專利名稱：一種治療早老性癡呆的藥物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥用化合物，特別涉及抗早老性癡呆藥物。
背景技術：
早老性癡呆(AlzheimerDisease, AD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要癥狀表現(xiàn) 為記憶力減退，認知能力低下和思維遲鈍，且進行性加重，最后生活不能自理而死亡，病程 一般8 10年。隨著社會老齡化進程的加快，AD的患病人數(shù)急劇上升，已成為威脅老齡特 別是高齡人口身心健康的嚴重疾病，并帶來了嚴重的社會、經(jīng)濟和家庭問題。
AD病人主要腦病理改變是形成大量神經(jīng)原纖維纏結(neurofibrillary tangles, NFTs)和 大量老年斑、其分子標志物分別是異常磷酸化的tau蛋白和beta-淀粉樣蛋白(A-beta)。 NFTs 的數(shù)量與AD臨床癡呆程度正相關。因此，干預NFTs對AD的防治尤為重要。自從發(fā)現(xiàn) NFTs的主要成分是異常、過度磷酸化的tau蛋白聚集形成的雙螺旋絲以來，國內(nèi)外學者普 遍公認，骨架蛋白tau的異常、過度磷酸化是NFTs形成的關鍵步驟。過度磷酸化tau蛋白 的聚集不僅以纏結的形式存在，它也是神經(jīng)氈纖絲和老年斑中的營養(yǎng)不良突起的主要成分。 因此，利用異常過度磷酸化的tau蛋白、A-beta聚積形成的老年斑和記憶障礙作為藥效評價 指標，對開發(fā)AD新藥有重要意義。
到目前為止，國外唯一得到FDA批準的抗早老性癡呆的藥物是他克林及其改良產(chǎn)品。 該類藥物價格昂貴，且他克林的肝臟毒性強，因此，很難在臨床推廣應用。此外，由于他 克林類藥物是針對改善膽堿能神經(jīng)功能而設計的，而膽堿能神經(jīng)功能損傷不是早老性癡呆 患者的特征性病理改變或機制。因此，本發(fā)明人利用同時體現(xiàn)早老性癡呆樣tau蛋白和beta-淀粉樣蛋白異常和學習記憶障礙的大鼠模型，開展了對中藥有效成分的篩選和研究工作。 發(fā)現(xiàn)脫氫吳茱萸堿在早老性癡呆模型中可有效預防和逆轉tau蛋白異常磷酸化、beta-淀粉樣 蛋白異常沉積以及學習記憶障礙。
本發(fā)明的目的旨在針對早老性癡呆患者特異性腦病理改變(即A-beta沉積形成老年斑 和tau蛋白異常磷酸化聚積)以及行為學改變(即學習記憶障礙)，提供一種或多種來源于 中藥的生物堿，該生物堿對早老性癡呆樣tau蛋白、A-beta和學習記憶異常有針對性預防 和逆轉作用。
他克林類藥物是針對改善膽堿能神經(jīng)功能而設計的，而膽堿能神經(jīng)功能損傷不是早老性
癡呆患者的特征性病理改變或機制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務是提供一種治療早老性癡呆的藥物，使其具有能夠對抗早老性癡呆患者特 征性病理改變，能夠明顯減少早老性癡呆的老年斑數(shù)量，使磷酸化的tau蛋白水平明顯降低， 使學習記憶障礙得到明顯改善等特點，能夠用于早老性癡呆的預防和治療。
本發(fā)明提供的這種治療早老性癡呆的藥物是脫氫吳茱萸堿。
脫氫吳茱萸堿是如式(I)所示的化合物
上式中，X —表示陰離子，該陰離子可以是
(1) 鹵素離子，如氟離子、氯離子、溴離子、碘離子等；或
(2) 源于無機酸的陰離子，如硝酸根離子、硫酸根離子、磷酸根離子、碳酸根離子等；
或
(3) 源于有機酸的陰離子，如甲酸離子、醋酸離子、乳酸離子、谷氨酸離子等源于羧 酸的陰離子。
