專利名稱：：用于預防和治療肝病的含有吡唑并嘧啶衍生物的藥劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種用于預防和治療肝病的藥物組合物，其含有吡唑并嘧啶衍生物作為有效成分，更明確地，涉及一種用于預防和治療以下疾病的藥物組合物，所述疾病包括肝纖維化、由肝纖維化導致的肝硬化、門靜脈高血壓、和由門靜脈高血壓導致的多種并發(fā)癥，且所述藥物組合物含有吡唑并嘧啶衍生物作為有效成分。
背景技術：
：肝臟具有比其他任何器官更多的生化功能。它是一個基本器官，經(jīng)其通過吸收的食物、藥物和其他外來物質，并且肝臟具有將后天獲得的和先天的有毒物質轉變?yōu)樗苄孕问胶笙@些有毒物質的功能。而且，它廣泛涉及于多種器官新陳代謝的功能中。肝臟組織合成并提供基礎蛋白質，如人體的清蛋白，且同時體內產生和排放活性物質。如上述所解釋的，肝臟是至關重要的器官，其控制人新陳代謝功能，在這其中發(fā)生了大量的化學過程。至今已經(jīng)證實在很短的時期內肝臟中發(fā)生大約500個化學過程。肝細胞是肝臟的主要功能細胞，每個單獨的肝細胞直徑為15-30微米。人肝臟含有大約2500億肝細胞。肝細胞的損傷導致細胞壞死。然而，壞死后肝細胞會再生，這歸功于它們優(yōu)秀的先天再生能力。然而，反復發(fā)生壞死和再生會觸發(fā)肝纖維化，及作為結果，肝硬化，門靜脈高血壓以及由其所引發(fā)的并發(fā)癥。一系列相關疾病都在肝纖維化后發(fā)展。肝纖維化由膠原蛋白，即一種纖維發(fā)生物質，在肝臟中的積累所導致。肝臟細胞由肝細胞、竇狀隙內皮細胞(SEC)、Kupper細胞和肝星狀細胞(HSC)組成，并且在這4種細胞中，肝星狀細胞在肝纖維化中起到最重要的作用(AmericanJournalofPhysiology.Gastrointestinal&LiverPhysiology,279(1),G7,2000)。肝星狀細胞組成總肝臟細胞的15%，且通常具有儲存類維生素A的功能，所述類維生素A是一種維生素A前體。然而，一旦肝細胞受到損傷，Kupper細胞開始消滅損傷的肝細胞，并分泌細胞因子(TGF-beta，PDGF，F(xiàn)GF，HGF，PAF和ET-1)來增殖肝星狀細胞。所述肝星狀細胞分化為肌成纖維細胞。肌成纖維細胞合成膠原蛋白，所述膠原蛋白在細胞外基質中累積并導致肝纖維化。這意味著肝星狀細胞的活化在肝纖維化的發(fā)展中扮演基本角色。更明確地，肝星狀細胞的活化在下列三個階段中完成炎前階段、炎性階段和炎后階段。在炎前階段中，肝細胞損傷誘導創(chuàng)傷激素，即一種肝星狀細胞增殖刺激劑的分泌，或通過降低精氨酸酶，即一種細胞增殖抑制劑，誘導肝星狀細胞的增殖。在大部分情形中，醇引起乙醛或脂類過氧化物的產生，這導致對基質基因表達的促進。在炎性階段中，肝星狀細胞通過所述活化的Kupper細胞和血小板分泌的細胞因子(TGF-beta,PDGF,FGF，HGF,PAF和ET-1)增殖，然后再分化為能夠產生纖維細胞的肌成纖維細胞(SeminarsinLiverDisease,16(4),357,1996;JournalofHepatology，26(6),1220,1997)。在炎后階段，在完全分化的肌成纖維細胞中分泌細胞因子和生長因子，從而激活非分化肝星狀細胞并分泌細胞外基質。由肝星狀細胞活化和分化的肌成纖維細胞合成膠原蛋白，然后所述膠原蛋白積累在細胞外基質中。膠原蛋白單體是非常不穩(wěn)定的且容易在體溫下分解，且分解的單體會聚合，從而誘導肝纖維化(AmericanJournalofPhysiology,264(4Pt1),G589,1993)。肝硬化歸因于肝纖維化，肝硬化是通過連續(xù)積累的膠原蛋白的聚合，并將積累的膠原蛋白改變?yōu)椴蝗苄岳w維發(fā)展而成的。肝硬化還能通過肝內連續(xù)的炎癥所誘導，該過程伴隨著肝細胞的破壞、再生和瘢疤形成，所述肝細胞的破壞、再生和瘢疤形成是通過長期濫用酒精、肝炎、暴露于毒性物質等而導致的。作為結果，肝尺寸減小，并且肝表面變得崎嶇不平。