專利名稱：用siRNA治療特征在于升高的眼內(nèi)壓的眼病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于眼病治療的方法和組合物；特別然而并非專門涉及青光眼的治療。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及RNAi技術(shù)的使用以下調(diào)眼房水(aqueous formation)形成基因和眼房水流出(aqueous outflow)基因。也提供了治療眼病的方法和組合物。
背景技術(shù)：
RNAi作為下調(diào)基因表達的工具通過同源重組的基因?qū)ぐ型ǔＳ糜诖_定哺乳動物中的基因功能，但是這是消耗成本和時間的方法。備選地，在用核酶或反義技術(shù)的mRNA抑制以后可以確定許多基因的功能。雖然在有些情況中是成功的，但是這些技術(shù)難以普遍應(yīng)用。siRNA-定向的“擊倒”的出現(xiàn)在體細胞遺傳學(xué)中激起了革命，允許哺乳動物中的基因功能的廉價并快速的分析。
建立在mRNA水平敲除基因表達的方便并可靠的方法是過去15年在分子生物學(xué)中周期性的題目。在產(chǎn)生細胞或生物功能損失的努力中，已經(jīng)試驗了多種分子，所述分子包括，例如，反義序列、核酶、和嵌合寡核苷酸，但是這樣分子的設(shè)計是基于反復(fù)試驗，取決于目標基因的性質(zhì)。而且，難以預(yù)知期望的效果，并且經(jīng)常僅實現(xiàn)弱抑制(Braasch Corey，2002)。
在1990年代初該現(xiàn)象在植物中發(fā)現(xiàn)以后，1998年Andy Fire和CraigMeilo首次用線蟲(Caenorhabditis elegans)蟲表明dsRNA(雙鏈RNA)可以以非常有效的方式特異并選擇性抑制基因表達(Fire等，1998)。在他們的實驗中，第一條鏈(稱為有義RNA)的序列與目標信使RNA(mRNA)的相應(yīng)區(qū)域的序列符合。第二條鏈(反義RNA)對于該mRNA是互補的。得到的dsRNA結(jié)果是遠比相應(yīng)的單鏈RNA分子(特別是，反義RNA)更有效(數(shù)個數(shù)量級)。Fire等，1998對RNA干涉命名為現(xiàn)象RNAi。這個有效的基因沉默機理已經(jīng)顯示在大多數(shù)系統(tǒng)發(fā)育的門之中的數(shù)個種類中起作用。
當叫作DICER的酶遇到dsRNA，并且將其切割成叫作小干擾RNAs或siRNAs的片段時，RNAi開始。這種蛋白屬于RNase III核酸酶家族。當?shù)鞍讖?fù)合物聚集這些RNA殘余物，并且將它們的密碼用作尋找和破壞細胞中具有匹配序列的任何RNAs諸如目標mRNA的向?qū)?綜述參見Bosher & Labouesse，2000)。
RNAi現(xiàn)象(Akashi等，2001)可以總結(jié)如下●步驟1dsRNA識別和掃描過程。
●步驟2通過RNAse III活性分解dsRNA，并且產(chǎn)生siRNAs。
●步驟3siRNAs和RISC復(fù)合體中締合因子的締合。
●步驟4識別互補的目標mRNA。
●步驟5在與siRNA互補區(qū)域中心分解目標mRNA。
●步驟6降解目標mRNA，并且再生RISC復(fù)合體。
在將RNAi現(xiàn)象用作基因擊倒技術(shù)的嘗試中，很快意識到，哺乳動物細胞已經(jīng)發(fā)展了針對病毒感染的各種保護現(xiàn)象，這些保護線性可以妨礙這種方法的應(yīng)用。實際上，極低水平的病毒dsRNA的存在引發(fā)了干擾素應(yīng)答，這導(dǎo)致翻譯的全面非特異性抑制，其又引發(fā)了程序性細胞死亡(Williams，1997，Gil & Esteban，2000)。
在2000年，使用dsRNA的第一次嘗試導(dǎo)致小鼠卵母細胞和早期胚胎中的3種基因的特異性抑制(MmGFP受控于延伸因子1a、E-鈣黏著蛋白和c-mos)。翻譯被抑制，因此，當所述胚胎繼續(xù)發(fā)育時，沒有觀察到PKR應(yīng)答(Wianny & Zemicka-Goetz，2000)。一年后，關(guān)于Ribopharma AG(Kulmbach，Germany)的研究首次證明了RNAi在哺乳動物細胞中的功能性。使用短的(20-24堿基對)dsRNAs—其叫作SIRPLEXTM—它們甚至在人細胞中特異性地關(guān)閉基因，而不起始急性期反應(yīng)。后來其它的研究小組進行的類似實驗(Elbashir等，2001；Caplen等.，2001)進一步證明了這些結(jié)果。
一年后，Paddison等(Paddison等，2002)嘗試應(yīng)用折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的小RNAs來抑制特異的基因的功能。這一工作受到早先的研究的啟發(fā)，早先的研究表明，線蟲中的一些基因通過編碼發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAs的RNAs而天然地調(diào)控其它基因。在各種正常的和癌癥的人和小鼠細胞系中檢測，短的發(fā)夾RNAs(shRNAs)能夠如同它們的siRNA副本那樣有效地沉默基因。此外，shRNA在體內(nèi)展現(xiàn)出比等價雙鏈體更少的再締合動力學(xué)。甚至更重要的，這些作者制備了轉(zhuǎn)基因細胞系，這些轉(zhuǎn)基因細胞系被加工以合成在細胞分裂過程中表現(xiàn)出持續(xù)長久的抑制作用的shRNAs(Eurogentec)。最近，表明另一組小RNAs(也包括在21-25nt范圍內(nèi))介導(dǎo)基因表達的下調(diào)。已經(jīng)在線蟲中描述了這些叫作小的瞬時調(diào)控RNAs(stRNAs)的RNAs，在線蟲中，它們調(diào)控發(fā)育過程中基因表達時間。應(yīng)該注意到，盡管有明顯的相似性，但是stRNAs和siRNAs通過不同的作用模式發(fā)生(綜述參見Banerjee& Slack，2002)。與siRNAs相反，22nt長的stRNAs在翻譯起始后下調(diào)目標mRNA的表達，而不影響mRNA的完整性。最近的研究表明，最初在線蟲類中描述的兩種stRNAs是線蟲類中存在的具有上百種其它微-RNAs(miRNAs)的大家族中的成員(Grosshans & Slack，2002)。
科學(xué)家開始將RNAi用在一些系統(tǒng)中，包括線蟲、果蠅、錐蟲和各種其它的無脊椎動物。并且，應(yīng)用這種方法，一些小組最近描述了在不同的哺乳動物細胞系—特別是在Hela細胞中一的蛋白生物合成的特異性抑制，這表明RNAi是在體外用于基因沉默的廣泛適用的方法?；谶@些結(jié)果，RNAi已經(jīng)迅速地成為確定(鑒定和分配)基因功能的公認工具。并且，應(yīng)用短dsRNA寡聚核苷酸的RNA干擾將允許解釋只被部分測序的基因的功能。因此，在諸如下列各項的研究中，RNAi將是不可避免的●在真核細胞中在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制基因表達。在這一內(nèi)容中，RNAi是快速評估基因功能和揭示無效表型的直接工具。
●研發(fā)RNAi技術(shù)用于移植后的胚胎。
●RNA干擾主要的經(jīng)濟顯著性由其作為治療原理的應(yīng)用而建立。由于此，RNAi可以產(chǎn)生治療人類疾病的基于RNA的藥物。
青光眼青光眼是盲的主要原因之一。世界范圍內(nèi)接近15％的盲的情況由青光眼產(chǎn)生。最普通的類型，原發(fā)性開角型青光眼，在超過40歲的一般人群中具有1/200的發(fā)病率。
已經(jīng)將青光眼簡單限定為由眼內(nèi)壓力(IOP)持續(xù)升高超過其正常生理極限的所引起視覺組織破壞的過程。
越來越清楚，許多形式的青光眼具有遺傳成分，并且更多的當前研究集中在識別染色體區(qū)域和促進青光眼的基因?？赡苁荗AG的病因?qū)W是多因素的，由超過一種基因中的突變的組合和至今未經(jīng)確認的環(huán)境因素產(chǎn)生。關(guān)于青少年和成年人發(fā)作的OAG，已經(jīng)識別了數(shù)個基因座。然而，僅已知一種基因，即染色體1q21-q31上的GLClA基因座處的肌纖蛋白/TIGR(小梁網(wǎng)可誘導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素反應(yīng))基因。在全世界的人種學(xué)多樣的人群中已經(jīng)識別了超過三十種該基因的突變。研究顯示了它僅導(dǎo)致了總OAG的大約5％(見Wirtz Samples，2003，和Khaw等，2004a中的評論)。
