專利名稱：作為有效的siRNA載體的高分支HK肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用siRNA通過將轉(zhuǎn)染復(fù)合物與一種或多種細(xì)胞相接觸而轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物及其組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)染復(fù)合物及其組合物治療患者的方法。
背景技術(shù)：
小干擾RNA分子(siRNA)的使用是使基因沉默并由此使相應(yīng)的基因產(chǎn)物沉默的有效新技術(shù)。已經(jīng)報道，RNA干擾(RNAi)比反義RNA獨自沉默基因的效率高十倍(Rocheleau CE等人，Wnt signaling and an APC-relatedgene specify endoderm in early C.elegans embryos.Cell 1997；90707-716.)。siRNA已經(jīng)用于研究蛋白質(zhì)在信號傳導(dǎo)途徑中的作用，并且已經(jīng)表明這些分子可以用于治療多種其中致病蛋白過量表達(dá)的疾病(Arenz C，SchepersU.，RNA interferencefrom an ancient mechanism to a state of the arttherapeutic application？Naturwissenschaften 2003；90345-359.；Coburn GA，Cullen BR.siRNAsa new wave of RNA-based therapeutics.J AntimicrobChemother 2003；51753-756.)。為避免由較長雙鏈RNA誘導(dǎo)的非特異性的基因沉默，小干擾RNA(21-23個核苷酸的雙鏈體)，已經(jīng)被用作調(diào)節(jié)子來降解靶mRNA(Fire A，Xu S，Montgomery MK，Kostas SA，Driver SE，MelloCC.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA inCaenorhabditis elegans.Nature 1998；391806-811.)。siRNA一旦進(jìn)入細(xì)胞，即被摻入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC) ——一種導(dǎo)致RNA雙鏈解旋和鏈分離的蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。然后，反義RNA指導(dǎo)活化的RISC來使靶mRNA退火并裂解靶mRNA(Hammond SM，Bernstein E，Beach D，HarmonGJ.An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing inDrosophila cells.Nature 2000；404293-296；Reynolds A，Leake D，Boese Q，Scaringe S，Marshall WS，Khvorova A.Rational siRNA design for RNAinterference.Nat Biotechnol 2004；22326-330；Hammond SM，Boettcher S，Caudy AA，Kobayashi R，Harmon GJ.Argonaute2，a link between genetic andbiochemical analyses of RNAi.Science 2001；2931146-1150；Bernstein E，Caudy AA，Hammond SM，Harmon GJ.Role for a bidentate ribonuclease inthe initiation step of RNA interference.Nature 2001；409363-366.)。
病毒和非病毒載體已經(jīng)被用來攜帶siRNA至它們的細(xì)胞溶質(zhì)的mRNA靶(Simeoni F，Morris MC，Heitz F，Divita G.Insight into themechanism of the peptide-based gene delivery system MPGimplications fordelivery of siRNA into mammalian cells.Nucleic Acids Res2003；312717-2724.)。然而，迄今為止，少數(shù)肽載體已經(jīng)被開發(fā)，其已經(jīng)證明對siRNA高效遞送至真核細(xì)胞(即，轉(zhuǎn)染)是有效的。
現(xiàn)有技術(shù)中存在對具有足以遞送治療有效量的siRNA進(jìn)入靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率的藥劑遞藥系統(tǒng)的需求。特別地，現(xiàn)有技術(shù)中存在對能夠遞送siRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的改良的遞藥系統(tǒng)的需求。現(xiàn)有技術(shù)中還存在對在血清中穩(wěn)定而使遞藥系統(tǒng)在體外和體內(nèi)都有效的載體的需求。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法。特別地，所述方法包括將轉(zhuǎn)染復(fù)合物與一種或多種細(xì)胞接觸，其中所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物包括轉(zhuǎn)運聚合物和siRNA。所述轉(zhuǎn)運聚合物包括組氨酸和賴氨酸。轉(zhuǎn)運聚合物的例子包括但不限于H3K8b、H3K8b(+RGD)和結(jié)構(gòu)上類似的類似物，具有八個末端分支和組氨酸富集的結(jié)構(gòu)域，特別是那些約與H3K8b同樣大小或比H3K8b小一些的聚合物。根據(jù)某些實施方案，細(xì)胞可以選自轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、重組細(xì)胞系、惡性細(xì)胞系或原代細(xì)胞系。
本發(fā)明的方法還可以包括形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。所述方法可以進(jìn)一步包括在將所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物與細(xì)胞接觸之前使轉(zhuǎn)染復(fù)合物在約室溫下靜置約15分鐘至約1個半小時。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括siRNA和包括H3K8b或其結(jié)構(gòu)類似物的轉(zhuǎn)運聚合物的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括這樣的轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組合物。
附圖簡述本發(fā)明通過參考附圖中所描述的其實施方案而更加容易被理解，其中

圖1HK聚合物的圖式結(jié)構(gòu)。圖1描述了這里所討論的HK聚合物的圖式結(jié)構(gòu)，包括本發(fā)明的某些HK聚合物，如H3K8b。在圖中，由實線連接的3個實心環(huán)代表各個聚合物的三賴氨酸核心。虛線分開聚合物中重要的結(jié)構(gòu)域或基團(tuán)。在高分支聚合物H3K8b中，從賴氨酸核心向外，順序如下(1)4個組氨酸富集的結(jié)構(gòu)域(H8HHHHNHHHH)；(2)4個賴氨酸(由K表示)；和(3)由R表示的8個末端HK分支。在較少分支的聚合物(H3K4b、H2K4b和HK4b)中，存在4個從三賴氨酸核心發(fā)出的末端HK分支。貫穿本申請，術(shù)語“H3K8b”指圖1中所描述的結(jié)構(gòu)，不含整合素(integrin)配基RGD。類似地，術(shù)語“H3K8b(-RGD)”指不含RGD的結(jié)構(gòu)。
圖2H3K8b是有效的siRNA載體。圖2是描述β-半乳糖苷酶siRNA的幾種可能的載體(Lipofectamine、DOTAP、H3K8b、H3K4b、H2K4b和HK4b)抑制SVR-bag4細(xì)胞中β-半乳糖苷酶(β-gal)表達(dá)的能力的效率的條線圖，為它們抑制SVR-bag4細(xì)胞中β-半乳糖苷酶(β-gal)表達(dá)的能力。H3K8b是最有效的載體，降低了80％的表達(dá)。在只有4個末端分支的聚合物(即HK4b、H2K4b和H3K4b)中，聚合物H3K4b是最有效的siRNA載體。數(shù)據(jù)表示三次實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(S.D.)。P＜0.001，對照vs.H3K8b或H3K4b；**，P＜0.05，對照vs.Lipofectamine、H2K4b或HK4b(多重比較vs.對照組(Bonferroni t檢驗))。
圖3H3K8b(+RGD)與β-半乳糖苷酶siRNA復(fù)合物顯著抑制β-半乳糖糖苷酶的表達(dá)。SVR-bag4細(xì)胞用H3K8b(+RGD)與β-半乳糖苷酶siRNA的復(fù)合物(4∶1；μg∶μg比例)轉(zhuǎn)染48小時，然后通過使用β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測β-半乳糖苷酶活性。β-半乳糖苷酶染色證實了H3K8b(+RGD)與β-半乳糖苷酶siRNA的復(fù)合物顯著抑制了SVR-bag4細(xì)胞的β-半乳糖苷酶活性。圖3A描述了使用H3K8b(+RGD)作為部分轉(zhuǎn)染復(fù)合物而轉(zhuǎn)染的SVR-bag4細(xì)胞。圖3B描述了未經(jīng)處理的對照細(xì)胞。
圖4、最佳的H3K8b∶siRNA比例。圖4是描述使用不同比例的聚合物∶siRNA(wt/wt)抑制β-半乳糖苷酶的條線圖。為確定對于H3K8b的最佳的聚合物∶siRNA(μg∶μg)比例，使用靶向β-半乳糖苷酶的不同比例的聚合物和siRNA轉(zhuǎn)染SVR-bag4細(xì)胞。48小時后，如實施例中所描述的對β-半乳糖苷酶活性定量。在約3∶1和約6∶1之間的聚合物∶siRNA比例比其他比例更多地抑制了β-半乳糖苷酶的表達(dá)。數(shù)據(jù)表示三次實驗的平均值±S.D.。
圖5H3K8b(+RGD)與靶向熒光素酶的siRNA的復(fù)合物顯著抑制熒光素酶活性。圖5是描述使用不同載體時抑制熒光素酶的條線圖。為檢測H3K8b作為其他siRNA的載體的能力，使用熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒與SuperFect的復(fù)合物(2∶1載體/核酸比例)及利用H3K8b(+RGD)(4∶1)、H3K4b(4∶1)、DOTAP(4∶1)使用靶向熒光素酶的siRNA共轉(zhuǎn)染惡性MDA-MB-435細(xì)胞系24小時。使用Turner 20/20光度計檢測熒光素酶活性。β-半乳糖苷酶用作對照siRNA，使用H3K8b以4∶1的比例轉(zhuǎn)染。數(shù)據(jù)表示三次實驗的平均值±S.D.。*，P＜0.001，對照vs.H3K8b(+RGD)、H3K4b或DOTAP；**，P＜0.01，H3K8b(+RGD)vs.H3K4b或DOTAP(使用bonferroni t-檢驗多重比較檢驗的單因素方差分析(one way ANOVA))。