嚴重的肝硬化是引起致命并發(fā)癥的嚴重疾病，如門靜脈高血壓，出血(特別是在食道和胃中)，肝細胞瘤，由廢物積累所引起的中毒，昏迷等(N.Engl.J.Med.350:1646-1654)。門靜脈高血壓與肝星狀細胞的活化、肝纖維化和肝硬化緊密相關。通過肝星狀細胞的活化而分化的肌成纖維細胞降低肝細胞的彈性，并且因此肝內阻力增加并形成門靜脈高血壓(SeminLiverDis2001;21:337-349)。與其它器官不同，肝組織特征性地具有雙血流途徑，該雙血流途徑是具有大量氧的動脈血經(jīng)肝動脈流入肝組織，和含有從胃或腸所吸收的營養(yǎng)的靜脈血經(jīng)肝門靜脈流入。經(jīng)肝動脈流入的血液量為大約400ml/分鐘，經(jīng)肝門靜脈流入的血液量為大約1200ml/分鐘，這意味著流入肝總血液的1/4采用肝動脈路徑，而剩余3/4采用肝門靜脈路徑。門靜脈血壓，相似于其他靜脈壓力，僅為動脈壓力的約1/10，且它能夠輕易得引起血壓循環(huán)的病癥。由連續(xù)的炎癥所引起的肝細胞的反復損傷及再生導致纖維物質的積累和再生結節(jié)(node)的形成。再生結節(jié)給肝組織中血液途徑壓力，或收縮血管本身，從而導致血液循環(huán)的障礙。雖然經(jīng)過門靜脈的血流量沒有變化，但是經(jīng)過肝組織的血流量由于血液循環(huán)的病癥而減少。作為結果，門靜脈血壓增高，從而引起門靜脈高血壓。門靜脈是一種無抗回流瓣膜的靜脈，因此血液回流能夠發(fā)生在門靜脈血壓增高的任意時刻，然后該血液再尋找循環(huán)中的迂回路，所述門靜脈血壓增高是由循環(huán)病癥所引起的。作為結果，消化道(特別是食道和胃)中的側副管形成，由此導致脾機能亢進。側副管通常形成在低壓區(qū)域中，如食道黏膜下層，前側腹壁，直腸等，并且其具有隨之發(fā)生的食道靜脈曲張，腹水，痔瘡及脾肥大的癥狀。最普遍的門靜脈高血壓并發(fā)癥是食道靜脈曲張，其需要至少12mmHg的壓力而形成。大約1/3的肝硬化患者表現(xiàn)出食道和胃中的靜脈曲張，該靜脈曲張占死亡原因的約30%(AmericanFamilyPhysician,55(5)，1851，1997)。直到現(xiàn)在，在由食道靜脈曲張和胃靜脈曲張所引起的出血中有所涉及的因素沒有得到完全的理解，但是相信靜脈曲張的尺寸與門靜脈高血壓的嚴重性有關(Pharmacotherapy:aphathophysiologicapproach,1996)。為了治療門靜脈高血壓，己進行了外科手術，如脾切除術或門腔靜脈的分流，從而減少門床(portalbed)流量。用于門靜脈高血壓的藥物由下列各項舉例說明普遍用于急性靜脈曲張出血的加壓素，生長激素抑制素，非特異性P-腎上腺素能阻斷劑，a-腎上腺素能阻斷劑，和硝酸鹽制劑。這些藥物通過減少朝向肝的動脈流量來降低門靜脈壓。作為結果，已經(jīng)受到嚴重影響的朝向肝的全部門血流甚至進一步惡化。因此，很多年來一直存在著對開發(fā)選擇性降低門靜脈壓的物質的需要。己證明磷酸二酯酶類型-5(下文中稱為'PDE5，)抑制劑，其作為對勃起功能障礙的治療法中的有效成分而已知，也對治療門靜脈高血壓及其相關疾病有效。例如，PDE5抑制劑用于預防和治療門靜脈高血壓的用途描述在PCT/EP2004/006014中。明確地，PDE5抑制齊lj，即西地那非和伐地那非，具有預防和治療門靜脈高血壓及其并發(fā)癥的作用，該作用通過增加門靜脈血管直徑和門靜脈血流量從而降低門靜脈血壓而實現(xiàn)。然而，門靜脈的舒張并不自動的意味著經(jīng)過肝的血流量的增加和門靜脈血壓的降低，實際上，特異性PDE5抑制劑對經(jīng)過肝的血流量和門靜脈血壓的作用是不可預測的。根據(jù)早期實驗硬化模型中研究西地那非對系統(tǒng)和內臟的血液動力學的作用的報告，西地那非降低平均動脈壓，從而導致系統(tǒng)低血壓，并且劑量依賴性地增加經(jīng)過腸系膜的血流量及門靜脈血壓(LiverInternational,24(1),63，2004;DigestiveDiseaseWeek，AbsS1553,2003)。因此，進行上述實驗的研究人員得出結論為了給硬化患者開西地那非處方還要求額外的研究，這是因為由西地那非所引起的門靜脈血壓的增高可能引起出血并發(fā)癥。