專利名稱：中藥水楊柳的新用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中藥水楊柳的新用途，尤其是水楊柳在制備治療和/或預防嘌呤代謝異常疾病藥物中的用途，屬于醫(yī)藥技術領域。
背景技術：
水楊柳為大戟科植物水柳Homonoia riparia Lour的根，其性味苦，寒，具有利尿，清熱，利膽，消炎，解毒的功效，能治療跌打，潰瘍，痔瘡，淋病，梅毒，膀光結石，膽囊結石，及急、慢性肝炎。
痛風是由于人體血液內尿酸異常增高，并使尿酸鹽結晶沉積在關節(jié)內而導致關節(jié)劇烈疼痛，同時伴有紅腫變形的一種疾病。常發(fā)生在足部跖趾關節(jié)、拇趾關節(jié)或者足跟、足背、踝關節(jié)或其他關節(jié)處，使受累關節(jié)發(fā)生刺痛，短時間內皮膚發(fā)熱并充血直至關節(jié)腫脹，24小時內可達到高峰，疼痛劇烈，輕者可在數小時內自選消退，重者要持續(xù)多日或幾周，多數痛風都會復發(fā)。如不及時治療，則易形成慢性、長期性疾病，并對關節(jié)造成永久性損害，不僅影響患者的正常生活、工作和學習，更嚴重危害患者的身體健康。另外，痛風是從血尿酸高開始的，癥狀表現出來需要一個慢長的過程，有的是幾年，有的則是幾十年，機體長期處在尿酸引起的非正常偏酸性環(huán)境中，對肝腎的損害極大，因此，不僅要治療痛風，更要防止尿酸過高?，F有的治療痛風的藥物如苯溴馬隆(立加利仙)，其主要作用機制是抑制腎小管對尿酸的重吸收，增加腎小管對尿酸的排泄；別嘌呤醇，抑制尿酸的生成；這類藥物常伴有胃腸道反應如腹瀉，胃腸不適，皮疹，白細胞及血小板減少，肝功能受損，毒性上皮壞死等毒、副作用，而且，一旦仃藥，又會復發(fā)，不能根治。復方伸筋膠囊，雖能治療濕熱瘀阻所致痛風引起的關節(jié)紅腫、熱痛，屈伸不利等癥，但服藥期間必須禁食生冷酸澀及含嘌呤的食物，如海鮮、豆制品及其它營養(yǎng)食物等等，容易造成身體營養(yǎng)不良，抵抗力、免疫力下降而引起其它疾病等不良后果。到目前為止，尚無根治的藥物問世。

發(fā)明內容
為克服現有藥物存在的毒、副作用大，因禁食多種食物而造成機體營養(yǎng)不良，抵抗力、免疫力下降，不能根治等不足，本發(fā)明的目的在于提供水楊柳在制備治療和/或預防嘌呤代謝異常疾病藥物中的應用。具體是水楊柳在制備治療或/和預防痛風病藥物中的應用。
水楊柳在制備治療或/和預防高尿酸血癥及其并發(fā)癥藥物中的應用。
水楊柳在制備治療或/和預防尿酸性結石、混合性鈣/尿酸結石病藥物中的應用。
水楊柳在制備治療或/和預防尿酸鹽腎病、尿酸性腎病藥物中的應用。
水楊柳在制備治療或/和預防痛風性關節(jié)炎病藥物中的應用。
水楊柳在制備上述治療各種疾病的藥物時，是以單獨的水楊柳為原料制成的藥劑。
水楊柳在制備上述治療各種疾病的藥物時，是以水楊柳與其他藥物配合制成的復方藥劑。
水楊柳在制備上述治療各種疾病的藥物時，是以水楊柳的原生藥或者以水楊柳的提取物為活性成份，配入適量醫(yī)藥上可接受的載體或輔助性成份以常規(guī)的制劑工藝制成的藥劑。
所述水楊柳提取物是對其植物的莖、葉和根以常規(guī)的方法進行水提取的水煎劑或其濃縮液，或者水提液醇沉后經噴霧干燥得到的粉劑。
所述水楊柳提取物是對其植物的莖、葉和根以常規(guī)的方法進行有機溶劑提取的濃縮浸膏或經噴霧干燥得到的粉劑。
所述用水楊柳制成的藥劑是臨床上能夠使用的各種不同劑型，如片劑、口服液、粉劑、丸劑、膠囊、注射或輸液劑、膏劑、酊劑、散劑和沖劑。
水楊柳用于制備上述藥物的特點是除具有清熱利膽，消炎解毒，利尿等常規(guī)功效外，對黃嘌呤氧化酶具有明顯的抑制作用，能降低尿酸、促進尿酸的排泄，可治療和/或預防痛風，高尿酸血癥及其并發(fā)癥，尿酸性結石，混合性鈣/尿酸結石，尿酸鹽腎病、尿酸性腎病，急、慢性痛風性關節(jié)炎等疾病。
具體實施例方式
實施例1
水楊柳提取物的制備方法取水楊柳干藥材，破碎后，用10倍量50-95％乙醇提取3次，收集提取液，靜置、離心，棄沉淀物，取上清液經濃縮后噴霧干燥，得水楊柳提取物；殘渣用水回流提取2次，提取液濃縮后噴霧干燥，得水楊柳提取物，合并以上兩種物質得水楊柳提取物A1。
