專(zhuān)利名稱(chēng)：包含栗精胺的組合抗病毒組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開(kāi)內(nèi)容主要涉及傳染病的治療，更具體而言，涉及應(yīng)用栗精胺組合抗病毒化合物治療或阻止由Flaviviridae引起或與其相關(guān)的感染，特別是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的或與其相關(guān)的感染。
背景技術(shù)：
黃病毒群包括許多人類(lèi)疾病和造成畜牧業(yè)重大損失的多種動(dòng)物疾病的病原體。黃病毒科(family Flaviviridae，其成員在本文中稱(chēng)為黃病毒)包括黃病毒屬(Flavivirus)(例如黃熱病病毒、登革熱病毒、日本腦炎病毒和蜱傳腦炎病毒)；瘟病毒屬(Pestivirus)(例如牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、典型性豬瘟病毒和邊界病病毒)；丙肝病毒屬(Hepacivirus)(例如丙型肝炎病毒)；和目前未分類(lèi)的Flaviviridae成員(例如，GB病毒A、B和C型)。Flaviviridae的成員由病毒分類(lèi)學(xué)國(guó)際委員會(huì)詳細(xì)描述(目前接受的分類(lèi)定義的描述見(jiàn)Virus TaxonomyThe Classificationand Nomenclature of Viruses(病毒分類(lèi)病毒的分類(lèi)和命名法)。病毒分類(lèi)學(xué)國(guó)際委員會(huì)(the International Committee on Taxonomy of Viruses)第七次報(bào)告，van Regenmortel等人，學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥(2000)，以上內(nèi)容在此引入作為參考)。
具有臨床意義的Flaviviridae科成員為丙型肝炎病毒(HCV)。HCV在1989年第一次鑒定，是急性肝炎的主要病因，并引起輸血后非甲、非乙型肝炎的多數(shù)病例。此外，HCV是慢性肝病的主要病因，包括硬化和肝癌(Hoofnagle，Hepatology 2615S，1997)。世界衛(wèi)生組織估計(jì)170,000,000人慢性感染HCV。每年約3-4百萬(wàn)人新感染，這些感染患者的80-85％發(fā)展為慢性感染，這些慢性感染患者的約20-30％發(fā)展為硬化和晚期肝病，常并發(fā)肝細(xì)胞癌(HCC)(參見(jiàn)，例如Kolykhalov et al，J.Virol.742046，2000)。
HCV為有被膜的正鏈RNA病毒。基因組在5′和3′端具有非翻譯區(qū)(NTR)，形成穩(wěn)定的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。5′N(xiāo)TR具有內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，其允許核糖體直接結(jié)合在接近于開(kāi)放閱讀框架的起始密碼子處。因此，HCV RNA的翻譯由IRES介導(dǎo)，而不是典型的用于翻譯細(xì)胞mRNA的CAP依賴(lài)機(jī)制。
HCV基因組包含單個(gè)長(zhǎng)的開(kāi)放閱讀框架，其編碼約3000個(gè)氨基酸殘基的多聚蛋白質(zhì)。該多聚蛋白質(zhì)在翻譯時(shí)和在翻譯后被加工成為至少10種不同的產(chǎn)物，包括兩種N連接的糖基化蛋白E1和E2。在多聚蛋白質(zhì)中，切割產(chǎn)物的順序如下核心(C)、外殼蛋白1(E1)、E2、p7(可能是形成離子通道的多肽)、非結(jié)構(gòu)蛋白2(NS2)、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。核心蛋白為強(qiáng)堿性RNA結(jié)合蛋白，形成核殼體的主要成分。外殼蛋白E1和E2為高度糖基化的1型膜蛋白，通過(guò)羧基端區(qū)域錨定。它們嵌入到病毒微粒的脂質(zhì)被膜上，并結(jié)合形成穩(wěn)定的異源二聚體。非結(jié)構(gòu)蛋白涉及病毒復(fù)制并具有蛋白酶(NS2/NS3)、解螺旋酶(NS3)和RNA聚合酶活性(NS5B)。HCV結(jié)合到宿主細(xì)胞可能需要E2或E1/E2復(fù)合體與存在于細(xì)胞表面的受體相互作用。
對(duì)HCV顆粒組裝機(jī)制的了解是有限的。缺乏復(fù)合聚糖、表達(dá)的HCV糖蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)內(nèi)以及細(xì)胞表面缺乏這些蛋白，這些合起來(lái)都暗示了初始病毒粒子形態(tài)形成的發(fā)生是通過(guò)從ER出芽形成細(xì)胞內(nèi)囊泡進(jìn)行。此外，成熟的E1-E2異源二聚體不離開(kāi)ER，以及在E1和E2的C端區(qū)域已鑒定出ER保留信號(hào)。因此，病毒通過(guò)固有分泌路徑被排出。與這種假設(shè)一致，復(fù)合的N連接的聚糖在部分純化病毒顆粒的表面發(fā)現(xiàn)，暗示了病毒通過(guò)高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)。
直到最近，干擾素-α(IFN-α)是證實(shí)有益于治療HCV感染的僅有的療法。約50％的病人對(duì)用IFN-α治療表現(xiàn)初始反應(yīng)，但這些反應(yīng)在多數(shù)病人中是不可忍受的，病人經(jīng)受相當(dāng)大的伴生的副作用。治療HCV感染的現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)是IFN-α與核苷類(lèi)似物利巴韋林(ribavirin)一起給藥。然而，鑒定具有更為有效的抗病毒活性和較少的不希望有的副作用的治療候選物是有必要的。
因此，亟需鑒定和開(kāi)發(fā)具有增強(qiáng)的抗病毒活性和減少的毒性的抗Flaviviridae藥劑，以及特別是治療HCV的治療劑。本發(fā)明滿(mǎn)足這些需要，并進(jìn)一步提供了其他相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明概述本發(fā)明主要提供了用于治療或阻止例如Flaviviridae感染(如由丙型肝炎病毒(HCV)引起的感染)的栗精胺(castanospermine)組合物。具體地，本公開(kāi)內(nèi)容提供了栗精胺與其他抗Flaviviridae的化合物的組合，其提供了抗HCV的意想不到的高或協(xié)同的抑制活性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療Flaviviridae感染的方法，包括給予個(gè)體栗精胺、或其藥物可接受的鹽，以及改變免疫功能的藥劑。在另外的實(shí)施方案中，提供了治療Flaviviridae感染的方法，包括給予個(gè)體栗精胺、或其藥物可接受的鹽，以及改變Flaviviridae科病毒復(fù)制的藥劑。在某些實(shí)施方案中，所述個(gè)體為人。在其他的某些實(shí)施方案中，F(xiàn)laviviridae科的病毒為黃病毒屬(genus Flavivirus)的成員，其可以為Hepacivirus，其中該Hepacivirus為丙型肝炎病毒(HCV)，或所述病毒為瘟疫毒屬(genus Pestivirus)的成員。在另外的特定的實(shí)施方案中，改變免疫功能的藥劑為干擾素，如干擾素-α；在特定的實(shí)施方案中，干擾素-α被聚乙二醇化。本發(fā)明還提供了如下方法其中栗精胺和改變免疫功能的藥劑順序給藥(其中，栗精胺先于改變免疫功能的藥劑給藥，或改變免疫功能的藥劑先于栗精胺給藥)，或栗精胺和改變免疫功能的藥劑同時(shí)給藥。在另外的實(shí)施方案中，栗精胺和改變免疫功能的藥劑被混和成單一組合物并同時(shí)給藥。在另外的實(shí)施方案中，所述方法包括給予個(gè)體(a)包含栗精胺和藥物可接受的載體的組合物，和(b)包含改變免疫功能的藥劑和藥物可接受的載體的組合物。
在另外的實(shí)施方案中，改變病毒復(fù)制的藥劑為利巴韋林或?yàn)楦蓴_素，如干擾素-α，在特定的實(shí)施方案中，干擾素-α被聚乙二醇化。本發(fā)明還提供了如下方法其中栗精胺和改變病毒復(fù)制的藥劑順序給藥(其中，栗精胺先于改變病毒復(fù)制的藥劑給藥，或改變病毒復(fù)制的藥劑先于栗精胺給藥)，或栗精胺和藥劑同時(shí)給藥。在另外的實(shí)施方案中，栗精胺和改變病毒復(fù)制的藥劑被混和成單一組合物并同時(shí)給藥。在另外的實(shí)施方案中，所述方法包括給予個(gè)體(a)包含栗精胺和藥物可接受的載體的組合物，和(b)包含改變病毒復(fù)制的藥劑和藥物可接受的載體的組合物。
本發(fā)明還提供了治療Flaviviridae感染的方法，包括給予個(gè)體栗精胺、或其藥物可接受的鹽，以及改變免疫功能的藥劑，其中栗精胺和改變免疫功能的藥劑協(xié)同地互相作用。在另外的實(shí)施方案中，提供了治療Flaviviridae感染的方法，包括給予個(gè)體栗精胺、或其藥物可接受的鹽，以及改變病毒復(fù)制的藥劑，其中栗精胺和改變病毒復(fù)制的藥劑協(xié)同地互相作用。