在肝硬化的情形中，觀察到由局部NO的過量生產而引起的內臟脈管舒張。根據(jù)報告，西地那非增加NO作用，從而導致血管腸系膜緊張性的降低和門靜脈血流量的增加(LiverInternational,24(1):63,2004;DigestiveDiseaseWeek,AbsSI553,2003)?；蚨嗷蛏俚?，肝的代謝功能在患有肝病，如肝硬化、門靜脈高血壓等的患者中有所降低，因此藥物的濃度-時間曲線下面積(AUC)和半衰期都有所增加(AlimentaryPharmacologyTherapeutics,20(1),29,2004;MethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology,25(8),625,2003)。然而，患有慢性肝病的患者需要長期施用和多種處方。如果給所述患者開的處方藥物具有短半衰期，則會降低患者的依從率并妨礙有效的治療。因此，已經(jīng)進行了對制備用于治療慢性肝病藥物的研究，該藥物持續(xù)地維持其藥物作用，并增加患者的依從率。己報道當將合成的與生長激素抑制素相似的奧曲肽作為持續(xù)釋放制劑每天施用一次時，其降低門靜脈血壓的作用是長期持久的(HepatologyResearch,19(2)，108，2001)。而且，當將持續(xù)釋放蘭瑞肽每天一次地通過肌肉注射施用于門靜脈高血壓小鼠時，延遲了外周血管舒張和過度血液循環(huán)，并防止了門靜脈高血壓、內臟充血及門系統(tǒng)分流，其中所述小鼠的門靜脈高血壓是由肝門靜脈循環(huán)硬化癥所誘導的(JournalofHepatology,31(3),482,1999)。鑒于上述問題，存在著對開發(fā)能夠無副作用地增加肝血流量，降低門靜脈血壓和增加順從性且具有長半衰期的新型藥物的需要。本發(fā)明人合成了一種新型化合物，即吡唑并嘧啶衍生物5-[2-丙氧基-5-(l-甲基-2-吡咯烷基乙基酰氨基磺?；?苯基]-l-甲基-丙基-l，6-二氫-7H-吡唑并(4,3—d)嘧啶-7-酮，并且在早先的研究中報告了其PDE5抑制作用(韓國專利號377,782)。然后，本發(fā)明人繼續(xù)將吡唑并嘧啶衍生物作為PDE5抑制劑進行研究，并通過證實了下列各項而完成了本發(fā)明所述吡唑并嘧啶衍生物具有良好的膠原蛋白合成抑制作用，并且由于具有長半衰期能夠提高慢性肝病患者的藥物順從性，以及能夠降低門靜脈血壓
發(fā)明內容技術問題本發(fā)明的一個目的是提供一種用于預防和治療肝病的藥物組合物，其含有吡唑并嘧啶衍生物作為其有效成分。本發(fā)明的另一個目的是提供肝纖維化抑制劑。本發(fā)明的進一步一個目的是提供一種通過抑制肝纖維化用于預防和治療肝硬化的藥物組合物。本發(fā)明還有一個目的是提供門靜脈高血壓抑制劑。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于預防和治療由門靜脈高血壓的發(fā)展所產生的并發(fā)癥的藥物組合物。技術方案為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于預防和治療肝纖維化、肝硬化、門靜脈高血壓及由其所引起的并發(fā)癥的藥物組合物，所述藥物組合物含有吡唑并嘧啶衍生物作為有效成分。在下文中，詳述本發(fā)明。本發(fā)明提供一種用于預防和治療肝纖維化、肝硬化、門靜脈高血壓及由其所引起的并發(fā)癥的藥物組合物，所述藥物組合物含有吡唑并嘧啶衍生物(5-[2-丙氧基-5-(l-甲基-2-吡咯烷基乙基酰氨基磺?；?苯基]-l-甲基-丙基-l，6-二氫-7H-吡唑并(4,3-d)嘧啶-7-酮)作為其有效成分。<化學圖1>吡唑并嘧啶衍生物是一種PDE5抑制劑。其具有良好的PDE5抑制活性和選擇性。吡唑并嘧啶衍生物快速被吸收，這歸因于它增強的溶解性，并且吡唑并嘧啶衍生物具有高生物利用度及巨大的生物分布范圍。而且，其特征為具有比西地那非和伐地那非至少長3倍的半衰期。批唑并嘧啶衍生物的物理化學性質如下其不溶于水但溶于乙酸、甲醇和氯仿。熔點是158-161。C，且具有pKa，和pKa2值分別為6.5和12.5。