專利名稱：地黃葉提取物及其制備方法和用途、用該提取物制備的藥物的制作方法
專利說(shuō)明地黃葉提取物及其制備方法和用途、用該提取物制備的藥物 本發(fā)明涉及一種植物有效成份的提取，尤其涉及一種地黃葉提取物及其制備方法和用途，以及用該提取物制備的藥物。玄參科植物地黃(Rehamnnia glutinosa Libosch)是公知的中藥材，常與其它中藥材配伍治療腎功能疾病，例如經(jīng)方《六味地黃丸》、 《金匱腎氣丸》等，地黃都是起主要作用的“君”藥。依照傳統(tǒng)，地黃是以它的塊根入藥，其葉則廢棄不用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，地黃葉/莖葉中所含主要成分是地黃葉總苷，而地黃的塊根不含地黃葉總苷，地黃葉總苷具滋陰補(bǔ)腎，涼血活血，攝精止血?？捎糜诘鞍啄?、血尿、慢性腎小球腎炎屬氣陰兩虛證，在中藥材資源日益匱乏的今天，應(yīng)充分利用地黃資源，挖掘地黃葉的藥用價(jià)值，使其物盡其用。目前尚無(wú)用地黃葉提取有效成分地黃葉總苷作為藥用或其它用途。發(fā)明目的本發(fā)明的首要目的，是提供一種含有效成分地黃葉總苷的地黃葉提取物及其制備方法。
本發(fā)明的另一目的，是提供一種地黃葉提取物的用途。
本發(fā)明的再一目的，是提供一種以地黃葉總苷為有效成分的藥物，尤其是一種主要用于治療腎功能疾病的藥物。
技術(shù)方案本發(fā)明的目的是這樣來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的地黃葉提取物，該提取物含有有效活性成分地黃葉總苷。地黃葉總苷的主要成分是麥角甾苷類，其干品含麥角總甾苷以麥角甾苷計(jì)的含量≥50％，麥角甾苷的含量≥25％。
本發(fā)明地黃葉提取物的制備方法，采取如下步驟①.將地黃葉/莖葉直接或粉碎后，采用溶劑加熱回流提取法或超臨界流體萃取提取法，得提取液。
②.將提取液過(guò)濾，回收溶劑并濃縮至相對(duì)密度1.01～1.10的濃縮液a。
③.將濃縮液a靜置澄清，取上清液通過(guò)吸附樹脂柱，用樹脂柱體積1～6倍量的水洗脫吸附樹脂柱，棄去水液，再用樹脂柱體積1～6倍量的濃度為20～96％的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度1.01～1.10的濃縮液b。
④.將濃縮液b靜置澄清，取上清液通過(guò)吸附樹脂柱，用水洗脫吸附樹脂柱至流出的液體近中性，棄去水液，再用樹脂柱體積1～3倍量的濃度為10～20％的乙醇洗脫，棄去乙醇洗脫液，繼以樹脂柱體積1～6倍量濃度為60～96％的乙醇洗脫，回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度1.20～1.40的浸膏，即得產(chǎn)品地黃葉總苷浸膏。
⑤.將浸膏干燥，即得產(chǎn)品地黃葉總苷固體。
上述步驟①所述的溶劑加熱回流提取法中，溶劑在50～100℃條件下回流提取1～3次，每次0.5～1.5小時(shí)，合并提取液。溶劑選用(a).水、甲醇、乙醇中的一種溶劑；或者(b).水或甲醇或乙醇與醋酸組成的混合溶劑中的一種，其用量體積比為，濃度30～96％乙醇或濃度30～96％甲醇或水∶醋酸＝80～99.99∶20～0.01(V∶V)；或者(c).在上述(a)、(b)中任意兩種或多種任意比例所組成的混合溶劑。所述溶劑優(yōu)選乙醇。
上述步驟③所述乙醇中含有0.01～10％的醋酸(V∶V)；步驟③所述的吸附樹脂柱采用D201、D101、H103、X-5、NKA-II等大孔吸附樹脂柱中的一種。
上述步驟④所述的吸附樹脂柱采用SP825、HP-20型等大孔吸附樹脂柱中的一種。
上述步驟⑤浸膏干燥方法可以是低溫干燥或者是噴霧干燥。
因地黃葉總苷在高溫、高濕條件下不穩(wěn)定，因此在本發(fā)明的提取溶劑中加入了醋酸，以提高其在制備過(guò)程中的穩(wěn)定性，并可保證產(chǎn)品收率和藥物制劑的有效性。
采用上述方法制得的地黃葉提取物，是一種組合物，除地黃葉總苷以外，還含有其它組分，但地黃葉總苷含量高，可達(dá)75％以上。該地黃葉總苷以干品計(jì)算含麥角總甾苷以麥角甾苷計(jì)≥50％；含麥角甾苷≥25％。
藥理學(xué)研究表明，地黃葉總苷的功能主治滋陰補(bǔ)腎、涼血活血，攝精止血。用于蛋白尿、血尿、慢性腎小球腎炎；屬氣陰兩虛證，癥見面色無(wú)華、少氣乏力、手足心熱、腰痛、浮腫、疲倦乏力、口干咽燥、咽喉腫痛、頭暈耳鳴、舌紅少苔、脈細(xì)弱等。
上述地黃葉提取物的用途可用于制備治療疾病的藥物或制備保健食品。
上述地黃葉提取物的用途尤其是用于制備一種主要用于治療腎功能疾病的藥物，該藥物含有效活性成分地黃葉總苷。
上述用于制備治療腎功能疾病的藥物，是用于治療蛋白尿、血尿、慢性腎小球腎炎等腎功能疾病的藥物。