圖6H3K8b(+RGD)與其他載體的比較增加了Cy3標(biāo)記的siRNA的攝取效率。圖6描述了在SVR-bag4細(xì)胞(一種小鼠內(nèi)皮細(xì)胞系，經(jīng)SV病毒轉(zhuǎn)化，表達(dá)β-半乳糖苷酶)、MDA-MB-435(一種惡性乳腺癌細(xì)胞系)和C6細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染率。使用復(fù)合有DOTAP(4∶1)、Lipofectamine(4∶1)或H3K8b(+RGD)(4∶1)的Cy3標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞；4小時后，使用熒光顯微鏡100x獲得影像。圖6顯示使用H3K8b(+RGD)作為Cy3標(biāo)記的siRNA載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞具有Cy3標(biāo)記的siRNA的較高攝取。
圖7由H3K8b∶siRNA復(fù)合物誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡和壞死。SVR-bag4細(xì)胞使用如下實施例中所細(xì)述的H3K8b與β-半乳糖苷酶siRNA的復(fù)合物所轉(zhuǎn)染。實驗組為未處理(A)和H3K8b∶siRNA復(fù)合物(4∶1比例；wt/wt)。細(xì)胞然后使用YO-PRO-I和PI熒光染料進(jìn)行處理并使用488nm激發(fā)光通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。V活力細(xì)胞；A凋亡細(xì)胞；N壞死細(xì)胞。
圖8由不同載體∶siRNA復(fù)合物誘導(dǎo)的毒性。SVR-bag4細(xì)胞使用實施例中細(xì)述的不同的載體與β-半乳糖siRNA的復(fù)合物轉(zhuǎn)染。細(xì)胞然后使用YO-PRO-I和PI熒光染料進(jìn)行處理并使用488nm激發(fā)光通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。通過從活力細(xì)胞組排除的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)來確定毒性(或非活力細(xì)胞)。數(shù)據(jù)表示三次實驗的平均值和S.D.。*，P＜0.05，H3Kb(+RGD)vsDOTAP；**，P＜0.001，H3K8b(+RGD)vs Lipofectamine、Lipofectamine 2000或Oligofectamine(用Bonferroni多重比較檢驗的單因素方差分析)。轉(zhuǎn)染載體∶siRNA復(fù)合物比例是4∶1(wt∶wt)，除了Lipofectamine 2000和Oligofectamine之外(其中比例為2∶1)。
圖9H3K8b的重要結(jié)構(gòu)域。為確定H3K8b的重要結(jié)構(gòu)域，合成了幾種聚合物，其改變了以下三個結(jié)構(gòu)域的一個或多個(+K)H3K8b加入單賴氨酸至各個末端分支；(-HHHK)H3K8b從各個末端分支去除4個氨基酸；H3K(G)8b用甘氨酸取代組氨酸富集的結(jié)構(gòu)域；H3K8b(+RGD)具有整合素配基RGD。圖9描述了這些聚合物的結(jié)構(gòu)。
圖10，圖10是顯示(+K)H3K8b(+RGD)中單個賴氨酸向末端分支的加入或H3K(G)8b(+RGD)中用甘氨酸對組氨酸富集的結(jié)構(gòu)域(H8)的取代顯著降低了這些聚合物作為siRNA載體的能力。數(shù)據(jù)表示三次實驗的平均值±S.D.。*，P＜0.001未處理的vs.Oligofectaniine、H3K8b、(-HHHK)H3K8b、H3K8b(+RGD)和(-HHHK)H3K8b(+RGD)；**，P＜0.01Oligofectaniine vs.H3K8b(+RGD)或(-HHHK)H3K8b(+RGD)(Bonferroni多重比較檢驗的單因素方差分析)。HK聚合物和Oligofectaniine與siRNA的復(fù)合物的比例分別為4∶1和2∶1w/w。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明的方面、優(yōu)點和其他特征參考以下詳細(xì)描述將變得明顯，以下詳細(xì)描述公開了本發(fā)明的各種非限制性實施方案。在描述本發(fā)明的實施方案中，為了清楚而采用了特定術(shù)語。然而，本發(fā)明無意限定于如此選擇的特定術(shù)語。應(yīng)該理解，每個特定的元素包括所有以相似方式達(dá)到相似目的的技術(shù)等同物。另外，這里的所有引文都通過引用方式整體并入本文。
本發(fā)明涉及用siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。特別地，本文公開的是新型的siRNA轉(zhuǎn)運復(fù)合物，包括意想不到有利的轉(zhuǎn)運聚合物。本發(fā)明的方法包括將轉(zhuǎn)染復(fù)合物與一種或多種細(xì)胞接觸，其中所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物包括轉(zhuǎn)運聚合物和siRNA。所述轉(zhuǎn)運聚合物是包括組氨酸和賴氨酸的載體(HK載體)。
這里使用的單數(shù)形式可以表示一或多。本文使用的“另一”可以表示至少第二或更多。
術(shù)語“氨基酸”包括20種普通氨基酸以及“非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸”，例如D氨基酸和化學(xué)(或生物學(xué))生成的“普通”氨基酸的衍生物，包括例如β-氨基酸。
如果由于兩種化合物之間共價或非共價相互作用兩種化合物已經(jīng)形成一種復(fù)合物，則一種化合物與第二種化合物是“連接的”。
術(shù)語“共聚物”指含有兩個或多個類型的單元的聚合物，不論單元沿鏈的排列(隨機(jī)、交替、嵌段、接枝)，也不論它的分子結(jié)構(gòu)(線性的或分支的)。術(shù)語“組氨酸共聚物”表示包括組氨酸作為其單元類型的共聚物。術(shù)語“轉(zhuǎn)運聚合物”表示包含本發(fā)明的組氨酸共聚物的聚合物。
術(shù)語“分支”包括任何單體或其線性聚合物(包括共聚物)，其在至少一個末端與分支單體的側(cè)基共價連接。本身包括一個或多個分支單體的分支被稱為“非末端分支”。不包含分支單體的分支被稱為“末端分支”。“末端分支”可以包括例如對分支的n末端氨基酸的組氨酸或賴氨酸的分支的最終分化。末端分支可以包括非組氨酸或賴氨酸(例如，半胱氨酸或其他連接劑)，其幫助結(jié)合穩(wěn)定劑(如PEG或HPMA)和/或靶向配基。
術(shù)語“分支的聚合物”包括含有至少一個骨架和至少一個末端分支的任何聚合物。分支的聚合物可以進(jìn)一步包括一個或多個非末端分支。
術(shù)語“HK肽”、“HK聚合物”和“HK載體”意欲表示包括組氨酸和賴氨酸的轉(zhuǎn)運聚合物，包括本發(fā)明涵蓋的聚合物。
術(shù)語“體內(nèi)”包括基于注射的治療，不論靜脈的還是局部的(例如，瘤內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、氣管內(nèi)、靜脈內(nèi)或眼內(nèi)直接注射入器官或氣道，注射入器官的脈管，或霧化入氣道)。術(shù)語“體內(nèi)”還包括基于對腫瘤、組織或器官的電穿孔的治療。
術(shù)語“脂類”作為它在本領(lǐng)域的術(shù)語而使用并包括具有疏水和親水部分的任何化學(xué)物種類。親水性特征一般從磷酸根、羧酸、硫酸根、氨基、巰基、硝基和其他類似基團(tuán)的存在而得來。疏水性可以由膽固醇及其衍生物和下述基團(tuán)賦予，包括但不限于長鏈飽和及不飽和脂肪烴基團(tuán)和被一個或多個芳香族、環(huán)脂肪族或雜環(huán)基團(tuán)所取代的此類基團(tuán)。
術(shù)語“非陽離子脂類”指以無電荷形式、中性的兩性離子形式或生理pH下的陰離子形式存在的許多脂類的任何一種。這樣的脂類包括例如二乙酰磷酯酰膽堿、二乙酰磷脂酰乙醇胺、神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、腦磷脂、心肌磷脂、腦苷脂、DOPE和膽固醇。
術(shù)語“陽離子脂類”指在生理pH下帶有凈正電荷的許多脂類的任何一種。這樣的脂類包括但不限于DODAC、DOTMA、DDAB、DOSPER、DOSPA、DOTAP、DC-膽固醇和DMRIE。另外，可用于本發(fā)明的許多商品化的陽離子脂類制劑可以獲得。這些包括，例如LIPOFECTIN注冊商標(biāo)(可商業(yè)獲得的陽離子脂質(zhì)體，包括DOTMA和DOPE，來自GIBCO/BRL，Grand Island，N.Y.，USA)；LIPOFECTAMINE注冊商標(biāo)(可商業(yè)獲得的陽離子脂質(zhì)體，包括DOSPA和DOPE，來自GIBCO/BRL)；和TRANSFECTAM注冊商標(biāo)(可商業(yè)獲得的陽離子脂質(zhì)體，包括DOGS，來自Promega Corp.，Madison，Wis.，USA)。
術(shù)語“肽”包括含有至少2個氨基酸殘基的直鏈和分支的氨基酸鏈以及環(huán)狀氨基酸鏈。術(shù)語“肽”和“多肽”在這里可互換使用。
術(shù)語“藥劑”包括可用于預(yù)防、延緩疾病發(fā)作或減輕疾病發(fā)作的嚴(yán)重度、減輕發(fā)作的疾病的嚴(yán)重度或者提高正常生理功能的任何治療劑以及診斷劑，例如標(biāo)志基因(GFP，熒光素酶)?！八巹笨梢园ㄒ环N或多種治療劑、一種或多種診斷劑或一種或多種治療劑和一種或多種診斷劑的組合物。
這里使用的“藥學(xué)上可接受的”本發(fā)明的藥劑遞送組合物的組分(如鹽、載體、賦形劑或稀釋劑)為一種組分，其(1)是與所述遞送組合物的其他成分相容的組分，因為它能夠包含在所述遞送組合物中而不消除所述組合物遞送藥劑的能力；和(2)當(dāng)所述遞送組合物意欲用于治療應(yīng)用時，適用于動物(如人類)而無不當(dāng)?shù)挠泻Ω弊饔?，如毒性、刺激和過敏反應(yīng)。當(dāng)副作用的危險超過所述藥劑提供的益處時是“不當(dāng)?shù)摹薄?br> 這里使用的術(shù)語“生理pH”被定義為在約7.2和約7.5之間的pH。
這里使用的術(shù)語“重組的”表示具有基因工程DNA的細(xì)胞，其在體外制備并包括來自宿主生物體或更常見的來自與宿主生物體相比不同種、屬、科、目、綱的DNA。
術(shù)語“siRNA”作為其在本領(lǐng)域的術(shù)語而被使用并包括靶向mRNA的RNA雙鏈體(每條鏈30個堿基或更少)。siRNA可以被化學(xué)或酶合成。根據(jù)本發(fā)明的siRNA可以被摻入RISC(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)中并然后在其中被活化。
“治療有效量”是預(yù)防、延緩疾病發(fā)作或減輕疾病發(fā)作的嚴(yán)重度所必需的量，或者阻止或減輕發(fā)作的疾病的嚴(yán)重度所必需的量，并且還包括提高正常生理功能所必需的量。
術(shù)語“轉(zhuǎn)染”在這里普遍用來指外源性化合物(如多聚核苷酸序列)導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞中；該術(shù)語包括但不限于外源性核酸導(dǎo)入細(xì)胞，其可以導(dǎo)致永生(immortal)或非永生(non-immortal)細(xì)胞系中基因型的永久或臨時改變。