其為白色或淡黃色粉末，且該粉末既非水化物也非溶劑化物。吡唑并嘧啶衍生物能夠通過以下3個步驟合成，如下列舉在步驟1中，制備4-[2-丙氧基-5-(氯磺酰)苯甲酰氨基]-l-甲基-3-丙基-5-氨基甲酰吡唑。明確地，將適量4-[2-丙氧基苯甲酰氨基]-1-甲基-3-丙基-5-氨基甲酰吡唑加入到在0'C冷卻的適量氯磺酸溶液中。攪拌、過濾、洗滌并干燥該混合物，從而產生4-[2-丙氧基-5-(氯磺酰)苯甲酰氨基]-1-甲基-3-丙基-5-氨基甲酰吡唑。在步驟2中，從上述步驟1所產生的吡唑化合物制備4-[2-丙氧基-5-(1-甲基_2-吡咯烷基乙基酰氨基磺酰基)苯甲酰氨基]-1-甲基-3-丙基-5-氨基甲酰吡唑。明確地，將適量的2-(2-氨基乙基)-l-甲基吡咯烷在0°〇加入到含有適量步驟l的4-[2-丙氧基-5-(氯磺酰)苯甲酰氨基-l-甲基-3-丙基-5-氨基甲酰吡唑的二氯甲烷溶液中，隨后進行攪拌。一旦反應完成，用二氯甲垸稀釋該反應溶液。其有機層經(jīng)洗滌、干燥、濃縮和過濾生成4-[2-丙氧基-5-(l-甲基-2-吡咯烷基乙基酰氨基磺?；?苯甲酰氨基-l-甲基-3-丙基-5-氨基甲酰吡唑。在步驟3中，從步驟2中所獲得的化合物制備5-[2-丙氧基-5-(l-甲基-2-吡咯烷基乙基酰氨基磺酰基)苯基]-1-甲基-3-丙基-1,6-二氫-7H-吡唑并(4,3-d)嘧啶-7-酮，即本發(fā)明的吡唑并嘧啶衍生物。明確地，將適量步驟2中合成的吡唑化合物溶解于t-丁醇中，向其中加入適量的叔丁醇鉀，隨后回流一段必需的時間。一旦反應完成，對該反應溶液進行冷卻、稀釋、洗滌和干燥。然后，進行減壓蒸餾、去除溶劑和硅膠柱層析，從而生成本發(fā)明的新型吡唑并嘧啶衍生物。本發(fā)明涉及一種用于預防和治療肝病的藥物組合物，如下所述。1)本發(fā)明提供肝纖維化抑制劑。2)本發(fā)明還提供一種用于預防和治療肝硬化的藥物組合物，其抑制肝纖維化。3)本發(fā)明進一步提供門靜脈高血壓抑制劑。4)本發(fā)明還提供一種用于預防和治療由門靜脈高血壓所引起的并發(fā)癥的藥物組合物。隨著肝臟中的肝星狀細胞中膠原蛋白沉積的增加，肝纖維化逐漸形成。然后，纖維間殘存的肝細胞開始增殖從而維持肝功能，通過此過程形成了再生結節(jié)。肝小葉的主靜脈受到這樣的纖維化和再生結節(jié)的擠壓，從而導致阻斷血流經(jīng)過門靜脈進入肝，從而導致門靜脈高血壓。因此，門靜脈血壓可以隨著肝纖維化的抑制而降低。經(jīng)過肝的血流量能夠隨著門靜脈血壓的降低和門血流量的增加而提高，從而導致對肝的保護。如上文所述，肝纖維化和門靜脈血壓的控制與肝保護緊密相關。本發(fā)明含有吡唑并嘧啶衍生物作為其有效成分的組合物能夠通過抑制膠原蛋白在肝星狀細胞中的合成來預防肝纖維化過程，具有對肝的保護作用，能夠通過直接作用于門靜脈降低門靜脈血壓，并增加經(jīng)過門靜脈的血流量，所有這些都暗示本發(fā)明具有對與肝纖維化和門靜脈高血壓相關的慢性肝病優(yōu)秀的治療作用。本發(fā)明的吡唑并嘧啶衍生物具有其他常規(guī)PDE5抑制劑10-16倍的優(yōu)秀的膠原蛋白合成抑制作用。通過這樣優(yōu)秀的作用證明了本發(fā)明的吡唑并嘧啶衍生物能夠抑制肝纖維化，該肝纖維化是由膠原蛋白在肝中的肝星狀細胞中的沉積所導致的，并且能夠保護肝(見表l)。另外，本發(fā)明的吡唑并嘧啶衍生物劑量依賴性地降低門靜脈血壓，但是增加門靜脈直徑和門靜脈血流量。與經(jīng)報告為而是增高門靜脈血壓的西地那非不同，本發(fā)明的吡唑并嘧啶衍生物能夠有效地用于治療門靜脈高血壓以及由此誘導的多種并發(fā)癥(見表2)。慢性肝病包括多種由肝硬化所導致的并發(fā)癥，該肝硬化是由肝纖維化和門靜脈高血壓所引起的(RubinFarberPathology,1999)。這樣的并發(fā)癥通過以下各項舉例說明食道靜脈曲張(AmericanFamilyPhysician,55(5),1851,1997)，脾肥大和脾機能亢進，腹水，肝腎綜合征(Gas加enterologyVol.120,No.3)，自發(fā)性細菌性腹膜炎(CurrOpinionInGastroenterology2004,20:254-263)，肝肺綜合癥(DigDisSci2003,48:556-560),肝性腦病(Neuroreport2003,14:2379-2382)，等。