發(fā)病機制雖然升高的水平可能不同，但是大多數(shù)的青光眼的特征在于升高的IOP。在那些青光眼中，其中所述升高最初是低的(即，開角型青光眼、黑色素細胞青光眼)并且一些繼發(fā)性青光眼、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞和視神經(jīng)損害發(fā)展緩慢。在閉角型青光眼中IOP的突然高度升高經(jīng)常致使眼盲，無疑主要由于在篩板水平的軸漿流中止。
在人的研究中，已經(jīng)廣泛地接受，組織壞死在青光眼發(fā)生的視神經(jīng)盤損害的引發(fā)或進行中起作用。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞退化可以是壞死，但是由IOP的升高觸發(fā)細胞凋亡的可能性是似乎合理的，并且認為一氧化氮和谷氨酸的各自作用在所述疾病的進行期間是相關(guān)的(對于這個問題上最近的綜述見Osborne等，2003)。
治療雖然數(shù)種病因?qū)W涉及青光眼綜合征，但是療法選擇中絕對的決定因素是虹膜角膜角之內(nèi)壓力的原發(fā)性和/或誘導(dǎo)的改變量。
雖然升高的IOP導(dǎo)致青光眼中神經(jīng)元損害的病理生理的機理是未知的，但是當前的治療包括針對降低這種壓力的藥物治療或外科手術(shù)。
可以利用四種類型的藥物嘗試醫(yī)藥抑制升高的IOP眼房水形成抑制劑(在它們之中有碳酸酐酶抑制劑、β-腎上腺素能阻滯劑、或α2-腎上腺素能受體激動劑)；縮瞳劑(即擬副交感神經(jīng)藥-膽堿功能藥物-、或抗膽堿酯酶抑制劑)；眼色素層鞏膜流出增強劑；和高滲試劑(穿過睫狀體上皮之內(nèi)的血液/水屏蔽產(chǎn)生滲透壓梯度)。將全部四種用于青光眼的治療中，前三種通常作為急診治療和長期的控制，而所述高滲試劑作為急診和手術(shù)前治療是寶貴的。第五類藥物，神經(jīng)保護試劑，正在開始出現(xiàn)為對于醫(yī)藥治療的重要的可能添加物。實際上，NOS和谷氨酸水平在青光眼中升高并且它們涉及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞壞死或細胞凋亡的觀察增加了神經(jīng)保護治療和甚至是神經(jīng)再生的可能性。因而氨基酸激發(fā)拮抗劑NOS抑制劑、谷氨酸受體拮抗體、細胞凋亡抑制劑和鈣通道封阻劑是將來青光眼治療的發(fā)展中的全部潛在的選擇物。所述鈣通道可以減少微循環(huán)對視神經(jīng)頭部的削弱效果，同時在小梁細胞水平潛在增加流出的可能性。
在參考文獻中給出了多種眼病和它們的治療的評論，特別是在Bunce(2005)、Costagliola(1995，2000)、Cullinane(2002)、Sakaguchi(2002)、Shah(2000)、和Wang(2005)中。
目前我們的現(xiàn)有治療肯定達不到目的并且與流出可能性的評價、治療的精確監(jiān)控和外科技術(shù)的復(fù)雜性有關(guān)的實際困難全部組合而困擾預(yù)后；全部青光眼中占優(yōu)勢的因素是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的退化，因而通過有效的低眼壓的神經(jīng)保護是我們使用的任何治療的基本需要(對于在這個問題上的最近綜述，見Khaw等2004b)。
發(fā)明概述在本發(fā)明中發(fā)明人描述了用于治療眼病癥的方法，特征在于改變動物包括人中的IOP。特別是，眼病癥可以包括青光眼、葡萄膜炎、和炎癥。所述方法基于基因表達的下調(diào)，所述基因涉及眼中的眼房水(aqueous)形成或眼房水流出。可以通過雙鏈核酸部分的使用影響下調(diào)，命名為siNA或小干涉的NA，其定向于干涉多種候選基因的mRNA表達。盡管修飾的核酸或類似的化學(xué)合成的實體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，但是所述siNA優(yōu)選是siRNA。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案涉及siNA的局部施用。本發(fā)明的實施方案也提供了供治療眼病癥用的藥物組合物。本發(fā)明可以使用在局部眼治療、涉及青光眼發(fā)病機制的目標基因、還有化學(xué)合成的實體治療動物(包括人)疾病的用途的領(lǐng)域內(nèi)。
除青光眼的治療之外，本方法也適于治療所述眼的前房的其它疾病。特別是，所述方法可以應(yīng)用于疾病的治療，其特征在于改變眼中的眼房水形成或流出?？梢灾委煹牟“Y實例包括局部病癥諸如感染或炎癥，和一般病癥諸如葡萄膜炎或全身疾病的表現(xiàn)。另外，本發(fā)明的某些實施方案提供用于糖尿病性視網(wǎng)膜病的治療。
發(fā)明詳述目標基因本發(fā)明中，本發(fā)明發(fā)明人限定一系列目標基因，其表達水平可以改變IOP。這些基因可以屬于涉及眼房水形成的基因的組或者涉及眼房水流出的基因的組。這里是我們的目標基因系列●碳酸酐酶II、IV和XII●腎上腺素能藥受體β1和2以及αIA、IB和ID●乙酰膽堿酯酶●環(huán)加氧酶1和2●腺苷三磷酸酶α1、α2、α3、β1、β2●內(nèi)皮性白細胞粘著分子I(ELAM-1)●血管緊張素系統(tǒng)血管緊張素II、血管緊張素II轉(zhuǎn)化酶類(ACEI和ACEII)、血管緊張素II受體(ATR1和ATR2)和腎素●CochlinsiNA的設(shè)計盡管RNAi的機制尚未已知，但是產(chǎn)生特異性的dsRNA寡核苷酸所需的步驟是清楚的。已經(jīng)表明，長度為21-26個核苷酸的dsRNA雙鏈體鏈在產(chǎn)生RNA干擾中最有效。選擇基因內(nèi)部正確的同源區(qū)域也是重要的。當考慮產(chǎn)生用于RNAi的dsRNA時，諸如距起始密碼子的距離、G/C含量和腺苷二聚體的位置的因素是重要的。然而，這樣做的一個后果是人們可能需要檢測一些不同的序列，以發(fā)現(xiàn)最有效的RNAi，并且這可能是花費大的。
在1999年，Tuschl等揭示了siRNAs的沉默機制，表明它們的效率是雙鏈體的長度、3′末端突出端長度和這些突出端的序列的函數(shù)?；谶@一奠基性的工作，Eurogentec推薦靶點mRNA區(qū)域，以及因而應(yīng)該使用下述指導(dǎo)方針選擇siRNA雙鏈體的序列由于RNAi依賴建立復(fù)雜的蛋白相互作用，因而，明顯地，mRNA靶點應(yīng)該完全沒有不相關(guān)的結(jié)合因子。在這一情況下，由于它們可能更富含調(diào)控蛋白結(jié)合位點，所以應(yīng)該避免5′和3′不翻譯區(qū)(UTRs)和臨近起始密碼子的區(qū)域。因此，siRNA的序列選擇如下●在mRNA序列中，選擇位于AUG起始密碼子下游或終止密碼子上游50-100nt的區(qū)域。
●在這一區(qū)域，尋找下述序列AA(N19)，CA(N19)。
●計算每個確定序列的G/C百分數(shù)。理想地，G/C含量為50％，但是它必須小于70％并且大于30％。
●優(yōu)選地，避免含有下列重復(fù)的序列AAA，CCC，GGG，TTT，AAAA，CCCC，GGGG，TTTT。
●還進行按照mRNA二級結(jié)構(gòu)的可接近性預(yù)測。
●還使用最適合前述標準的核苷酸序列進行BLAST(即，NCBI ESTs數(shù)據(jù)庫)，以確保只有一種基因?qū)⒈皇Щ睢?br> 為了將結(jié)果的解釋最大化，當使用siRNAs時，應(yīng)該進行下列預(yù)防措施●總是在獨立的實驗中檢測有義和反義單鏈。
●嘗試零亂的(scramble)siRNA雙鏈體。這應(yīng)該具有與你們的siRNA相同的核苷酸組成，但是缺少與任何其它基因(包括你們的基因)的顯著序列同源性。
●如果可能，用2種獨立的siRNA雙鏈體擊倒(knock-down)相同的基因，以控制沉默方法的特異性。
實際上，將每種選擇的基因作為核苷酸序列輸入到預(yù)測程序中，所述程序考慮到上述所有的變化，用于設(shè)計最佳的寡核苷酸。這種程序掃描任何mRNA核苷酸序列的易受siRNAs靶向的區(qū)域。這種分析的輸出是可能的siRNA寡核苷酸的得分。最高得分用來設(shè)計雙鏈寡核苷酸(盡管其它長度也是可能的，典型地21bp長)，其典型地通過化學(xué)合成制備。
除了siRNA之外，還可以使用修飾的核苷酸。我們計劃檢測本領(lǐng)域內(nèi)公知的一些化學(xué)修飾物。這些修飾物目的是增加siNA的穩(wěn)定性或可用性。適宜的修飾物的實例在下文參考的出版物中描述，每一份出版物通過參考結(jié)合于此。