本文還提供了治療Flaviviridae感染的方法，包括栗精胺與如下物質(zhì)組合抑制細(xì)胞被Flaviviridae感染的藥劑；抑制病毒RNA從病毒衣殼中釋放或抑制Flaviviridae基因產(chǎn)物的功能的化合物；改變Flaviviridae復(fù)制的化合物；改變免疫功能的化合物；改變Flaviviridae感染癥狀的化合物；或治療Flaviviridae相關(guān)感染的化合物。在某些實(shí)施方案中，改變免疫功能的化合物為干擾素，如干擾素-α，在特定的實(shí)施方案中，干擾素-α被聚乙二醇化。在特定的實(shí)施方案中，改變Flaviviridae病毒復(fù)制的化合物為利巴韋林或干擾素-α。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)laviviridae相關(guān)感染為乙型肝炎病毒(HCB)感染或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒感染為人免疫缺陷病毒感染(HIV)。
本文還提供了治療Flaviviridae感染的方法，包括給予個(gè)體栗精胺、或其藥物可接受的鹽，以及干擾素。在某些實(shí)施方案中，干擾素為干擾素-α，在特定的其他實(shí)施方案中，干擾素-α被聚乙二醇化。在一個(gè)實(shí)施方案中，栗精胺和干擾素協(xié)同地互相作用。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A和1B分別以三維和二維表示干擾素-α2b(IFN-α)和栗精胺(Cast)對(duì)MDBK細(xì)胞的協(xié)同作用，所述MDBK細(xì)胞被BVDV以0.01的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染。水平面(相加性表面)之上的正％顯示了可觀察到協(xié)同作用的區(qū)域和相應(yīng)的藥物濃度。從亮到暗的灰色梯度顯示了協(xié)同作用的水平。
圖2表示圖1所顯示數(shù)據(jù)的等效線(xiàn)圖解。
圖3A和3B分別以三維和二維表示利巴韋林(RBV)和栗精胺(Cast)對(duì)MDBK細(xì)胞的協(xié)同作用，所述MDBK細(xì)胞被BVDV以0.01的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染。水平面(相加性表面)之上的正％顯示了可觀察到協(xié)同作用的區(qū)域和相應(yīng)的藥物濃度。從亮到暗的灰色梯度顯示了協(xié)同作用的水平。
圖4表示圖3所顯示數(shù)據(jù)的等效線(xiàn)圖解。
圖5A和5B分別以三維和二維表示細(xì)胞病變分析結(jié)果，其中MDBK細(xì)胞被BVDV以0.01的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染，隨后暴露于干擾素-α2b(IFN-α)和栗精胺(Cast)。水平面(相加性表面)之下的負(fù)％顯示了細(xì)胞毒性不增加、甚至可能減少的區(qū)域和相應(yīng)的藥物濃度。從亮到暗的灰色梯度顯示了拮抗作用的水平(即未受影響的細(xì)胞毒性)。
圖6A和6B分別以三維和二維表示細(xì)胞病變分析結(jié)果，其中MDBK細(xì)胞被BVDV以0.01的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染，隨后暴露于利巴韋林(RBV)和栗精胺(Cast)。水平面(相加性表面)之下的負(fù)％顯示了細(xì)胞毒性不增加、甚至可能減少的區(qū)域和相應(yīng)的藥物濃度。從亮到暗的灰色梯度顯示了拮抗作用的水平(即未受影響的細(xì)胞毒性)。
發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明主要提供了組合物以及與另外的抗病毒化合物組合使用栗精胺治療或阻止傳染病的方法。具體地，這些組合物可用于治療或阻止Flaviviridae感染，如丙型肝炎病毒(HCV)感染。因此，本發(fā)明主要涉及驚人的發(fā)現(xiàn)，即栗精胺與另外的化合物組合具有抗HCV的意想不到的高活性，所述另外的化合物如干擾素-α(IFN-α、干擾素-α、alpha-干擾素或α-干擾素)或利巴韋林。因此，本發(fā)明的化合物例如可用于治療HCV感染和HCV相關(guān)的疾病，也可用于作為研究工具用于體外和基于細(xì)胞的分析來(lái)研究HCV感染的生物機(jī)制(例如復(fù)制和傳導(dǎo))。
作為背景，糖蛋白根據(jù)糖和蛋白質(zhì)氨基酸之間的鍵被分為兩大類(lèi)。最普遍的為蛋白質(zhì)的天冬酰胺和寡糖的N-乙?；?D-葡糖胺殘基之間的N-糖苷鍵。連接到多肽的主鏈后，N連接的寡糖由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中一系列特異的酶加工，這種加工途徑已很明確。
在ER中，α-葡萄糖苷酶I負(fù)責(zé)從前體寡糖除去末端α-1，2葡萄糖殘基，α-葡萄糖苷酶II除去兩個(gè)剩余的α-1，3連接的葡萄糖殘基，隨后由甘露糖苷酶除去甘露糖殘基，和進(jìn)一步的加工反應(yīng)涉及多種轉(zhuǎn)移酶。這些寡糖的“修整”反應(yīng)使得糖蛋白可正確折疊，并可與伴侶蛋白(如鈣聯(lián)接蛋白和鈣網(wǎng)織蛋白)相互作用以轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)高爾基體。
這種生物合成途徑中關(guān)鍵酶的抑制劑，尤其是那些阻止α-葡萄糖苷酶和α-甘露糖苷酶的抑制劑，阻止了一些有被膜病毒的復(fù)制。這些抑制劑可以通過(guò)干擾病毒被膜糖蛋白的折疊起作用，因此阻止了初始的病毒-宿主細(xì)胞相互作用或隨后的融合。這些抑制劑也可通過(guò)阻止完成病毒膜所需的適當(dāng)?shù)奶堑鞍椎男纬蓙?lái)阻止病毒復(fù)制。
例如，非特異性糖基化抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖和β-羥基-正纈氨酸抑制HIV糖蛋白的表達(dá)和阻止合胞體的形成(Blough et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.14133-38(1986))。用這些藥劑處理的HIV感染的細(xì)胞中病毒增殖停止，可能是由于不能獲得病毒膜形成所需的糖蛋白。糖基化抑制劑2-脫氧-2-氟-D-甘露糖通過(guò)阻止病毒膜蛋白的糖基化顯示了對(duì)流感感染的細(xì)胞的抗病毒活性(McDowell et al.，Biochemistry，248145-52(1985))。Lu等人提供了N連接的糖基化為乙型肝炎病毒分泌所需的證據(jù)(Virology 213660-665(1995))，Block等人證實(shí)人乙型肝炎病毒的分泌被亞氨基糖N-丁基脫氧野尻霉素所抑制(Proc.Natl Acad.Sci USA 912235-39(1994)，還參見(jiàn)，例如WO9929321)。
用在本文中時(shí)，除非另外說(shuō)明，任一濃度范圍、百分比范圍、比率范圍或整數(shù)范圍可理解為包括所列舉范圍內(nèi)的任一整數(shù)值，以及適合時(shí)還包括其分?jǐn)?shù)(如整數(shù)的十分之一和百分之一)。用在本文中時(shí)，除非另外說(shuō)明，“約”或“包含大體上”指所表明的值或范圍的±15％?！斑x擇”(例如“或”)的應(yīng)用應(yīng)理解為指或者一個(gè)、兩個(gè)或可選擇物的任何組合。
栗精胺如上所述，本發(fā)明提供了具有栗精胺、其藥物可接受的鹽的組合物及其應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)了含有與具有抗病毒活性的其它化合物或分子組合的栗精胺的組合物，或含有與改變宿主功能或反應(yīng)的其它化合物(如改變免疫功能或反應(yīng)的化合物)或分子組合的栗精胺的組合物，該組合具有意想不到的高抗病毒活性，特別是高抗Flaviviridae活性，如抗HCV。
栗精胺和某些亞氨基糖(如脫氧野尻霉素(DNJ))為ERα-葡萄糖苷酶的抑制劑，兩者都有效抑制糖蛋白形成的早期階段(參見(jiàn)，例如Ruprecht et al.，J.Acquir.Immune Defic.Syndr.2149-57(1989)；還參見(jiàn)，例如Whitby et al.，Antiviral Chem.Chemother.15141-51(2004)；Branza-Nichita et al.，J.Virol.753527-36(2001)；Courageot et al.，J.Virol75564-72(2000)；Choukhi et al.，J.Virol.723851-58(1998)；WO99/29321；WO 02/089780)。然而，抑制劑的效應(yīng)根據(jù)它們所應(yīng)用的系統(tǒng)而有很大不同，并且它們顯示了完全不同的特異性，栗精胺相對(duì)特異于α-葡糖苷I。
栗精胺是由黑豆和大葉榕栗樹(shù)(Castanospermum australe)衍生的天然生物堿(Hohenschutz et al，Phytochemistry 20811-14(1981))。栗精胺是水溶的，因而根據(jù)本領(lǐng)域常用的方法容易地分離(參見(jiàn)，例如AlexisPlatform，San Diego，CA)?；衔锏淖罡邼舛却嬖谟诜N子和種子莢中(Pan et al.，Arch.Biochem.Biophys.303134-44(1993))。除了抑制α-葡糖苷I的酶活性外，栗精胺還抑制腸內(nèi)糖苷酶，如麥芽糖酶和蔗糖酶，這導(dǎo)致了不希望的副作用(Saul et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8293-97(1985))。通過(guò)將個(gè)體的飲食改變?yōu)闊o(wú)淀粉、高葡萄糖飲食，可以最小化或阻止接受栗精胺的個(gè)體中的很多副作用(參見(jiàn)，例如上述Saul et al.)。
栗精胺具有下式