上述用于制備保健食品，是用于制備免疫調(diào)節(jié)類和抗疲勞類的保健食品。
所述的保健食品，該保健食品中含有地黃葉提取物地黃葉總苷。
所制備的治療腎功能疾病的藥物，該藥物含有效活性成分地黃葉總苷。
所制備的治療腎功能疾病的藥物，該藥物是由地黃葉總苷加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。其地黃葉總苷、輔料或輔助性成分的重量配比組分為黃葉總苷1～100％，輔料(或輔助性成分)0～99％。
上述藥劑可以是藥劑學(xué)上所說(shuō)的任何一種劑型。
上述藥物的劑型是膠囊劑、軟膠囊劑、片劑(包括口服普通片、含片、咀嚼片、泡騰片、緩釋片、控釋片)、顆粒劑、丸劑、散劑、合劑、糖漿劑。
有益效果本發(fā)明提取、利用地黃葉中的有效活性成分地黃葉總苷，變廢為寶，為地黃葉開辟了應(yīng)用領(lǐng)域，充分利用地黃植物資源，緩解了供需矛盾。尤其是用該提取物地黃葉總苷制備的藥物，具有滋陰補(bǔ)腎、涼血活血，攝精止血之功，特別適用于蛋白尿、血尿、慢性腎小球腎炎屬氣陰兩虛證候者。本發(fā)明研制的以地黃葉總苷為有效成分的藥物，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)等五家臨床單位對(duì)本藥物其中的膠囊制劑進(jìn)行的I、II、III期臨床試驗(yàn)及藥理毒理試驗(yàn)表明具有滋陰補(bǔ)腎、涼血活血，攝精止血之功，用于蛋白尿、血尿、慢性腎小球腎炎屬氣陰兩虛證者療效顯著，安全性好。實(shí)施例一①.將地黃葉或地黃莖葉干品經(jīng)粉碎后，用50kg干地黃葉(或地黃莖葉)分別加入溶劑400L(第一次)、350L(第二次)，溶劑采用濃度80％的乙醇(其中含體積0.5％的冰醋酸)，80℃回流提取兩次，每次1小時(shí)，收集提取液。
②.將提取液濾過(guò)，取濾液在60～70℃濃縮至相對(duì)密度1.02～1.04(50-60℃)的濃縮液a。
③.將濃縮液a靜置澄清，取上清液通過(guò)D101大孔吸附樹脂柱，用樹脂柱體積2倍量的水洗脫樹脂柱，棄去水液，再用樹脂柱體積的1.5倍量的乙醇溶劑(濃度為50％的乙醇∶濃度為5％的冰醋酸＝99.5∶0.5)洗脫樹脂柱，收集乙醇洗脫液，60～70℃回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度1.02～1.04(50～60℃)的濃縮液b。
④.將濃縮液b靜置澄清，取上清液，通過(guò)SP825大孔吸附樹脂柱，用水洗脫吸附樹脂柱至流出的液體近中性，棄去水液；再用樹脂柱體積2倍量的濃度18％的稀乙醇洗脫樹脂柱，棄去該乙醇洗脫液；繼用樹脂柱體積1.5倍量濃度95％的乙醇洗脫樹脂柱，收集該洗脫液，回收乙醇并真空減壓濃縮至相對(duì)密度約1.20(60～70℃)的浸膏。
⑤.將浸膏噴霧干燥成固體，即得產(chǎn)品地黃葉總苷。本品地黃葉總苷為淺棕色至棕褐色粉末，氣微，味微苦。本品以干燥品計(jì)算，含麥角總甾苷(以麥角甾苷計(jì)C29H36015)計(jì)為58.5％；麥角甾苷(C29H36015)為27.3％。
取上述地黃葉總苷75g，粉碎成細(xì)粉，與124g淀粉混合均勻，加50％乙醇制粒，于50～60℃干燥，加入1g微粉硅膠，混均，灌裝成膠囊，制成1000粒，即得膠囊劑(含藥量75mg/粒)。
實(shí)施例二①.將地黃葉或地黃莖葉干品經(jīng)粉碎后，用50kg干地黃葉(或地黃莖葉)分別加入溶劑400L、350L溶劑，采用濃度80％的甲醇(其中含體積0.5％的冰醋酸)，80℃回流提取兩次，每次1小時(shí)，收集提取液。
②.將提取液濾過(guò)，取濾液60～70℃濃縮至相對(duì)密度1.02～1.04(50～60℃)的濃縮液a。
③.將濃縮液a靜置澄清，取上清液通過(guò)NKA-II大孔吸附樹脂柱，用樹脂柱體積3倍量的水洗脫樹脂柱。再用樹脂柱體積的3倍量的乙醇溶劑(濃度為80％的乙醇∶濃度為5％的冰醋酸＝99.5∶0.5)洗脫樹脂柱，收集乙醇洗脫液，60～70℃回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度1.02～1.04(50～60℃)的濃縮液b。
④.將濃縮液b靜置澄清，取出上清液，通過(guò)SP825大孔吸附樹脂柱，用水洗脫吸附樹脂柱，直到水液近中性，棄去水液；再用樹脂柱體積3倍量的濃度18％的稀乙醇洗脫樹脂柱，棄去該乙醇洗脫液；繼用樹脂柱體積2倍量濃度95％的乙醇洗脫樹脂柱，收集該洗脫液，回收乙醇并真空減壓濃縮至相對(duì)密度1.20～1.3(60～70℃)的浸膏。
⑤.將浸膏50～65℃干燥成固體，即得產(chǎn)品地黃葉總苷。本品地黃葉總苷為淺棕色至棕褐色粉末，氣微，味微苦。本品以干燥品計(jì)算，含麥角總甾苷(以麥角甾苷計(jì)C29H36015)計(jì)為62.8％；麥角甾苷(C29H36015)為30.4％。