本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了新型的包含組氨酸和賴氨酸的用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的分支載體(見Chen QR，Zhang L，Stass SA，Mixson AJ.Branchedco-polymers of histidine and lysine are efficient carriers of plasmids.NucleicAcids Res 2001；291334-1340.)。在這些分支共聚物中，賴氨酸和組氨酸組分與質(zhì)粒DNA形成復(fù)合物并部分中和質(zhì)粒DNA的負(fù)電荷。另外，pKa約為6.0的組氨酸組分緩沖并幫助質(zhì)粒DNA從內(nèi)體小泡中的釋放。通常，HK肽對遞送siRNA是無效的。在本發(fā)明中，發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)一步開發(fā)了這些載體，并目前已經(jīng)開發(fā)了其他新型高分支HK聚合物，其是具有意想不到的效果的siRNA載體。本發(fā)明的HK聚合物是有利的，例如，因為它們毒性較小并比其他聚合物提供更有效的siRNA遞送。
本發(fā)明的HK聚合物可以用于例如在體內(nèi)遞送siRNA至細(xì)胞的內(nèi)部。然而，這些聚合物還可以具有體內(nèi)應(yīng)用。這些方法都包括將轉(zhuǎn)染復(fù)合物與一種或多種細(xì)胞相接觸以遞送siRNA。所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物包括至少一個轉(zhuǎn)運聚合物和siRNA。所述轉(zhuǎn)運聚合物包括組氨酸和賴氨酸。
通常，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞包括但不限于使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)染復(fù)合物在體外或體內(nèi)易受siRNA細(xì)胞內(nèi)遞送的任何動物、植物或細(xì)菌細(xì)胞。例如，適當(dāng)?shù)募?xì)胞靶包括但不限于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、血細(xì)胞，血細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞、粒細(xì)胞、各種干細(xì)胞或祖細(xì)胞，特別是造血干或祖細(xì)胞，例如從骨髓、臍帶血液、外周血液、胎兒肝等獲得的。在某些方面，所述細(xì)胞選自肺細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、造血干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。
根據(jù)某些實施方案，所述細(xì)胞包括一種或多種選自轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、重組細(xì)胞系、惡性細(xì)胞系和原代細(xì)胞系。通過非限制性的例子，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可以包括選自SVR-bag4、MDA-MB-435、C6和HUVEC(人類臍靜脈內(nèi)皮)細(xì)胞系的一種或多種細(xì)胞。
對于基于質(zhì)粒的治療，核輸入對于轉(zhuǎn)錄的發(fā)生是重要的，且這在幾種細(xì)胞系中似乎是限速步驟(Pollard H，Remy JS，Loussouarn G，Demolombe S，Behr JP，Escande D.Polyethylenimine but not cationic lipids promotestransgene delivery to the nucleus in mammalian cells.J Biol Chem1998；2737507-7511；Zabner J，F(xiàn)asbender AJ，Moninger T，Poellinger KA，Welsh MJ.Cellular and molecular barriers to gene transfer by a cationic lipid.JBiol Chem 1995；27018997-19007.)。因為核輸入對于siRNA降解其靶mRNA是不必要的，認(rèn)為本發(fā)明的聚合物在大多數(shù)細(xì)胞系中作為siRNA載體是有效的。
根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法還可以包括形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物和在將所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物與細(xì)胞接觸之前使所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物在約室溫下靜置約15分鐘至約1.5小時或從約15分鐘至約45分鐘。
根據(jù)本發(fā)明包括組氨酸和賴氨酸的轉(zhuǎn)運聚合物包括有效用于轉(zhuǎn)運siRNA的一種或多種HK載體，包括例如具有6-10個末端分支的聚合物。根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明的轉(zhuǎn)運聚合物包括8個末端分支和一個組氨酸富集的結(jié)構(gòu)域。根據(jù)某些實施方案，所述轉(zhuǎn)運聚合物包含具有序列-HHHKHHHKHHHKHHHKHHH-或其亞片段的末端分支。根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)運聚合物的非限制性例子包括選自H3K8b和結(jié)構(gòu)類似物的一種或多種聚合物，如H3K8b(+RGD)、包括一種或多種其他配基的H3K8b、(-HHHK)H3K8b、(-HHHK)H3K8b(+RGD)等。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)運聚合物可以任選地包括一種或多種穩(wěn)定劑。參考本公開內(nèi)容，適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定劑的非限制性例子包括聚乙二醇(PEG)或羥丙基甲基丙烯酰亞胺(HPMA)。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)運聚合物可以任選地包括一種或多種靶向配基。參考本公開內(nèi)容，適當(dāng)?shù)陌邢蚺浠鶎τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。
可能有效用于siRNA轉(zhuǎn)運的HK聚合物的許多模式被分離、開發(fā)和考慮。在帶有4個分支的聚合物中，末端分支上的HHHK重復(fù)模式(如H3K4b)比HH(如H2K4b)或HK(如HK4b)重復(fù)模式似乎更有效增加siRNA的攝取(見圖1和2，其描述了此類聚合物的結(jié)構(gòu)及其效力)。結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人在構(gòu)建高分支H3K8b和H3K8b(+RGD)中采用了類似的模式并發(fā)現(xiàn)其可高效用于制備siRNA載體。
H3K8b具有8個末端分支并具有高比例的組氨酸和低比例的賴氨酸。與HHK相比，HHHK模式因較高比例的組氨酸而具有提高的緩沖能力并因較低比例的賴氨酸而具有降低的結(jié)合。緩沖酸性內(nèi)涵體腔的末端分支中組氨酸數(shù)目的增加將允許內(nèi)涵體裂解和DNA從內(nèi)涵體脫離。類似地，H3K8b中的組氨酸富集的結(jié)構(gòu)域?qū)⒂型ㄟ^提高聚合物的緩沖能力而增加細(xì)胞溶質(zhì)的遞送。然而，用甘氨酸或截短的組氨酸富集的結(jié)構(gòu)域(-HHKHH)取代組氨酸富集的結(jié)構(gòu)域生成了HK聚合物，其是無效的siRNA載體。具有截短的組氨酸富集的結(jié)構(gòu)域的HK聚合物不比具有甘氨酸的聚合物更有效，這表明組氨酸富集的結(jié)構(gòu)域的緩沖能力可能不是該結(jié)構(gòu)域的顯性機(jī)制。另外，這些結(jié)果表明高分支HK肽的所有結(jié)構(gòu)域(末端分支和組氨酸富集的結(jié)構(gòu)域)對于有效的siRNA載體的發(fā)展都是重要的。
盡管HHK重復(fù)模式存在于H3K4b和H3K8b(+RGD)中，但N末端賴氨酸在高分支聚合物H3K8b中被去除。H3K8b的末端分支中的賴氨酸數(shù)目的減少可以導(dǎo)致siRNA結(jié)合減少并增加siRNA在細(xì)胞質(zhì)中相對于其在細(xì)胞核中的量。通過向H3K8b的各末端分支加入單個賴氨酸(每個聚合物共8個賴氨酸)，新聚合物((+K)H3K8b(+RGD))在減少靶mRNA中的效率與H3K8b(+RGD)的效率相比顯著受損。完成siRNA轉(zhuǎn)運的較小的聚合物序列(即，那些不具有添加至各末端分支的賴氨酸的聚合物序列)有利于更容易合成聚合物。結(jié)合調(diào)節(jié)siRNA釋放的觀點符合以下發(fā)現(xiàn)具有對siRNA結(jié)合的增加的載體肽作為siRNA載體是較不有效的(Simeoni F，Morris MC，Heitz F，Divita G.Insight into the mechanism of the peptide-based genedelivery system MPGimplications for delivery of siRNA into mammaliancells.Nucleic Acids Res 2003，312717-2724.)。然而，具有不同結(jié)合核酸能力的大量HK載體是無效的siRNA載體。
H3K8b(-RGD)與siRNA的復(fù)合物只是在尺寸上小于H2K4b/siRNA復(fù)合物。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，盡管變化H3K8b(RGD)/siRNA的比例使ζ電勢(顆粒表面電荷的量度)從正電荷改變至負(fù)電荷，但轉(zhuǎn)染活性受到最低限度的影響。相比之下，復(fù)合物的攝取與聚合物復(fù)合物(polyplexe)的轉(zhuǎn)染水平更密切相關(guān)。H2K4b比H3K8b(或H3K8b(+RGD))更顯著增進(jìn)了質(zhì)粒攝取和來自轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的蛋白質(zhì)表達(dá)。相比之下，H3K8b比其他HK聚合物或受試的非病毒載體更有效增加了siRNA攝取(見圖6)。盡管通過HK載體的核酸攝取在多數(shù)情況下與核酸的預(yù)期作用有關(guān)，但攝取與核酸作用之間的差異可能在基于質(zhì)粒的系統(tǒng)中比在siRNA遞送系統(tǒng)中更常存在。
根據(jù)本發(fā)明的HK聚合物的非限制性例子包括但不限于選自H3K8b、H3K8b(+RGD)、(-HHHK)H3K8b和(-HHHK)H3K8b(+RGD)的一種或多種聚合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明范圍內(nèi)做出其他改變。例如，不同于RGD的配基，如靶向其他受體的配基，可以被加入本發(fā)明范圍內(nèi)的聚合物。另外，大小介于其間并包括16mer H3K8b聚合物和12mer(-HHHK)H3K8b聚合物的聚合物在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。進(jìn)一步地，第5或第6氨基酸可以從H3K8去除并依然在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
下面是本發(fā)明范圍內(nèi)的某些化合物的命名的例子。該命名是基于國際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)關(guān)于有機(jī)化合物的命名法。