系統(tǒng)上，這個(gè)化合物可以幾種方式命名[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氫-1，6，7，8-中氮茚四醇或[1S，(1S，6S，7R，8R，8aR)-1，6，7，8-四羥基-吲哚里西啶(indolizidine)或1，2，4，8-四脫氧-1，4，8-次氮基-L-甘油-D-乳(galacto)-辛糖醇(octitol)。本文采用術(shù)語(yǔ)栗精胺或第一個(gè)系統(tǒng)命名。
藥物可接受的鹽指栗精胺或本文中描述的其它化合物的鹽，這種鹽是藥物可接受的并具有期望的藥理學(xué)(例如抗病毒)活性。這些鹽包括(1)酸加成鹽，與無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸形成，所述無(wú)機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述有機(jī)酸如醋酸、丙酸、己酸、環(huán)戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸、馬來(lái)酸、延胡索酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲?；?苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙烷-二磺酸、2-羥乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、4-甲基雙環(huán)[2.2.2]-八-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羥萘甲酸、水楊酸、硬脂酸、粘康酸等；或(2)存在于母體化合物中的酸性質(zhì)子被金屬離子(如堿金屬離子、堿土金屬離子或鋁離子)替代形成的鹽；或與有機(jī)堿(如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺和N-甲基葡糖胺等)配位形成的鹽。
結(jié)構(gòu)上純的化合物指如下的化合物組成構(gòu)成該組成的大部分百分比的單個(gè)分子，例如大約95％至100％的等級(jí)，優(yōu)選自約95％、96％、97％、98％、99％或更多起的范圍的單個(gè)分子，包含以相同的順序和相同的鍵互相連接的相同數(shù)量和類(lèi)型的原子。用在本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)上純的”無(wú)意區(qū)分相互不同的幾何異構(gòu)體或相互不同的光學(xué)異構(gòu)體。例如，順式和反式-丁-2，3-烯的混合物被認(rèn)為是結(jié)構(gòu)上純的，外消旋混合物也是如此。當(dāng)組合物旨在包含大部分百分比的單個(gè)幾何異構(gòu)體或光學(xué)異構(gòu)體時(shí)，分別使用術(shù)語(yǔ)“幾何學(xué)上純的”和“光學(xué)上或?qū)τ丑w上純的”。
術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)上純的”也無(wú)意區(qū)別不同的互變異構(gòu)體形式或分子的離子化狀態(tài)，或分子的其他形式，這些形式由平衡現(xiàn)象或其他可逆互變產(chǎn)生。因此，例如有機(jī)酸的組合物是結(jié)構(gòu)上純的，即使一些羧基基團(tuán)為質(zhì)子化狀態(tài)(COOH)，其他的為去質(zhì)子化狀態(tài)(COO-)。同樣地，除非另外明確說(shuō)明，包含酮和烯醇互變異構(gòu)體的組合物被認(rèn)為是結(jié)構(gòu)上純的。
治療制劑和應(yīng)用方法如本文所述，栗精胺，特別是與諸如改變免疫功能的藥劑和/或改變病毒復(fù)制的其它藥劑(化合物或分子)組合時(shí)，可協(xié)同地起抑制病毒感染或病毒復(fù)制的作用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明中描述的組合根據(jù)統(tǒng)計(jì)上可測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)在臨床相關(guān)濃度上抑制Flaviviridae科病毒(優(yōu)選HCV)的復(fù)制。將栗精胺與本發(fā)明中描述的至少一種其他治療藥劑的組合作為療法涉及治療應(yīng)用，即，將該組合給予已知或認(rèn)為感染了Flaviviridae科病毒(如HCV)的個(gè)體。本發(fā)明還關(guān)注栗精胺與諸如干擾素-α的藥劑的組合，其中，與栗精胺的組合可改變(以統(tǒng)計(jì)上顯著的方式增強(qiáng)或減弱，優(yōu)選增強(qiáng))干擾素-α或利巴韋林治療Flaviviridae感染的效果(功效)。
治療還涉及預(yù)防或預(yù)防性地給予本發(fā)明中描述的組合。對(duì)Flaviviridae感染的有效治療可包括治愈感染(即，從宿主或宿主組織根除病毒)；持續(xù)反應(yīng)，例如在結(jié)束治療方案后六個(gè)月在患者血液中不再能檢測(cè)到HCV RNA(這種持續(xù)反應(yīng)等同于良好的預(yù)后和等同于治愈)；減慢或減少肝瘢疤形成(纖維化)；減慢或減少病毒的產(chǎn)生；減少、減輕或消除個(gè)體的癥狀；或阻止癥狀或感染惡化或進(jìn)展。
因此，本發(fā)明描述的組合物可用于達(dá)到至少一個(gè)如下目標(biāo)(1)消除感染性和Flaviviridae感染(如HCV感染)對(duì)另外的個(gè)體的潛在的傳播；(2)阻止肝病進(jìn)展和改善臨床預(yù)后；(3)阻止硬化和HCC的發(fā)生；以及(4)改進(jìn)當(dāng)前所用的治療分子或藥征的臨床益處。至今，仍沒(méi)有獲得可充分治療或阻止HCV感染和一些相關(guān)疾病且無(wú)嚴(yán)重副作用的治療藥劑。
所述治療或預(yù)防優(yōu)選治療或防止以上確定的病毒的感染。具體地，所述治療或預(yù)防可以是治療或預(yù)防選自如下的疾病丙型肝炎、黃熱病、登革熱、日本腦炎、墨累山谷腦炎(Murray valley encephalitis)、羅西歐病毒感染(Rocio virus infection)、西尼羅河熱(West Nile fever)、圣路易斯腦炎(St.Louis encephalitis)、蜱傳腦炎、跳躍病病毒感染(Louping ill virus infection)、波瓦生病毒感染(Powassan virus infection)、鄂木斯克出血熱(Omsk hemorrhagic fever)、科薩努爾森林病(Kyasanurforest disease)、牛腹瀉、典型性豬瘟、邊界病和豬霍亂。病毒感染，如Flaviviridae感染(例如HCV感染)，指涉及(即造成、加重或特征為)在個(gè)體或患者細(xì)胞或體內(nèi)存在黃病毒的任何狀態(tài)或狀況。患者或個(gè)體可以是人、非人的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、綿羊、牛、馬、豬、狗、貓、大鼠或其他哺乳動(dòng)物。
HCV在細(xì)胞培養(yǎng)中難于有效繁殖，因此致使分析和鑒別潛在的抗HCV藥劑存在困難。在沒(méi)有能夠支持人HCV復(fù)制和在體外再感染細(xì)胞的適合培養(yǎng)體系情況下，應(yīng)用Flaviviridae科的其它成員牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)是本領(lǐng)域接受的用于細(xì)胞培養(yǎng)模式的替代病毒(Stuyveret al.，Antimicrob.Agents Chemother.47244-54(2003)；上述Whitby etal)。HCV和BVDV共享有很大程度上的局部蛋白同源性、共有復(fù)制策略和可能相同的病毒被膜亞細(xì)胞定位。HCV和BVDV都具有單鏈基因組(分別約9,600和12,6000核苷)，編碼九個(gè)功能類(lèi)似的基因產(chǎn)物，包括E1和E2被膜糖蛋白(參見(jiàn)，例如Rice，F(xiàn)laviviridaeThe Viruses andTheir Replication，in Fields Virology(黃病毒科病毒和它們的復(fù)制，病毒學(xué)領(lǐng)域)，第三版，Philadelphia，Lippincott，931-59(1996))。
本發(fā)明描述的化合物也可為有用的研究工具，用于體外和基于細(xì)胞的分析，來(lái)研究病毒(優(yōu)選HCV)的感染、生長(zhǎng)和復(fù)制的生物機(jī)制。作為背景和不希望被理論束縛，HCV形態(tài)發(fā)生是復(fù)雜的，其中，預(yù)組裝的病毒核顆粒被認(rèn)為附著在病毒被膜(表面)蛋白的細(xì)胞質(zhì)側(cè)，而該被膜蛋白已插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜。獲得被膜后，病毒顆粒出芽至ER的內(nèi)腔，隨后轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)高爾基體到細(xì)胞外液。從未成熟的病毒糖蛋白上除去N連接的葡萄糖殘基(剪切通過(guò)細(xì)胞酶作用，如α-葡萄糖苷酶)可以在病毒糖蛋白從ER轉(zhuǎn)移到高爾基上起作用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒別抗病毒化合物的方法，包括在給予足以抑制病毒復(fù)制的條件和時(shí)長(zhǎng)下，使病毒感染的宿主細(xì)胞與栗精胺和一種其他測(cè)試化合物或藥劑接觸，鑒別抑制(阻止、減慢、消除、干擾)感染、病毒復(fù)制和/或病毒組裝的候選藥劑。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明所描述的方法可用于鑒別測(cè)試化合物，所述測(cè)試化合物與栗精胺組合時(shí)相加地或協(xié)同地起作用。在另外的實(shí)施方案中，提供了鑒別懷疑具有病毒感染的細(xì)胞的方法，包括在給予足以抑制病毒感染、病毒復(fù)制、和/或病毒組裝的條件和時(shí)長(zhǎng)下，使懷疑被病毒感染的宿主細(xì)胞與栗精胺和一種候選化合物或藥劑接觸，并鑒別被病毒感染的細(xì)胞。優(yōu)選地，病毒感染由HCV引起或與HCV相關(guān)。本發(fā)明中描述的分析法可用于確定候選化合物和/或組合的治療價(jià)值，也可用于確定在有需要的個(gè)體的治療中有用的劑量參數(shù)。