研究表明，用脫氧核糖核苷酸取代具有2個核苷酸3′-突出端的21-mersiRNA雙鏈體的3′-末端核苷酸突出端片段，對RNAi活性沒有不利作用。已經(jīng)報道用脫氧核糖核苷酸取代siRNA每端多達4個核苷酸是很好耐受的，而用脫氧核糖核苷酸完全取代導(dǎo)致沒有RNAi活性(Elbashir 2001)。另外，Elbashir等.還報道了用2′-O-甲基核苷酸取代siRNA完全消除了RNAi活性。
可以使用WO2005/044976中所述的親和力修飾的核苷。這一公布描述了包括修飾的核苷的寡核苷酸，以便具有對于靶點mRNA和/或互補siNA鏈中它們的互補核苷酸的增加的或減少的親和力。
GB2406568描述了備用的修飾的寡核苷酸，其被化學(xué)修飾，以提供針對降解的提高的抗性或提高的吸收。這樣的修飾的實例包括硫代磷酸核苷酸間鍵合、2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脫氧-氟核糖核苷酸、2′-脫氧核糖核苷酸、“通用堿基”核苷酸、5-C-甲基核苷酸和反向脫氧堿性(deoxyabasic)殘基結(jié)合。
WO2004/029212描述了被修飾以增強siRNA的穩(wěn)定性或增加靶向效率的寡核苷酸。修飾包括siRNA兩個互補鏈之間的化學(xué)交聯(lián)，和siRNA一條鏈3’末端的化學(xué)修飾。優(yōu)選的修飾為內(nèi)部修飾，例如，糖修飾、核堿基修飾和/或骨架修飾。描述了2′-氟修飾的核糖核苷酸和2′-脫氧核糖核苷酸。
WO2005/040537還描述了可以用于本發(fā)明的修飾的寡核苷酸。
如應(yīng)用dsNA和修飾的dsRNA一樣好，本發(fā)明可以應(yīng)用短的發(fā)夾NA(shNA)；siNA分子的兩條鏈可以通過接頭區(qū)連接，接頭可以是核苷酸接頭或非核苷酸接頭。
除了與靶點區(qū)域完美互補的siNA之外，簡并的siNA序列也可以用來靶向同源區(qū)域。WO2005/045037描述了靶向這樣的同源序列的siNA分子的設(shè)計，例如，通過結(jié)合非規(guī)范的堿基對，例如錯配和/或搖擺(wobble)堿基對，其可以提供其它的靶點序列。在確定錯配的實例中，非規(guī)范堿基對(例如，錯配和/或搖擺堿基)可以用來產(chǎn)生靶向多于一種基因序列的siNA分子。在一個非限制性實例中，非規(guī)范堿基對諸如UU和CC堿基對用來產(chǎn)生能夠靶向使共享序列同源性的靶點不同的序列的siNA分子。這樣，使用本發(fā)明的siNAs的一個優(yōu)點是，單一的siNA可以設(shè)計成包括與在同源基因之間保守的核苷酸序列互補的核酸序列。在這種方法中，單一的siNA可以用來抑制多于一種基因的表達，而不是使用多于一種的siNA分子來靶向不同的基因。
本發(fā)明優(yōu)選的siNA分子是雙鏈的。本發(fā)明的siNA分子可以包括平端的，即，不包括任何突出核苷酸的末端。在一個實施方案中，本發(fā)明的siNA分子可以包括一個或多個平端。在優(yōu)選實施方案中，siNA分子具有3′突出端。本發(fā)明的siNA分子可以包括具有n個核苷酸(5≥n≥1)的3′突出端的雙鏈體核酸分子。Elbashir(2001)表明，當含有3′-末端二核苷酸突出端時，21個核苷酸的siRNA雙鏈體是最活躍的。
為了促進從動物到人臨床研究的轉(zhuǎn)換，進一步篩選了候選寡核苷酸的種間序列保守性。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，使用保守寡核苷酸；這允許單一寡核苷酸序列用于動物模型和人臨床試驗。


圖1顯示了與通過備選剪接產(chǎn)生的P2RX7轉(zhuǎn)錄物對應(yīng)的GenBank登記號。在這些基因的一些中，備選的剪接產(chǎn)生在外顯子含量上不同的一族轉(zhuǎn)錄體。本發(fā)明容許各自轉(zhuǎn)錄體形式的單獨定向。
RNAi針對其而選擇的寡核苷酸序列在圖2中顯示。顯示的序列是由siNA靶向的DNA序列。因此，本發(fā)明將應(yīng)用具有與指示DNA序列互補序列的NA雙鏈體。
在圖2中顯示的序列不是限制性的。事實上，靶點DNA不必必要地在AA或CA之后。此外，靶點DNA可以由包含在圖2中的側(cè)連以任何鄰近序列的序列組成。
體外和動物研究獲得siRNA雙鏈體使用適當保護的核糖核苷氨基磷酸酯(phosphoramidites)和常規(guī)DNA/RNA合成儀，優(yōu)選地化學(xué)合成RNAs。用2′-脫氧或2′-O-甲基寡核糖核苷酸取代siRNA雙鏈體的一條或兩條鏈，消除了蠅提取物中的沉默作用(Elbashir等.2001)。然而，在哺乳動物中，用2′-O-甲基寡核糖核苷酸取代有義siRNA似乎是可能的(Ge等.2003)。
最便利地，siRNAs從商業(yè)RNA寡聚物合成供應(yīng)商獲得，其出售不同質(zhì)量和價格的RNA-合成產(chǎn)物。一般地，21-nt RNAs不是很難合成的，并且易于以適合RNAi的質(zhì)量提供。
RNA合成試劑的供應(yīng)商包括Proligo(Hamburg，Germany)、DharmaconResearch(Lafayette，CO，USA)、Glen Research(Sterling，VA，USA)、ChemGenes(Ashland，MA，USA)和Cruachem(Glasgow，UK)、Qiagen(Germany)、Ambion(USA)和Invitrogen(Scotland)。早先常規(guī)的RNA合成公司具有目標確認的許可有資格提供siRNAs。特別地，我們的siRNA供應(yīng)商是Ambion，、Dharmacon和Invitrogen，這些公司提供siRNA傳統(tǒng)常規(guī)的化學(xué)合成服務(wù)，并且提供用HPLC純化的siRNA，并且以干燥形式與沒有Rnase的水一起遞送。RNAi和siRNA方法的主要的基于網(wǎng)絡(luò)的來源，以及其它siRNA相關(guān)產(chǎn)物和服務(wù)的鏈接，可以在上述提及的供應(yīng)商的網(wǎng)頁上找到。
當用單鏈RNA分子操作時，退火步驟是必要的。嚴格地，所有的操作步驟都應(yīng)該在無菌、沒有Rnase的條件下進行。為了使RNAs退火，寡聚物必須通過260納米(nm)處的UV吸收而進行定量。然后，將基于Elbashir等.(2001)的下述流程用于退火●獨立地將每種RNA寡聚物等分并且稀釋到50μM濃度。
●將30μl每種RNA寡聚物溶液和15μl5×退火緩沖液組合。終緩沖液濃度為100mM醋酸鉀，30mM HEPES-KOH pH7.4，2mM醋酸鎂。終體積是75μl。
●將所述溶液在90℃溫育1分鐘，將管離心15秒，在37℃靜置1小時，然后在環(huán)境溫度下使用。所述溶液可以在-20℃冷凍保存，并且冷凍-解凍可達5次。siRNA雙鏈體的終濃度通常為20μM。
備選地，已經(jīng)退火的dsRNA可以從供應(yīng)商那里購買。
還可以使用化學(xué)修飾的核酸。例如，WO03/070744給出了可以使用的修飾類型的總觀點，它的內(nèi)容通過參考結(jié)合于此。特別要注意的是這一公布的第11-21頁。其它可能的修飾如上文所述。有經(jīng)驗的人應(yīng)該直到可以結(jié)合到RNA分子中的其它類型的化學(xué)修飾。
體外系統(tǒng)為了檢驗所述siRNA干涉的特異性，采用表達所述目標基因的不同細胞培養(yǎng)。用于這些實驗的細胞是兔非著色睫狀體上皮細胞NPE、人睫狀體上皮細胞OMDC、和人胚腎細胞HEK293。用相應(yīng)的siRNA雙鏈體溫育所述細胞，并且進行所述目標基因表達下調(diào)的分析。為了將siRNA擊倒與培養(yǎng)細胞中的特定表型相聯(lián)系，有必要證明目標蛋白質(zhì)的減少或至少證明目標mRNA的減少。
靶點基因的mRNA水平可以通過實時定量PCR(qRT-PCR)進行定量。此外，蛋白水平可以以本領(lǐng)域公知的各種方法確定，諸如使用針對不同靶點的特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡分析允許對靶點蛋白減少的直接監(jiān)測。
siRNA雙鏈體的轉(zhuǎn)染本領(lǐng)域眾所周知技術(shù)的數(shù)個實例如下本發(fā)明發(fā)明人可以利用陽離子的脂質(zhì)進行siRNA雙鏈體的單一轉(zhuǎn)染，諸如RNAiFect轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen)和Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen)并且在轉(zhuǎn)染后24、48和72小時檢測沉默作用。