取上述地黃葉總苷75g，粉碎成細(xì)粉，與124g淀粉混合均勻，加50％乙醇制粒，于50~60℃干燥，加入1g硬脂酸鎂，混均，壓制成1000片，即得藥物片劑(含藥量75mg/片)。
實(shí)施例三①.將地黃葉或地黃莖葉干品經(jīng)粉碎后，用50kg干地黃葉(或地黃莖葉)分別加入400L、350L水(其中含體積0.5％的冰醋酸)，75～85℃回流提取兩次，每次1小時(shí)，收集提取液。
②.將提取液濾過(guò)，取濾液60～70℃濃縮至相對(duì)密度1.02～1.04(50～60℃)的濃縮液a。
③.將濃縮液a靜置澄清，取上清液通過(guò)X-5大孔吸附樹脂柱，用樹脂柱體積2倍量的水洗脫樹脂柱。再用樹脂柱體積的1.5倍量的乙醇溶劑(濃度為80％的乙醇∶濃度為5％的冰醋酸＝99.5∶0.5)洗脫樹脂柱，收集乙醇洗脫液，60～70℃回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度1.02～1.04(50～60℃)的濃縮液b。
④.將濃縮液b靜置澄清，取出上清液，通過(guò)SP825大孔吸附樹脂柱，用水洗脫吸附樹脂柱，直到水液近中性，棄去水液；再用樹脂柱體積2倍量的濃度18％的稀乙醇洗脫樹脂柱，棄去該乙醇洗脫液；繼用樹脂柱體積1.5倍量濃度95％的乙醇洗脫樹脂柱，收集該洗脫液，回收乙醇并真空減壓濃縮至相對(duì)密度1.20～1.3(60～70℃)的浸膏。
⑤.將浸膏50～65℃干燥成固體，即得產(chǎn)品地黃葉總苷。本品地黃葉總苷為淺棕色至棕褐色粉末，氣微，味微苦。本品以干燥品計(jì)算，含麥角總甾苷(以麥角甾苷計(jì)C29H36015)計(jì)為50.7％；麥角甾苷(C29H36015)為25.2％。
取上述地黃葉總苷75g，粉碎成細(xì)粉，與3925g糊精混合均勻，加乙醇制粒，于50～60℃干燥，整粒，灌裝成1000袋，即得藥物顆粒劑(含藥量75mg/袋)。
實(shí)施例四①.將地黃葉或地黃莖葉干品經(jīng)粉碎后，用50kg干地黃葉(或地黃莖葉)分別加入溶劑400L、350L，溶劑采用濃度80％的乙醇(其中含體積1％的冰醋酸)，80℃左右回流提取兩次，每次1小時(shí)，收集提取液。
②.將提取液濾過(guò)，取濾液60～70℃濃縮至相對(duì)密度1.02～1.04(50～60℃)的濃縮液a。
③.將濃縮液a靜置澄清，取上清液通過(guò)D201大孔吸附樹脂柱，用樹脂柱體積2倍量的水洗脫樹脂柱。再用樹脂柱體積的2.5倍量的乙醇溶劑(濃度為70％的乙醇∶濃度為5％的冰醋酸＝99.5∶0.5)洗脫樹脂柱，收集乙醇洗脫液，60～70℃回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度1.02～1.04(50～60℃)的濃縮液b。
④.將濃縮液b靜置澄清，取出上清液，通過(guò)SP825大孔吸附樹脂柱，用水洗脫吸附樹脂柱，直到水液近中性，棄去水液；再用樹脂柱體積2倍量的濃度18％的稀乙醇洗脫樹脂柱，棄去該乙醇洗脫液；繼用樹脂柱體積1.5倍量濃度95％的乙醇洗脫樹脂柱，收集該洗脫液，回收乙醇并真空減壓濃縮至相對(duì)密度1.20～1.3(60～70℃)的浸膏。
⑤.將浸膏50-65℃干燥成固體，即得產(chǎn)品地黃葉總苷。本品地黃葉總苷為淺棕色至棕褐色粉末，氣微，味微苦。本品以干燥品計(jì)算，含麥角總甾苷(以麥角甾苷計(jì)C29H36015)計(jì)為56.2％；麥角甾苷(C29H36015)為28.6％。
取上述地黃葉總苷75g，粉碎成細(xì)粉，與200g蔗糖、70g糊精、2g甜菊素混合均勻，制粒、干燥，噴入含5ml薄荷油的乙醇溶液20ml，密閉2小時(shí)，加入硬脂酸鎂和微粉硅膠各1.5g混勻，壓制成1000片，即得藥物含片(含藥量75mg/片)。
實(shí)施例五
①.將地黃葉或地黃莖葉干品經(jīng)粉碎后，用50kg干地黃葉(或地黃莖葉)分別加入溶劑400L、350L，溶劑采用濃度60％的乙醇(其中含體積0.5％的冰醋酸)，85℃回流提取兩次，每次1小時(shí)，收集提取液。
②.將提取液濾過(guò)，取濾液60～70℃濃縮至相對(duì)密度1.02～1.04(50～60℃)的濃縮液a。
③.將濃縮液a靜置澄清，取上清液通過(guò)H103大孔吸附樹脂柱，用樹脂柱體積2倍量的水洗脫樹脂柱。再用樹脂柱體積的1.5倍量的乙醇溶劑(濃度為80％的乙醇∶濃度為5％的冰醋酸＝99.5∶0.5)洗脫樹脂柱，收集乙醇洗脫液，60～70℃回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度1.02～1.04(50～60℃)的濃縮液b。
