汰。將篩選獲得的敏感大鼠隨機(jī)分為5組，分別為陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照硝苯地平組和式I化合物低、中、高3個(gè)劑量組，每組10只。式I化合物經(jīng)尾靜脈注射給予，體積為1ml/kg，陰性對(duì)照組靜脈注射給予同體積生理鹽水；硝苯地平口服灌胃給予，1ml/100g。式I化合物給藥后0.5小時(shí)，硝苯地平給藥后1小時(shí)，腹腔注射3.0％戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉，仰臥固定，于四肢插入針電極記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖，記錄給垂體后葉素前心電圖，然后舌下靜脈注射垂體后葉素0.4U/kg，并于5秒內(nèi)注完，于注射后即刻、15、30秒、1、2、3、4、6、8分鐘記錄動(dòng)物心電圖，統(tǒng)計(jì)舌下靜脈注射垂體后葉素后J點(diǎn)及T波改變的絕對(duì)值以及各自相對(duì)于給藥前的變化率，用t-檢驗(yàn)同陰性組同時(shí)間點(diǎn)的變化率進(jìn)行比較。
2.8、實(shí)驗(yàn)結(jié)果各給藥組對(duì)垂體后葉素致大鼠心肌缺血II導(dǎo)聯(lián)心電圖J點(diǎn)變化及T波值變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，表5。
陰性對(duì)照組動(dòng)物靜脈注射垂體后葉素后15秒至3分鐘可以引起動(dòng)物心電圖發(fā)生明顯的心肌缺血樣變化J點(diǎn)(QRS波終點(diǎn))發(fā)生位移，T波振幅變大，并在給予垂體后葉素后3分鐘達(dá)到最大。硝苯地平可以使垂體后葉素引起的心肌缺血得到非常明顯的緩減，J點(diǎn)位移和T波振幅均較模型組明顯降低。式I化合物各給藥組對(duì)J點(diǎn)位移以及T波振幅變大均有較明顯的改善作用，且與劑量正相關(guān)。式I化合物2.5-5mg/kg可以非常顯著性降低0.25、0.5分鐘時(shí)由垂體后葉素引起的J點(diǎn)位移(p＜0.01)，顯著性降低1分鐘時(shí)由垂體后葉素引起的J點(diǎn)位移(p＜0.05)；式I化合物5mg/kg可以顯著性降低0.25、0.5、1分鐘時(shí)由垂體后葉素引起的T波振幅變大(p＜0.05)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，式I化合物2.5-5mg/kg靜脈注射給藥可以顯著性降低由垂體后葉素引起的心肌缺血性心電圖改變。
2.9、小結(jié)靜脈注射式I化合物2.5-5mg/kg對(duì)由垂體后葉素所引起的大鼠心肌缺血有明顯的改善作用。
表4.式I化合物對(duì)垂體后葉素大鼠心電圖J點(diǎn)的影響(mv，n＝10，x±S)

*p＜0.05，**p＜0.01，與陰性對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)的改變值比較表5.式I化合物對(duì)垂體后葉素大鼠心電圖T波的影響(mv，n＝10，x±S)

*p＜0.05，**p＜0.01，與陰性對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)的改變值比較效果實(shí)施例3式I化合物對(duì)異丙腎上腺素(ISO)所至大鼠心肌缺血治療作用的研究3.1、供試樣品將實(shí)施例1制得的式I化合物精確稱量后用1M的Na2CO3溶液逐滴溶解后，加無(wú)菌雙蒸水配制終濃度為1.25mg/ml、2.5mg/ml和5mg/ml。
3.2、對(duì)照樣品普萘洛爾(上海辛帕斯制藥有限公司，批號(hào)051001，規(guī)格10mg白色片劑)，加入0.5％西黃蓍膠溶液配成含量為2mg/ml混懸液。
3.3、其他藥品水合氯醛中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司，AR，批號(hào)20030227，用雙蒸水配成12％的溶液；異丙腎上腺素臨用前用生理鹽水配成8mg/ml的溶液；乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20060311)。
3.4、試驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司)，雄性，180-220克，動(dòng)物飼養(yǎng)于正壓凈化通風(fēng)動(dòng)物房?jī)?nèi)，室溫25±2℃，自由進(jìn)食與飲水。
3.5、儀器ECG-6511型心電圖機(jī)(日本NIHON-KOHDEN生產(chǎn))。
3.6、劑量設(shè)置式I化合物本試驗(yàn)采用1.25、2.5、5mg/kg三個(gè)劑量，陽(yáng)性對(duì)照藥為β受體拮抗劑普萘洛爾，劑量為8mg/kg。
3.7、實(shí)驗(yàn)方法健康雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為空白(正常)對(duì)照組、模型對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照普萘洛爾組和式I化合物1.25、2.5、5mg/kg三個(gè)劑量組。空白對(duì)照組和模型對(duì)照組分別預(yù)先靜脈注射給予生理鹽水(同給藥組等容量)，式I化合物各劑量組分別靜脈注射給藥，每日1次，體積為1ml/kg體重，普萘洛爾組為灌胃給藥，給藥體積為1ml/100g，均連續(xù)給藥三天。模型對(duì)照組和式I化合物各劑量組第二天和第三天給藥0.5h后給予ISO(0.1ml/100g體重，s.c.)，普萘洛爾第二天和第三天給藥1h后給予ISO，正常對(duì)照組給予等容量的生理鹽水(s.c.)，分別記錄最后一次給受試藥物前及第2次注射ISO后30min的心電圖(標(biāo)準(zhǔn)II導(dǎo)聯(lián))，測(cè)量J點(diǎn)值，計(jì)算注射ISO后各組大鼠J點(diǎn)位移的絕對(duì)值。大鼠腹主動(dòng)脈采血，肝素抗凝后離心分離血漿，分光光度法測(cè)定血漿中LDH活性單位。各給藥組統(tǒng)計(jì)結(jié)果和模型組比較進(jìn)行t-檢驗(yàn)。乳酸脫氫酶計(jì)算公式如下