典型的轉(zhuǎn)染方案可以如下進行對于6-孔板的一個孔，本發(fā)明發(fā)明人利用100nM作為siRNA的終濃度轉(zhuǎn)染。在RNAiFect方案后，在轉(zhuǎn)染的前一天，本發(fā)明發(fā)明人將3ml的適當生長培養(yǎng)基中的每孔接種2-4×105細胞，所述生長培養(yǎng)基含有DMEM、10％血清、抗生素和谷氨酰胺，并且在正常生長條件(37℃和5％CO2)下溫育細胞。轉(zhuǎn)染那天，細胞必須30-50％匯合。本發(fā)明發(fā)明人將15μl的20μM的siRNA雙鏈體(相當于100nm終濃度)稀釋在85μl的Buffer EC-R中，得到100μl的終體積，并通過渦流混合。對于復(fù)合體形成，本發(fā)明發(fā)明人將19μl的RNAiFeet轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋的siRNA并通過移液管或渦流混合。在將所述樣品在室溫下溫育10-15分鐘而形成轉(zhuǎn)染復(fù)合體以后，本發(fā)明發(fā)明人將所述復(fù)合體逐滴加入到細胞中，所述細胞具有2ml新鮮的低抗生素生長培養(yǎng)基。在旋渦所述板以確保轉(zhuǎn)染復(fù)合體均勻分布以后，本發(fā)明發(fā)明人在它們的正常生長條件下溫育所述細胞。第二天，除去所述復(fù)合體并加入新鮮的和完全生長培養(yǎng)基。為了監(jiān)控基因沉默，在轉(zhuǎn)染后24、48和72小時收集細胞。Lipofectamine2000試劑的方案是相當類似的。轉(zhuǎn)染的前一天，本發(fā)明發(fā)明人在3ml的適當生長培養(yǎng)基中每孔接種2-4×105細胞，所述生長培養(yǎng)基含有DMEM、10％血清、抗生素和谷氨酰胺，并且在正常生長條件(37℃和5％CO2)下溫育細胞。在轉(zhuǎn)染當天，細胞必須30-50％匯合。本發(fā)明發(fā)明人將12.5μl20μM的siRNA雙鏈體(相當于100nm終濃度)稀釋在250μl的DMEM中，得到262.5μl的終體積，并混合。同樣，將6μl的Lipofectamine 2000在250μl的DMEM中稀釋并混合。在室溫下溫育5分鐘以后，將稀釋的寡聚體和稀釋的Lipofectamine合并以容許在室溫下的20分鐘溫育期間形成復(fù)合體。然后，本發(fā)明發(fā)明人將所述復(fù)合體逐滴加入到細胞中，所述細胞具有2ml新鮮的低抗生素生長培養(yǎng)基，并通過來回搖動所述板而輕輕混合，以確保轉(zhuǎn)染復(fù)合體的均勻分布。本發(fā)明發(fā)明人在它們的正常生長條件下溫育所述細胞并且在次日除去所述復(fù)合體并加入新鮮的和完全的生長培養(yǎng)基。為了監(jiān)控基因沉默，在轉(zhuǎn)染后的24、48和72小時收集細胞。
轉(zhuǎn)染效率可以取決于細胞類型，但是也取決于傳代次數(shù)和細胞的匯合。形成siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合體的時間和方式(例如，倒置相對旋轉(zhuǎn))也是關(guān)鍵的。低轉(zhuǎn)染效率是不成功沉默作用的最常見的原因。良好的轉(zhuǎn)染是一個重要的問題，并且需要仔細檢驗要應(yīng)用的每種新細胞系。轉(zhuǎn)染效率可以通過轉(zhuǎn)染報道基因，例如CMV-驅(qū)動的EGFP-表達質(zhì)粒(例如，來自Clontech)或B-Gal表達質(zhì)粒，然后在第二天通過相差和/或熒光顯微鏡方法評估而檢測。
檢測siRNA雙鏈體取決于靶點蛋白的豐度和壽命(或周轉(zhuǎn))，在1-3天后或者甚至以后，擊倒表型可以變得明顯。在沒有觀察到表型的情形中，蛋白的耗盡可以通過免疫熒光或蛋白質(zhì)印跡而觀察到。
轉(zhuǎn)染后，從細胞提取的總RNA級分用DNase I預(yù)處理，并且使用隨機引物用于反轉(zhuǎn)錄。為了控制前-mRNAs的擴增，使用覆蓋至少一個外顯子-外顯子連接的特異的引物對進行PCR擴增。還需要非靶點mRNA的RT/PCR作為對照。mRNA的有效耗盡而靶點蛋白的無法檢測的減少可能表明，在細胞中可能存在穩(wěn)定蛋白的大儲存庫。備選地，實時PCR擴增可以用于以更精確的方法檢測mRNA的減少或消失。實時反轉(zhuǎn)錄(RT)PCR最特異性的、靈敏地和可重現(xiàn)性地定量模板的初始量。實時PCR監(jiān)測在反應(yīng)過程中發(fā)射的熒光，作為在每一PCR循環(huán)中擴增子產(chǎn)生的指示。這種信號與反應(yīng)中PCR產(chǎn)物的量成正比例增加。通過記錄每一循環(huán)中發(fā)射的熒光量，可以在指數(shù)期監(jiān)測PCR反應(yīng)，在指數(shù)期，PCR產(chǎn)物量的第一次顯著增加與靶點模板初始量相關(guān)。
為了證實在所述細胞培養(yǎng)中識別的差異表達基因的干涉模式，根據(jù)制造商的規(guī)程進行qRT-PCR。對于定量的RT-PCR(qRT-PCR)，將接近250ng的總RNA用于反轉(zhuǎn)錄，接著是在含有Master SYBR Green I的反應(yīng)混合物中用各自基因的特定引物的PCR擴增?；綪CR條件包含在91℃下30分鐘的初始步驟，接著是在95℃下5秒、在62℃下10秒和在72℃下15秒的40個循環(huán)。使用對應(yīng)于各自目標基因的特定引物序列。將b-肌動蛋白mRNA的定量用作數(shù)據(jù)標準化的對照。在所述樣品中，當選擇的內(nèi)源性/內(nèi)部的對照是更大量的并保持恒定，與總RNA成比例時，相對基因表達比較運行得最好。通過利用不變的內(nèi)源對照作為活性參考物，mRNA目標的定量可以對于加入到各自反應(yīng)的總RNA的數(shù)量標準化。
藥物制劑本發(fā)明可以包括一種或多種siNA分子的同時施用。這些種類可以選擇靶向一種或多種靶點基因。
本發(fā)明的siNA分子及其制劑或組合物可以直接或表面局部地(例如，局部地)施用到眼，這通常是本領(lǐng)域已知的。例如，siNA分子可以包括施用給受試者的遞送載體，其包括脂質(zhì)體。在藥用制劑中可以存在載體和稀釋劑及它們的鹽。核酸分子可以通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的各種方法施用到細胞，這些方法包括，但不限于，包封到脂質(zhì)體中，通過離子電滲療法，或者通過結(jié)合其它載體，諸如可生物降解的聚合物、水凝膠、環(huán)式糊精聚(乳酸-共-乙二醇)酸(PLGA)和PLCA微球、可生物降解的微膠囊、和生物黏附性微球，或者通過蛋白質(zhì)載體而施用。在另一個實施方案中，本發(fā)明的核酸分子還可以與聚乙烯亞胺及其衍生物諸如聚乙烯亞胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亞胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物一起配制或復(fù)合。
本發(fā)明的siNA分子可以與膜分解劑和/或陽離子脂質(zhì)或輔助脂質(zhì)分子絡(luò)合。
可以用于本發(fā)明的遞送系統(tǒng)包括，例如，水性和非水性凝膠、乳膏劑、多樣乳劑、微乳劑、脂質(zhì)體、軟膏劑、水性和非水性溶液、洗液、氣溶膠、碳水化合物堿和粉劑，并且可以包含賦形劑諸如增溶劑，滲透增強劑(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)，和親水聚合物(例如聚親碳物質(zhì)(polycarbophil)和聚乙烯吡咯烷酮)。在一個實施方案中，藥用載體是脂質(zhì)體或透皮增強劑。
本發(fā)明的藥物制劑是適合施用例如全身或局部施用到細胞或受試者的形式，所述受試者包括例如人。適合的形式部分取決于應(yīng)用或者進入的途徑，例如，口服、透皮或者通過注射。其它因素在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，并且包括這樣的考慮，諸如防止所述組合物或制劑行使其作用的毒性和形式。
本發(fā)明還包括用于儲存或施用而制備的組合物，其在藥用載體或稀釋劑中包括藥物有效量的需要的化合物。治療應(yīng)用的可用載體或稀釋劑在制藥領(lǐng)域內(nèi)是公知的。例如，可以提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和調(diào)味劑。這些包括苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸的酯。另外，可以施用抗氧化劑和混懸劑。