這樣的并發(fā)癥在下文中詳述。食道靜脈曲張指食道或胃中產生異常靜脈。當病癥惡化時，也隨之惡化，那些靜脈破裂并出血。高門靜脈血壓導致血流障礙，從而增加脾細胞的尺寸，由此形成脾肥大，形成了內部出血的另一個原因。腹水指腹部水腫。高門壓增高血漿和淋巴中的靜水力學壓力，從而導致淋巴靜態(tài)平衡，該靜態(tài)平衡誘導水分外流到腹腔中。腹水壓迫肺，導致困難呼吸，并且對肺的長期壓迫還導致致命的膿毒病。先天(自生)細菌性腹膜炎，也是由高門靜脈血壓所觸發(fā)的，經(jīng)常在患有腹水的患者中觀察到，這與其它具有預期原因如內部腸破裂(enterrohexis)和胃破裂或外傷的腹膜炎(繼發(fā)性腹膜炎)不同。肝腎綜合征包括由肝硬化所引起的嚴重的腎衰，它是由體液不平衡所觸發(fā)的。肝肺綜合征是組織缺氧疾病，在患有慢性肝病的患者中觀察到，盡管那些患者不具有特殊的心臟或肺疾病。類似于肝硬化，肝性腦病是另一種嚴重的并發(fā)癥，該并發(fā)癥從由于肝功能衰退而引起的氨，即一種內部毒性物質向尿素轉化的功能障礙發(fā)展而來，由此影響神經(jīng)元系統(tǒng)及甚至導致致命的昏迷。如上文所解釋的，血液循環(huán)障礙壓迫門靜脈并隨之發(fā)生血液在門靜脈中回流，因此該血流尋找不經(jīng)過肝的迂回路。作為結果，產生側副管，特別地是在食物導管的低壓區(qū)如在食道的黏液層下面，前側腹壁上和直腸等中。因此本發(fā)明的吡唑并嘧啶衍生物能夠有效地用作一種預防和治療上文所提及的并發(fā)癥的藥物組合物，且這是通過從根本上抑制門靜脈壓的增高來實現(xiàn)的。一種用于預防和治療肝病的藥物組合物，其含有吡唑并嘧啶衍生物作為本發(fā)明的有效成分，該組合物能夠口服或腸胃外施用，并且以藥物制劑的普遍形式使用。在本發(fā)明中，口服是優(yōu)選的。本發(fā)明的藥物組合物能夠通過與常用填充劑、增量劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、稀釋劑如表面活性劑或賦形劑相混合而制備用于口服或胃腸外給藥。用于口服的固體制劑是片劑、丸劑、粉劑、粒劑和膠囊劑。這些固體制劑是通過混合一種或多種適合的賦形劑如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、明膠等而制備的。除了簡單賦形劑，即潤滑劑，能夠使用例如硬脂酸鎂、滑石等。用于口服的液體制劑是混懸劑、溶液、乳劑和糖漿，并且上述制劑除了常用的簡單稀釋劑如水和液體石蠟外，能夠含有多種賦形劑，如潤濕劑、甜味劑、芳香劑和防腐劑。用于胃腸外給藥的制劑是無菌水溶液，不溶于水的賦形劑，混懸劑，乳劑和栓劑。不溶于水的賦形劑和混懸劑，除了一種或多種所述活性化合物外，能夠包含丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄欖油，可注射的酯如油酸乙酯，等。栓劑，除一種或多種所述活性化合物外，能夠包含witepsol，聚乙二醇，吐溫61，可可脂，月桂精油脂，甘油明膠，等。本發(fā)明的含有吡唑并嘧啶衍生物作為有效成分的組合物的有效劑量能夠根據(jù)重量、年齡、性別、健康狀況、飲食、給藥頻率、給藥方法、排泄以及疾病的嚴重性來確定。對成年人優(yōu)選的劑量和給藥頻率是50200mg/天及每天l到3或4次。附圖簡述圖1-4是一組顯微照片，其顯示了根據(jù)本發(fā)明實施例2的各種膠原蛋白合成抑制作用，包括野生型對照(圖1)，溶劑對照(圖2)，西地那非處理組(圖3)和吡唑并嘧啶衍生物處理組(圖4)。實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明實用的和目前優(yōu)選的實施方案如以下實施例所示進行例證說明。然而，可以理解本領域中的技術人員，鑒于本公開內容，可以在本發(fā)明的精神和范圍內進行修改和改進。