④.將濃縮液b靜置澄清，取出上清液，通過(guò)HP-20大孔吸附樹脂柱，用水洗脫吸附樹脂柱，直到水液近中性，棄去水液；再用樹脂柱體積2倍量的濃度18％的稀乙醇洗脫樹脂柱，棄去該乙醇洗脫液；繼用樹脂柱體積2倍量濃度90％的乙醇洗脫樹脂柱，收集該洗脫液，回收乙醇并真空減壓濃縮至相對(duì)密度1.20～1.3(60～70℃)的浸膏。
⑤.將浸膏50～65℃干燥成固體，即得產(chǎn)品地黃葉總苷。本品地黃葉總苷為淺棕色至棕褐色粉末，氣微，味微苦。本品以干燥品計(jì)算，含麥角總甾苷(以麥角甾苷計(jì)C29H36015)計(jì)為52.6％；麥角甾苷(C29H36015)為26.3％。
取上述地黃葉總苷75g，粉碎成細(xì)粉，與200g蔗糖、72g糊精、1.5g桔子香精混勻，干燥，加入硬脂酸鎂和微粉硅膠各1.5g混勻，壓制成1000片，即得藥物咀嚼片(含藥量75mg/片)。
實(shí)施例六取實(shí)施例一所得地黃葉總苷75g，與53.5g蔗糖、180g淀粉、混勻，制粒，干燥，得干顆粒；加入枸櫞酸和碳酸氫鈉各20g混勻，再加入1.5g硬脂酸鎂混勻，壓制成1000片，即得藥物泡騰片(含藥量75mg/片)。
實(shí)施例七取實(shí)施例一所得地黃葉總苷75g，與75g的助懸劑(氫化大豆油1份植物油4份)加入150g食用植物油中制成的混合物，用膠體磨研磨混勻制得軟膠囊內(nèi)容物，將該內(nèi)容物用壓制法制成1000粒軟膠囊。該軟膠囊囊殼用明膠∶甘油∶蒸餾水(重量比100∶35∶80)制成，即得藥物軟膠囊劑(含藥量75mg/粒)。
實(shí)施例八取實(shí)施例一所得地黃葉總苷75g，加200ml純化水溶解，過(guò)濾，加40％單糖漿ml，混勻，加純化水稀釋至1L，加入山梨酸鉀混勻，灌裝，滅菌，得藥物合劑1000ml。
在上述實(shí)施例中，步驟①所用溶劑中，可以不含醋酸。
如需制成丸劑、散劑、糖漿劑、緩釋片及控釋片等其它劑型，其地黃葉總苷、輔料或輔助性成分的重量配比組分為地黃葉總苷10～70％，輔料或輔助性成分90～30％，按現(xiàn)有常規(guī)制劑方法，即制得。
實(shí)施例九地黃葉提取物的制備方法，與上述實(shí)施例一不同的是在步驟①中，提取液的提取方法采用超臨界流體萃取提取法取地黃葉/莖葉(或粉碎)，超臨界CO2流體萃取提取，收集提取液。其中萃取壓力為38MPa，萃取溫度為63℃，萃取流量為20L/h，分離壓力為6.5MPa，分離溫度為33℃。其他步驟與實(shí)施例一相同。
以下通過(guò)成都中醫(yī)藥大學(xué)及四川大學(xué)華西醫(yī)院等其他四家醫(yī)院對(duì)本藥物膠囊劑(實(shí)施例一)的I、II、III期臨床試驗(yàn)及藥理毒理試驗(yàn)，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明地黃葉提取物用于治療腎功能疾病的蛋白尿、血尿、慢性腎小球腎炎等的療效顯著性和用藥安全性。
1.I期臨床試驗(yàn)1.1試驗(yàn)?zāi)康倪x擇健康志愿者，從絕對(duì)安全的初始劑量開始，考察正常人體對(duì)本藥物的耐受性和安全性，為制定本藥物的II期臨床試驗(yàn)區(qū)給藥方案提供依據(jù)。
1.2單次給藥耐受性試驗(yàn)設(shè)50mg、100mg、150mg、250mg、350mg、500mg等閃個(gè)劑量組，結(jié)果從最小劑量50mg到最大劑量500mg，均未出現(xiàn)不良反應(yīng)，表明正常人體對(duì)該藥物單次給藥的耐受性較好。
1.3在單次給藥耐受性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了連續(xù)給藥耐受性試驗(yàn)，根據(jù)單次給藥耐受性試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合本藥物所用原料的主要成分的臨床應(yīng)用，本膠囊劑連續(xù)給藥耐受性試驗(yàn)的給藥方案確定為低劑量組口服，每次75mg，1日3次，連續(xù)給藥7天；高劑量組口服，每次150mg，1日3次，連續(xù)給藥7天。
連續(xù)性給藥耐受性試驗(yàn)過(guò)程中，所有受試者均未出現(xiàn)不良反應(yīng)，表明正常人體對(duì)該藥物的耐受性較好，臨床使用比較安全。
2.II期臨床試驗(yàn)2.1試驗(yàn)?zāi)康膶?duì)該藥物治療慢性腎小球腎炎(氣陰兩虛證)的有效性和安全性作了初步評(píng)價(jià)。
2.2試驗(yàn)的起止日期2003年4月-2004年2月2.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)采取按試驗(yàn)中心分層、區(qū)段隨機(jī)、雙盲、平行陽(yáng)性藥對(duì)照設(shè)計(jì)。