實施例2水楊柳提取物的制備方法取水楊柳藥材，經破碎后，用8倍量水回流提取4次，提取液濃縮后噴霧干燥，得水楊柳提取物A2。
實施例3水楊柳提取物的制備方法取水楊柳藥材，經破碎后，用95％乙醇、50％乙醇及水依次分別回流提取3次，每次1.5h，溶媒用量為8-10倍，提取液過濾，合并濾液，減壓濃縮至干，再加適量水煮沸加熱1-2小時，使其溶解，抽濾，濾液加到已處理好的大孔吸附樹脂柱上，慢慢滴加完后，先用水洗，再用50-20％乙醇依次洗脫，收集洗脫液，濃縮后噴霧干燥，得水楊柳提取物A3。
實施例4取水楊柳生藥干燥粗粉4.14kg，用60％乙醇滲漉提取，滲漉液減壓回收乙醇，得浸膏(I)790.3g；取浸膏498g加適量水，用氯仿萃取。氯仿層回收氯仿后分別用石油醚、乙醚、乙酸乙酯提取，得石油醚提取物(II)3.6g、乙醚提取物(III)15.3g、乙酸乙酯提取物(IV)2.4g；水層用正丁醇萃取得水層提取物(V)140.2g和正丁醇提取物(VI)41.2g，得水楊柳提取物A4。
下面通過實驗數據證實本發(fā)明所說的水楊柳的新用途。
1、水楊柳提取物抗炎作用的試驗取正常健康SD大鼠，體重180±30g，全部為雄性，50只，隨機分為5組，秋水仙堿陽性對照組、提取物A1的高、中、低劑量組、模型組，每組10只。分別每日灌胃給予1.0mg/kg秋水仙堿、A1提取物5.6g/kg、2.8g/kg、1.4g/kg和1ml/100g純化水。于第3天給藥2h后，無菌操作，在每只大鼠右后肢足跖皮下注射0.1mlMUS混懸液(100mg/ml)致炎。于致炎前、致炎后1h、2h、4h、6h、8h分別測定大鼠右后肢足爪容積的變化，以致炎前后足容積之差作為腫脹度。
A1提取物的中、高劑量組大鼠足跖腫脹消退明顯，且顯效較快；低劑量組作用不明顯。與模型組比較，提取物A1的中、高劑量組有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。陽性對照秋水仙堿組與模型組相比足跖腫脹度差異非常顯著(P＜0.01＝。結果見表1。
2、A1提取物對高尿酸血癥小鼠血清尿酸的影響取正常健康ICR小鼠60只，雄性，體重18～22g，隨機分為6組，每組10只，即生理鹽水組，高尿酸血癥空白組，A1提取物的低、中、高劑量組和別嘌呤醇陽性對照組。生理鹽水組、高尿酸血癥空白組按25ml/kg劑量灌胃生理鹽水，A1提取物組按1.4g/kg、2.8g/kg、5.6g/kg低、中、高劑量灌胃，別嘌呤醇組按20mg/kg劑量灌胃，每天一次，連續(xù)5天。高尿酸血癥空白組在取血樣前2小時用氧嗪酸鉀鹽按300mg/kg劑量腹腔注射小鼠；A1提取物的低、中、高劑量組和別嘌呤醇陽性對照組在最后一次給藥前半小時，腹腔注射氧嗪酸鉀鹽(300mg/kg)，給藥后1.5h摘眼球采血，血樣分別置于1.5ml的離心管中，在2500r/min離心5min。每份血樣取血清100μl用氧化酶法進行尿酸。
與生理鹽水組比較，模型組血清尿酸水平有顯著性差異(P＜0.01)，說明造模是成功的，腹腔注射氧嗪酸鉀鹽(300mg/kg)，可以造成小鼠血清尿酸水平顯著升高。與模型組比較，A1提取物的中、高劑量組和別嘌呤醇組均顯著地降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平(P＜0.05，P＜0.01)。別嘌呤醇能使高尿酸血癥小鼠血清降低至正常水平以下，表2。
3、水楊柳提取物及其分離純化物在體外對黃嘌呤氧化酶的抑制作用分別精密稱取適量A4提取物I、II、III、IV、V、VI，以少量二甲亞砜(DMSO)溶解后，加磷酸鹽緩沖液(pH＝7.5)配制成2mg/ml溶液；同時配制含二甲亞砜相同濃度的空白溶液作對照。另取別嘌呤醇、黃嘌呤(X)、黃嘌呤氧化酶(XO)適量，用磷酸鹽緩沖液(pH＝7.5)溶解并稀釋配制成濃度分別為40μg/ml，0.15μmol/μl，0.2U/ml備用。