實施例1:利用肝星狀細胞研究吡唑并嘧啶衍生物對膠原蛋白合成的抑制作用進行以下實驗研究本發(fā)明的吡唑并嘧啶衍生物對膠原蛋白合成的抑制作用。肝星狀細胞分離自SpragueDawley白色雄性大鼠(重量約300g，n=10)。首先，將氯胺酮(ketamin)注射到其腹腔內，從而麻醉該大鼠。打開其腹部，并將肝素注射到門靜脈中。然后，將含有0.02%鏈霉蛋白酶和0.015%膠原蛋白酶的Hank's緩沖溶液經(jīng)肝灌注一段必需的時間，從而將肝制備為切片。將摘除的肝在無菌培養(yǎng)皿上碾碎，再將其放入含有鏈霉蛋白酶和DNA酶的緩沖溶液，并對該碾碎的肝在無菌培養(yǎng)皿上進行均化。利用100um尼龍網(wǎng)在50ml的管中過濾所制備的樣品。以50g離心2分鐘，從而分離上清液中的非實質細胞。再一次在4"C以450g進行離心10分鐘。使該沉淀漂浮在含有25"g/ml的DNA酶的緩沖溶液中，隨后在4'C以450g離心IO分鐘，該過程重復兩次。使最終沉淀漂浮在21ml緩沖溶液中，再將其與17ml的25%OptiPrep混合，從而制備11.2%OptiPrep的最終溶液(1.058g/cm3)。將與OptiPrep混合的細胞混懸液溶液小心地分配到4個裝有3ml17%OptiPrep的15ml管中，向其中加入lml的緩沖溶液。在4匸以1400g離心17分鐘，作為結果，從所述緩沖溶液和11.8%OptiPrep間的不透明層中獲得純肝星狀細胞。將分離的肝星狀細胞懸浮于DMEM(Dulbecco'sModifiedEagle'sMedia)中，隨后洗滌。將該細胞再一次懸浮于添加了10%FBS(胎牛血清)和抗生素的DMEM中，然后接種在培養(yǎng)瓶中，將其培養(yǎng)在37。C，5%002的培養(yǎng)箱中。首先在24小時后更換該培養(yǎng)基，然后每48小時進行更換，從而進行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)了8次的肝星狀細胞以2xl()S進行分組，所述肝星狀細胞經(jīng)過25ng/ml的PDGF(血小板衍生生長因子)預處理24小時。在那時，將吡唑并嘧啶衍生物，西地那非和伐地那非以O，3，5和10ng/ml的不同的濃度加入，進行反應。提取總RNA并對膠原蛋白進行RT-PCR(反轉錄酶多聚酶鏈式反應)。.基于與P-肌動蛋白的相對濃度，將靶物質與其它測試樣品進行比較。為了確定靶樣品對膠原蛋白合成的抑制作用，研究了抑制濃度50%(IC50)并將結果示于表l中。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>如表1中所示，吡唑并嘧啶衍生物的IC5o是0.8土0.2nM，其膠原蛋白合成的抑制作用分別高于西地那非和伐地那非16倍和10倍。因此，證明了本發(fā)明的吡唑并嘧啶衍生物比其他PDE5抑制劑，即西地那非和伐地那非，具有更優(yōu)秀的對膠原蛋白合成的抑制作用，并且從而對肝纖維化也具有優(yōu)秀的抑制作用以及由此的優(yōu)秀的肝保護作用，其中所述肝纖維化是由過量膠原蛋白沉淀所引起的。實施例2:利用肝纖維化動物模型研究吡唑并嘧啶衍生物的肝保護作用進行了以下實驗，從而研究本發(fā)明的吡唑并嘧啶衍生物的體內膠原蛋白合成抑制作用。將SpragueDawle白色雌性大鼠(體重大約300g)分為4組(每組5只)，并在除野生型對照組以外的實驗組中誘導肝纖維化(Toxicology,2001)。將DMN(二甲基亞硝胺)以10mg/kg的劑量注射到腹腔中，以每周3次的劑量頻率連續(xù)注射2周。將三唑緩沖劑(Merch)中的吡唑并嘧啶衍生物和西地那非以10mg/kg/天經(jīng)口施用2周(DMN誘導期)。僅將三唑緩沖劑施用于所述溶劑對照組。2周后，摘除肝，在10%中性福爾馬林中固定，包埋在石蠟中，并以4m切片。用二甲苯處理每個切片，從而去除石蠟，隨后用酒精和0.1%過氧化氫(H202)處理。經(jīng)PBS處理后，用以1:500稀釋的針對膠原蛋白類型I的多克隆抗血清(Chemicon)和以1:100稀釋的針對膠原蛋白類型III的多克隆抗血清(BioGenesis)，在37。C處理所述切片1小時。洗滌后，用以1:200稀釋的生物素綴合山羊抗兔IgG處理樣品。