2.4試驗(yàn)人群符合慢性腎小球腎炎診斷及氣陰兩虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)；年齡在18-65歲之間的患者。
2.5給藥方案試驗(yàn)組本藥物膠囊劑，口服，1次2粒，1日2次。
對(duì)照組腎炎康膠囊，口服，1次2粒，1日2次。
2.6觀察指標(biāo)療效性觀察指標(biāo)1、主要指標(biāo)(1)尿蛋白；(2)尿紅細(xì)胞；(3)腎功能。
2、次要指標(biāo)中醫(yī)氣陰兩虛證證候。
安全性觀察指標(biāo)血、尿、便常規(guī)，ALT、BUN、Cr、電解質(zhì)(K+、Na+、Cl-、Ca2+、P3+)，心電圖。
2.7療程用藥8周。
2.8受試者入組情況試驗(yàn)入組240例，剔除23例，剔除率9.58％，脫落12例，脫落率5.0％。符合方案集205例(試驗(yàn)組103例，對(duì)照組102例)，符合全分析集239例(試驗(yàn)組119例，對(duì)照組120例)，符合安全性分析集239例(試驗(yàn)組119例，對(duì)照組120例)。
2.9各組有效性分析研究結(jié)果2.9.1對(duì)慢性腎小球腎炎的療效比較PP分析，試驗(yàn)組臨床控制率為14.56％，控顯率為43.69％，總有效率75.73％；對(duì)照組分別為12.75％、33.34％、61.76％，組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
FAS分析，試驗(yàn)組臨床控制率為13.45％，控顯率為42.02％，總有效率72.27％；對(duì)照組分別為10.83％、30.83％、59.17％，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，試驗(yàn)組優(yōu)于對(duì)照組。
2.9.1對(duì)蛋白尿的療效比較PP分析，試驗(yàn)組臨床控制率為35.29％，控顯率為58.82％，總有效率88.24％；對(duì)照組分別為19.00％、41.00％、74.00％，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，試驗(yàn)組優(yōu)于對(duì)照組。
FAS分析，試驗(yàn)組臨床控制率為31.36％，控顯率為55.09％，總有效率83.90％；對(duì)照組分別為16.10％、38.98％、69.49％，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，試驗(yàn)組優(yōu)于對(duì)照組。
2.9.3對(duì)血尿的療效比較PP分析試驗(yàn)組臨床控制率為28.05％，控顯率為69.21％，總有效率89.02％；對(duì)照組分別為29.63％、56.79％、76.54％，組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
FAS分析，試驗(yàn)組臨床控制率為28.57％，控顯率為68.13％，總有效率85.71％；對(duì)照組分別為27.59％、55.18％、75.86％，組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.9.4對(duì)氣陰兩虛證的療效比較PP分析，試驗(yàn)組控顯率為22.33％，總有效率90.29％；對(duì)照組分別為24.51％、76.47％，組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
FAS分析，試驗(yàn)組控顯率為22.69％，總有效率86.55％；對(duì)照組分別為24.16％、76.67％，組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.9.5兩組對(duì)面色無(wú)華，少氣乏力，手足心熱、腰痛或口干咽燥，咽喉腫痛等氣陰兩虛證癥狀均有明顯改善，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.10各組安全性分析結(jié)果臨床試驗(yàn)過(guò)程中，未觀察到試驗(yàn)藥物對(duì)心、肝功能、造血系統(tǒng)、電解質(zhì)有異常影響及其他不良反應(yīng)。
2.11結(jié)論
本藥物及其原料藥，其主要藥效成分具有滋陰補(bǔ)腎、涼血活血，攝精止血之功，用于慢性腎小球腎炎氣陰兩虛證。本期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明該藥物能顯著降低慢性腎炎患者蛋白尿和血尿水平，能明顯改善其面色無(wú)華、少氣乏力、手足心熱、腰痛、浮腫等癥狀。該藥物對(duì)慢性腎炎患者蛋白尿的療效優(yōu)于腎炎康膠囊，同時(shí)具有較好的安全性。