脫氫吳茱萸堿可按照例如J.Org.Chem.， ia ， 1246-1255(1985)中記載的化學合成方法，或 按照American Journal of Chinese Medicine W， 75-85 (1982)中記載的方法從蕓香科吳茱萸 屬植物(吳茱萸、楝葉吳茱萸等)等含脫氫吳茱萸堿的植物中提取。
本發(fā)明實驗資料
分為3個不同劑量組進行實驗，所選用的脫氫吳茱萸堿的注射劑量分別為3.125 mg/kg/day, 6. 25 mg/kg/day, 12. 5 mg/kg/day ，注射體積是2 ml，注射時間是分別為7天和 14天。具體操作步驟如下
1.尾靜脈或腹腔注射給藥
(1)尾靜脈或腹腔給藥選擇雄性Wistar大鼠，固定后在清醒情況下向尾靜脈或腹腔 注入脫氫吳茱萸堿藥液(2 ml) 7天或14天，濃度分別為3.125 mg/kg/day, 6.25
mg/kg/day， 12. 5 mg/kg/day。然后再從側腦室注射wortmannin和GFX復制早老性癡呆樣TAU 蛋白異常過度磷酸化，A-beta過量產(chǎn)生和沉積以及學習記憶障礙。觀察脫氫吳茱萸堿對這些 異常改變的預防作用。
(2)腦片培養(yǎng)給藥將大鼠海馬切成300pm的腦片，在含95°/。02和5%(:02的條件下培 養(yǎng)不同時間(30min 8h)。用CalyculinA (—種蛋白磷酸酯酶的抑制劑)復制早老性癡呆樣 TAU蛋白異常過度磷酸化，用脫氫吳茱萸堿進行干預，分為3個不同劑量組進行實驗，各組 所加入脫氫吳茱萸堿藥液濃度分別為10pM, 100pM和20(VM。
2. Morris水迷宮訓練及測試
目的通過訓練及測試來判斷用脫氫吳茱萸堿后模型大鼠學習記憶能力的變化。
實驗所采用Morris水迷宮測試系統(tǒng)主要包括大鼠行為學測試系統(tǒng)、圖象采集系統(tǒng)及微機
數(shù)據(jù)處理分析系統(tǒng)。測試用圓形水池直徑120cm，高60 cm;圓柱形有機玻璃平臺直徑10cm，
高40 cm。大鼠在訓練前2 h移入水迷宮室，并用染發(fā)劑將頭頸部涂黑，涂染面積不小于3
X3cm2,以與背景形成反差。水池中水面高約45cm，室溫及水溫均保持在26±2°C，水以
奶粉攪渾；平臺用雙層白色紗布覆蓋扎緊后任意放置于某一象限的中心位置，并沒于水面下
約2cm。整個背景均為乳白色，以避免老鼠用視覺搜尋平臺。用于指導大鼠游泳找到平臺的
紅色或蘭色標記物分別置于平臺所在象限邊緣1m左右。
訓練時將大鼠從任一象限1/2弧度處頭面向池壁輕放于水中，其游泳圖像經(jīng)水面上方1.5
m處的攝像機拍攝并連接于路徑追蹤系統(tǒng)采集，最后通過微機分析，可提供潛伏期(即大鼠
從入水點起到找到平臺所用的時間)、路徑、搜索策略等指標，本實驗選用潛伏期作為衡量
大鼠學習記憶和測試成績的指標。每只大鼠每天在4個象限共訓練4次,每次游泳時限為60s,
即在60s內(nèi)未找到平臺者系統(tǒng)自動停止記錄，潛伏期記為60s，由測試者引導其上臺，休息
30s后進行下一次訓練。
3. 分子病理學檢測
目的通過免疫印跡和免疫組化來反映造模前后以及與對照組比大鼠腦組織tau蛋白的 分子病理學變化。
(1) 免疫印跡法
頸椎脫臼斷頭處死大鼠，迅速取出大腦腦組織置于0-4。C 0.05MTris緩沖鹽溶液(TB， pH7.0)內(nèi)，快速分離雙側海馬，制成10%的蛋白勻漿，在1000rmp離心5分鐘，取上清， 測定蛋白含量后備用。
(2) 免疫組化法
用4%多聚甲醛磷酸緩沖鹽溶液(PB〉進行心臟灌注固定腦組織，待取出腦組織后再在
上述固定液中后固定6 h，即可作振蕩切片。免疫組化采用ABC法，二氨基聯(lián)苯氨 (diaminobezidin， DAB)顯色。