在特定的實(shí)施方案中，當(dāng)與附加治療劑組合時(shí)，栗精胺被結(jié)合或組合給藥(例如，以混合物或共包裝或以如下方式給藥全身或感染部位可得到栗精胺和這種其他化合物，這樣各自抗病毒作用會(huì)相加或優(yōu)選協(xié)同作用)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，栗精胺與諸如干擾素-α的改變免疫功能的藥劑組合，在另外的優(yōu)選的實(shí)施方案中，栗精胺與改變病毒(如Flaviviridae)復(fù)制的藥劑(例如核苷類(lèi)似物，如利巴韋林(Sigma))組合。在另外的實(shí)施方案中，栗精胺與改變免疫功能的藥劑(如干擾素-α)結(jié)合或組合給藥，或與改變病毒復(fù)制的藥劑(化合物)(如利巴韋林)組合或聯(lián)合給藥。
在一個(gè)實(shí)施方案中，栗精胺與改變免疫功能的藥劑的組合或栗精胺與改變病毒復(fù)制的藥劑的組合在給體中相加地起作用。即，栗精胺與另外的化合物相互作用導(dǎo)致治療效果(或抗病毒效果)接近于單個(gè)化合物或藥劑單獨(dú)給藥的效果。
具有抗病毒活性的化合物或分子例如可抑制或阻止感染細(xì)胞(如阻止病毒結(jié)合或黏附在細(xì)胞上)；抑制、減少或阻止病毒復(fù)制或組裝；抑制、減少或阻止病毒RNA從病毒衣殼中釋放；和/或抑制、降低或干擾HCV基因產(chǎn)物的功能。改變免疫功能(以統(tǒng)計(jì)上顯著的方式或臨床上顯著的方式增強(qiáng)或減弱)的化合物或分子優(yōu)選增加或增強(qiáng)對(duì)感染病毒的免疫功能或免疫反應(yīng)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，果精胺與改變免疫功能的藥劑的組合或栗精胺與改變病毒復(fù)制的藥劑的組合在個(gè)體中協(xié)同地起作用。協(xié)同起作用的兩種或多種化合物相互作用，以至于化合物的組合效果強(qiáng)于每一化合物單獨(dú)給藥時(shí)的單個(gè)效果的總和(參見(jiàn)，例如Ouzounov et al.Antivir.Res.55425-35(2002)；Berenbaum，Pharmacol.Rev.4193(1989))。栗精胺與另外的藥劑或化合物之間的相互作用可由多種機(jī)械和經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)分析(參見(jiàn)，例如上述Ouzounov et al.)。分析藥劑組合之間的相互作用的常用方法使用了等效線(xiàn)(等效曲線(xiàn))作圖，其中藥劑的組合(da，db)由圖中的點(diǎn)表示，圖中的軸為單個(gè)藥劑的劑量軸(參見(jiàn)，例如上述Ouzounov et al.；MacSynergyTMII軟件操作手冊(cè)(University of Michigan，Ann Arbor，MI))。當(dāng)以協(xié)同作用量的峰值計(jì)算的所產(chǎn)生的協(xié)同作用量大于相加效果(即，每個(gè)藥劑單獨(dú)效果的總和)15％以上，或大于相加效果兩倍以上，或大于相加效果三倍或多倍以上時(shí)，栗精胺與改變免疫功能的藥劑的組合或與改變病毒復(fù)制的藥劑或本文中描述的另外的藥劑或化合物的組合協(xié)同地起作用或具有協(xié)同作用。將三維(3-D)圖和MacSynergyTMII軟件提供的協(xié)同作用量的計(jì)算作為等效線(xiàn)圖解法的補(bǔ)充分析可描述協(xié)同作用。因此，當(dāng)以μM/ml2％或μM(IU)/ml(孔)2％表示的值在25和50μM/ml2％之間，或25和50μM(IU)/ml(孔)2％之間(較小，但是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的)；在50和100μM/ml2％或μM(IU)/ml(孔)2％之間(適度協(xié)同作用)；或大于100μM/ml2％或μM(IU)/ml(孔)2％(強(qiáng)協(xié)同作用)時(shí)，栗精胺與改變免疫功能的藥劑的組合或與改變病毒復(fù)制的藥劑或本文描述的另外的藥劑或化合物的組合協(xié)同起作用或具有協(xié)同作用。Buckwold等人報(bào)道了利巴韋林和干擾素-α組合(所述藥物組合為目前治療HCV感染的治療標(biāo)準(zhǔn))具有66±25IU(μg)/ml(孔)2％的協(xié)同作用量(Atttimicrob.AgentsChemother.472293(2003))。本發(fā)明中描述的栗精胺與干擾素-α的組合具有范圍為193-224μM/(IU/ml)2％的協(xié)同作用量。
在某些實(shí)施方案中，提供了組合物，包括與抑制Flaviviridae(如HCV)結(jié)合和/或感染細(xì)胞的化合物組合的栗精胺。這些化合物的例子包括抗體，所述抗體特異結(jié)合到一種或多種Flaviviridae的基因產(chǎn)物(例如HCV E1和/或E2蛋白)或特異結(jié)合到HCV結(jié)合的細(xì)胞受體?？贵w可為單克隆或多克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段，包括遺傳上工程化的嵌合體、人源化的sFv或其他此類(lèi)免疫球蛋白。阻止病毒結(jié)合或感染細(xì)胞的其他化合物包括糖胺聚糖(如硫酸乙酰肝素和蘇拉明)。
栗精胺也可與抑制病毒RNA從病毒衣殼中釋放或抑制Flaviviridae(如HCV)基因產(chǎn)物的功能的化合物組合，這些化合物包括IRES抑制劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑、解螺旋酶抑制劑和病毒聚合酶/復(fù)制酶抑制劑(參見(jiàn)，例如Olsen et al.，Antimicrob.Agents Chemother.483944-53(2004)；Stansfield et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.145085-88(2004))。IRES抑制劑例如包括核苷酸序列特異的反義核酸(參見(jiàn)，例如McCaffrey et al.，Hepatology 38503-508(2003))；小的酵母RNA(參見(jiàn)，例如Liang et al.，World J，Gastroenterol 91008-13(2003))；或短的干擾RNA分子(siRNA)，其抑制mRNA的翻譯；以及氰鈷胺(CNCb1，維生素B12)(Takyar et al.，J.MoI Biol.3191-8(2002))。NS3蛋白酶(解螺旋酶)抑制劑包括由NS3底物衍生并起阻斷酶活性作用的肽。命名為BILN 2061(如參見(jiàn)Lamarre et al.，Nature 426186-89(2003)(BoehringerIngelheim Phanna，Quebec)和VX-905(Vertex Pharmaceuticals，Inc.Cambridge，MA)的蛋白酶抑制劑已研究為可能的HCV治療劑。
在另外的實(shí)施方案中，栗精胺可與干擾細(xì)胞的涉及或影響Flaviviridae復(fù)制的功能的化合物、或直接改變Flaviviridae的復(fù)制的化合物組合，這些化合物包括RNA依賴(lài)的RNA聚合酶抑制劑或HCVp7抑制劑(例如DGJ和衍生物)；糖蛋白加工的其他抑制劑(如亞氨基糖，包括脫氧半乳糖野尻霉素(DGJ)和脫氧野尻霉素(DNJ)，及其衍生物(如N-丁基-DNJ、N-壬基-DNJ和長(zhǎng)的烷基鏈亞氨基糖，如N7-氧壬基-DNJ、N7-氧壬基-DGJ))；核苷類(lèi)似物，包括次黃苷單磷酸脫氫酶(例如利巴韋林、霉酚酸和VX497)；以及其他抗病毒化合物，如金剛胺(Symmetrel，Endo Pharamceuticals)、金剛乙胺(Flumadine，F(xiàn)orestPharmaceuticals.Inc.)和valopicitabine(NM283，IdenixPharmaceuticals)。
在另外的實(shí)施方案中，栗精胺可與改變免疫功能(統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著、臨床上顯著或生物學(xué)上顯著地增強(qiáng)或減弱)的化合物組合，優(yōu)選對(duì)Flaviviridae感染增強(qiáng)或刺激免疫功能或免疫反應(yīng)。例如，所述化合物可刺激T細(xì)胞反應(yīng)或增強(qiáng)特定的免疫反應(yīng)(例如，胸腺素-α和干擾素，如α-干擾素和β-干擾素)，或刺激或增強(qiáng)體液反應(yīng)。改變免疫功能的化合物的例子包括I型干擾素，如干擾素-α(參見(jiàn)，例如Nagata et al，Nature287401-408(1980))、干擾素-β(參見(jiàn)，例如Tanigushi et al.，Nature285547-49(1980))和干擾素-ω(Adolf，J.Gen.Virol.681669-76(1987))；和II型干擾素，如干擾素-γ(Belardelti，APMFS 103161，1995)和干擾素-γ-1b(Alferon)。干擾素-α的例子包括干擾素-α-2a(Roferon-A；Hoffinan-La Roche)、干擾素-α-2b(Intron A，PBL Biomedical)、干擾素-α-con-1(Infergen)、干擾素-α-n3(Alferon)、白蛋白干擾素-α(Albufeton-alphaTM，Human Genome Sciences，Rockville，MD)和Veldona(Amarillo Biosciences，Inc.)。干擾素-β的例子包括干擾素-β-1a(Avonex)和干擾素-β-1b(Betaseron)。
