專利名稱：棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽及其在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽及其在制藥中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)
背景技術(shù)：
自從抗生素發(fā)明以來(lái)，人類在控制和治療微生物感染疾病中取得了較大的成就。但隨著“傳統(tǒng)抗生素”的持續(xù)使用，不斷產(chǎn)生出諸多新問(wèn)題.目前，微生物抗藥性已成為臨床微生物感染疾病治療的重大問(wèn)題，以至于某些病原細(xì)菌已沒(méi)有臨床治療的一線藥物。在目前，萬(wàn)古霉素抗性的葡萄球菌、腸球菌以及其他革蘭氏陰性感染疾病，均是世界范圍內(nèi)的臨床難題，三類主要引起腦膜炎的細(xì)菌在臨床上也出現(xiàn)了強(qiáng)的抗藥性，抗青霉素、氯霉素腦膜炎雙球菌、肺炎球菌，對(duì)抗新頭孢菌素抗生素的肺炎球菌也廣泛出現(xiàn)。因此，新一類抗生素的研制已成為當(dāng)務(wù)之急和國(guó)際上的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，多肽抗生素具有廣譜的抗菌活性，同時(shí)具有“傳統(tǒng)抗生素”無(wú)法比擬的優(yōu)越性如在最小作用濃度時(shí)，快速而廣譜地殺滅微生物(包括目前臨床抗藥菌)；對(duì)真菌也有抑制作用；不會(huì)誘導(dǎo)抗藥菌株的產(chǎn)生；對(duì)于拒不感染和全身感染都有效，有希望成為新一代抗菌劑，其研制已受到廣泛重視。
很多兩棲類動(dòng)物在中國(guó)屬于傳統(tǒng)中藥和民族藥物而廣泛應(yīng)用，如中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和澤蛙(Euphlyctislimnocharis)等。這些兩棲類動(dòng)物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效。已報(bào)道藥理活性有廣譜抗微生物作用、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、局部麻醉、免疫調(diào)節(jié)、心血管系統(tǒng)作用等。在國(guó)外，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已是新藥發(fā)明的熱點(diǎn)。據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，已從各種生物來(lái)源分離得到不同的活性多肽，有些已進(jìn)入臨床治療。如從爪蟾(Xenopus laevis)皮膚分泌液獲得的活性多肽Magainin具廣譜抗微生物作用，同時(shí)具有抗腫瘤活性，在美國(guó)已獲準(zhǔn)作為廣譜抗菌藥物，其基因工程產(chǎn)品已進(jìn)入三期臨床；Intrabiotics公司生產(chǎn)的活性多肽IB-367已獲準(zhǔn)用于治療癌癥病人因多種細(xì)菌感染而引起的口腔潰瘍一期臨床試驗(yàn)；Applied Microbiology公司與Astra公司合作用活性多肽nisin治療胃潰瘍的臨床試驗(yàn)也取得良好的療效。我國(guó)對(duì)兩棲類藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，但對(duì)其活性成分和藥理性質(zhì)的研究主要集中于生物堿等有機(jī)小分子，對(duì)其皮膚活性肽類物質(zhì)研究不多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽。
本發(fā)明的目的還在于提供一種棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽的藥物用途，特別是棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽在制備治療病原微生物感染疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的。棕點(diǎn)湍蛙(Amolops loloensis)主要分布于四川、云南省，是我國(guó)特色資源動(dòng)物之一。本發(fā)明利用乙醚刺激棕點(diǎn)湍蛙，收集到棕點(diǎn)湍蛙皮膚分泌液，經(jīng)離心去除沉淀，冷凍干燥后經(jīng)一系列的生物化學(xué)手段分離純化得到一種多肽，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)，根據(jù)所得到的氨基酸序列合成該多肽。采用飛行時(shí)間質(zhì)譜法測(cè)定分子量，等電聚焦測(cè)定等電點(diǎn)，自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀確認(rèn)其氨基酸序列結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的多肽是一種單鏈多肽，并命名為棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽，其分子量1706.96道爾頓，等電點(diǎn)8.75，多肽全序列為苯丙氨酸—亮氨酸—脯氨酸—脯氨酸—絲氨酸—脯氨酸—色氨酸—賴氨酸—谷氨酸—蘇氨酸—苯丙氨酸—精氨酸—蘇氨酸—蘇氨酸；或表示為Phe Leu Pro Pro Ser Pro Trp Lys Glu Thr Phe Arg Thr Thr1 5 10發(fā)明人將本發(fā)明的棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索比較未發(fā)現(xiàn)有任何相同的多肽。
本發(fā)明的棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽是從天然生物資源得到的產(chǎn)物，具有顯著的抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，可用于制備病原微生物感染疾病的治療藥物。
本發(fā)明取得的進(jìn)步意義是利用我國(guó)自然資源，為制備治療病原微生物感染疾病的藥物提供了又一選擇。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。但本發(fā)明的內(nèi)容并不受此限制。