4. 統(tǒng)計分析
全部數(shù)據(jù)均釆用又土SD表示，利用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。
5. 藥物效果的評估
根據(jù)上述實驗步驟進行操作，結果顯示通過尾靜脈給藥7天后，兩種給藥劑量(6.25 mg/kg/day, 12.5 mg/kg/day)均可明顯改善模型鼠的學習記憶障礙，即水迷宮測試潛伏期 明顯縮短(圖l);在此基礎上，我們選擇低藥物劑量(3. 125mg/kg/day和6.25 mg/kg/day)， 延長給藥時間至14天后檢測，發(fā)現(xiàn)6.25 mg/kg/day可明顯改善模型鼠的學習記憶障礙，而 3. 125mg/kg/day則無效(圖2);通過尾靜脈給藥(6.25 mg/kg/day) 14天可明顯減少早老 性癡呆樣模型大鼠的老年斑數(shù)量(圖3);通過尾靜脈給藥(6.25 mg/kg/day) 14天磷酸化 的tau蛋白顯色明顯變淡；磷酸化的tau蛋白水平明顯降低(圖4)。上述結果說明大鼠尾靜 脈注射脫氫吳茱萸堿可明顯改善模型大鼠的腦病理學改變和學習記憶障礙。
實驗證實脫氫吳茱萸堿具有對抗早老性癡呆患者特征性病理改變的作用，能夠明顯減少 早老性癡呆的老年斑數(shù)量，使磷酸化的tau蛋白水平明顯降低，使學習記憶障礙得到明顯改 善。本發(fā)明揭示了脫氫吳茱萸堿是一種預防和治療早老性癡呆的有效藥物。


圖1和圖2大鼠尾靜脈注射脫氫吳茱萸堿可改善模型大鼠空間學習記憶功能 水迷宮研究結果顯示與模型組相比較，通過大鼠尾靜脈注射脫氫吳茱萸堿(6.25 mg/kg/day， 12.5 mg/kg/day， 2 ml) 7天能明顯縮短大鼠找到安全平臺的時間(即潛伏期， n=15; *, p<0.05)。說明尾靜脈注射兩種劑量的脫氫吳茱萸堿可改善大鼠空間記憶障礙。同 時，我們還研究了通過大鼠尾靜脈注射脫氫吳茱萸堿(6.25 mg/kg/day, 3. 125 mg/kg/day， 2 ml)14天的影響，發(fā)現(xiàn)在6. 25 mg/kg/day劑量組檢測到潛伏期明顯縮短(rpl5; *, p〈0. 05), 而在3.125 mg/kg/day劑量組則無改善作用。說明延長時間給藥并進一步降低給藥劑量可能 不能達到改善大鼠空間記憶障礙的效用。
圖3大鼠尾靜脈注射脫氫吳茱萸堿明顯減少模型大鼠的老年斑
用4%多聚甲醛磷酸緩沖鹽溶液進行心臟灌注固定腦組織，取出腦組織后再在上述固定
液中后固定6h,作振蕩切片及用ABC法作免疫組化用DAB顯色。結果顯示與模型組相
比較，通過尾靜脈給藥(6. 25 mg/kg/day) 14天可明顯減少早老性癡呆樣模型大鼠的老年斑
數(shù)量(見箭頭標示，n=15)。 A,C，F(xiàn)為對照組；B,D，E,G，H,I為模型組。A，B為海馬神經(jīng)元(X
40); C，D，E為皮質神經(jīng)元(X400) ;F,朋，I為皮質神經(jīng)元(XIOOO)。
圖4 大鼠尾靜脈注射脫氫吳茱萸堿明顯減少模型大鼠腦中tau蛋白異常過度磷酸化 操作同圖3。結果顯示與模型相比較，通過尾靜脈給藥(6.25 mg/kg/day) 14天組大
鼠的海馬區(qū)明顯的tau蛋白異常過度磷酸化水平明顯減低(/7=15;*, /X0. 01)。表現(xiàn)為tau-l (識別非磷酸化位點)抗體著色減弱，PHF-1 (識別磷酸化位點)抗體著色增強(見箭頭標示，
n=15)。
具體實施方式
實施例
大鼠尾靜脈注射脫氫吳茱萸堿對早老性癡呆的保護作用
a)實驗動物及分組