干擾素可改變免疫功能，也可改變(抑制、阻止、消除或減慢)病毒(如HCV)的復(fù)制。干擾素-α和干擾素-β在病毒感染的細(xì)胞中的產(chǎn)生引起抵抗病毒復(fù)制、增強(qiáng)I型MHC表達(dá)、增加了抗原呈遞和激活自然殺傷細(xì)胞(缺乏抗原特異表面受體的淋巴細(xì)胞子集)殺死病毒感染的細(xì)胞(參見(jiàn)，例如Janeway et al.，in Immunobiology，第五版，New York，LondonGarland Publishing，(2001))。因此，這些干擾素通過(guò)影響先天和獲得性免疫來(lái)改變免疫功能。
在一個(gè)實(shí)施方案中，栗精胺與干擾素(如干擾素-α)組合給藥。干擾素-α已用于治療多種病毒感染，或作為單獨(dú)治療，或作為組合治療的一部分(參見(jiàn)，例如Liang，New Engl J.Med.3391549-50(1998)；Hultonet al.，J.Acquir.Immune Defic.Syndr.51084-90(1992)；Johnson et al.，J.Infect.Dis.1611059-67(1990))。干擾素-α結(jié)合到細(xì)胞表面受體，刺激導(dǎo)致抑制病毒復(fù)制的細(xì)胞酶(例如，雙鏈RNA活化的蛋白激酶和RNaseL分別抑制翻譯起始和裂解病毒RNA)活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(參見(jiàn)，例如Samuel，Clin.Microbiol.Rev.14778-809(2001)；Kaufman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9611693-95(1999))。HCV E2糖蛋白和NS5a可以阻斷RNA活化的蛋白激酶活性，這樣一些HCV菌株更加抵抗干擾素-α，因此，可能有必要以干擾素-α和一種或多種其他化合物的組合療法治療持久病毒感染(參見(jiàn)，例如上述Ouzounov et al.，及其中引用的參考文獻(xiàn))。在特定的實(shí)施方案中，聚乙二醇部分被連接到干擾素-α(稱(chēng)作聚乙二醇化的干擾素-α；聚乙二醇干擾素-α-2b(Peg-Intron；Schering-Plough或PBL Biomedical)以及聚乙二醇干擾素-α-2a(Pegasys；Hoffmann-La Roche)，其可具有增強(qiáng)的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，也顯示了較少的不希望有的副作用(參見(jiàn)，例如Zeuzem et al.，New Engl J.Med.3431666-72(2000)；Heathcote et al.，New Engl，J.Med.3431673-80(2000)；Matthews et al.，Clin.Ther.26991-1025(2004))。
干擾素-α-2a(Roferon-A；Hoffman-La Roche)、干擾素-α-2b(Intron-A；Schering-Plough)和干擾素-αcon-1(Infergen；Intermune)在美國(guó)已被批準(zhǔn)用作治療成人慢性丙型肝炎感染的單一藥劑。治療慢性丙型肝炎感染的干擾素-α-2b和-α-2a的推薦劑量為3,000,000單位，每周三次，皮下或肌肉注射給藥。給藥治療六個(gè)月至兩年。對(duì)干擾素-α-con-1，推薦劑量為第一次治療每周三次每次9μg，對(duì)沒(méi)有反應(yīng)或復(fù)發(fā)的患者在接著的六個(gè)月每周三次每次15μg。在用任何這些重組的干擾素治療期間，必需對(duì)患者監(jiān)視副作用，包括流感樣癥狀、抑郁、皮疹和反常的血球計(jì)數(shù)。單獨(dú)用干擾素治療在少于15％的患者中產(chǎn)生持續(xù)反應(yīng)。由于這種低反應(yīng)率，這些干擾素很少被用作單一療法治療慢性丙型肝炎感染患者。
干擾素-α與利巴韋林的組合治療HCV感染優(yōu)于任一單獨(dú)治療，該組合是治療的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)。給藥的效力、劑量和頻率在三大組雙盲法、安慰劑對(duì)照的臨床試驗(yàn)中做了研究(Reichard et al.，Lancet35183-87(1998)；Poynard et al.，Lancet 3521426-32(1998)；McHutchison et al.，New Engl.J.Med.3391485-92(1998))。(還參見(jiàn)Buckwold et al.，Antimicrob.Agents Chemother.472293-93(2003)；Buckhold，Antimicrob.Chemother.53412-14(2004))。與利巴韋林相關(guān)的負(fù)作用包括異常的胎兒發(fā)育。利巴韋林也禁忌用在具有貧血病、心臟病和腎病的患者中。因此，需要替代的組合物、療法和治療組合，如本發(fā)明中描述的那些。
栗精胺也可與調(diào)節(jié)(優(yōu)選降低或減少?lài)?yán)重性或程度、減少數(shù)量或消除)Flaviviridae感染(如HCV感染)癥狀和作用的化合物(例如，抗氧化劑，如黃酮類(lèi)化合物(flavinoids))結(jié)合。
附加治療劑可包括抗病毒化合物，例如用于治療特定感染原的抗病毒化合物或藥物，這些特定感染原常被鑒定為共感染了Flaviviridae(如HCV)的個(gè)體。這些共感染可能由HBV、人逆轉(zhuǎn)錄病毒如HIV1和2、和/或人T細(xì)胞親淋巴病毒(HTLV)1型或2型引起。抗病毒化合物的例子包括核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)抑制劑(例如，拉米夫定(Lamivudine)(3TC)、齊多夫定、司他夫定、去羥肌苷、阿德福韋(adefovirdipivoxil)和阿巴卡韋)；非核苷RT抑制劑(例如奈韋拉平)；以及天冬氨酰蛋白酶抑制劑(例如沙奎那維、茚地那韋和利托那韋)。
本發(fā)明中論述的附加治療劑可作為在藥物可接受的載體中的單一組合物同時(shí)給藥，或作為各自具有藥物可接受的載體的單獨(dú)組合物同時(shí)給藥。在另外的實(shí)施方案中，栗精胺和附加治療劑可順序給藥，或以其任一組合(例如，首先為栗精胺，隨后為附加治療，或首先為附加治療，隨后為栗精胺)。此外，如果給予多于一劑組合治療時(shí)，順序給藥的次序可以改變或在每次給藥的時(shí)間點(diǎn)保持相同。確定本發(fā)明中描述的任一組合治療的效果的方法可為本發(fā)明中描述的方法，并為技術(shù)人員所常用，如確定免疫反應(yīng)是否改變、確定Flaviviridae感染的癥狀或作用是否被調(diào)節(jié)、或確定Flaviviridae的復(fù)制是否改變(優(yōu)選不利地影響、阻止、減弱、抑制或消除病毒復(fù)制)。
如本發(fā)明中所描述的，BVDV是用于細(xì)胞培養(yǎng)模型的本領(lǐng)域接受的替代病毒(上述Stuyver et al.；上述Whitby et al.)。因此可采用諸如牛腎細(xì)胞(MDBK)和牛陀螺狀細(xì)胞(BT)的牛細(xì)胞系，采用BVDV的細(xì)胞病變菌株，如引起感染細(xì)胞溶解的NADL菌株(自ATCC，Manassas，VA獲得)來(lái)進(jìn)行分析。可用于確定單獨(dú)的栗精胺或與另外的化合物、藥劑或分子組合的栗精胺是否可用于治療Flaviviridae感染或抑制或阻止Flaviviridae感染的示例性分析法包括病毒斑形成分析法、細(xì)胞毒性分析法(參見(jiàn)，例如Buckwold et al.，Antimicrob.Agents Chemother.472293-98(2003)；上述Whitby et al.)、病毒釋放分析法、細(xì)胞增殖分析法(例如，非放射性MTS/PMS或MTT分析法，或放射性胸腺嘧啶摻入分析法)和本發(fā)明中描述的其他分析法以及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知和熟練的分析法。當(dāng)與另外的化合物組合的栗精胺被分析時(shí)，從這些測(cè)定中得到的數(shù)據(jù)，如由細(xì)胞毒性分析法所得到的數(shù)據(jù)，可如本發(fā)明中所描述的方法確定藥劑相互作用是否提供了相加效應(yīng)或協(xié)同作用。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含栗精胺與用于治療或阻止病毒感染(如HCV)的另外的化合物的組合。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)給予本發(fā)明的栗精胺與一種其他化合物的組合治療或阻止病毒感染的方法，其中，每一組分的給藥劑量足以治療或阻止病毒感染，如上所述。當(dāng)用于本文描述的方法中時(shí)，栗精胺以及這些化合物的組合或混合物優(yōu)選為藥物組合物的一部分。栗精胺可與本發(fā)明中描述的另外的化合物組合給藥，其通過(guò)對(duì)個(gè)體順序給予每種化合物來(lái)進(jìn)行，即，栗精胺先于另外的化合物給藥，或在另外的化合物給藥之后給藥，或栗精胺與另外的化合物同時(shí)給藥。對(duì)于本發(fā)明中描述的組合中的每種化合物(分子、藥劑)的順序或同時(shí)給藥來(lái)說(shuō)，每種化合物可以相同的或不同的制劑通過(guò)相同的或不同的途徑給藥，這些在本發(fā)明中有描述并且部分地根據(jù)化合物的性質(zhì)來(lái)確定。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于本文描述的治療方法的藥物組合物，其包含本文中描述的栗精胺(或其藥物可接受的鹽)和藥物可接受的載體、媒介物、或賦形劑、以及任選的添加劑(例如一種或多種粘合劑、著色劑、干燥劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑或防腐劑)。同樣地，附加治療，如干擾素-α或利巴韋林，可與藥物可接受的載體、媒介物、或賦形劑、以及任選的添加劑組合。包括干擾素-α或利巴韋林的藥物組合物的制備可根據(jù)公知的和本領(lǐng)域常用的制備用于對(duì)個(gè)體給藥的這些化合物的方法。