通過所述樣品與抗生物素蛋白-生物素復合物(VectorLaboratories)反應進行免疫組織學染色，然后用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)標記抗原-抗體復合物，其圖像利用光學顯微鏡獲取，并顯示于圖l-4中。用非免疫馬血清代替一抗對所述對照組進行處理。如圖1-4所示，在所述溶劑對照組的肝門靜脈內和門靜脈附近觀察到了與野生型動物相比，高水平的膠原蛋白的合成，這說明膠原蛋白的合成受到吡唑并嘧啶衍生物和西地那非的顯著抑制。膠原蛋白合成的抑制在吡唑并嘧啶衍生物處理組中比在西地那非處理組中更強烈。實施例3:利用門靜脈高血壓動物模型研究吡唑并嘧啶衍生物的作用進行了以下實驗，從而研究本發(fā)明的吡唑并嘧啶衍生物對門靜脈高血壓的作用。將12只重量約為10kg的小獵兔犬(beagledogs)分為4組(每組隨機選擇3只犬)，并對它們進行膽管結扎。在從該手術后兩周內，將吡唑并嘧啶衍生物、西地那非和伐地那非以10mg/kg/天的劑量經(jīng)口施用，并且對其中3只僅施用溶劑。使該動物禁食4小時，然后靜脈注射戊巴比妥，從而麻醉它們。將管子經(jīng)腸系膜靜脈插入到門靜脈，從而測量門靜脈血壓。進行多普勒超聲波檢查法，以測量門靜脈的直徑。經(jīng)過所述門靜脈的血流量通過利用以下數(shù)學化學圖1進行測量，并且將其結果顯示于表2中。數(shù)學圖1血流速率=jiR2XVX60(R:門靜脈直徑/2,V:平均血流速)2吡唑并嘧啶衍生物對門靜脈高血壓的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>a平均值士標準偏差，'統(tǒng)計學上顯著的(p<0.05)如表2中所示，門靜脈血壓在所述吡唑并嘧啶衍生物處理組中降低了21%，在所述西地那非處理組中降低了7%和在所述伐地那非處理組中降低了9%，這些結果都是通過與所述溶劑處理組比較而獲得的。由比較門靜脈直徑，證明了所述吡唑并嘧啶衍生物、西地那非和伐地那非處理組中每個的門靜脈直徑都增加了6-9%，并認為這些結果在統(tǒng)計學上是不顯著的。還比較了經(jīng)過門靜脈的血流速率。作為結果，與所述溶劑處理組相比，所述吡唑并嘧啶衍生物處理組中的血流速率增加了59.9%,西地那非和伐地那非處理組中的血流速率分別增加了29.1%和24.8%。由上述結果，證明了本發(fā)明的吡唑并嘧啶衍生物，與已知相反地增高門靜脈血壓的西地那非不同，它明顯地降低門靜脈血壓而顯著增加經(jīng)過門靜脈的血液流量，從而使其成為治療藥物組合物的有效候選者，其中所述治療藥物組合物是用于門靜脈高血壓及其并發(fā)癥的，且無副作用，包括食道靜脈曲張出血，等。實施例4:研究吡唑并嘧啶衍生物的體內藥物動力學符合如下標準的門靜脈高血壓患者中的9名志愿者參加了實驗，所述標準為年齡在19-45歲之間，體重超過45kg(在理想體重15%的偏差內)。他們都是以書面形式同意加入該實驗且值得信任，合作并愿意遵守規(guī)則的志愿者。將他們隨機地分為3組；向他們中的3名施用吡唑并嘧啶衍生物，3名施用西地那非，剩下的3名施用伐地那非，且分別以100，50和10mg的不同的濃度進行給藥。使用雙盲方法進行本實驗。在測試當天上午8-9點，將測試藥物和240ml水一起給志愿者。從給藥開始4小時中，使他們禁食，并在4小時后提供午餐，9小時后提供晚餐。在以下時刻取血液樣品測試當天給藥前，給藥后第0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、12、24和32小時。分離血漿，隨后進行HPLC。將100tU的O.IM碳酸鈉和l.Omlethyleter加入到0.5ml血漿中，然后充分混合l分鐘，隨后以12，000rpm離心3分鐘。獲得上清液，并利用速度真空機(speedvac)揮發(fā)有機溶劑。然后，加入100tU流動相，隨之攪拌。將由此獲得的產物注入HPLC注射器中，結果顯示于表3中。