取X 660μl加磷酸鹽緩沖液(pH＝7.5)適量(約1.27ml)，在室溫的條件下，以磷酸鹽緩沖液(pH＝7.5)為空白，在295nm波長處測定光密度值。然后加入XO 70μl，振蕩5min后在上述條件下測定光密度值，以加XO后的光密度值減去未加XO的光密度值的差值為A4值。
在含X 660μl的各試管中分別加入A4提取物I、II、III、IV、V溶液，DMSO 12、25、50、100μl；A4提取物VI溶液1、3、6、12、25、50、100μl；別嘌呤醇15、30、60、120μl；分別加入磷酸鹽緩沖液(pH＝7.5)配制成一定濃度，于室溫條件下，以磷酸鹽緩沖液(pH＝7.5)為空白，在295nm波長處測定光密度值。之后，在每一試管中加入XO 70μl，振蕩5min后在相同條件下測定光密度值，以加XO后的光密度值減去未加XO的光密度值的差值為B值。
以公式(1-B/A)×100％計算XO活性抑制百分率，結果見表3。
實驗表明由表3可看出A4提取物I有較好的黃嘌呤氧化酶抑制活性，其中活性物質主要在正丁醇提取部分VI。分別以提取物I、VI和別嘌呤醇的濃度為橫坐標，以其相對應的XO抑制百分率為縱坐標進行線性回歸，計算XO抑制百分率為50％時的藥物濃度IC50值，A4提取物的IC50為27.20μg/ml，經進一步分離后測得乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、水提取部分IC50分別為99.78、66.67、18.14、91.67ug/ml。
4、A3提取物對小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶的影響取正常健康ICR小鼠50只，雄性，體重18～22g，隨機分為5組，每組10只，即生理鹽水組，A3提取物的低、中、高劑量組和別嘌呤醇陽性對照組。生理鹽水組按25ml/kg劑量灌胃生理鹽水，A3提取物組按1.4g/kg、2.8g/kg、5.6g/kg低、中、高劑量灌胃，別嘌呤醇組按20mg/kg劑量灌胃，每天一次，連續(xù)3天。在最后一次給藥后兩小時，處死小鼠，取出肝臟，稱重，加五倍pH7.4的50mM磷酸鹽緩沖液研漿，研漿液在轉速為3000r/min離心10min，小心除去表面脂層，剩下的上清夜在4℃、轉速為10000r/min繼續(xù)高速離心60min，把上清液小心取出用于進行酶分析。
在各試管中依次加入各組小鼠肝漿提取上清液50μl，純化水2.425ml，氧嗪酸鉀鹽275μl，在37℃孵育15min后，以純化水為空白，在295nm波長處測定光密度值。之后，在每一試管中加入黃嘌呤0.6ml，20min后將各反應管置于冰水中終止反應，在相同條件下測定光密度值，以加黃嘌呤后的光密度值減去未加黃嘌呤的光密度值的差值作為反應值。
A3提取物對小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶有一定的抑制作用，且其抑制率隨含量的增加而增大。陽性對照別嘌呤醇組則有較強的抑制作用，見表4。
5、A2提取物對兔酚紅排泄的影響取正常健康大耳白兔8只，雄性，體重2.0～2.5kg，隨機分為4組，每組2只，即生理鹽水組，A2提取物的中、高劑量組和苯溴馬隆陽性對照組。生理鹽水組按25ml/kg劑量灌胃生理鹽水，A2提取物組按2.1g/kg、4.2g/kg中、高劑量灌胃，苯溴馬隆組按10mg/kg劑量灌胃，每天一次，連續(xù)2天。第二次灌胃后兩小時按2.4mg/kg耳緣靜脈注射0.6％酚紅溶液，注射酚紅溶液前采血作空白對照，之后5分鐘、15分鐘各采血一次。血樣3000g/min離心10分鐘，取血清0.1ml加入1ml 0.03M NaOH溶液中，于560nm測吸光度。然后兔子正常飼養(yǎng)五天后，交換組別進行試驗，共進行四次試驗。結果見表5，A2高劑量組有延遲酚紅排泄作用，A2有促尿酸排泄作用。