H3K8bK[(HHHKHHHKHHHKHHH)2(KHHHHNHHHHH)]-K[(HHHKHHHKHHHKHHH)2(KHHHHNHHHHH)]-K[(HHHKHHHKHHHKHHH)2(KHHHHNHHHHH)]H3K8b(+RGD)K[(HHHKHHHKHHHKHHH)2(KHHHHNHHHHH)]-K[(HHHKHHHKHHHKHHH)2(KHHHHNHHHHH)]-K[(HHHKHHHKHHHKHHH)2(KHHHHNHHHHH)](RGD)(-HHHK)H3K8b[(HHHKHHHKHHH)2(KHHHHNHHHHH)]-K[(HHHKHHHKHHH)2(KHHHHNHHHHH)]-K[(HHHKHHHKHHH)2(KHHHHNHHHHH)]
H3K8b和H3K8b(+RGD)的末端分支包括以下序列(HHHKHHHKHHHKHHH)。(-HHHK)H3K8b的末端分支包括以下序列(HHHKHHHKHHH)。穩(wěn)定劑(如聚乙烯二醇(PEG)或羥丙基甲基丙烯酰亞胺(HPMA))和/或靶向配基可以任選地被加入至高分支聚合物的末端分支和/或其核心。
本發(fā)明的多肽能夠被化學(xué)合成并通過現(xiàn)有技術(shù)中公知的技術(shù)純化。例如，分支多肽可以通過任何現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法制備，所述方法用于將任何天然存在或合成的氨基酸共價連接至多肽鏈中任何天然存在或合成的氨基酸，所述多肽鏈具有能夠與所述氨基酸上的氨基或羧基基團(tuán)反應(yīng)以與所述多肽鏈成為共價連接的側(cè)鏈基團(tuán)。特別地，具有游離氨基側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸(例如但不限于二氨基丁酸、賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、二氨基丙酸和瓜氨酸)能夠被摻入多肽以便氨基酸能夠隨其形成分支，例如通過形成從所述殘基至所述游離氨基側(cè)基的多肽鍵?；蛘撸哂杏坞x羧基側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸(例如但不限于谷氨酸、門冬氨酸和高瓜氨酸)能夠被摻入多肽以便氨基酸能夠隨其形成分支，例如通過形成從所述殘基至所述游離羧基側(cè)基的多肽鍵。形成側(cè)鏈的氨基酸能夠通過任何類型的共價鍵被連接至多肽鏈中氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)，所述共價鍵包括但不限于多肽鍵、酯鍵和二硫鍵。
例如但非限制性，分支多肽能夠如下制備(1)從主多肽鏈分支的氨基酸能夠被制備為N-α-叔-丁氧羰基(N-α-tert-butyloxycarbo-nyl)(Boc)保護(hù)的氨基酸五氟苯基(Opfp)酯，此分支氨基酸所連接的主鏈內(nèi)殘基可以是N-Fmoc-α-γ-二氨基丁酸(N-Fmoc-α-γ-diaminobutyric acid)；(2)Boc保護(hù)的氨基酸與二氨基丁酸的偶聯(lián)的實現(xiàn)可以通過向含有150ml DMF和2.25ml吡啶和50mg二甲基氨基吡啶的燒瓶中加入5克各前體并使溶液混合24小時；(3)然后可以從150ml偶聯(lián)反應(yīng)液中提取多肽，方法是通過在1升分液漏斗將反應(yīng)液與400ml二氯甲烷(DCM)和200ml 0.12N的鹽酸混合，并使各相分開，保留底部水層并使用200ml 0.12N鹽酸再次提取上層兩次；(4)含有多肽的溶液的脫水可以通過加入2-5克硫酸鎂，濾出硫酸鎂，并蒸發(fā)剩余溶液至體積約2-5ml；(5)然后二多肽(dipolypeptide)可以通過加入乙酸乙酯和隨后2體積己烷而被沉淀，然后過濾收集沉淀并使用冷己烷洗滌兩次；和(6)得到的濾液可以被冷凍干燥以獲得光粉末(light powder)形式的想要的二多肽。通過該方法制備的分支多肽在分支的氨基酸位置上具有二氨基丁酸的取代。使用N-Fmoc偶聯(lián)形式的氨基酸或氨基酸類似物，可以類似于上述過程制備含有不同于二氨基丁酸的氨基酸或氨基酸類似物取代物的分支多肽。
轉(zhuǎn)運聚合物的多肽也可以由病毒DNA編碼并被表達(dá)在病毒表面?；蛘?，組氨酸能夠使用水溶性二碳酰亞胺通過酰胺鍵共價連接于蛋白質(zhì)。
HK轉(zhuǎn)運聚合物還可以包括多肽—“合成單體”共聚物。在這些實施方案中，轉(zhuǎn)運聚合物骨架可以包括共價連接的多肽片段和合成單體或合成聚合物的片段。合成單體或聚合物可以是生物相容的和/或生物可降解的。合成單體的例子包括含有至少一個用于結(jié)合多肽的反應(yīng)位點的乙烯化(ethylenically)或乙炔化(Acetylenically)不飽和單體。適當(dāng)?shù)膯误w以及用于制備多肽—“合成單體”共聚物的方法在Nowinski等人的題為″Polymerizable compounds and methods for preparing synthetic polymers thatintegrally contain polypeptides″的美國專利第4,511,478號中有所描述，其在這里通過引用并入本文。當(dāng)轉(zhuǎn)運共聚物包含分支聚合物時，合成單體或聚合物可以被摻入骨架和/或分支。此外，骨架或分支可以包括合成單體或聚合物。最后，在該實施方案中，分支單體可以是分支氨基酸或分支合成單體。分支合成單體可以包括例如含有至少一個取代反應(yīng)性側(cè)基的乙烯化或乙炔化不飽和單體。
根據(jù)本發(fā)明的siRNA的非限制性例子是靶向Raf-1序列5’-AAUGUCCACAUGGUCAGCACC-3’(SEQ ID 1)的siRNA。本發(fā)明還包括其他形式的siRNA。
本發(fā)明的體外遞送方法可以包括例如(i)從受治療者中取出細(xì)胞；(ii)通過將所述細(xì)胞與含有siRNA和HK聚合物的遞送組合物(轉(zhuǎn)染復(fù)合物或含有這種轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組合物)接觸而將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞；和(iii)將所述細(xì)胞再導(dǎo)入所述受治療者。
對于基于局部注射(例如瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜腔內(nèi)、心內(nèi)和霧化的治療)的體內(nèi)治療，組氨酸和非組氨酸氨基酸的整體含量可以使分支的轉(zhuǎn)運聚合物整體上可溶于水。當(dāng)分支的轉(zhuǎn)運聚合物由氨基酸組成時，分支的轉(zhuǎn)運聚合物可以被設(shè)計使得組氨酸和非組氨酸親水氨基酸(即，具有帶電荷或不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸)的含量使分支的轉(zhuǎn)運聚合物可溶于水。在這些實施方案中，組氨酸和非組氨酸親水性氨基酸可以占分支的轉(zhuǎn)運聚合物中氨基酸的至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％?；蛘?，可以通過將親水性基團(tuán)(即，可溶性配基、可溶性藥劑，等)共價連接于轉(zhuǎn)運聚合物而使不溶于水的分支轉(zhuǎn)運聚合物可溶于水。當(dāng)藥劑是核酸(一般負(fù)電荷)并希望與轉(zhuǎn)運聚合物非共價連接時，非組氨酸氨基酸可以選自具有中性親水性側(cè)鏈的氨基酸(例如，絲氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)和具有在生理pH下帶正電荷的側(cè)基的氨基酸(例如，賴氨酸、鳥氨酸和精氨酸)，且可以是賴氨酸。當(dāng)考慮到水溶性分支轉(zhuǎn)運聚合物和水溶性藥劑(例如DNA)的非共價連接時，HK轉(zhuǎn)運聚合物和siRNA在注射之前不需要被連接。雖然藥物遞送復(fù)合物在注射前形成是優(yōu)選的，但轉(zhuǎn)運聚合物和siRNA可以被順序(以任一順序)或同時注入(通過局部注射)以在注射位置形成藥物遞送組合物。
本發(fā)明還涉及形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物的方法，例如通過將siRNA與HK轉(zhuǎn)運聚合物混合。在轉(zhuǎn)染復(fù)合物中，轉(zhuǎn)運聚合物與siRNA的比例可以是約0.5∶1(wt/wt)至約24∶1(wt/wt)，或約0.5∶1(wt/wt)至約24∶1(wt/wt)，或約0.5∶1(wt/wt)至約6∶1(wt/wt)，或約3∶1(wt/wt)至約6∶1(wt/wt)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及轉(zhuǎn)染復(fù)合物，其包括siRNA和HK轉(zhuǎn)運聚合物。根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)運復(fù)合物可以包括本發(fā)明的任何HK聚合物。根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)染復(fù)合物的非限制性例子包括選自H3K8b、H3K8b(+RGD)、(-HHHK)H3K8b和(-HHHK)H3K8b(+RGD)的一種或多種聚合物。
根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)運HK聚合物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法合成。作為非限制性的例子，這里討論的某些HK聚合物可以被如下合成。在馬里蘭大學(xué)的Biopolymer Core Facility可以被用來在Ranin Voyager固相合成器(PTI，Tucson，AZ，USA)上合成例如下述HK聚合物(1)H2K4b(83mer；分子量11137Da)；(2)H3K4b(71mer；分子量9596Da)；(3)HK4b(79mer；分子量10896Da)；4)H3K8b(163mer；分子量23218Da)；(5)H3K8b(+RGD)(166mer；分子量23564Da)；(6)(-HHHK)H3K8b(131mer；分子量18901Da)；(7)(-HHHK)H3K8b(+RGD)(134mer；分子量19243Da)；(8)((K+)H3K8b(+RGD)(174mer；分子量24594Da)。某些分支聚合物的結(jié)構(gòu)在圖1和9中顯示。具有4個分支的聚合物(例如H3K4b、HK4b)可以通過現(xiàn)有技術(shù)已知的方法合成。對于具有8個末端分支的高分支聚合物的合成的序列可以是如下(1)RGD或其他配基(如果存在)；(2)3-賴氨酸核心；(3)組氨酸富集的結(jié)構(gòu)域；(4)賴氨酸的添加；和(5)末端分支。RGD序列可以首先通過儀器隨后通過與(fmoc)-賴氨酸-(Dde)(賴氨酸核心)的三次人工偶聯(lián)而被合成。(Dde)保護(hù)基團(tuán)可以在自動脫保護(hù)循環(huán)過程中被去除。然后可以通過儀器將包含組氨酸富集結(jié)構(gòu)域的活化的氨基酸連續(xù)加至賴氨酸核心。(fmoc)-賴氨酸-(fmoc)氨基酸被加至組氨酸富集的結(jié)構(gòu)域并然后去除fmoc保護(hù)基團(tuán)。然后可以將末端分支的活化的氨基酸加至該賴氨酸的α和ε氨基。通過現(xiàn)有技術(shù)已知的方法將肽從樹脂裂解并沉淀。