藥物有效劑量是預(yù)防、抑制疾病狀態(tài)發(fā)生或者治療(在某種程度上減輕癥狀，優(yōu)選所有癥狀)疾病狀態(tài)所需要的劑量。藥物有效劑量取決于攪拌類型、所用的組合物、施用途徑、要治療的哺乳動物類型、考慮中具體哺乳動物的物理特征、協(xié)同藥物治療、以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該意識到的其它因素。
一般地，施用在0.1mg/kg和100mg/kg體重/天之間的量的活性成分。
本發(fā)明的制劑可以以單位劑量制劑施用，其包括常規(guī)的無毒藥用載體、佐劑和/或載體。制劑可以是適于口服應(yīng)用的形式，例如，作為片劑、藥片、錠劑、水性或油性混懸液、可分散的粉劑或粒劑、乳劑、硬或軟膠囊、或糖漿或酏劑。意欲用于口服使用的組合物可以按照本領(lǐng)域已知的關(guān)于藥物組合物制備的任何方法進行制備，并且這樣的組合物可以包含一種或多種這樣的甜味劑、調(diào)味劑、著色劑或防腐劑，以提供藥學(xué)上美觀和可口的制劑。片劑在與適于制備片劑的無毒藥用賦形劑的混合物中含有活性成分。
這些賦形劑可以是，例如，惰性稀釋劑；諸如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；?；捅澜鈩?，例如，玉米淀粉或褐藻酸；結(jié)合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯樹膠；和潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。片劑可以是沒有涂層的或者它們可以通過已知技術(shù)涂層。在一些情形中，這樣的涂層可以通過已知技術(shù)制備，以延緩崩解和在胃腸道中的吸收，并且由此在更長的時間段提供持續(xù)不變的作用。例如，可以應(yīng)用時間延緩物質(zhì)，諸如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。
口服使用的制劑還可以作為硬明膠膠囊存在，其中活性成分與惰性固體稀釋劑如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合，或者作為軟明膠膠囊存在，其中活性成分與水或油性介質(zhì)如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。
水性混懸液在與適于制備水性混懸液的賦形劑的混合物中含有活性物質(zhì)。這樣的賦形劑是混懸劑，例如羧甲基纖維素、甲基纖維素、羥丙基-甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、西黃蓍膠和阿拉伯樹膠；分散或濕潤劑可以是天然存在的磷脂如卵磷脂，或烯化氧與脂肪酸的縮合產(chǎn)物如聚氧乙烯硬脂酸酯，或環(huán)氧乙烷與長鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物如十七烷基乙烯氧基十六烷醇，或環(huán)氧乙烷與衍生于脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合物諸如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，或環(huán)氧乙烯與衍生于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物如聚乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。所述水性混懸液還可以包含一種或多種防腐劑如乙基、或正丙基對羥基苯甲酸，一種或多種著色劑，和一種或多種甜味劑諸如蔗糖或糖精。
油性混懸液可以通過將活性成分懸浮在植物油如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油或者懸浮在礦物油諸如液體石蠟中而配制。油性混懸液可以含有增稠劑如蜂蠟、硬石蠟或十六烷醇?？梢约尤胩鹞秳┖驼{(diào)味劑以提供可口的口服制劑。這些組合物可以通過加入抗氧化劑諸如抗壞血酸而保存。
適于通過加入水而制備水性混懸液的分散粉劑和粒劑，在與分散劑或濕潤劑、混懸劑和一種或多種防腐劑的混合物中提供活性成分。適當?shù)姆稚┗驖駶檮┗蚧鞈覄┩ㄟ^上文已經(jīng)提及的那些而示例。還可以存在其它賦形劑，例如甜味劑、調(diào)味劑和著色劑。
本發(fā)明的藥物組合物還可以是油-在-水的乳劑形式。油相可以是植物油或礦物油或這些油的混合物。適宜的乳化劑可以是天然存在的樹膠如阿拉伯樹膠或西黃蓍膠，天然存在的磷脂如大豆、卵磷脂，以及衍生于脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯如脫水山梨糖醇單油酸酯，以及所述偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。所述乳劑還可以含有甜味劑和調(diào)味劑。
糖漿和酏劑可以與甜味劑如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖一起配制。這樣的制劑還可以含有緩和劑、防腐劑和調(diào)味劑以及著色劑。所述藥物組合物可以是無菌注射水性或油質(zhì)混懸液的形式。
這種混懸液可以使用上文提及的那些適當?shù)姆稚┗驖駶檮┖突鞈覄┌凑找阎夹g(shù)進行配制。
無菌注射制劑還可以是在腸胃外適用的稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或混懸液，例如作為在1，3-丁二醇中的溶液。在可以應(yīng)用的可用載體和溶劑中，有水、Ringer′s溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，無菌的、不揮發(fā)的油可以便利地用作溶劑或混懸介質(zhì)。為了這一目的，可以應(yīng)用任何溫和的不揮發(fā)油，包括合成的單酸-或二脂酰甘油酯。另外，脂肪酸諸如油酸用于制備注射劑。
本發(fā)明分核酸分子還可以以栓劑形式施用，例如，用于藥物的直腸投藥。這些組合物可以通過將藥物與適當?shù)臒o刺激性賦形劑混合而制備，所述無刺激性賦形劑在常溫下是固體的但是在直腸溫度下是液體的，并且因此將在直腸中熔融而釋放所述藥物。這樣的物質(zhì)包括可可油和聚乙二醇。
本發(fā)明的核酸分子可以在無菌介質(zhì)中進行腸胃外施用。取決于所用的載體和濃度，藥物可以懸浮或者溶解在賦形劑中。有利地，佐劑諸如局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑可以溶解在載體中。
應(yīng)該理解，用于任何具體的受試者的具體的劑量水平取決于各種因素，包括所用的具體的化合物的活性、年齡、體重、綜合健康、性別、飲食、施用時間、施用途徑、和排泄速度、藥物組合以及正在進行治療的具體疾病的嚴重性。
對于施用給非人動物，組合物還可以添加到動物飼料或飲用水中?？梢苑奖愕嘏渲苿游镲暳虾惋嬘盟M合物，以便動物在其飲食中攝取治療適當量的組合物。還可以方便地將所述組合物作為添加到飼料或引用水中的預(yù)混合料存在。
本發(fā)明的核酸分子還可以與其它治療化合物組合施用給受試者，以提高綜合治療效果。應(yīng)用多種化合物治療一種指征可以增加有利效果而減少副作用的存在。
備選地，本發(fā)明的某些siNA分子可以在細胞內(nèi)從真核啟動子表達。能夠表達siNA分子的重組載體可以被遞送到并且保持在目標細胞內(nèi)。備選地，可以使用提供核酸分子的瞬時表達的載體。當需要時，這樣的載體可以重復(fù)施用。一旦表達，所述siNA分子與靶點mRNA相互作用，并且產(chǎn)生RNAi反應(yīng)。SiNA分子表達載體的遞送可以是全身的，諸如通過靜脈內(nèi)或肌內(nèi)施用，通過施用給從受試者移植的靶點細胞然后再引入受試者，或者通過允許引入需要的靶點細胞的任何其它方法進行遞送。
動物研究新西蘭兔是用來研究IOP的實驗平臺中的金標準。它易于操作并且它具有大眼睛，在大小上類似于人的器官。另外，測量IOP的現(xiàn)有裝備不適于用在具有小眼睛的動物諸如小鼠或大鼠中。最后，兔具有IOP(約23mmHg)，其可以利用局部商業(yè)的低血壓的藥物療法降低直到它的值的40％。因而，雖然可以產(chǎn)生兔青光眼模型(例如，外科阻塞鞏膜靜脈或人為閉塞所述小梁網(wǎng))，本發(fā)明發(fā)明人已經(jīng)使用了正常血壓的兔，因為，在本發(fā)明發(fā)明人手中，可以容易并可重復(fù)地測量IOP的藥理學(xué)降低。