雄性Wistar大鼠(華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物實驗中心提供)，SPF級，體重250 320克，90只，常規(guī)環(huán)境飼養(yǎng)。分6組，每組15只①正常組；②假手術組；③Hcy組1 (100 (aM);④Hcy組2 (350 pM); Hey組l+葉酸/VitB12;⑥Hcy組2+葉酸/VitB12。
給大鼠注射同型半胱氨酸(homocystin， Hcy)構建復合型早老性癡呆動物模型，可選 擇尾靜脈注射、腹腔注射或側腦室注射。大鼠尾靜脈注射方法是將大鼠在清醒狀態(tài)下固定， 從尾靜脈緩慢注入(注射速度為lml/約10秒)Hcy;腹腔注射方法是將大鼠在清醒狀態(tài) 下固定，從腹腔緩慢注入(注射速度為lml/約5秒)Hcy;大鼠側腦室注射方法是將大鼠 麻醉后固定在腦立體定位儀上，清晰暴露前后囟，于前囟后1.0 1.2 mm，中線旁側1.5 1.8mm垂直進針至硬膜下約3.5 3.8 mm，用牙科水泥固定留針，緩慢注入(注射速度為 20 4/約lmin) Hcy。同型半胱氨酸homocystin的注射劑量為尾靜脈注射每次注射濃度 為100pM的同型半胱氨酸lml，每天1次，持續(xù)14天，或每周1次，持續(xù)半年；腹腔注射 每次注射濃度為100jaM的同型半胱氨酸lml，每天l次，持續(xù)14天，或每周l次，持續(xù)半 年；側腦室注射每次注射濃度為100 nM的同型半胱氨酸20 pl，每天1次，持續(xù)14天。 通過尾靜脈或腹腔或側腦室持續(xù)注射同型半胱氨酸(homocystin， Hcy)，能在大鼠復制出同 時具有老年斑(A-beta沉積)、tau蛋白異常磷酸化和學習記憶障礙的復合型早老性癡呆大 鼠模型。尾靜脈注射和腹腔注射等外周注射法具有操作簡單，重現(xiàn)性好，模型維持時間長， 所需費用低等特點。本方法構建的動物模型可用于篩選AD新藥、評價臨床治療效果和用以
研究發(fā)病機制等。 (2)主要試劑
丙烯酰胺(Arc), N, N-亞甲基雙丙烯酰(bis),四甲基乙二胺(TEMED)，十二烷基磺酸 鈉(SDS)，甘氨酸(Glycine),牛血清白蛋白(BSA)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，礬酸鈉 (Na3 V04)， beta-磷酸甘油(beta-PG),氟化鈉(NaF)， Calyculin A， wortmannin, GFX 為Sigma產(chǎn)品；過硫酸銨(AP)及考馬斯亮藍蛋白顯色液從Pierce (美國)公司購買；預染的高分子量蛋白標準從Gibco公司購買。
(3) 主要儀器
WDT-V型腦立體定位儀(西安西北光電儀器廠) STT-III型三維手動推進器(西安西北光電儀器廠) 垂直型電泳槽和濕式電轉膜槽(Hoefer, USA) 電泳儀(DF-C型，東方特力科貿(mào)中心) 轉膜儀(BI0-RAD，北京市六一儀器廠) 臺式高速離心機(Sigma，德國) 酶標儀(DG-3022型)
圖象分析系統(tǒng)(Image pro-plus kodak, USA) 衡溫雜交孵育箱(Biometra) 腦立體定位注射儀(日本)
(4) 尾靜脈注射給藥
將大鼠在清醒狀態(tài)下固定，從尾靜脈緩慢注入2ml脫氫吳茱萸堿(6.25mg/kg/day, 3.125 mg/kg/day)。
(5) Morris水迷宮訓練及測試
實驗所采用Morris水迷宮測試系統(tǒng)主要包括大鼠行為學測試系統(tǒng)、圖象采集系統(tǒng)及微機
數(shù)據(jù)處理分析系統(tǒng)。測試用圓形水池直徑120cm，高60cm;圓柱形有機玻璃平臺直徑10cm,