如本文所闡述的，栗精胺和一種或多種附加治療化合物或分子可以被包括在藥物可接受的載體、賦形劑或稀釋劑中，以便以有效治療或阻止Flaviviridae感染(尤其是HCV感染)的量向有需要的個(gè)體給藥。在特定的實(shí)施方案中，本文所述的對(duì)所有適應(yīng)癥的活性化合物的給藥劑量范圍為每天約0.01mg/kg至約300mg/kg，優(yōu)選每天約0.1mg/kg至約100mg/kg，或更優(yōu)選每天約0.5mg/kg至約25mg/kg接受者體重。典型的給藥劑量范圍為適合的載體中約0.01-3％wt/wt。當(dāng)與栗精胺組合給藥時(shí)，干擾素-α或利巴韋林可根據(jù)本領(lǐng)域公知的和常用的劑量方案給藥(參見(jiàn)，例如如上Matthews et al.；Foster，Semin.Liver Dis.24Suppl 297-104(2004)；Craxi et al，Semin Liver Dis.23 Suppl 135-46(2003))，或當(dāng)與栗精胺一起給藥時(shí)，所述劑量可調(diào)節(jié)。
活性成分優(yōu)選給藥達(dá)到血漿濃度的峰值為約0.001μM至約30μM，優(yōu)選約0.01μM至約10μM。這可例如通過(guò)靜脈注射栗精胺制劑的組合物(優(yōu)選在鹽水或其他水介質(zhì)中)實(shí)現(xiàn)。在另外的實(shí)施方案中，栗精胺通過(guò)推注(bolus)給藥。用于本文所述的治療方法中的栗精胺和其他化合物可口服、或肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、真皮給藥，通過(guò)煙霧劑或通過(guò)吸入給藥、直腸、陰道、或局部給藥(包括口腔和舌下給藥)。
藥物組合物中活性化合物的濃度取決于化合物的吸收、分布、失活和排除速率，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他因素。劑量也可根據(jù)要減輕的疾病的嚴(yán)重程度而不同。特定的給藥方案(包括給藥劑量的頻率)可根據(jù)患者個(gè)體的需要以及給藥或指導(dǎo)該組合物給藥的人員的職業(yè)判斷隨時(shí)間進(jìn)行調(diào)節(jié)。劑量水平和方案取決于多種因素，包括年齡、體重、飲食、性別、健康狀況和病史(包括患者是否被共感染有另外的病毒，如HBV或HIV)。因此，本文所述濃度范圍僅為示例性的，無(wú)意限制要求保護(hù)的組合物的范圍或?qū)嵤?。活性成分可一次給藥，或分成許多較小劑量在不同的間隔時(shí)間給藥。
本文中描述的藥物用途的組合物可為組件的試劑盒的形式。試劑盒可例如包括栗精胺作為單位劑型中的組合物的一個(gè)組分，還可包含改變免疫功能的藥劑(例如干擾素-α)或改變病毒復(fù)制的藥劑(如利巴韋林)，每一種在各自的單位劑型中。試劑盒可包括使用說(shuō)明書(shū)和其他相關(guān)信息，以及管理機(jī)構(gòu)所需的信息。
口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體。它們可封裝在明膠膠囊中或被壓縮成片劑。為了進(jìn)行口服治療給藥，活性化合物可與賦形劑結(jié)合，并以片劑、錠劑或膠囊的形式應(yīng)用。藥物相容的粘合劑，和/或輔助原料可作為組合物的一部分被包括在內(nèi)。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可含有如下成分或具有類(lèi)似性質(zhì)的化合物粘合劑，如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠；賦形劑，如淀粉或乳糖；分散劑，如褐藻酸、Primogel、或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂或Sterore；助流劑，如膠體二氧化硅；甜味劑，如蔗糖或糖精；或增香劑，如薄荷、水楊酸甲酯、或橙色香料(orange flavoring)。當(dāng)劑量單位形式為膠囊時(shí)，除上述類(lèi)型的原料之外，還可包含液態(tài)載體，如脂肪油。此外，劑量單位形式可包含改變劑量單位外形的多種其他原料，例如，糖包衣、蟲(chóng)膠或腸內(nèi)吸收藥。通常參照“Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明頓藥物科學(xué)”)，Mack Publishing Co.，Easton，PA。
活性化合物或其藥物可接受的鹽或衍生物可作為酏劑、懸浮劑、糖漿劑、糯米紙囊劑、口香糖等的成分給藥。除活性成分外，糖漿劑還可包含作為甜味劑的蔗糖和某些防腐劑、染料和著色劑，以及調(diào)味劑。
除了栗精胺外，本文中描述的藥物組合物優(yōu)選包含至少一種藥物可接受的媒介物、載體、稀釋劑或賦形劑，以及其他組分或活性成分(如其他抗HBV藥物)，包括改變病毒復(fù)制的藥劑或改變免疫功能或反應(yīng)的藥劑，和/或抗Hepadnaviridae(例如抗HBV)的藥劑，這些在本文中有詳細(xì)描述。本發(fā)明的組合物具有多種活性成分，如栗精胺或其藥物可接受的鹽，或與一種或多種抗生素、抗真菌劑、抗炎癥藥劑或其他抗病毒化合物的混和物或組合。
適合與組合物一起應(yīng)用的藥物可接受的載體包括，例如，增稠劑、緩沖劑、溶劑、濕潤(rùn)劑、防腐劑、螯合劑、輔劑等，及其組合。用于治療用途的藥物可接受的載體為醫(yī)藥領(lǐng)域所熟知，并在本文中有描述，例如“Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明頓藥物科學(xué))”，MackPublishing Co.(A.R.Gennaro編輯，第18版，1990)和CRC Handbook ofFood，Drug，and Cosmetic Exciptents(食物、藥物和化妝品賦形劑CRC手冊(cè))，CRC Press LLC(S.C.Smolinski ed.，1992)。
適用于腸胃外、皮內(nèi)、皮下或局部應(yīng)用的溶液或懸浮液包括下述組分無(wú)菌稀釋液，如注射用水、鹽溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，如苯甲醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩沖劑，如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及調(diào)節(jié)滲透壓的試劑，如氯化鈉或葡萄糖。腸胃外制劑被封裝在安瓿、一次性注射器、或由玻璃或塑料制成的倍劑量瓶中。如果靜脈內(nèi)給藥，優(yōu)選的載體為生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或輔劑。示例性的輔劑為明礬(氫氧化鋁REHYDRAGEL)；磷酸鋁；病毒顆粒；具有和沒(méi)有脂質(zhì)A的脂質(zhì)體，Detox(Ribi/Corixa)；MF59；或其他油或水乳劑型輔劑，如納米乳劑(如，參見(jiàn)第5,716,637號(hào)美國(guó)專(zhuān)利)和亞微粒乳劑(如，參見(jiàn)第5,961,970號(hào)美國(guó)專(zhuān)利)，以及弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物是無(wú)菌的。
在特定的實(shí)施方案中，活性化合物與載體一起制備，可防止化合物從體內(nèi)快速除去，如可控釋放制劑，包括植入物和微膠囊遞送體系?？刹捎蒙锟山到獾?、生物相容的聚合體，如乙烯醋酸乙烯酯、多聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這些制劑的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。例如，如本領(lǐng)域所公知的，一些這樣的原料可從Alza Corporation(CA)和Gilford Pharmaceuticals(Baltimore，MD)購(gòu)得。