實驗規(guī)程使用正常血壓的新西蘭白兔(雄性，2-3kg)。將所述動物保存在具有食物和水自由入口的單獨籠中。將它們進行人為的12小時光/暗循環(huán)，以避免IOP的不受控制的晝夜擺動。依照European Communities CouncilDirective(86/609/EEC)和Association for Research in Vision andOphthalmology關(guān)于Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research的聲明進行動物操作和治療。
典型地通過在角膜表面上滴入小體積(一般是40μL)施用所述藥物。將對側(cè)的眼單獨用載體處理并且可以用作各自實驗中的對照，以免對于另一只眼存在交感現(xiàn)象。應(yīng)當取消在相同動物中的多重實驗。
利用接觸眼壓計(TONOPEN XL，Mentor，Norwell，Massachusetts)進行IOP測量。TonoPen眼壓計是很方便的，這是由于它的可靠性和小尺寸。將所述眼壓計的傳感器精巧地施加到角膜表面進行該儀器的測量。已經(jīng)證明這裝置是用于在兔中測量3至30mm Hg范圍內(nèi)的眼內(nèi)壓所選擇的眼壓計(Abrams等，1996)。全部測量屬于這個時間間隔眼內(nèi)壓的平均基線值是17.0±0.39mm Hg(n＝100)。因為IOP從夜間至白晝改變，所以全部實驗是同時進行的以容許IOP更穩(wěn)定并且容許與載體處理的客觀比較。為了避免使所述動物受苦，將兔局部麻醉(oxibuprocaine/丁卡因，0.4％/1％，在鹽溶液中(1/4體積比)。將所述溶液施用(10μl)至所述角膜，之后進行眼內(nèi)壓的各自測量。將siRNA或鹽水以40μl的體積局部施用至所述角膜。
用于在兔中的siRNA施用的標準規(guī)程如下。在四個連續(xù)日期間，每天將終體積為40μl的siRNA在鹽溶液(0.9％重量/體積)的劑量施用至一個眼。將相對的眼作為對照并且在相同的時間點將40μl的無菌鹽水(0.9％重量/體積)滴在其上。在各自施用以前測量IOP并且在10天期間在滴注之后的2h、4h和6h測量。在第二和第三天之間觀察到最大反應(yīng)。為了比較siRNA與其它減血壓化合物的效果，檢定了Xalatan(拉坦前列素0.005％)和Trustop(多佐胺2％)并且在相同條件下測量眼內(nèi)壓。
結(jié)果實施例1體外檢定。
為了利用RNAi技術(shù)確定涉及青光眼的不同目標的抑制，第一步是在細胞培養(yǎng)中進行實驗。對于每個目標，根據(jù)前述的規(guī)則利用特定的軟件設(shè)計數(shù)個siRNAs。將所述siRNAs應(yīng)用于細胞培養(yǎng)，諸如NPE、OMDC和HEK293。根據(jù)標準規(guī)程，通過實時PCR和半定量的PCR分析siRNAs對所述目標基因的效果。利用肌動蛋白作為持家基因?qū)⑺龌蚰繕宿D(zhuǎn)錄水平是標準化。下面的表I顯示對于上述一些目標基因的實時PCR實驗的代表性結(jié)果。所述值表示siRNA對每個基因表達干涉的曾經(jīng)與對照細胞進行標準化的百分比的平均值和它們的標準偏差。相比于所述對照細胞，在24和48h時間點的不同轉(zhuǎn)錄水平都在siRNA治療以后顯著減少。在所述表中包括一些測試的不同siRNAs和在所述目標基因干涉中的不同功效。表中所用的siRNAs相應(yīng)于圖2中給出的所列人siRNA目標，如下。
AC2siRNA1對于人SEQ.ID.73同源的兔序列siRNA2對于人SEQ.ID.54相同的兔序列siRNA3對于人SEQ.ID.66相同的兔序列PTGS1siRNA1對于人SEQ.ID.353同源的兔序列siRNA2對于人SEQ.ID.369同源的兔序列PTGS2siRNA1對于人SEQ.ID.426相同的兔序列siRNA2對于人SEQ.ID.421同源的兔序列siRNA3對于人SEQ.ID.477同源的兔序列
表IsiRNA治療減少目標基因轉(zhuǎn)錄水平。從用不同siRNA治療24和48h的細胞制備RNA。通過實時PCR利用特定引物分析所述樣品。所述值顯示不同轉(zhuǎn)錄物相對于細胞對照的平均表達水平，所述轉(zhuǎn)錄物標準化至肌動蛋白。
圖3顯示用于一些上述目標的一些典型的半定量的凝膠。每個目標基因的基因表達的減少取決于siRNA沉默中的效率。對于每個目標，將通過體外研究獲得的最有效的siRNA施用至所述動物模型。從用不同siRNAs治療的細胞制備RNA。利用特定的引物通過半定量的PCR分析所述樣品。所述圖顯示對于β腎上腺素能受體2表達(A)及其它對于乙酰膽堿酯酶表達(B)的典型半定量的凝膠。MMW標記物；C對照細胞；TC轉(zhuǎn)染對照；1siRNA1；2siRNA2；3siRNA；NC陰性對照。每個目標的表達水平取決于siRNA沉默中的功效。在所述圖中使用的siRNAs相應(yīng)于圖2中給出的人目標，如下板A(β腎上腺素能受體2)1對于人SEQ.ID.122同源的兔序列2對于人SEQ.ID.125相同的兔序列3對于人SEQ.ID.139同源的兔序列板B(乙酰膽堿酯酶)1對于人SEQ.ID.162同源的兔序列2對于人SEQ.ID.177同源的兔序列實施例2體內(nèi)檢定。
在siRNA治療應(yīng)用之前，確認體內(nèi)檢定以確定正確的siRNA遞送。
將那些通過體外檢定選擇的siRNAs應(yīng)用到動物模型，接著是上面描述的規(guī)程。為了避免由于晝夜節(jié)律循環(huán)引起的IOP波動的效果，同時進行全部施用。為了確定siRNA效果，如前面提到的那樣測量眼內(nèi)壓(IOPs)。
因為青光眼病理學(xué)提出眼內(nèi)壓的增加，所以目的是獲得在siRNA施用之后眼內(nèi)壓水平的減少。
與對照和同樣用商業(yè)藥物(拉坦前列素和多佐胺)相比，對于不同目標的大部分結(jié)果顯示IOP水平的顯著減小并且用載體單獨處理的動物(陰性對照)在它們的IOP基線中不存在任何顯著的變化。所述數(shù)據(jù)概括在表II中，其中值表示在siRNA治療以后曾經(jīng)標準化的IOP減少的最大百分比的平均值和它們的標準偏差。IOP的減小對于全部治療目標是統(tǒng)計上顯著的。這些結(jié)果表明siRNAs和商業(yè)的藥物以類似的方式起作用，減少IOP水平約20％，雖然siRNAs還存在更保持的效果。沿著所述實驗規(guī)程，沒有在所述動物中觀察到副作用。用于這些實驗的siRNAs相應(yīng)于圖2中給出的人目標如下AC2對于人SEQ.ID.73同源的兔序列AC4對于人SEQ.ID.5相同的兔序列AC12對于人SEQ.ID.522相同的兔序列ADRB1對于人SEQ.ID.105相同的兔序列ADRB2對于人SEQ.ID.139同源的兔序列ADRA1A對于人SEQ.ID.546同源的兔序列ADRA1B對于人SEQ.ID.619同源的兔序列ACHE對于人SEQ.ID.189同源的兔序列PTGS1對于人SEQ.ID.322同源的兔序列PTGS2對于人SEQ.ID.426相同的兔序列SELE對于人SEQ.ID.262同源的兔序列ACE1對于人SEQ.ID.866同源的兔序列AGTR1對于人SEQ.ID.705同源的兔序列AGTR2對于人SEQ.ID.774相同的兔序列ATP1A1對于人SEQ.ID.1399相同的兔序列ATP1B2對于人SEQ.ID.1820相同的兔序列
表IIsiRNAs對血壓正常的新西蘭兔中的IOP還原的影響。所述值表示對所述對照(僅有載體的對側(cè)的眼)的IOP還原的百分比的均值和它們的標準誤差(SEM)。
參考文獻Abrams LS，Vitale S，Jampel HD.Comparison of three tonometers for measuringintraocular pressure in rabbits.Invest Ophthalmol Vis Scl.1996 Apr；37(5)940-4.
Akashi H，Miyagishi M，Taira K.Suppression of gene expression by RNAinterference in cultured plant cells.Antisense Nucleic Acid Drug Dev，2001，11(6)359-67.
Banerjee D，Slack F.Control of developmental timing by small temporal RNAsaparadigm for RNA-mediated regulation of gene expression.Bioessays，2002，24(2)119-29.
Bhattacharya SK，Annangudi SP，Salomon RG，Kuchtey RW，Peachey NS，CrabbJW.Cochlin deposits in the trabecular meshwork of the glaucomatous DBA/2Jmouse.Exp Eye Res.2005a May；80(5)741-4.