作為非限制性的例子，本發(fā)明的聚合物可以進(jìn)行如下分析。聚合物可以首先通過高效液相色譜(HPLC；Beckman，F(xiàn)ullerton，CA，USA)并且如果HPLC揭示聚合物的純度為95％或更高則可以不被進(jìn)一步純化。聚合物可以例如使用System Gold操作軟件，使用具有二元溶劑系統(tǒng)的Dynamax21-4×250mm C-18反相制備柱在HPLC柱上進(jìn)行純化。檢測可以在214nm下進(jìn)行。聚合物的進(jìn)一步分析可以例如使用Voyager基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時間(MALDI-TOF)質(zhì)譜儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)和氨基酸分析(AAA Laboratory Service，Boring，OR，USA)來進(jìn)行。轉(zhuǎn)染試劑如SuperFect(Qiagen，Valencia，CA)、Oligofectamine(Invitrogen，Carlsbad，CA)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)和Lipofectamine(Invitrogen)可以根據(jù)生產(chǎn)商的說明書來使用。DOTAP脂質(zhì)體可以通過現(xiàn)有技術(shù)已知的方法來制備。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括本發(fā)明的轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組合物。這種組合物可以包括例如一種或多種與HK聚合物和/或siRNA連接的細(xì)胞內(nèi)遞送組分。所述細(xì)胞內(nèi)遞送組分可以包括例如脂類(如陽離子脂類)、過渡金屬或?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的其他組分。
在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物包括適當(dāng)?shù)妮d體，如藥學(xué)上可接受的載體。在這些實施方案中，這些載體可以是或不是病毒或脂質(zhì)體組分。在這些實施方案中，由轉(zhuǎn)運聚合物和siRNA形成的復(fù)合物可以在pH約5.0和7.4之間是穩(wěn)定的。
在某些實施方案中，轉(zhuǎn)染復(fù)合物組合物包括轉(zhuǎn)運聚合物(其可以作為細(xì)胞內(nèi)遞送組分)和siRNA。在這些實施方案中，轉(zhuǎn)運聚合物可以作為細(xì)胞內(nèi)遞送組分而不需要其他遞送組分，或者可以與其他遞送組分結(jié)合起作用。
在其他實施方案中，轉(zhuǎn)染復(fù)合物組合物可以包括(i)轉(zhuǎn)運聚合物，(ii)至少一種與所述轉(zhuǎn)運聚合物連接的細(xì)胞內(nèi)遞送組分，和(iii)與細(xì)胞內(nèi)遞送組分和/或轉(zhuǎn)運聚合物連接的siRNA。制備這些組合物的方法可以包括將(i)和(ii)組合至足以使轉(zhuǎn)運聚合物與siRNA連接成穩(wěn)定復(fù)合物的時間。組分(i)、(ii)和(iii)可以適當(dāng)載體提供，如藥學(xué)上可接受的載體。在包括不同于轉(zhuǎn)運聚合物的細(xì)胞內(nèi)遞送組分的實施方案中，轉(zhuǎn)運聚合物可以通過非共價或共價相互作用與細(xì)胞內(nèi)遞送組分(如脂質(zhì)體)相互作用。
轉(zhuǎn)運聚合物可以通過非共價或共價相互作用與siRNA相互作用。或者，在整個復(fù)合物環(huán)境中，轉(zhuǎn)運聚合物不需要與siRNA直接相互作用，而轉(zhuǎn)運聚合物可以與細(xì)胞內(nèi)遞送組分相互作用，所述細(xì)胞內(nèi)遞送組分又與siRNA相互作用。
本發(fā)明的細(xì)胞內(nèi)遞送組分可以是轉(zhuǎn)運聚合物本身。當(dāng)不同于轉(zhuǎn)運聚合物的細(xì)胞內(nèi)遞送組分被使用時，這種遞送組分可以是病毒或非病毒組分。適當(dāng)?shù)牟《拘约?xì)胞內(nèi)遞送組分包括但不限于反轉(zhuǎn)錄病毒(如鼠白血病病毒、禽類慢病毒屬)、腺病毒和腺伴隨病毒、單純性皰疹病毒、鼻病毒、仙臺病毒和痘病毒類。適當(dāng)?shù)姆遣《拘约?xì)胞內(nèi)遞送組分包括但不限于脂類和各種基于脂類的物質(zhì)，如脂質(zhì)體和微膠粒，以及各種現(xiàn)有技術(shù)已知的聚合物。
適當(dāng)?shù)闹惏ǖ幌抻诹姿岣视王?、神?jīng)鞘磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、溶血磷脂膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰卵磷脂、雙亞油酰磷脂膽堿、鞘糖脂、兼性脂類。脂類可以是單層或多層脂質(zhì)體形式。
細(xì)胞內(nèi)遞送組分可以包括但不限于陽離子脂類。許多這樣的陽離子脂類是現(xiàn)有技術(shù)已知的。已經(jīng)制備了多種陽離子脂類，其中二?；视突蚰懝檀际杷鶊F(tuán)通過代謝可降解的酯鍵與陽離子首基相連，例如1，2-二(油酰氧基)-3-(4-′-三甲基銨)丙烷(DOTAP)、1，2-二油?；?3-(4′-三甲基銨)丁酰-sn-甘油(DOTB)、1，2-二油?；?sn-丁二酰-sn-甘油膽堿酯(DOSC)和膽固醇基(4′-三甲基銨)丁酸酯(ChoTB)。其他適當(dāng)?shù)闹惏ǖ幌抻陉栯x子非pH敏感脂類，如1，2-二油酰-3-二甲基-羥基乙基溴化銨(DORI)、1，2-二油酰氧丙基-3-二甲基-羥乙基溴化銨(DORIE)和1，2-二肉豆蔻氧丙基-3-二甲基-羥乙基溴化銨(DMRIE)。其他非pH敏感陽離子脂類包括但不限于O，O′-二月桂基-N-[p-(2-三甲基銨乙基氧)苯甲酰]-N，N，N-三甲基氯化銨、Lipospermine、DC-膽固醇(3β[N-(N′N″-二甲基氨基乙烷)羰基]膽固醇)、脂多(L-賴氨酸)、含有N-(α-三甲基銨乙酰基-二月桂基-D-谷氨酸氯化物的陽離子多層脂質(zhì)體(TMAG)、TransfectACE TM(DDAB(雙十八烷基二甲基溴化銨)和DOPE的比例為1∶2.5(w∶w))(Invitrogen)和lipofectAMINETM(DOSPA(2，3-油酰氧-N-[20([2，5-二[(3-氨基-丙基)氨基]-1-氧戊]氨基)乙基]-N，N-二甲基-2，3-二(9-十八碳烯基氧基)-1-丙基三氟乙酸銨)與DOPE的比例為3∶1(w∶w))(Invitrogen)。其他適當(dāng)?shù)闹愒赪olff等人題為″Amphipathic PH sensitive compounds and delivery systems for deliveringbiologically active compounds″的美國專利第5,965,434號中有所描述。
可以根據(jù)本發(fā)明使用的陽離子脂類包括但不限于那些在生理學(xué)上可相容的環(huán)境中形成脂質(zhì)體的脂類。適當(dāng)?shù)年栯x子脂類包括但不限于選自下述的的陽離子脂類1，2-二油?；醣?3-三甲基溴化銨；1，2-二肉豆蔻氧丙基-3-二甲基-羥乙基溴化銨；二甲基二十八烷基溴化銨；1，2-二油?；?3-(三甲基銨)丙烷(DOTAP)；3βN-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨甲酰]膽固醇(DC-膽固醇)；1，2二油?；?sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿；1，2-二肉豆蔻-sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿；[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基-氯化銨(DOTMA)；1，3-二油酰氧基-2-(6羧精基)丙酰胺(DOSPER)；2，3-二油酰氧基-N-[2(精胺-羧基酰胺)乙基]-N，N，二甲基-1-丙基三氟乙酸銨(DOSPA)；和1，2-二肉豆蔻氧丙基-3-二甲基-羥乙基溴化銨(DMRIE)。
陽離子脂類可以與一種或多種輔助脂類(如二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE))一起使用以增強(qiáng)轉(zhuǎn)染。這些輔助脂類在陽離子脂質(zhì)體中的摩爾百分比為約5-50％。另外，能夠延長陽離子脂質(zhì)體體內(nèi)半衰期的PEG化脂類可以約0.05-0.5％的摩爾百分比存在。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以可選地包括一種或多種組分以提高轉(zhuǎn)染、保護(hù)試劑或提高遞送復(fù)合物的穩(wěn)定性。例如，穩(wěn)定化合物如聚乙二醇可以與脂類或轉(zhuǎn)運聚合物共價連接。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包括pH在約4和7.7之間的適當(dāng)?shù)木彌_溶液。優(yōu)選地在中和酸性溶液至pH在約5.0和7.4之間的兩個小時內(nèi)，施用所述組合物。所述組合物的各種組分可以冷凍干燥并使用pH為約5.0和7.4之間的緩沖液重新溶解成原來的濃度。聚合物的穩(wěn)定性和溶解性可以在弱酸性溶液中保持，特別是在與大的荷負(fù)電的大分子(如DNA)復(fù)合時。
本發(fā)明的組合物可以包括樹狀聚合物(dendrimer)。細(xì)胞內(nèi)遞送組分和siRNA可以一起包括在樹狀聚合物-siRNA復(fù)合物中。
本發(fā)明的組合物還可以適當(dāng)?shù)匕ǜ鞣N現(xiàn)有技術(shù)中已知的增強(qiáng)遞送的組分。例如，所述組合物可以包括一種或多種已知的使細(xì)胞核或配基經(jīng)受受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用等的化合物。例如，所述配基可以包括分裂內(nèi)涵體的融合病毒肽，使核酸避免溶酶體降解。增強(qiáng)遞送的組分的其他例子包括但不限于以維持表達(dá)的核蛋白、腺病毒顆粒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表面活性劑B、抗血栓調(diào)節(jié)蛋白、插入試劑、血球凝集素、去唾液糖蛋白(asialglycoprotein)、氯喹、秋水仙堿、整合素配基、LDL受體配基和病毒性蛋白(例如整合酶、LTR元件、rep蛋白、oriP和EBNA-I蛋白)或與細(xì)胞表面蛋白相互作用的病毒組分(例如ICAM、HA-I、MLV的gp70-磷酸鹽運載體和HIV的gpl20-CD4)。增強(qiáng)遞送的組分可以與轉(zhuǎn)運聚合物、細(xì)胞內(nèi)遞送組分或藥劑共價或非共價連接。例如，可以通過共價連接-RGD-或-NGR-基序來靶向至腫瘤脈管系統(tǒng)的遞送。這可以使用肽合成器或通過用水溶性二碳二亞胺(例如，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)與轉(zhuǎn)運聚合物上的氨基或羧基偶聯(lián)來實現(xiàn)。這兩種方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
本發(fā)明的組合物可以適當(dāng)?shù)匕ㄟ^渡金屬離子，如鋅離子。本發(fā)明的復(fù)合物中過渡金屬的存在可以提高轉(zhuǎn)染率。
本發(fā)明進(jìn)一步包括用于檢測用于轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中的有效的siRNA載體的測定法。這些測定法包括將siRNA與轉(zhuǎn)運聚合物混合以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；將所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物與一種或多種細(xì)胞接觸；和檢測細(xì)胞內(nèi)siRNA活性的存在或不存在。在某些實施方案中，使siRNA針對β-半乳糖苷酶。