3.8、實(shí)驗(yàn)結(jié)果各組對(duì)ISO致大鼠心肌缺血II導(dǎo)聯(lián)心電圖J點(diǎn)位移變化見表6。各組對(duì)ISO致大鼠心肌缺血LDH活性單位變化見表7。
表6、式I化合物對(duì)ISO所致大鼠心肌缺血J點(diǎn)位移的影響(n＝8，x±S)

*p＜0.05，**p＜0.01，與模型組比較表7、式I化合物對(duì)ISO大鼠s.c.后LDH活性單位的影響(n＝8，x±S)

*p＜0.05，**p＜0.01，與模型組比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在大鼠皮下注射(s.c.)ISO后，模型組動(dòng)物出現(xiàn)J點(diǎn)位移增大，血漿中LDH活力單位增加的顯著性心肌缺血改變。陽(yáng)性藥普萘洛爾20mg/kg口服給藥可以非常顯著性降低由ISO引起的J點(diǎn)位移增加(p＜0.01)；顯著性降低由ISO引起的血漿LDH升高(p＜0.05)。式I化合物2.5mg/kg可以顯著性降低J點(diǎn)位移和血漿中LDH水平(p＜0.05)；式I化合物5mg/kg可以非常顯著性降低J點(diǎn)位移和血漿中LDH水平(p＜0.01)，式I化合物各劑量組均呈現(xiàn)抗心肌缺血作用，并與劑量正相關(guān)。
3.9、小結(jié)式I化合物2.5～5mg/kg對(duì)ISO引起的大鼠心肌缺血有顯著的抑制作用，并可減輕缺血心肌的損傷，因此對(duì)心肌有明顯的缺血保護(hù)作用。
4、結(jié)論從效果實(shí)施例1～3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10-7-10-5g/ml的式I化合物可使離體豚鼠心臟的心肌耗氧量有明顯的降低，預(yù)期對(duì)心肌缺血有保護(hù)作用。靜脈注射式I化合物2.5-5mg/kg對(duì)由垂體后葉素所引起的大鼠心肌缺血有明顯的抑制作用。靜脈注射式I化合物2.5-5mg/kg對(duì)ISO引起的大鼠心肌缺血有顯著的抑制作用，并可減輕缺血心肌的損傷，式I化合物對(duì)心肌有顯著的缺血保護(hù)作用。
效果實(shí)施例4式I化合物對(duì)光化學(xué)法致大鼠腦缺血模型的治療作用4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司)，雄性，200～250克，飼養(yǎng)于恒溫凈化通風(fēng)動(dòng)物房，自由進(jìn)食與飲水，25±2℃。
4.2受試樣品將實(shí)施例1制得的式I化合物精確稱量后用1M的Na2CO3溶液逐滴溶解后，加無(wú)菌雙蒸水配制終濃度為2.5mg/ml和5mg/ml。
4.3其它試劑水合三氯乙醛(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)20030227)；實(shí)驗(yàn)用光敏感染料玫瑰紅B(ACROS ORGANICS，New Jersey USA，批號(hào)A008292305)；
紅四氮唑(TTC)(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)F20050620)。
4.4實(shí)驗(yàn)儀器LGS100-2醫(yī)用冷光源(上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠一分廠生產(chǎn))；307-6臺(tái)式牙鉆車(上海齒科醫(yī)械廠生產(chǎn))；SXP-1B手術(shù)顯微鏡(上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠生產(chǎn))。
4.5動(dòng)物分組隨機(jī)分為3組，每組6只。
第1組陰性對(duì)照組 生理鹽水第2組式I化合物低劑量2.5mg/kg第3組式I化合物高劑量5mg/kg4.6實(shí)驗(yàn)方法取雄性Wistar大鼠，體重200-250g，共18只，隨機(jī)分成3組。樣品在中動(dòng)脈在顯微鏡下確定已完全閉塞后立即靜脈注射給藥，給藥體積為0.1ml/100g。陰性對(duì)照組給同等體積的溶劑生理鹽水。