Bhattacharya SK，Rockwood E1，Smith SD，Bonilha VL，Crabb JS，Kuchtey RW，Robertson NG，Peachey NS，Morton CC，Crabb JW.Proteomics reveal Cochlindeposits associated with glaucomatous trabecuiar meshwork.J Biol Chem.2005b Feb 18；280(7)6080-4.Epub 2004 Dec 3.
Bosher JM，Labouesse M.RNA interferencegenetic wand and geneticwatchdog.Nat Cell Biol，2000，2(2)E31-6.
Braasch DA，Corey DR.Novel antisensa and peptide nucleic acid strategies forcontrolling gene expression.Biochemistry，2002，41(14)4503-10Bunce C，Hitchings RA，Van Duijn CM，De Jong PT，Vingerling JR.Associationsbetween the deletion polymorphism of the angiotensin 1-converting enzymegene and ocular signs-of primary open-angle glaucoma.Graefes Arch Clin ExpOphthalmol.2005Apr；243(4)294-9.Epub 2004 Oct 13.
Caplen，N.J.，Parrish，S.，Imanl，F(xiàn).，F(xiàn)ire，A.& Morgan，R.A.Spedfic inhibition ofgene expression by small double stranded RNAs in invertebrate and vertebratesystems.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2001，989742-9747.
Costagllola C，Verolino M，De Rosa ML，Iaccarino G，Ciancaglini M，Mastropasqua L.Effect of oral losartan potassium administration on intraocularpressure in normotensive and glaucomatous human subjects.Exp Eye Res.2000 Aug；71(2)167-71.
Costagliola C，Di Benedetto R，De Caprio L，Verde R，Mastropasqua L.Effect oforal captopril(SQ 14225)on intraocular pressure in man.Eur J Ophthalmol.1995 Jan-Mar；5(1)19-25.
Cullinane AB，Leung PS，Ortego J，Coca-Prados M，Harvey BJ.Renin-angiotensinsystem expression and secretory function in cultured human ciliary body non-pigmented epithelium.Br J Ophthalmol.2002 Jun86(6)676-83.
E1bashir SM，Lendeckel W，Tuschl T.RNA interference is mediated by 21-and22-nucleotide RNAs.Genes Dev，2001，15(2)188-200.
Fire A，Xu S，Montgomery MK，Kostas SA，Driver SE，Mello CC.Potent andspecific genetic interference by double stranded-RNA in Caenorhabditis elegans.Nature，1998，391(6669)806-11.
Ge Q，McManus MT，Nguyen T，Shen CH，Sharp PA，Eisen HN，Chen J.RNAinterference of influenza virus production by directly targeting mRNA fordegradation and indirectly inhibiting all viral RNA transcription.Proc Natl AcadSci U S A.，2003；100(5)2718-23.
Gil J，Esteban M.Induction of apoptosis by the dsRNA-dependent protein kinase(PKR)mechanism of action.Apoptosis，2000，5(2)107-14.
Grosshans H，Slack FJ.Micro-RNAssmall is plentiful；J Call Biol，2002，156(1)17-21.
Hara H，Ichikawa M，Oku H，Shimazawa M，Araie M.Bunazosin，a seiectivealpha1-adrenoceptor antagonist，as an anti-glaucoma drugeffects on ocularcirculation and-retinal neuronal damage.Cardiovasc Drug Rev.2005Spring；23(1)43-56.
Khaw PT，Shah P，Elkington AR.Glaucoma-1diagnosis.BMJ，2004a，32897-9.Khaw PT，Shah P，Elkington AR.Glaucoma-2treatment.BMJ，2004b，328156-8.
Osborne NN，Chidlow G，Wood J，Casson R.Some current ideas on thepathogenesis and the role of neuroprotection in glaucomatous opticneuropathy.Eur J Ophthalmol.2003 Apr；13 Suppl 3S19-26.Paddison PJ，Caudy AA，Bernstein E，Hannon GJ，Conklin DS.Short hairpinRNAs(shRNAs)Induce sequence-specific silencing in mammalian cells.GenesDev，2002，16(8)948-58.
Sakaguchi H，Takal S，Sakaguchi M，Sugiyama T，Ishihara T，Yao Y，Miyazaki M，Ikeda T.Chymase and angiotensin converting enzyme activities in a hamstermodel of glaucoma filtering surgery.Curr Eye Res.2002 May；24(5)325-31.
Shah GB，Sharma S，Mehta AA，Goyal RK.Oculohypotensive effect ofangiotensin-converting enzyme inhibitors in acute and chronic models ofglaucoma.J Cardiovasc Pharmacol.2000 Aug；36(2)169-75.
Tuschl T，Zamore PD，Lehmann R，Bartel DP，Sharp PA.Targeted mRNAdegradation by double-stranded RNA in vitro.Genes Dev.，1999；13(24)3191-7.
Wang RF，Podos SM，Mittag TW，Yokoyoma T.Effect of CS-088，an angiotensinAT1 receptor antagonist，on intraocular pressure in glaucomatous monkey eyes.Exp Eye Res.2005 May；80(5)629-32.Epub 2005 Jan 4.