3、III期臨床試驗(yàn)3.1試驗(yàn)?zāi)康膶?duì)本藥物治療慢性腎小球腎炎(氣陰兩虛證)的有效性和安全性作出進(jìn)一步評(píng)價(jià)。
3.2試驗(yàn)的起止日期2004年5月-2005年3月3.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)采取按試驗(yàn)中心分層、區(qū)段隨機(jī)、雙盲、平行陽(yáng)性藥對(duì)照設(shè)計(jì)。
3.4試驗(yàn)人群符合慢性腎小球腎炎診斷及氣陰兩虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)；年齡在18-65歲之間的患者。
3.5給藥方案試驗(yàn)組本藥物膠囊劑，口服，1次2粒，1日2次。
對(duì)照組腎炎康膠囊，口服，1次2粒，1日2次。
3.6觀察指標(biāo)療效性觀察指標(biāo)1、主要指標(biāo)(1)尿蛋白；(2)尿紅細(xì)胞；(3)腎功能。
2、次要指標(biāo)中醫(yī)氣陰兩虛證證候。
安全性觀察指標(biāo)血、尿、便常規(guī)，ALT、BUN、Cr、電解質(zhì)(K+、Na+、Cl-、Ca2+、P3+)，心電圖。
3.7療程用藥8周。
3.8受試者入組情況試驗(yàn)入組480例，剔除23例，剔除率4.79％，脫落29例，脫落率6.04％。符合方案集428例(試驗(yàn)組320例，對(duì)照組108例)，符合全分析集478例(試驗(yàn)組358例，對(duì)照組120例)，符合安全性分析集478例(試驗(yàn)組358例，對(duì)照組120例)。
3.9各組有效性分析結(jié)果3.9.1對(duì)慢性腎小球腎炎的療效比較PP分析，試驗(yàn)組臨床控顯率為42.00％，總有效率75.54％；對(duì)照組分別為29.63％、69.44％，組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
FAS分析，試驗(yàn)組臨床控制率為18.56％，控顯率為42.07％，總有效率72.95％；對(duì)照組分別為16.81％、27.73％、65.55％，組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.9.2對(duì)蛋白尿的療效比較PP分析，試驗(yàn)組臨床控制率為25.81％、控顯率為54.84％，總有效率87.74％；對(duì)照組分別為19.63％、38.32％、72.90％，組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，試驗(yàn)組優(yōu)于對(duì)照組FAS分析，試驗(yàn)組臨床控制率為24.34％，控顯率為51.91％，總有效率82.12％；對(duì)照組分別為18.64％、35.59％、68.64％，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，試驗(yàn)組優(yōu)于對(duì)照組。
3.9.3對(duì)血尿的療效比較PP分析，試驗(yàn)組臨床控顯率為63.55％，總有效率81.33％；對(duì)照組分別為59.74％、85.71％，組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
FAS分析，試驗(yàn)組臨床控顯率為59.60％，總有效率76.40％；對(duì)照組分別為57.14％、82.14％，組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.9.4對(duì)氣陰兩虛證的療效比較PP分析，試驗(yàn)組控制率為1.88％，控顯率為32.82％、總有效率為93.13％；對(duì)照組分別為1.85％、25.92％、88.88％，組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
FAS分析，試驗(yàn)組控制率為1.96％、控顯率為31.29％、總有效率88.55％；對(duì)照組分別為1.67％、23.34％、85.01％，組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.9.5兩組對(duì)面色無(wú)華，少氣乏力，手足心熱，腰痛，浮腫，口干咽燥，咽喉腫痛等氣陰兩虛證癥狀均有明顯改善，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.10各組安全性分析結(jié)果臨床試驗(yàn)過(guò)程中，未觀察到試驗(yàn)藥物對(duì)心、肝功能、造血系統(tǒng)、電解質(zhì)有異常影響及其他不良反應(yīng)。