本發(fā)明還提供了包括使用本發(fā)明的復(fù)合物或組合物治療疾病的方法。特別地，提供了通過給患者施用治療有效量的本發(fā)明的復(fù)合物或組合物來治療患病患者的方法。還包括通過給患者施用由這里公開的方法所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來治療患病患者的方法。可使用所述復(fù)合物、組合物和方法治療的遺傳和/或非腫瘤性疾病的例子包括但不限于以下腺苷脫胺酶缺乏癥、嘌呤核苷磷酸化酶缺乏癥、有p47phox缺陷的慢性肉芽腫性疾病、具HbS的鐮狀細(xì)胞、β-珠蛋白生成障礙性貧血、范康尼氏貧血、家族性高膽固醇血癥、苯丙酮尿癥、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶缺乏癥、載脂蛋白E缺乏、血友病A和B、肌肉萎縮癥、纖維囊泡癥、帕金森癥、色素性視網(wǎng)膜炎、溶酶體貯存病(例如粘多糖1型、Hunter、Hurler和Gaucher)、糖尿病性視網(wǎng)膜病、人免疫缺陷病毒病病毒性感染、獲得性貧血、心臟及外周血管疾病和關(guān)節(jié)炎的疾病。在一些上述疾病例子中，治療基因可以編碼遺傳或獲得性疾病的替代酶或蛋白質(zhì)、反義或核酶分子、誘餌分子或自殺基因產(chǎn)物。
使用siRNA的體外和體內(nèi)基因治療還可用于癌癥。這些針對癌癥的siRNA應(yīng)用包括但不限于1)減少生長因子的表達(dá)，減少增進(jìn)細(xì)胞循環(huán)的蛋白質(zhì)(如Raf-1、PI-3激酶)，生長因子受體(例如EGFR、Her-2)，或?qū)δ[瘤的支持細(xì)胞關(guān)鍵的蛋白質(zhì)(例如，用于腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF、VEGFR1-2)；2)靶向或減少抗細(xì)胞凋亡的因子(例如，BCL-2)的表達(dá)；和3)靶向那些減少針對腫瘤的免疫活性的蛋白質(zhì)或酶。
本發(fā)明還提供了體外基因治療的方法，其包括(i)從所述患者取出細(xì)胞；(ii)通過將所述細(xì)胞與轉(zhuǎn)染復(fù)合物或含有本發(fā)明的這種轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組合物接觸而將核酸(如siRNA)遞送至所述細(xì)胞內(nèi)部；和(iii)給所述患者施用包含所述核酸(如siRNA)的所述細(xì)胞。
重組細(xì)胞可以使用本發(fā)明的復(fù)合物來生成。生成的重組細(xì)胞可以通過現(xiàn)有技術(shù)已知的各種方法被遞送至受治療者。在某些實施方案中，注射重組細(xì)胞，例如皮下注射。在其他實施方案中，重組皮膚細(xì)胞可以作為皮膚移植物被應(yīng)用到患者。重組血液細(xì)胞(例如，造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞)優(yōu)選地由靜脈注射。所述細(xì)胞還可以被包入適當(dāng)?shù)妮d體中，然后植入受治療者(見，例如，Dionne等人的PCT公開WO92/19195，日期為1992年11月12日)。施用細(xì)胞的量取決于現(xiàn)有技術(shù)中已知的多種因素，例如預(yù)期效果、受治療者狀態(tài)、嵌合多肽的表達(dá)率等，并且容易由本領(lǐng)域技術(shù)人員測定。
下述實施例描述了本發(fā)明的特定實施方案。這里列出的實施例意于說明性并不應(yīng)該以任何方式用來限制所要求的發(fā)明的范圍。正如對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，各種變化和修改是可能的并被認(rèn)為在所描述的發(fā)明的范圍之內(nèi)，并且可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員所實施而不背離本發(fā)明精神。
實施例實施例1方法通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法在Ranin Voyager合成器(PTI，Tucson，AZ)上合成幾種分支聚合物。然后根據(jù)它們遞送siRNA進(jìn)入SVR-bag4細(xì)胞、MDA-MB-435細(xì)胞和C6細(xì)胞的能力來篩選這些聚合物。在確定一個聚合物H3K8b為有效的siRNA載體并使用流式細(xì)胞儀考察其毒性后，合成其他的聚合物來測定對siRNA轉(zhuǎn)運重要的結(jié)構(gòu)域。然后分別使用N4亞微米顆粒尺寸分析儀(Submicron Particle Size Analyzer)和Delsa 440 SXζ電勢分析儀(Zeta Potential Analyzer)來計算HK∶siRNA復(fù)合物的尺寸/ζ電勢。
細(xì)胞系MDA-MB-435(一種惡性乳腺癌細(xì)胞系)、C6(大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系)、C6/lacZ(表達(dá)β-半乳糖苷酶的C6系)和SVR-bag4(小鼠內(nèi)皮細(xì)胞系，被SV病毒轉(zhuǎn)化，其表達(dá)β-半乳糖苷酶)保存在含有約10％胎牛血清和約20mM谷胺酰胺的杜爾貝科氏最低必需培養(yǎng)基(DMEM)中。
轉(zhuǎn)染劑HK聚合物和其他載體馬里蘭大學(xué)的生物聚合物核心實驗室在Ranin Voyager合成器(PTI，Tucson，AZ)上合成了HK聚合物。所述分支的聚合物的結(jié)構(gòu)在圖1和9中所示。然后使用HPLC純化聚合物。轉(zhuǎn)染劑SuperFect(Qiagen)、Oligofectamine(Invitrogen)和Lipofectamine(Invitrogen)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書來使用。如這里所述制備DOTAP。
siRNAsiRNA復(fù)合體以及它們的靶如下1)熒光素酶siRNA，有意義鏈為5′-CUU ACG CUG AGU ACU UCG A dTdT-3′(SEQ ID 2)，反義鏈為5′-U CGA AGU ACU CAG CCU AAG dTdT-3′(SEQ ID 3)(靶5′-CTT ACGCTG AGT ACT TCG-3′(SEQ ID 4))；和2)β-半乳糖苷酶(β-gal)siRNA，有意義鏈為5′-CAG UUG CGC AGC CUG AAU G dTdT-3′(SEQ ID 5)，反義鏈為5′-CAG UUG CGC AGC CUG AAT G dTdT-3′(SEQ ID 6)(靶5′-AAC AGUUGC GCA GCC UGA AUG-3′(SEQ ID 7))。關(guān)于siRNA輸入研究，Cy3-標(biāo)記的siRNA(有意義鏈為5′-CGU ACG CGG AAU ACU UCG A-dTdT-3′(SEQID 8)，反義鏈為5′-T CGA AGU AUU CCG CGU ACG-dTdT-3′(SEQ ID 9))購自Darmacon。
siRNA轉(zhuǎn)染開始，將3×104SVR-bag4細(xì)胞鋪板入每孔含有約500μl添加10％血清的DMEM的24孔板中。約24小時后，當(dāng)細(xì)胞約有40％融合時，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入培養(yǎng)基。制備載體與siRNA(除非另有說明，比例4∶1)的復(fù)合物，siRNA(2μg)于OptiMEM中與載體(約8μg)快速混合好并在室溫下靜置約30分鐘。OptiMEM中聚合物/DNA復(fù)合物的總體積為約50μl，并將該復(fù)合物滴加至在約0.5ml DMEM/10％血清中的細(xì)胞。
對于Lipofectamine 2000，轉(zhuǎn)染方法類似，除了載體∶siRNA比例是2∶1；另外，Oligofectamine∶siRNA比例是2∶1并且在培養(yǎng)基換為DMEM/10％FCS之前將復(fù)合物加入0.5ml DMEM中的細(xì)胞維持4小時。
β-半乳糖苷酶染色和活性檢測。在β-半乳糖苷酶siRNA轉(zhuǎn)染SVR-bag4細(xì)胞后約48小時，通過使用β-半乳糖苷酶染色和檢測試劑盒(Invitrogen)如生產(chǎn)商的說明來測定β-半乳糖苷酶的細(xì)胞內(nèi)水平。從被轉(zhuǎn)染細(xì)胞去除生長培養(yǎng)基，然后用PBS洗滌。對于染色，細(xì)胞在室溫下固定約10分鐘并用PBS洗滌2次；將X-gal染色溶液加至細(xì)胞并在約37℃下培育約6小時。為測定β-半乳糖苷酶活性，將裂解緩沖液(約50ml)加至各細(xì)胞，然后將所述細(xì)胞凍融3個循環(huán)。然后將β-半乳糖苷酶的底物ONPG與細(xì)胞一起在37℃下培育30分鐘。使用1M碳酸鈉溶液終止反應(yīng)并在420nm下測定吸光度，將β-半乳糖苷酶特異活性記錄為水解的ONPG的納摩爾數(shù)/min/mg蛋白裂解物。
使用熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒和靶向熒光素酶的siRNA共轉(zhuǎn)染。將約1×105MDA-MB-435細(xì)胞鋪板入24孔板后約24小時以達(dá)到約70％的融合，使用質(zhì)粒和siRNA共轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。同時分別制備熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒(Promega，Madison，Wi)與SuperFect的復(fù)合物(2∶1)，和siRNA(靶向熒光素酶的mRNA)與幾種載體中的一種的復(fù)合物。然后將這兩種復(fù)合物一起加入至細(xì)胞；約24小時后，細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌并隨后用約100μl的1×被動裂解緩沖液(Promega Corp)裂解。使用BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒(Pierce)檢測蛋白質(zhì)濃度。使用直流電Turner 20/20光度計(Turner Design，Sunnyvale，CA)測定熒光素酶活性。使用重組熒光素酶(Promega，Madison，WI)作為標(biāo)準(zhǔn)將相對光單位轉(zhuǎn)換為熒光素酶的皮克(pg)數(shù)。每個濃度檢測雙份并進(jìn)行三次獨立實驗。
結(jié)果在穩(wěn)定表達(dá)了β-半乳糖苷酶的內(nèi)皮細(xì)胞系(SVR-bag4)中，siRNA與H3K8b聚合物的復(fù)合物抑制了β-半乳糖苷酶表達(dá)超過80％。相似地，H3K8b與靶向熒光素酶的siRNA的復(fù)合物抑制了MDA-MB-435細(xì)胞中的熒光素酶表達(dá)。相比之下，作為有效的質(zhì)粒載體的聚合物H2K4b不是有效的siRNA載體。在抑制其靶的最佳濃度下，H3K8b∶siRNA復(fù)合物具有最低的毒性。組氨酸富集的結(jié)構(gòu)域和H3K8b末端臂的長度似乎影響siRNA的遞送。然而，尺寸和表面電荷沒有表現(xiàn)出影響遞送siRNA。
結(jié)論因此，認(rèn)為復(fù)雜程度和序列特異性都是用于開發(fā)siRNA的HK載體的因素。特別地，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)某些具有8個末端分支和組氨酸富集結(jié)構(gòu)域的分支HK聚合物(H3K8b和類似的結(jié)構(gòu)類似物)是有效的siRNA載體。
實施例2攝取實驗如上所述使用載體(DOTAP，Lipofectamine，或H2K4b，或H3K8b)與Cy3-標(biāo)記的siRNA的復(fù)合物來轉(zhuǎn)染細(xì)胞；約4小時后，使用Diaphot-TMD熒光顯微鏡，100×(Nikon，Tokyo，Japan)獲得影像。