Wianny F，Zemicka-Goetz M.Specific interference with gene function bydouble-stranded RNA in early mouse development Nat Cell Biol，2000，2(2)70-5.
Williams BR.Role of the double-stranded RNA-activated protein kinase(PKR)incell regulation.Biochem Soc Trans，1997，25(2)509-13.
Wirtz MK，Samples JR.The genetic loci of open-angle glaucoma.OphthalmolClin North Am.2003 16505-14.
權(quán)利要求
1.siNA在藥物制備中的用途，所述藥物用于治療眼病癥的方法中，所述方法包含目標基因在需要治療的患者中的減量表達，所述基因選自包含眼房水形成基因和眼房水流出基因的組。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述眼病癥的特征在于所述患者中改變的眼內(nèi)壓(IOP)。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述眼病癥選自包含青光眼，感染；炎癥，葡萄膜炎，和全身疾病的表達的組。
4.任何在前權(quán)利要求的用途，其中所述眼病癥是青光眼。
5.任何在前權(quán)利要求的用途，其中所述眼病癥是糖尿病性視網(wǎng)膜病。
6.任何在前權(quán)利要求的用途，其中所述目標基因表達在所述患者眼睛中是下調(diào)的。
7.任何在前權(quán)利要求的用途，其中所述目標基因選自包含下列基因的組碳酸酐酶II、IV和XII；腎上腺素能受體β1和2以及α1A、1B和1D；乙酰膽堿酯酶；環(huán)加氧酶1和2；腺苷三磷酸酶α1、α2、α3、β1、β2；內(nèi)皮性白細胞粘著分子I(ELAM-I)；血管緊張素系統(tǒng)血管緊張素II，血管緊張素II轉(zhuǎn)化酶類(ACE I和ACE II)，血管緊張素II受體(ATR1和ATR2)和腎素；Cochlin。
8.任何在前權(quán)利要求的用途，其中所述siNA是siRNA。
9.權(quán)利要求8的用途，其中所述siRNA是dsRNA。
10.權(quán)利要求8的用途，其中所述siRNA是shRNA。
11.任何在前權(quán)利要求的用途，其中所述siNA包含修飾的寡核苷酸。
12.任何在前權(quán)利要求的用途，其中將所述siNA局部施用至患者的眼睛。
13.權(quán)利要求12的用途，其中將所述siNA施用至患者的角膜。
14.任何在前權(quán)利要求的用途，其中使用多個種類的siNA。
15.權(quán)利要求14的用途，其中所述多個種類是靶向相同mRNA種類的。
16.權(quán)利要求14的用途，其中所述多個種類是靶向不同mRNA種類的。
17.任何在前權(quán)利要求的用途，其中所述siNA是靶向選自SEQ ID 1至SEQ ID 1829的序列的。
18.權(quán)利要求17的用途，其中所述目標基因是碳酸酐酶IV，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 1至SEQ ID 46的序列的。
19.權(quán)利要求17的用途，其中所述目標基因是碳酸酐酶II，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 47至SEQ ID 98的序列的。
20.權(quán)利要求17的用途，其中所述目標基因是β腎上腺素能受體1，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 99至SEQ ID 109的序列的。
21.權(quán)利要求17的用途，其中所述目標基因是β腎上腺素能受體2，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 110至SEQ ID 160的序列的。
22.權(quán)利要求17的用途，其中所述目標基因是乙酰膽堿酯酶，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 161至SEQ ID 190的序列的。
23.權(quán)利要求17的用途，其中所述目標基因是ELAM-1(選擇蛋白E)，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 191至SEQ ID 318的序列的。
24.權(quán)利要求17的用途，其中所述目標基因是前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 319至SEQ ID 374的序列的。
25.權(quán)利要求17的用途，所述目標基因是前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 375至SEQ ID 491的序列的。
26.權(quán)利要求17的用途，所述目標基因是碳酸酐酶XII，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 492至SEQ ID 538的序列的。
27.權(quán)利要求17的用途，所述目標基因是α腎上腺素能受體1A，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 539至SEQ ID 598的序列的。
28.權(quán)利要求17的用途，所述目標基因是α腎上腺素能受體1B，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 599至SEQ ID 634的序列的。
29.權(quán)利要求17的用途，所述目標基因是腎上腺素能受體1D，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 635至SEQ ID 646的序列的。
30.權(quán)利要求17的用途，所述目標基因是血管緊張素原，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 647至SEQ ID 694的序列的。
31.權(quán)利要求17的用途，所述目標基因是血管緊張素II受體類型1，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 695至SEQ ID 749的序列的。
32.權(quán)利要求17的用途，所述目標基因是血管緊張素II受體類型2，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 750至SEQ ID 807的序列的。
33.權(quán)利要求17的用途，所述目標基因是血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶1，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 808至SEQ ID 939的序列的。
34.權(quán)利要求17的用途，所述目標基因是血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶2，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 940至SEQ ID 1139的序列的。
35.權(quán)利要求17的用途，所述目標基因是腎素，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 1140至SEQ ID 1196的序列的。
36.權(quán)利要求17的用途，所述目標基因是cochlin，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 1197至SEQ ID 1307的序列的。
37.權(quán)利要求17的用途，所述目標基因是腺苷三磷酸酶α1，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 1308至SEQ ID 1500的序列的。
38.權(quán)利要求17的用途，所述目標基因是腺苷三磷酸酶α2，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 1501至SEQ ID 1606的序列的。
39.權(quán)利要求17的用途，所述目標基因是腺苷三磷酸酶α3，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 1607至SEQ ID 1705的序列的。
40.權(quán)利要求17的用途，所述目標基因是腺苷三磷酸酶β1，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 1706至SEQ ID 1780的序列的。
41.權(quán)利要求17的用途，所述目標基因是腺苷三磷酸酶β2，并且所述siNA是靶向選自SEQ ID 1780至SEQ ID 1829的序列的。
42.一種眼病癥的治療方法，所述方法包含施用siNA而在患者中下調(diào)目標基因的表達，所述目標基因選自包含眼房水形成基因和眼房水流出基因的組。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述眼病癥選自包含青光眼，感染；炎癥，葡萄膜炎，和全身疾病的表達的組。
44.權(quán)利要求42的方法，其中所述眼病癥是青光眼。
45.權(quán)利要求42的方法，其中所述眼病癥是糖尿病性視網(wǎng)膜病。
46.權(quán)利要求42的方法，其中所述目標基因選自包含下列基因的組碳酸酐酶II、IV和XII；腎上腺素能受體β1和2以及α1A、1B和1D；乙酰膽堿酯酶；環(huán)加氧酶1和2；腺苷三磷酸酶α1、α2、α3、β1、β2；內(nèi)皮性白細胞粘著分子I(ELAM-I)；血管緊張素系統(tǒng)血管緊張素II，血管緊張素II轉(zhuǎn)化酶類(ACE I和ACE II)，血管緊張素II受體(ATR1和ATR2)和腎素；Cochlin。
47.權(quán)利要求42的方法，其中所述siNA是siRNA。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述siRNA是dsRNA。
49.權(quán)利要求47的方法，其中所述siRNA是shRNA。
50.權(quán)利要求42的方法，其中所述siNA包含修飾的寡核苷酸。
51.一種用于眼病癥治療的分離的siNA分子，其特征在于在所述患者中改變的眼內(nèi)壓(IOP)，所述siNA對于選自SEQ ID 1至SEQ ID 1829的核苷酸序列是互補的。
52.分離的siNA分子在制備用于眼病癥治療的藥物中的用途，所述分子具有對于選自SEQ ID 1至SEQ ID 1829的核苷酸序列互補的序列。
53.一種藥物組合物，所述組合物包含具有對于選自SEQ ID 1至SEQID 1829的核苷酸序列互補的序列的siNA。
全文摘要
公開了利用RNA干涉用于治療眼病癥的序列和規(guī)程。目標基因選自負責(zé)眼房水流動或眼房水流出的那些，而特別優(yōu)選的要治療的病癥包括青光眼和葡萄膜炎。
文檔編號A61P27/06GK101076590SQ200580036349
公開日2007年11月21日 申請日期2005年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月23日
發(fā)明者安娜·I·希門尼斯, 安吉拉·塞斯托, 何塞·P·羅曼, 伊雷妮·加斯孔, 貢薩洛·岡薩雷斯·德·布伊特拉格 申請人:西倫蒂斯私人股份公司