3.11結(jié)論
本期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明該藥物對(duì)慢性腎炎患者蛋白尿的療效優(yōu)于腎炎康膠囊，數(shù)據(jù)顯示本藥物膠囊劑能顯著降低慢性腎炎患者蛋白尿和血尿水平，能明顯改善其面色無(wú)華、少氣乏力、手足心熱、腰痛、浮腫及口干咽燥、咽喉腫痛等癥狀，同時(shí)具有較好的安全性。三期臨床試驗(yàn)結(jié)論與二期臨床試驗(yàn)結(jié)論具有一致性，進(jìn)一步驗(yàn)證了本藥物治療慢性腎炎的安全性及有效性。
藥理毒理試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)例1藥效試驗(yàn)本藥物膠囊劑是由原料藥地黃葉總苷制成的制劑，地黃葉總苷以20-80mg/kg小鼠口服給藥3周，20-40mg/kg大鼠口服給藥16天，對(duì)小鼠和大鼠IgG加速型腎毒血清腎炎有明顯的治療作用，表現(xiàn)在明顯降低尿蛋白、升高血漿白蛋白、降低尿素氮、膽固醇和肌酐，在大鼠實(shí)驗(yàn)的形態(tài)學(xué)觀察，地黃葉總苷可減輕腎組織的病理?yè)p傷(包括腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚，纖維化樣壞死，新月體形成等)及IgG在腎小球的沉積在大鼠C-BSA腎炎模型上，地黃葉總苷20-40mg/kg口服大鼠1個(gè)月，也有明顯的治療作用，明顯降低尿蛋白、尿素氮、膽固醇和肌酐，形態(tài)學(xué)觀察有明顯改善(包括腎小球增大、系膜增生、小球內(nèi)細(xì)胞增多等)；亦可減少IgG和C3補(bǔ)體在腎小球的沉積。地黃葉總苷對(duì)腎炎的治療作用與環(huán)磷酸胺10mg/kgip作用相似，但動(dòng)物狀態(tài)、存活率均優(yōu)于環(huán)磷酸胺組。
地黃葉總苷20-40mg/kg口服3周，對(duì)被動(dòng)Heymann腎炎有明顯的治療作用，在降低尿蛋白、改善血液生化測(cè)定值及減少IgG及C3補(bǔ)體在腎小球的沉積方面與環(huán)磷酸膠10mg/kg組作用相近。在動(dòng)物成活方面地黃葉總苷組明顯優(yōu)于環(huán)磷酸胺組。
地黃葉總苷20-40mg/kg口服可明顯抑制小鼠抗體IgM的形成，5-20mg/kg口服可提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，此結(jié)果有可能部分解釋其對(duì)腎小球腎炎的治療作用機(jī)理。地黃葉總苷15-60mg/kg一次口服有一定的利尿作用。
以上結(jié)果為本藥物臨床治療腎小球腎炎提供了藥效學(xué)依據(jù)。
實(shí)驗(yàn)例2一般藥理實(shí)驗(yàn)本藥物膠囊劑由原料藥地黃葉總苷制成的制劑，地黃葉總苷一次灌服60、30和15mg/kg(相當(dāng)于人用劑量的12、6和3倍)，觀察4小時(shí)對(duì)麻醉貓血壓、心率、心電圖、呼吸頻率和幅度無(wú)明顯影響同樣劑量對(duì)小鼠戊巴比妥閾下劑量的睡眠百分率、戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間以及小鼠自主活動(dòng)無(wú)明顯影啊。
實(shí)驗(yàn)例3毒理試驗(yàn)3.1動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)本藥物膠囊劑由原料藥地黃葉總苷制成的制劑，地黃葉總苷以動(dòng)物能耐受的最大濃度、最大體積的藥量一日內(nèi)連續(xù)灌胃小鼠各20只，雌雄各半，連續(xù)觀察7天，未發(fā)現(xiàn)死亡。總給藥量為16mg/kg(相當(dāng)于生藥1333g/kg)，相當(dāng)于臨床用量的3200倍。本實(shí)驗(yàn)為本藥物臨床安全用藥提供了參考。
3.2長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)本藥物膠囊劑由原料藥地黃葉總苷制成的制劑，以地黃葉總苷250、100和40mg/kg(相當(dāng)于臨床用量的50、20、8倍)灌服給予大鼠，以200、100和40mg/kg(相當(dāng)于臨床用量的40、20、8倍)灌服給予犬，連續(xù)26周，大鼠停藥后觀察4周，犬停藥后觀察2周，對(duì)動(dòng)物一般情況、體重均無(wú)明顯的影響，血液學(xué)檢測(cè)、血液生化指標(biāo)及尿液檢測(cè)均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)，心電圖基本正常。三組大鼠體重增長(zhǎng)及進(jìn)食量與對(duì)照組(腎炎康膠囊)比無(wú)明顯差異，食物利用率與對(duì)照組基本相同。對(duì)重要器官未引起明顯的病理變化。實(shí)驗(yàn)表明，本藥物在所試劑量范圍內(nèi)是安全的。