表3比較吡唑并嘧啶衍生物、西地那非和伐地那非在門靜脈高血壓患者中的半衰期<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>a平均值土標準偏差如表3中所示，吡唑并嘧啶衍生物的半衰期是15.1±3.5小時，分別是西地那非(4.5±1.2)和伐地那非(6.3±2.1)的3倍和2倍。因此，本發(fā)明的吡唑并嘧啶衍生物不僅具有優(yōu)秀的對肝纖維化和門靜脈高血壓的治療作用，還降低給藥頻率，這歸功于它的比其他PDE5抑制劑更長的半衰期，這些暗示吡唑并嘧啶衍生物能夠提高患有慢性肝病的患者的順從性。下文描述了本發(fā)明組合物的制備實例。制備實例制備用于口服的藥物組合物1.制備粉劑吡唑并嘧啶衍生物2g乳糖lg將上述成分混合在一起，并將該混合物裝入密封袋中，從而制備粉劑。將上述成分混合在一起，且片劑通過根據(jù)常規(guī)片劑生產方法壓片制備。3.制備膠囊劑將上述成分混合在一起，根據(jù)常規(guī)膠囊劑生產方法將該混合物裝入到明膠膠囊中，從而制備膠囊劑。工業(yè)適用性如上文所解釋的，本發(fā)明的吡唑并嘧啶衍生物對于肝星狀細胞中膠原蛋白合成具有優(yōu)秀的抑制作用，增加經(jīng)過門靜脈的血流量并通過直接作用于所述門靜脈擴張該門靜脈的直徑，以及降低門靜脈血壓。因此，吡唑并嘧啶衍生物能夠有效地用于預防和治療肝纖維化，長期肝纖維化所導致的肝硬化，門靜脈高血壓以及由此導致的多種并發(fā)癥。另外，本發(fā)明的吡唑并嘧啶衍生物在體內具有較長的半衰期，這暗示著它能夠通過削減給藥頻2.制備片劑吡唑并嘧啶衍生物玉米淀粉乳糖硬脂酸鎂100mg100mg100mg2mg吡唑并嘧啶衍生玉米淀粉乳糖硬脂酸鎂100mg100mg100mg2mg率來提高慢性肝病患者的順從性。本領域的那些技術人員會理解以上描述中公開的概念和具體實施方案可以方便地用作改良或設計其他實施方案的基礎，從而實現(xiàn)與本發(fā)明相同的目的。本領域中的那些技術人員還將理解那樣的等價實施方案不背離如所附權利要求所闡明的本發(fā)明的精神和范圍。權利要求1.一種肝纖維化抑制劑，其包含由以下化學圖1所表示的吡唑并嘧啶衍生物作為有效成分?；瘜W圖12.—種用于預防和治療肝硬化的藥物組合物，其包含由以下化學圖l所表示的吡唑并嘧啶衍生物作為有效成分。化學圖1<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3.—種門靜脈高血壓抑制劑，其包含由以下化學圖1所表示的吡唑并嘧啶衍生物作為有效成分?；瘜W圖1<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage3</formula>4.一種用于預防和治療由門靜脈高血壓所導致的并發(fā)癥的藥物組合物，其包含由以下化學圖1所表示的吡唑并嘧啶衍生物作為有效成分?；瘜W圖1<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage3</formula>5.權利要求4中所述的用于預防和治療由門靜脈高血壓所導致的并發(fā)癥的藥物組合物，其中所述并發(fā)癥選自由下列各項組成的組食道靜脈曲張，脾肥大，脾機能亢進，腹水，自發(fā)性細菌性腹膜炎，肝腎綜合征，肝肺綜合癥或肝性腦病。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于預防和治療肝病的藥物組合物，其含有吡唑并嘧啶衍生物作為有效成分。根據(jù)本發(fā)明，吡唑并嘧啶衍生物對于抑制肝星狀細胞中膠原蛋白合成具有優(yōu)秀作用，并直接作用于門靜脈。特別地，它可以增加所述門靜脈的直徑及血流量，并最終降低其壓力。因此，吡唑并嘧啶衍生物能夠有利地用于預防和治療肝纖維化、由肝纖維化導致的肝硬化、門靜脈高血壓以及由門靜脈高血壓導致的多種并發(fā)癥。另外，根據(jù)本發(fā)明的吡唑并嘧啶衍生物由于其長半衰期，能夠降低劑量給藥頻率，并且因此具有改善患慢性肝病患者藥物順從性的優(yōu)勢。文檔編號A61K31/519GK101193636SQ200580050065公開日2008年6月4日申請日期2005年10月21日優(yōu)先權日2005年6月10日發(fā)明者劉武嬉,安秉玉,崔薛珉申請人:東亞制藥株式會社