高40cm。大鼠在訓練前2小時移入水迷宮室，并用染發(fā)劑將頭頸部涂黑，涂染面積不小于3
X3cm2,以與背景形成反差。水池中水面高約45 cm，室溫及水溫均保持在26±2°C,水以
奶粉攪渾；平臺用雙層白色紗布覆蓋扎緊后任意放置于某一象限的中心位置，并沒于水面下
約2cm。整個背景均為乳白色，以避免老鼠用視覺搜尋平臺。用于指導大鼠游泳找到平臺的
紅色或蘭色標記物分別置于平臺所在象限邊緣1m左右。
訓練時將大鼠從任一象限1/2弧度處頭面向池壁輕放于水中，其游泳圖象經(jīng)水面上方1.5
m處的攝象機拍攝并連接于路徑追蹤系統(tǒng)采集，最后通過微機分析，可提供潛伏期(即大鼠
從入水點起到找到平臺所用的時間)、路徑、搜索策略等指標，本實驗選用潛伏期作為衡量
大鼠學習記憶和測試成績的指標。每只大鼠每天在4個象限共訓練4次,每次游泳時限為60s，
即在60s內(nèi)未找到平臺者系統(tǒng)自動停止記錄，潛伏期記為60s，由測試者引導其上臺，休息 30s后進行下一次訓練。
(6) 分子病理學檢測
目的通過免疫印跡和免疫組化來反映脫氫吳茱萸堿對骨架蛋白TAU和A-beta的影響。
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免疫印跡法
頸椎脫臼斷頭處死雄性Wistar大鼠，迅速取出大腦腦組織置于0-4°C 0.05M Tris緩沖鹽 溶液(TB， PH7.0)內(nèi)，快速分離雙側海馬，制成10%的蛋白勻槳，在1000rmp離心5分鐘， 取上清，測定蛋白含量后備用。
免疫組化法
用4%多聚甲醛磷酸緩沖鹽溶液(PB)進行心臟灌注固定腦組織，待取出腦組織后再在 上述固定液中后固定6 h，即可作振蕩切片。免疫組化采用ABC法，二氨基聯(lián)苯氨 (diaminobezidin, DAB)顯色。
(7) 統(tǒng)計分析
全部數(shù)據(jù)均采用又土SD表示，利用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。
(8) 藥物效果的評估
根據(jù)上述實驗步驟進行操作，結果顯示通過大鼠尾靜注射脈脫氫吳茱萸堿(6.25 mg/kg/day, 12. 5 mg/kg/day) 7天或14天可明顯改善模型鼠的學習記憶障礙、明顯減少老年 斑數(shù)量、明顯降低磷酸化的tau蛋白水平。
(9) 結論
上述結果說明通過大鼠尾靜脈注射脫氫吳茱萸堿對早老性癡呆的保護作用。證實脫氫吳 茱萸堿能夠對抗早老性癡呆患者特征性病理改變，能夠明顯減少早老性癡呆的老年斑數(shù)量， 使磷酸化的tau蛋白水平明顯降低，使學習記憶障礙得到明顯改善等特點，能夠用于早老性 癡呆的預防和治療。
權利要求
1 . 一種治療早老性癡呆的藥物，它是以脫氫吳茱萸堿作為活性成分。
2 .脫氫吳茱萸堿在制備用于預防和治療早老性癡呆的藥物中的應用。
3 . —種治療早老性癡呆的藥物制劑，其特征在于含有活性成分脫氫吳茱萸堿和藥學上 容許的載體或添加劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種治療早老性癡呆的藥物，該藥物是以脫氫吳茱萸堿作為活性成分，實驗證實脫氫吳茱萸堿具有對抗早老性癡呆患者特征性病理改變的作用，能夠明顯減少早老性癡呆的老年斑數(shù)量，使磷酸化的tau蛋白水平明顯降低，使學習記憶障礙得到明顯改善，是一種預防和治療早老性癡呆的有效藥物。
文檔編號A61P25/28GK101120946SQ200610019948
公開日2008年2月13日 申請日期2006年8月9日 優(yōu)先權日2006年8月9日
發(fā)明者王建枝 申請人:華中科技大學