下面通過臨床觀察證明水楊柳的新用途。本發(fā)明經106例臨床觀察，其結果如下1、臨床資料1.1一般資料全部病例均為門診患者，且血清中尿酸指標超常，癥狀明顯。將患者隨機分為對照組和試驗組兩組，全部病例共106例，其中試驗組66例男42例，女24例，年齡23～64歲，平均43歲，病程3～10年；對照組40例男25例，女15例，年齡21～65歲，病程2～10年。經統(tǒng)計學處理，兩組間在年齡、性別、病程方面無顯著差異(P＞0.05)，具有可比性。
1.2診斷標準所有患者均符合我國制定的《尿酸血癥疾病分類方案與診斷標準》的診斷標準。
2、治療及觀察方法2.1治療方法試驗組口服本發(fā)明提供的A1藥粉，每日2次，每次1.2～1.8克；對照組口服別嘌呤醇，每日2-3次，每次50mg，最大劑量300-600mg/日；兩組均以15天為一療程，每一個療程門診隨訪一次，詳細記錄有關情況。共治療4個療程60天，治療結束進行療效評價。
2.2安全性觀察包括一般體格檢查，心電圖、血、尿、便常規(guī)，肝腎功能。
2.3療效評定方法2.3.1療效評定標準參照《中藥新藥臨床研究指導原則》制定臨床痊愈治療后尿酸指標正常，軀體癥狀消失，飲食良好，無需禁忌食物，睡眠規(guī)律，工作、生活、學習能達到病前水平，持續(xù)6一年。癥狀累計總分值減少≥95％；顯效治療后尿酸指標略高于正常值，軀體癥狀明顯改善，但未完全消失，飲食一般，適當禁忌魚類、牛肝、牛腎、腦、濃肉湯等食物，工作、生活、學習能力提高，持續(xù)3個月。癥狀累計總分值減少；有效治療后尿酸指標略高于正常值，臨床癥狀至少有2項以上改善，禁忌魚類、貝類、動物肝臟、肉類、腦、和部分高嘌呤蔬菜，工作、生活、學習能力稍有提高。癥狀累計總分值減少35％～70％；無效治療后尿酸指標高，軀體癥狀無改善，工作、生活、學習能力無提高。癥狀累計總分值下降＜35％；3、治療結果治療組共66例，痊愈25例(37.87％)，顯效28例(42.42％)，有效8例(12.12％)，無效5例(7.58％)，總有效率(61例)為92.42％。對照組共40例，顯效20例(50％)，有效6例(15％)，無效14例(35％)，總有效率(26例)為65％，兩組結果經統(tǒng)計學處理有顯著性差異，本發(fā)明的痛風藥臨床療效顯著高于對照組(P＜0.01)。
表1 A1提取物對大鼠足跖腫脹程度的影響(X±S，n＝8)

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01表2 A1對高尿酸血癥小鼠尿酸水平的影響(x±s，n＝10)

與生理鹽水組比較##P＜0.01，與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
表3 A4不同提取組分的黃嘌呤氧化酶抑制活性

表4 A提取物對小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶的影響

表5、A2提取物對兔酚紅排泄的影響(X±S，n＝8)

與生理鹽水組比較**P＜0.01，*P＜0.05。
權利要求
1.水楊柳在制備治療和/或預防嘌呤代謝異常疾病藥物中的應用。
2.水楊柳在制備治療或/和預防痛風病藥物中的應用。
3.水楊柳在制備治療或/和預防高尿酸血癥及其并發(fā)癥藥物中的應用。
4.水楊柳在制備治療或/和預防尿酸性結石、混合性鈣/尿酸結石病藥物中的應用。
5.水楊柳在制備治療或/和預防尿酸鹽腎病、尿酸性腎病藥物中的應用。
6.水楊柳在制備治療或/和預防痛風性關節(jié)炎病藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供水楊柳在制備治療和/或預防嘌呤代謝異常疾病藥物中的應用。除具有清熱利膽，消炎解毒，利尿等常規(guī)功效外，對黃嘌呤氧化酶具有明顯的抑制作用，能降低尿酸、促進尿酸的排泄，可治療和/或預防痛風，高尿酸血癥及其并發(fā)癥，尿酸性結石，混合性鈣/尿酸結石，尿酸鹽腎病、尿酸性腎病，急、慢性痛風性關節(jié)炎等疾病。
文檔編號A61P13/12GK101032545SQ200610010739
公開日2007年9月12日 申請日期2006年3月10日 優(yōu)先權日2006年3月10日
發(fā)明者游德順 申請人:游德順