實(shí)施例一、棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽的制備將從我國(guó)云南省得到的活體棕點(diǎn)湍蛙用水清洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無(wú)水乙醚(1升體積容積加1毫升無(wú)水乙醚)，密閉容器3-5分鐘，可見(jiàn)大量的泡沫狀物質(zhì)從棕點(diǎn)湍蛙皮膚分泌出來(lái)，收集分泌物，離心(10000rpm，20分鐘)、冷凍干燥后保存。詳細(xì)制備過(guò)程為第一步Sephadex G-50凝膠過(guò)濾柱層析，按上述方法獲得的原材料棕點(diǎn)湍蛙皮膚分泌液凍干粉300mg溶解于5ml純凈水，10000rpm 4℃離心10min去除沉淀。Sephadex G-50凝膠過(guò)濾柱(長(zhǎng)1000mm，直徑26mm)用0.1M Na2HPO4-NaH2PO4 pH 6.0緩沖液平衡，充分后將樣品上于該柱。用同樣緩沖液洗脫，收集活性峰。
第二步反相高壓液相色譜為Sephadex G-50凝膠過(guò)濾得到的活性成分的峰上樣于經(jīng)含1‰三氟乙酸的超純水充分平衡的C18反相柱(長(zhǎng)300mm，直徑5mm)用含1‰三氟乙酸的乙晴緩沖液從0％至100％的梯度洗脫。收集具有抗菌作用的活性峰。
第三步純化的棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測(cè)定采用飛行時(shí)間質(zhì)譜法(Time of flight mass spectrometry，TOF-MS)，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
通過(guò)上述方法制備的棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽，分子量1706.96道爾頓，等電點(diǎn)8.75，多肽全序列為苯丙氨酸—亮氨酸—脯氨酸—脯氨酸—絲氨酸—脯氨酸—色氨酸—賴氨酸—谷氨酸—蘇氨酸—苯丙氨酸—精氨酸—蘇氨酸—蘇氨酸；或表示為Phe Leu Pro Pro Ser Pro Trp Lys Glu Thr Phe Arg Thr Thr1 5 10將本發(fā)明的棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同的多肽。
二、棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用實(shí)驗(yàn)抗菌活性檢測(cè)，采用杯碟法，培養(yǎng)基為普通瓊脂培養(yǎng)基。分別注入加熱融化的培養(yǎng)基20ml于平皿中作為底層，使其在皿底內(nèi)均勻攤布，凝固后，另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，分別在每皿中加入5ml菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離均勻放入已消毒的不銹鋼杯6個(gè)。第一個(gè)鋼杯加入0.1-0.3mg/ml濃度的待測(cè)化合物溶液0.1ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作為最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。細(xì)菌菌株來(lái)源于昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，此試驗(yàn)重復(fù)四次，取平均值，結(jié)果如表1。
表1棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用

實(shí)驗(yàn)證明，棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽具有顯著的抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，可用于制備病原微生物感染疾病的治療藥物。
權(quán)利要求
1.一種棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽，其特征在于該多肽是從棕點(diǎn)湍蛙中分離得到的一種單鏈多肽，分子量1706.96道爾頓，等電點(diǎn)8.75，多肽全序列為苯丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸-絲氨酸-脯氨酸-色氨酸-賴氨酸-谷氨酸-蘇氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸。
2.如權(quán)利要求1所述的棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽的應(yīng)用，其特征在于該棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽用于制備治療病原微生物感染疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽及其在制藥中的應(yīng)用。通過(guò)生物化學(xué)手段，從棕點(diǎn)湍蛙皮膚分泌液中分離純化得到抗菌多肽并測(cè)定其序列，按照所得的序列合成該多肽。棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽是一種單鏈多肽，分子量1706.96道爾頓，等電點(diǎn)8.75，多肽全序列為苯丙氨酸—亮氨酸—脯氨酸—脯氨酸—絲氨酸—脯氨酸—色氨酸—賴氨酸—谷氨酸—蘇氨酸—苯丙氨酸—精氨酸—蘇氨酸—蘇氨酸。實(shí)驗(yàn)證明棕點(diǎn)湍蛙抗菌多肽具有顯著的抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，可用于制備治療病原微生物感染疾病的藥物。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1827637SQ20061001260
公開(kāi)日2006年9月6日 申請(qǐng)日期2006年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月18日
發(fā)明者劉敬澤, 梁建國(guó) 申請(qǐng)人:河北師范大學(xué)