脂質(zhì)體懸浮液也可為藥物可接受的載體。這些可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備(例如第4,522,811號(hào)美國(guó)專(zhuān)利；第6,320,017號(hào)美國(guó)專(zhuān)利；第5,595,756號(hào)美國(guó)專(zhuān)利)。例如脂質(zhì)體制劑可通過(guò)如下方法制備將適合的脂質(zhì)(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰膽堿、花生四烯酸酰(arachadoyl)磷脂酰膽堿和膽固醇)溶解在無(wú)機(jī)溶劑中，這些無(wú)機(jī)溶劑隨后蒸發(fā)，在容器表面留下薄層干燥的脂質(zhì)。隨后將活性化合物或其單磷酸鹽、二磷酸鹽和/或三磷酸鹽衍生物的水溶液引入容器中。容器隨后用手旋轉(zhuǎn)，以使脂質(zhì)材料脫離容器壁以及分散脂質(zhì)聚集體，由此形成脂質(zhì)懸浮液。親水化合物，如栗精胺，很可能被封在脂質(zhì)體的含水內(nèi)部。
本發(fā)明中提到的所有美國(guó)專(zhuān)利、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)出版物、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)、外國(guó)專(zhuān)利、外國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)和非專(zhuān)利出版物在此全部引入作為參考。下述實(shí)施例旨在說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1栗精胺、干擾素-α2B和利巴韋林保護(hù)MDBK細(xì)胞不受BVDV誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性采用非放射性細(xì)胞增殖MTS/PMS分析法(MTS3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(PromegaCorporation，Madison，WT)；PMS吩嗪硫酸甲酯(Sigma Aldrich，StLouis，MO))進(jìn)行細(xì)胞增殖分析。MDBK細(xì)胞接種于96孔平板，密度為每孔約2×104細(xì)胞。培養(yǎng)孵育3-24小時(shí)，在感染和加入化合物之間使細(xì)胞附著于培養(yǎng)板。適當(dāng)PFU量的BVDV加入到每個(gè)孔中，達(dá)到所需的MOI(0.1或0.01)；細(xì)胞暴露于用含有1％馬血清的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)稀釋到適當(dāng)濃度的病毒1至2小時(shí)。隨后除去病毒接種物，細(xì)胞用含有1％HS的PBS洗滌。將測(cè)試化合物、栗精胺、利巴韋林和干擾素-α溶于含2％HS的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并以不同濃度加至細(xì)胞，隨后在5％CO2、37℃下孵育3-4天。未感染的細(xì)胞和感染的、未處理的細(xì)胞(即，沒(méi)有化合物)作為另外的對(duì)照。孵育3-4天后，組合的MTS/PMS溶液加入到含有100μL細(xì)胞培養(yǎng)物的分析平板每孔中，得到終濃度為333μg/ml MTS和25μM PMS。分光光度計(jì)板式讀數(shù)器用于測(cè)定96孔板在濕潤(rùn)的、5％CO2空氣中37℃孵育1-4小時(shí)后在490nm處的吸收值。測(cè)定每套三個(gè)重復(fù)孔的平均吸收值?？共《净钚宰鳛镸TS轉(zhuǎn)化相對(duì)于細(xì)胞(未感染的)和病毒(未經(jīng)藥物處理的)對(duì)照轉(zhuǎn)化之間的差額進(jìn)行測(cè)定。對(duì)每個(gè)濃度的測(cè)試化合物，細(xì)胞病理效應(yīng)(CPF)減少(與抗病毒活性相關(guān))的測(cè)定如下％CPE減少＝[(D-ND)/(NI-ND)]×100，其中，D(藥物處理的)為藥物處理的細(xì)胞的吸收值；ND(未經(jīng)藥物處理的)為未處理的感染的細(xì)胞的吸收值；NI(未感染的)為未感染的細(xì)胞的吸收值。數(shù)據(jù)如表1所示。
表1.保護(hù)MDBK細(xì)胞不受BVDV誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性

*IU＝干擾素單位EC50代表保護(hù)50％細(xì)胞不受BVDV誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(即，50％CPE減少)的藥物濃度。CC50等于影響50％MDBK細(xì)胞成活力的濃度。這些結(jié)果表明每種測(cè)試化合物都具有抗病毒效果，它可以是直接的或間接的。實(shí)施例2和3公開(kāi)了抗病毒效果實(shí)際上由于對(duì)病毒的直接作用。
實(shí)施例2栗精胺、干擾素-α2B和利巴韋林在體外抑制BVDV從MDBK細(xì)胞中釋放Madin-Dafby牛腎細(xì)胞(MDBK)(American Type Culture Collection(ATCC)，Manassas，VA；ATCC CCL22)以每孔約2×104細(xì)胞的密度接種在96孔板的含2％熱失活馬血清(HS)的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(例如，Dulbecco′s Modified Eagles Medium(DMEM)；Gibco，Ontario，Canada)中。在感染和添加化合物之間，讓細(xì)胞孵育3-24小時(shí)，以使得細(xì)胞附著到組織培養(yǎng)板。將在含有1％HS的無(wú)菌PBS中稀釋的適當(dāng)斑形成單位(PFU)量的BVDV菌株NADL(ATCC VR-534)加入到每個(gè)孔，達(dá)到期望的感染復(fù)數(shù)MOI(約0.01)。將細(xì)胞在37℃、5％CO2下暴露于病毒1.5小時(shí)，隨后用PBS洗滌。將溶解在具有2％HS的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的測(cè)試化合物隨后以不同濃度加至細(xì)胞。培養(yǎng)板在37℃、5％CO2中孵育24小時(shí)(BVDV復(fù)制的一個(gè)周期)。96孔板隨后低速離心以沉淀細(xì)胞。上清被連續(xù)稀釋?zhuān)⒂糜诟腥?2孔板中的新的單層細(xì)胞。細(xì)胞單層隨后用0.5％的瓊脂糖覆蓋，所述瓊脂糖溶解在具有5％HS的包含如下物質(zhì)的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中(1)栗精胺(Phytex，Australia)；(2)利巴韋林(Ribavirin，Sigma)；(3)IFN-α2b(PBL BiomedicalLaboratories，Piscataway，NJ)；或(4)單獨(dú)的(即，沒(méi)有加入的測(cè)試化合物)。處理的細(xì)胞在37℃、5％CO2中孵育3-5天，用甲醛固定，用結(jié)晶紫或亞甲基藍(lán)染色，在重蒸溜水中洗滌，最后在室溫中風(fēng)干。手工計(jì)數(shù)形成的病毒斑，并測(cè)定滴度。數(shù)據(jù)如表2所示。
表2.抑制病毒釋放

*IU＝干擾素單位EC50為抑制感染細(xì)胞的培養(yǎng)基中50％的病毒釋放(與未處理的對(duì)照相比)的化合物濃度。這些結(jié)果支持實(shí)施例1中的數(shù)據(jù)，并進(jìn)一步證實(shí)了每個(gè)測(cè)定化合物具有直接的抗病毒效果，這表明了HCV也被栗精胺、干擾素和利巴韋林直接抑制。
實(shí)施例3斑抑制分析BVDV病毒儲(chǔ)備物在含1-5％馬血清(HS)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中連續(xù)稀釋。MDBK細(xì)胞生長(zhǎng)至在培養(yǎng)皿中匯合，在37℃用不同感染復(fù)數(shù)(＜1至＞0.001)的BVDV感染。吸附1.5小時(shí)后，除去接種物。細(xì)胞單層用0.5％的瓊脂糖覆蓋，所述瓊脂糖溶解在包含5％HS、具有和沒(méi)有測(cè)試化合物(栗精胺、利巴韋林或IFN-α)的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)皿在37℃、5％CO2中孵育3-5天。單層MDBK細(xì)胞用甲醛固定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用結(jié)晶紫或亞甲基藍(lán)染色，隨后在重蒸溜水中洗滌。洗滌后，將板在室溫風(fēng)干。手工計(jì)數(shù)在MDBK細(xì)胞培養(yǎng)物中形成的病毒斑。試驗(yàn)化合物的抑制活性的測(cè)定通過(guò)計(jì)算斑減少的百分?jǐn)?shù)(％)進(jìn)行％斑減少＝(斑數(shù)(藥物處理的感染細(xì)胞)/斑數(shù)(對(duì)照(沒(méi)有化合物)的感染細(xì)胞)×100。數(shù)據(jù)如表3所示。
表3.斑減少分析

+IU＝干擾素抗性單位EC50為抑制50％的病毒斑形成單位(與未處理的對(duì)照相比)的化合物濃度。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了，如實(shí)施例2的試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)測(cè)試化合物具有對(duì)病毒增殖的直接效果。