流式細(xì)胞儀。按生產(chǎn)商的關(guān)于Vybrant Apoptosis Assay#4(分子探針)的說明，來測定使用H3K8b∶siRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞毒性。在轉(zhuǎn)染之前24小時，將2×105SVR-bag4細(xì)胞鋪板于12孔板的各孔中。使用表達(dá)β-半乳糖苷酶的siRNA(約2μg)與載體(H3K8b，DOTAP，Lipofectamine，8μg；Oligofectamine，Lipofectamine 2000；4μg)的復(fù)合物轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。然后約24小時后收集細(xì)胞，在冷1×PBS中洗滌，并將細(xì)胞懸浮于約1mlPBS中。向該懸浮液中加入約1μl的綠色熒光染料母液(YO-PRO-1)和約1μl的紅色熒光母液(碘化丙啶)。在冰上培育約30分鐘之后，通過FACScan(BectonDickinson，San Jose，Ca)使用488nm激發(fā)光分析那些具有活力的細(xì)胞、壞死的細(xì)胞和/或凋亡的細(xì)胞的數(shù)目。然后在扣除未處理組的無活力的細(xì)胞之后，從不同的載體∶siRNA復(fù)合物計算無活力的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(見圖7和8)。
圖8中描述的數(shù)據(jù)表示三次實驗的平均值和S.D.；**P＜0.001，H3K8b(+RGD)vs.Lipofectamine、Lipofectamine2000或Olifofectamine(使用Bonferroni多重比較檢驗的單因素方差分析(ANOVA))。復(fù)合物中轉(zhuǎn)染載體∶siRNA的比例是4∶1(w/w)，除了使用Lipofectamine2000和Oligofectamine的復(fù)合物中的比例為2∶1。
DNA-HK聚合物復(fù)合物的尺寸和ζ電勢的檢測。與前述轉(zhuǎn)染復(fù)合物類似制備HK聚合物、H3K8b(-RGD)和H2K4b(24或48μg)與質(zhì)粒DNA(約12μg)的復(fù)合物。在聚合物復(fù)合物于Opti-MEM(約300μl)中靜置約30分鐘后，將約950μl Hepes緩沖液(約20mM，pH約7.5)加入至微孔中。通過在N4亞微米顆粒尺寸分析儀(Beckman Coulter，Hialeah，F(xiàn)L)上測量在約90度角的光散射來測定各種復(fù)合物的顆粒尺寸。將顆粒尺寸記錄為從Unimodal分析得到的平均尺寸，所述分析使用儀器生產(chǎn)商提供的軟件進(jìn)行。使用Delsa 440 SX儀器(Coulter)來檢測ζ電勢(顆粒表面電荷的量度)。根據(jù)顆粒在電場中的可動性而測量ζ電勢值。每個數(shù)據(jù)點代表三次測量的平均值±S.D.。
結(jié)果H3K8b是有效的siRNA載體。合成了幾種HK肽并將其作為siRNA進(jìn)入細(xì)胞的載體檢驗。這些作為siRNA載體試驗的HK肽的代表在圖1中顯示。在圖2中，比較了這些HK載體在遞送靶向于SVR-bag4細(xì)胞中表達(dá)的β-半乳糖苷酶(β-gal)的siRNA的效率。具有4個末端分支的載體不是特別有效的siRNA載體，適當(dāng)?shù)爻薍3K4b。值得注意的是，如H2K4b的肽，有效的質(zhì)粒載體，不是成功的siRNA載體。具有8個末端分支的H3K8b聚合物是最有效的siRNA載體，其減少細(xì)胞內(nèi)靶約80％。與其他HK聚合物比較，它是高分支的并具有最高百分比的組氨酸和最低百分比的賴氨酸。H3K8b用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比H2K4b的效率小約5倍。β-半乳糖苷酶染色證實了H3K8b與β-半乳糖苷酶siRNA的復(fù)合物顯著抑制了SVR-bag4細(xì)胞中的β-半乳糖苷酶活性(圖3)。
還測定了用于減少β-半乳糖苷酶表達(dá)的H3K8b∶siRNA的比例。所述比例從約0.5∶1至約6∶1(wt∶wt)或在約3∶1和約6∶1之間變化(圖4)。3∶1 wt∶wt的比例相當(dāng)于約1.7 N(+)∶P(-)的比例。接下來，發(fā)現(xiàn)SVR-bag4細(xì)胞的β-半乳糖苷酶染色被H3K8b(+RGD)與β-半乳糖苷酶siRNA的復(fù)合物顯著抑制(圖3)。另外，在穩(wěn)定表達(dá)β-半乳糖苷酶的C6細(xì)胞系中，H3K8b與β-半乳糖苷酶siRNA的復(fù)合物抑制了約60％的β-半乳糖苷酶的表達(dá)。
實施例3經(jīng)由H3K8b介導(dǎo)的熒光素酶siRNA遞送的熒光素酶活性的顯著抑制。本發(fā)明的發(fā)明人接下來測定了H3K8b(+RGD)在轉(zhuǎn)運靶向惡性細(xì)胞系、MDA-MB 435細(xì)胞中轉(zhuǎn)染的熒光素酶的siRNA中的效率(圖5)。使用熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒與SuperFect的復(fù)合物連同靶向熒光素酶的siRNA與載體H3K8b(+RGD)、H3K4b或DOTAP之一的復(fù)合物共轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。結(jié)果顯示，與H3K8b∶β-半乳糖苷酶siRNA對照相比，H3K8b(+RGD)∶Luc siRNA復(fù)合物是最有效的，抑制了約90％熒光素酶活性。因此，在表達(dá)β-半乳糖苷酶的SVR-bag4細(xì)胞中和在使用MDA-MB-435細(xì)胞的共轉(zhuǎn)染實驗中，H3K8b(+RGD)都是最有效的siRNA載體。
實施例4H3K8b(+RGD)介導(dǎo)的siRNA遞送在幾種細(xì)胞系中是高效的。為測定H3K8b(+RGD)作為有效的siRNA載體的機(jī)制，檢測了H3K4b(+RGD)∶siRNA在三種細(xì)胞系(SVR-bag4、MDA-MB-435和C6細(xì)胞)中的攝取。這些細(xì)胞然后用Cy3標(biāo)記的siRNA與DOTAP(4∶1比例；載體(mg)/siRNA(mg)比例)、Lipofectamine(4∶1)或H3K8b(+RGD)(4∶1)的復(fù)合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。如圖6所示，使用H3K8b(+RGD)載體的siRNA熒光比使用DOTAP和Lipofectamine基團(tuán)要強(qiáng)很多。另外，由H3K8b(+RGD)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的siRNA熒光比包括H2K4b和HK4b在內(nèi)的其他HK載體更強(qiáng)(數(shù)據(jù)未顯示)。在三種細(xì)胞系中，由H3K8b遞送的Cy3標(biāo)記的siRNA顯示了分離的熒光焦點和外周分布。通過HK載體的SiRNA的攝取與預(yù)期效果有關(guān)。
使用H3K8b(+RGD)∶siRNA復(fù)合物觀察到最低的毒性。在使用YO-PRO-I和PI染料對轉(zhuǎn)染的SVR-bag4細(xì)胞群進(jìn)行染色后，凋亡細(xì)胞顯示綠色熒光，死亡細(xì)胞顯示紅色和綠色熒光，活力細(xì)胞顯示很少或沒有熒光。H3K8b(+RGD)與β-半乳糖苷酶siRNA(H3K8b(+RGD)∶siRNA；4∶1wt/wt比例)的復(fù)合物與未處理的細(xì)胞相比顯示了最小的毒性(圖7)，具有最小的細(xì)胞凋亡和/或細(xì)胞死亡。包括Oligofectamine和Lipofectaniine 2000在內(nèi)的其他siRNA載體對細(xì)胞明顯具有更多的毒性(圖7)。在雙重轉(zhuǎn)染實驗中，將細(xì)胞群分成活力組(V)、凋亡組(A)和壞死(N)組。對于未處理的細(xì)胞，活力細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的比例分別是95.79、1.65和1.75；對于H3K8b∶siRNA復(fù)合物，活力細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的比例分別是91.99、2.22和1.39。因此，來自HK∶siRNA復(fù)合物的細(xì)胞凋亡和/或細(xì)胞死亡少于約5％。數(shù)據(jù)表示三次實驗的平均值。
實施例5H3K8b的結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了下述幾種有助于轉(zhuǎn)運siRNA的H3K8b的結(jié)構(gòu)域1)末端分支(例如，HHHKHHHKHHHKHHH)，其可能與siRNA結(jié)合；2)組氨酸富集核心(H8)；和3)結(jié)合整合素的結(jié)構(gòu)域。將整合素結(jié)合配基(+RGD)添加至H3K8b可以增強(qiáng)siRNA的轉(zhuǎn)運和效力。為考察這些對siRNA輸入而言可能重要的區(qū)域，本發(fā)明的發(fā)明人合成了幾種HK聚合物，其中改變了H3K8b的結(jié)構(gòu)域(見例如，圖9)。將-RGD添加至H3K8b(例如H3K8b(+RGD))稍微提高了siRNA在SVR-bag4細(xì)胞(圖10)和在MDA-MB-435細(xì)胞中的效力，觀察到，使用H3K8b(+RGD)作為siRNA載體與H3K8b比較提高siRNA效力20％。當(dāng)將幾種氨基酸從H3K8b或H3K8b(+RGD)的末端分支去除時，siRNA的轉(zhuǎn)運聚合物的效力最低限度地降低(約25％)。因此，存在對截短運載siRNA的H3K8b的末端分支的長度的耐受性。
當(dāng)將一個賴氨酸添加至各末端分支(每個聚合物8個額外的賴氨酸)時，分支HK聚合物作為siRNA載體的效力顯著降低。
在另外一個實施方案中，使用甘氨酸取代H8結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示了siRNA的效力降低約3倍。
H3K8b∶siRNA復(fù)合物的最佳比例(wt∶wt)是在約2∶1和約4∶1之間。值得注意的是，H3K8b作為siRNA進(jìn)入SVR-bag4細(xì)胞的載體比Oligofectamine更好。
實施例6HK∶siRNA復(fù)合物的尺寸和ζ電勢。本發(fā)明的發(fā)明人接下來比較了H3K8b和H2K4b與β-半乳糖苷酶siRNA的復(fù)合物的尺寸和電勢。雖然H3K8b是有效的siRNA載體，而H2K4b不是有效的siRNA載體。值得注意的是，H3K8b和H2K4b聚合物都缺乏整合素配基RGD。如表1所示，H3K8b復(fù)合物的尺寸適當(dāng)?shù)匦∮贖2K4b復(fù)合物。
表1HK聚合物的尺寸和ζ電勢
類似地，使用Opti-MEM(300μl)制備作為轉(zhuǎn)染復(fù)合物的HK聚合物(48μg或96μg)與質(zhì)粒DNA(12μg)的復(fù)合物。在聚合物復(fù)合物靜置30分鐘后，加入約950μl的Hepes緩沖液(pH 7.5，20mM)。分別使用N4型亞微米顆粒尺寸分析儀和Delsa 440 SXζ電勢分析儀檢測尺寸和表面電荷。各數(shù)據(jù)點表示三次測量的平均值。
由于H3K8b∶siRNA復(fù)合物具有較大的組氨酸∶賴氨酸比例(其中組氨酸在生理pH下具有較少電荷)，其ζ電勢與H2K4b∶siRNA復(fù)合物相比降低。雖然以2∶1比例制備的H3K8b∶siRNA和以4∶1比例制備的H2K4b∶siRNA的ζ電勢是相似的，但它們運轉(zhuǎn)siRNA的能力是顯著不同的。而且，雖然ζ電勢通過改變H3K8b∶siRNA的比例而從正變?yōu)樨?fù)，但通過改變H3K8b∶siRNA比例的經(jīng)由這些正到負(fù)對lacZ mRNA的抑制與經(jīng)由這些具有不同電荷的復(fù)合物對lacZ mRNA的抑制是相似的。對于H3K8b聚合物∶β-半乳糖苷酶siRNA復(fù)合物，在2∶1和6∶1之間的比例是最好的并相似地抑制了細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶水平。