權(quán)利要求
1.一種地黃葉提取物，其特征在于該提取物含有有效活性成分地黃葉總苷。
2.一種權(quán)利要求1所述地黃葉提取物的制備方法，包括如下步驟①.將地黃葉/莖葉直接或粉碎后，采用溶劑加熱回流提取法，溶劑在50～100℃條件下回流提取1～3次，每次0.5～1.5小時(shí)，合并提取液；②.將提取液過(guò)濾，回收溶媒并濃縮至相對(duì)密度1.01～1.10的濃縮液a；③.將濃縮液a靜置澄清，取上清液通過(guò)吸附樹脂柱，用樹脂柱體積1～6倍量的水洗脫吸附樹脂柱，棄去水液，再用樹脂柱體積1～6倍量的濃度為20～96％的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度1.01～1.10的濃縮液b；④.將濃縮液b靜置澄清，取上清液通過(guò)吸附樹脂柱，用水洗脫吸附樹脂柱至流出的液體近中性，棄去水液，再用樹脂柱體積1-3倍量的濃度為10～20％的乙醇洗脫，棄去乙醇洗脫液，繼以樹脂柱體積1～6倍量濃度為60～96％的乙醇洗脫，回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度1.20～1.40的浸膏，即得產(chǎn)品地黃葉總苷浸膏；⑤.將浸膏干燥，即得產(chǎn)品地黃葉總苷固體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的地黃葉提取物制備方法，其特征在于所述溶劑選用(a).水、甲醇、乙醇中的一種；或者(b).水或甲醇或乙醇與醋酸組成的混合溶媒中的一種，其用量體積比，濃度30-96％乙醇或濃度30-96％甲醇或水∶醋酸＝80～99.99∶20～0.01；或者(c).在(a)、(b)中任意兩種或多種任意比例所組成的混合溶媒。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的地黃葉提取物制備方法，其特征在于步驟③所述乙醇中含有0.01～10％的醋酸(V∶V)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的地黃葉提取物制備方法，其特征在于步驟①所述的提取方法采用超臨界流體萃取提取法。
6.權(quán)利要求1所述地黃葉提取物的用途用于制備治療疾病的藥物或用于制備保健食品。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述地黃葉提取物的用途，其特征在于用于制備治療腎功能疾病的藥物。
8.一種治療腎功能疾病的藥物，其特征在于該藥物含有有效活性成分地黃葉總苷。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的治療腎功能疾病的藥物，其特征在于該藥物是由地黃葉總苷加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的治療腎功能疾病的藥物，其特征在于所述藥劑是膠囊劑、軟膠囊劑、片劑、顆粒劑、散劑、丸劑、合劑、糖漿劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種地黃葉提取物及其制備方法和用途，以及用該提取物制備的藥物。該提取物含有活性成分地黃葉總苷，制備方法包括①將地黃葉，采用溶劑加熱回流提取法或超臨界流體萃取提取法，得提取液；②將提取液過(guò)濾，回收溶劑并濃縮；③將濃縮液靜置，取上清液經(jīng)吸附樹脂柱，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇并濃縮；④將濃縮液靜置，取上清液經(jīng)吸附樹脂柱，用水洗脫吸附樹脂柱至液體近中性，再用稀乙醇洗脫，棄洗脫液，繼以乙醇洗脫，回收乙醇并濃縮至浸膏；⑤將浸膏干燥為固相，得產(chǎn)品。該提取物用于制備治療疾病的藥物或用于制備保健食品，尤其是用于制備主要治療腎功能疾病的藥物。該藥物經(jīng)臨床試驗(yàn)表明具有滋陰補(bǔ)腎、涼血活血、攝精止血之功，用于蛋白尿、血尿、慢性腎小球腎炎屬氣陰兩虛證者療效顯著，安全性好。
文檔編號(hào)A61P13/12GK1947757SQ20061002187
公開日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2006年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月16日
發(fā)明者邊寶林, 楊建 , 何緯, 張祝君, 卿光明, 李彥, 胡德模 申請(qǐng)人:四川美大康藥業(yè)股份有限公司