將大鼠以12％的水合氯醛腹腔注射麻醉(450mg/kg)后，側(cè)臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。沿右外耳道與右眼外眥連線的中點(diǎn)垂直于連線切開皮膚約2cm然后在手術(shù)顯微鏡下分離顳肌至其與顴弓的交界處，在顴弓與顳鱗骨結(jié)合處的前端2mm處用牙科鉆作一直徑為5mm的骨窗，切開硬腦膜即可清晰看到MCA(大腦中動(dòng)脈)近側(cè)段跨越嗅束。選擇MCA起始部或嗅束內(nèi)側(cè)2mm到大腦下靜脈之間的部位為光照部位，首先將由光導(dǎo)纖維射出的光束(光投射孔徑3mm)垂直放MCA表面，經(jīng)股靜脈注射3％的玫瑰紅B(30mg/kg體重)，持續(xù)照射30min(光照強(qiáng)度為12V，100W)，在顯微鏡下證實(shí)MCA已消失，方可認(rèn)為閉塞模型已形成。
術(shù)后24小時(shí)用單盲法進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，評(píng)分方法為(1)提鼠尾離開地面約1尺，觀察前肢情況。正常大鼠兩前肢對(duì)稱地伸向地面。如果有左肩內(nèi)旋，左前肢內(nèi)收現(xiàn)象發(fā)生者，評(píng)分為4分，否則為0分。(2)將動(dòng)物置平滑地板上分別推左(或右)肩向?qū)?cè)移動(dòng)，檢查抵抗推動(dòng)的阻力。正常大鼠雙側(cè)阻力明顯且對(duì)稱。如果推右肩向左側(cè)移動(dòng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)阻力下降者，根據(jù)下降程度的不同，評(píng)分為1-3分。(3)將動(dòng)物兩前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察兩前肢的肌張力。正常大鼠兩前肢張力明顯且對(duì)稱。而發(fā)生左前肢張力下降者，根據(jù)下降程度的輕重評(píng)為0-3分。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)打分，滿分10分。評(píng)分完畢，斷頭取腦。將大腦平均冠狀分為5片，放于TTC溶液中，37℃溫育10～15min染色。梗死區(qū)不著色，正常腦組織染成紅色。用生理鹽水沖洗后數(shù)碼照相，圖像輸入電腦，用Osiris軟件測(cè)定壞死區(qū)面積及全腦面積，計(jì)算壞死區(qū)面積占全腦面積的百分比。所有的數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用t檢驗(yàn)。
4.7實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8所示表8.式I化合物對(duì)大鼠光化學(xué)法局部性腦缺血模型的治療作用

與陰性對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01可見，式I化合物能改善大鼠行為學(xué)評(píng)分，減小腦壞死百分率，在2.5和5mg/kg的劑量下均顯示出較好的治療效果，與陰性組比較有顯著性差異(P＜0.05)，且效果與劑量有正相關(guān)性。
4.8結(jié)論通過(guò)大鼠體內(nèi)試驗(yàn)，初步證明靜脈注射式I化合物2.5及5mg/kg對(duì)腦缺血性疾病有一定治療作用。
從上述各效果實(shí)施例的結(jié)果可以看出，式I化合物芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷-4′-O-α-L-鼠李糖苷在防治缺血性疾病，特別是心、腦缺血性疾病方面具有良好的效果，可制備成應(yīng)用于此方面的新藥。
權(quán)利要求
1.式I化合物芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷-4′-O-α-L-鼠李糖苷 式I在制備防治缺血性疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述缺血性疾病為心和/或腦血管缺血性疾病。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖苷－4′－O－α－L－鼠李糖苷在制備防治缺血性疾病，特別是心、腦血管缺血性疾病的藥物中的新應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P9/00GK101053570SQ20061002562
公開日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2006年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月12日
發(fā)明者夏玉葉, 閔旸, 鐘雁, 盛雨辰, 郭美麗, 鄭曉娟 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院