實施例7合成了幾種聚合物，其改變了H3K8b的一個或多個結(jié)構(gòu)域，H3K8b(+RGD)添加了整合素配基RGD；(+K)H3K8b(+RGD)添加了單個賴氨酸至各末端分支；H3K(G)8b(+RGD)用單個甘氨酸(用G表示)取代了組氨酸富集的結(jié)構(gòu)域；(-HHHK)H3K8b或(-HHHK)H3K8b(+RGD)從各末端分支去除了氨基酸。H3K8b的這些修飾的示意圖在圖9中描述。由實線連接的三個實心環(huán)表示3賴氨酸核心，且K表示賴氨酸，其中兩個末端分支是接合的。
含有整合素配基的H3K8b的有效類似物H3K8b(+RGD)能夠顯著抑制細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶的表達(dá)。另外，測定了H3K8b(+RGD)與靶向熒光素酶的siRNA的復(fù)合物抑制了熒光素酶在MDA-MB-435細(xì)胞中的表達(dá)。在抑制其靶的最佳濃度下，H3K8b(+RGD)∶siRNA復(fù)合物具有最小的毒性。相比之下，siRNA的載體如Oligofectamine和Lipofectamine 2000明顯毒性更大。
向(+K)H3K8b(+RGD)的末端分支添加單個賴氨酸或用甘氨酸取代H3K(G)8b(+RGD)中的組氨酸富集結(jié)構(gòu)域(H8)顯著降低了這些聚合物作為siRNA載體的能力。
圖10中描述的數(shù)據(jù)表示三次實驗的平均值±S.D.；**P＜0.01未處理的vs.Oligofectamine、H3K8b、(-HHHK)H3K8b、H3K8b(+RGD)和(-HHHK)H3K8b(+RGD)，**P＜0.01，Oligofectamine vs.H3K8b(+RGD)或(-HHHK)H3K8b(+RGD)(使用Bonferroni多重比較檢驗的單因素方差分析)。復(fù)合物中HK聚合物和Oligofectamine與siRNA的比例分別是4∶1和2∶1(w/w)。
如圖10中所示，H3K8b(+RGD)比Oligofectamine和lipofectamine 2000有利地作為siRNA進(jìn)入SVR-bag4細(xì)胞的載體；H3K8b(+RGD)和Lipofectamine 2000作為siRNA載體分別降低了81.9±0.1％和74.2±0.4％的β-半乳糖苷酶(P＝0.053；Mann-Whitney秩和檢驗)。
雖然通過特定實施方案及其應(yīng)用的方式描述了本發(fā)明，但可以做出大量修改和改變而不背離本發(fā)明的精神和范圍。所附權(quán)利要求的范圍不限于所描述的特定實施方案。
權(quán)利要求
1.一種使用siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，其包括將轉(zhuǎn)染復(fù)合物與一種或多種細(xì)胞相接觸；其中所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物包括轉(zhuǎn)運聚合物和siRNA，且其中所述轉(zhuǎn)運聚合物包括組氨酸和賴氨酸。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)運聚合物包括6-10個末端分支。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)運聚合物包括至少一種具有序列-HHHKHHHKHHHKHHHHKHHH-或其亞片段的末端分支。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)運聚合物包括至少一種穩(wěn)定劑。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述穩(wěn)定劑包括PEG。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)運聚合物包括靶向配基。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物包括一種或多種選自H3K8b、H3K8b(+RGD)、(-HHHK)H3K8b和(-HHHK)H3K8b(+RGD)的聚合物。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物包括H3K8b。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物包括H3K8b(+RGD)。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物包括(-HHHK)H3K8b。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合物包括(-HHHK)H3K8b(+RGD)。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種細(xì)胞包括一種或多種選自轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、重組細(xì)胞系、惡性細(xì)胞系和原代細(xì)胞系的細(xì)胞。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種細(xì)胞包括一種或多種選自SVR-bag4、MDA-MB-435、C6和HUVEC細(xì)胞系的細(xì)胞。
14.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述siRNA靶向Raf-1序列。
15.一種使用siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，其包括將siRNA與包含組氨酸和賴氨酸的轉(zhuǎn)運聚合物混合以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；使所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物在約室溫下靜置約15分鐘至約1.5小時；和將所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物與一種或多種細(xì)胞接觸。
16.一種制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物的方法，其包括將siRNA與包含組氨酸和賴氨酸的轉(zhuǎn)運聚合物混合；其中所述轉(zhuǎn)運聚合物包含6-10個末端分支。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)運聚合物與所述siRNA的比例是約0.5∶1(wt/wt)至約24∶1(wt/wt)。
18.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述聚合物包含至少一個具有序列-HHHKHHHKHHHKHHHKHHH-或其亞片段的末端分支。
19.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述聚合物包括一種或多種選自H3K8b、H3K8b(+RGD)、(-HHHK)H3K8b和(-HHHK)H3K8b(+RGD)的聚合物。
20.一種轉(zhuǎn)染復(fù)合物，其包括siRNA和包含組氨酸和賴氨酸的轉(zhuǎn)運聚合物；其中所述轉(zhuǎn)運聚合物包含約6至約10個末端分支。
21.權(quán)利要求20所述的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，其中所述聚合物包括一種或多種選自H3K8b、H3K8b(+RGD)、(-HHHK)H3K8b和(-HHHK)H3K8b(+RGD)的聚合物。
22.權(quán)利要求20所述的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，其中所述siRNA靶向Raf-1序列。
23.權(quán)利要求20所述的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，其中所述轉(zhuǎn)運聚合物與所述siRNA的比例是約0.5∶1(wt/wt)至約24∶1(wt/wt)。
24.一種組合物，其包含權(quán)利要求20所述的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。
25.一種治療患有一種或多種疾病的患者的方法，其包括給所述患者施用治療有效量的一種轉(zhuǎn)染復(fù)合物；其中所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物包括siRNA和轉(zhuǎn)運聚合物，且其中所述轉(zhuǎn)運聚合物包含組氨酸和賴氨酸并具有約6至約10個末端分支。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述一種或多種疾病包括一種或多種遺傳或非腫瘤性疾病。
27.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述一種或多種疾病包括一種或多種選自下述的疾病腺苷脫胺酶缺乏癥、嘌呤核苷磷酸化酶缺乏癥、p47phox缺陷的慢性肉芽腫性疾病、具HbS的鐮狀細(xì)胞、β-珠蛋白生成障礙性貧血、范康尼氏貧血、家族性高膽固醇血癥、苯丙酮尿癥、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶缺乏癥、載脂蛋白E缺乏、血友病A和B、肌肉萎縮癥、纖維囊泡癥、帕金森癥、色素性視網(wǎng)膜炎、溶酶體貯存病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、人免疫缺陷病毒病病毒性感染、獲得性貧血、心臟及外周血管疾病和關(guān)節(jié)炎。
28.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述一種或多種疾病包括癌癥。
29.一種用于治療患有一種或多種疾病的患者的方法，其包括給所述患者施用已經(jīng)通過權(quán)利要求1所述方法用siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
30.一種用于治療患有一種或多種疾病的患者的方法，其包括從所述患者取出細(xì)胞；通過將所述細(xì)胞與一種轉(zhuǎn)染復(fù)合物接觸而將siRNA遞送至所述細(xì)胞；和給所述患者施用包含siRNA的所述細(xì)胞；其中所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物包括siRNA和轉(zhuǎn)運聚合物，且其中所述轉(zhuǎn)運聚合物包含組氨酸和賴氨酸并具有約6至約10個末端分支。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用siRNA通過將轉(zhuǎn)染復(fù)合物與一種或多種細(xì)胞相接觸而轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，其中所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物包括轉(zhuǎn)運聚合物和siRNA。所述轉(zhuǎn)運聚合物可以包括例如H
文檔編號A61K31/70GK101060849SQ200580039448
公開日2007年10月24日 申請日期2005年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月17日
發(fā)明者阿奇博爾德·米克森 申請人:巴爾的摩馬里蘭大學(xué)