實(shí)施例4栗精胺與IFN-α2b或利巴韋林組合的協(xié)同作用和細(xì)胞毒性進(jìn)行細(xì)胞病變分析，以確定栗精胺與IFN-α2b或利巴韋林協(xié)同作用的可能性。采用平均的背景和顏色校正數(shù)據(jù)，在抑制細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)分析法中進(jìn)行雙向組合分析(two-way combination assay)，描述如下。通過(guò)產(chǎn)生“棋盤(pán)”實(shí)現(xiàn)該雙向藥物組合，其中一種藥物水平地、另一種藥物垂直地滴定到以0.01MOI的BVDV感染的MDBK細(xì)胞上。同樣的方法用在未感染的MDBK細(xì)胞上，以觀察該組合對(duì)藥物的細(xì)胞毒性的影響。每一雙向組合進(jìn)行兩次。EC50代表對(duì)BVDV誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(CPE)提供50％保護(hù)的化合物濃度。應(yīng)用MacSynergy軟件程序(由Dr.Mark Prichard贈(zèng)予，University of Alabama，Tuscaloosa，AL)分析EC50數(shù)據(jù)來(lái)確定任何協(xié)同作用(參見(jiàn)，例如上述Ouzounov et al.；Buckwold et al.，Antimicrob.Agents Chemother.472293，2003)。
由添加第二抗病毒藥物劑量得到的第一抗病毒藥物的EC50值對(duì)第二抗病毒藥物濃度繪圖產(chǎn)生等效線(xiàn)(劑量對(duì))，所有等效線(xiàn)以等效線(xiàn)圖解法繪制來(lái)確定存在協(xié)同作用、拮抗或相加性。相加線(xiàn)的作圖通過(guò)連接兩種測(cè)試化合物(即，栗精胺和干擾素或栗精胺和利巴韋林)中每個(gè)的單一治療的EC50值。連接單一治療EC50值的線(xiàn)代表了兩種化合物的理論上的相加作用值。組合治療的等效線(xiàn)在相加線(xiàn)以下表示協(xié)同作用，而在相加線(xiàn)以上表示拮抗。也測(cè)定單獨(dú)的以及組合中的每種化合物對(duì)MDBK細(xì)胞的細(xì)胞毒性百分?jǐn)?shù)(或％存活)，并用于計(jì)算CC50值?？共《舅幬锏腃C50為在50％細(xì)胞中(與未處理的細(xì)胞相比)引起細(xì)胞毒性的劑量。
與等效線(xiàn)圖解法結(jié)合，MacSynergyTMII軟件也用于獲得雙組合數(shù)據(jù)的協(xié)同作用量百分?jǐn)?shù)或拮抗量百分?jǐn)?shù)。從實(shí)驗(yàn)測(cè)定的值中減去計(jì)算的相加相互作用，以揭示觀察到協(xié)同作用(以正的％值表示)或拮抗(以負(fù)的％值表示)作用時(shí)的區(qū)域和相應(yīng)的藥物濃度。0％抑制的水平面代表了相加性(相加表面)。從亮到暗的灰色梯度表明協(xié)同作用的水平。實(shí)驗(yàn)的劑量效應(yīng)表面的95％置信區(qū)間用于統(tǒng)計(jì)學(xué)上評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)。
表4列出了用于每個(gè)試驗(yàn)的每種化合物的濃度范圍。
表4.測(cè)試的濃度范圍

如實(shí)施例1進(jìn)行的，對(duì)于每一組合試驗(yàn)，開(kāi)始時(shí)測(cè)定單個(gè)化合物在MDBK細(xì)胞中抑制BVDV誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)的效力(EC50)(見(jiàn)表5)?？捎^察到單個(gè)藥物效力的最小實(shí)驗(yàn)間波動(dòng)。
表5.保護(hù)MDBK細(xì)胞不受BVDV誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(EC50)

劑量對(duì)EC50的影響隨著干擾素-α2b濃度的增加，栗精胺的EC50顯示了劑量依賴(lài)的減小(表6)。隨著干擾素-α2b的濃度從0增加到60IU/mL，栗精胺的EC50從52μM減少到＜1μM，在20IU/mL干擾素-α2b時(shí)減少了約50倍(表6)。同樣地，隨著栗精胺濃度從0增加到100μM，干擾素-α2b的EC50從16μM減少到＜1μM，在11μM栗精胺時(shí)減少了約2倍(表6)。
表6.劑量對(duì)EC50的影響

雙組合的效力較大的正百分?jǐn)?shù)(協(xié)同作用)量表明了協(xié)同作用。小于25μM/ml2％或25μM(IU/mL(孔)2％的值是不顯著的；在25和50μM/ml2％或25和50μM(IU/mL(孔)2％之間的值被認(rèn)為是較小但顯著的；在50和100μM/ml2％或μM(IU/mL(孔)2％之間的值表明了適度的協(xié)同作用，其可能表明在體內(nèi)的顯著的協(xié)同作用；大于100μM/ml2％或μM(IU/mL(孔)2％的值顯示了強(qiáng)協(xié)同作用，其很可能表示在體內(nèi)的顯著的協(xié)同作用。
栗精胺與干擾素-α2b組合顯示了對(duì)BVDV感染的MDBK細(xì)胞的效力的強(qiáng)協(xié)同作用(表7)，以及在任一測(cè)試的濃度組合都沒(méi)有顯著的拮抗作用(＞-25μM(IU/mL)％；小于-25μM(IU/mL)％的任何值為顯著的拮抗作用)。協(xié)同作用的峰值在栗精胺的濃度為25μM和33μM之間以及干擾素-α2b的濃度為10IU/mL(見(jiàn)圖1)。應(yīng)用等效線(xiàn)圖解法作圖分析組合數(shù)據(jù)證實(shí)了所觀察到的強(qiáng)的協(xié)同作用；例如，在干擾素-α2b為10IU/mL時(shí)，栗精胺的EC50減少了＞7倍，而預(yù)期減少不到2倍(見(jiàn)圖2)。
栗精胺與利巴韋林組合顯示了對(duì)BVDV感染的MDBK細(xì)胞的效力的適度的協(xié)同作用(表7)。協(xié)同作用的峰值在栗精胺的濃度為10μM和50μM之間以及利巴韋林的濃度為1μM和6μM之間(見(jiàn)圖3)。協(xié)同作用達(dá)到的最大百分?jǐn)?shù)在22μM2％和31μM2％之間(見(jiàn)圖3)。在化合物的較高濃度時(shí)可觀察到效力的拮抗作用(-145μM2％)，例如，拮抗作用的峰值發(fā)生在栗精胺的濃度為300μM以及利巴韋林的濃度為30μM時(shí)，它們?cè)隗w內(nèi)是不可能相關(guān)的。拮抗作用達(dá)到的最大百分?jǐn)?shù)約-68μM2％。由栗精胺與利巴韋林組合得到的等效線(xiàn)圖解法曲線(xiàn)圖也表明了栗精胺與利巴韋林之間的協(xié)同作用；例如，在約2μM利巴韋林時(shí)，栗精胺的EC50減少了2到3倍，而預(yù)期減少不到2倍(見(jiàn)圖4)。
干擾素-α2b與利巴韋林結(jié)合顯示了對(duì)BVDV感染的MDBK細(xì)胞的效力的適度的協(xié)同作用(68μM(IU/mL)％)(表7)。類(lèi)似的協(xié)同作用量由Buckwold等人在2003年的文獻(xiàn)中報(bào)道。協(xié)同作用的峰值在干擾素-α2b的濃度為2IU/mL和10IU/mL之間以及利巴韋林的濃度為0.7μM和3.3μM之間(數(shù)據(jù)未示出)。協(xié)同作用達(dá)到的最大百分?jǐn)?shù)在20％和30％之間。在高濃度藥物時(shí)也觀察到效力中的拮抗作用(-102μM(IU/mL)％)，拮抗作用的峰值發(fā)生在干擾素-α2b的濃度≥50IU/mL以及利巴韋林的濃度≥20μM。拮抗作用達(dá)到的最大百分?jǐn)?shù)約-63μM(IU/mL)％。由干擾素-α2b與利巴韋林組合得到的等效線(xiàn)圖解法曲線(xiàn)圖也表明了干擾素-α2b與利巴韋林之間具有協(xié)同作用；例如，在約10IU/mL干擾素-α2b時(shí)，利巴韋林的EC50減少了高達(dá)＞6倍，而預(yù)期減少約2倍(數(shù)據(jù)未示出)。
表7.雙組合治療的效力協(xié)同作用量

CI＝置信區(qū)間；IFN-α2b＝干擾素-α2b
雙組合的細(xì)胞毒性較大的負(fù)百分?jǐn)?shù)(拮抗)量表明了組合對(duì)細(xì)胞具有較小的細(xì)胞毒性作用。小于-25μM/(IU/mL)％被認(rèn)為是顯著的拮抗作用(即，沒(méi)有顯著的細(xì)胞毒性)。
栗精胺與干擾素-α2b組合在未感染的MDBK細(xì)胞中顯示了對(duì)細(xì)胞毒性的適度的拮抗作用(-63μM/(IU/mL)％)，同時(shí)沒(méi)有觀察到協(xié)同作用(＞25μM/(IU/mL)％)(表8)。拮抗作用的波谷位于栗精胺的濃度為50μM和100μM之間以及干擾素-α2b的濃度為大于0.4IU/mL(見(jiàn)圖5)。
拮抗作用達(dá)到的最大百分?jǐn)?shù)在-9％和-17％之間。
栗精胺與利巴韋林組合在未感染的MDBK細(xì)胞中顯示了對(duì)細(xì)胞毒性的適度的拮抗作用(-46μM2％)，同時(shí)沒(méi)有觀察到協(xié)同作用(＞25μM2％)(表8)。拮抗作用的波谷位于栗精胺的濃度大于20μM以及利巴韋林的濃度為約3μM。拮抗作用達(dá)到的最大百分?jǐn)?shù)在-6％和-7％之間(見(jiàn)圖6)。
干擾素-α2b與利巴韋林組合在未感染的MDBK細(xì)胞中顯示了對(duì)細(xì)胞毒性具有平均值為-83μM/(IU/mL)％的適度的拮抗作用，同時(shí)沒(méi)有觀察到顯著的協(xié)同作用(＞25μM2％)(表8)。拮抗作用在兩個(gè)抗病毒藥物的整個(gè)濃度范圍內(nèi)相當(dāng)一致，沒(méi)有區(qū)域發(fā)現(xiàn)比其他區(qū)域具有顯著的較高的拮抗作用(數(shù)據(jù)未顯示)。拮抗作用達(dá)到的最大百分?jǐn)?shù)在-8％和-18％之間。
表8.雙組合治療的細(xì)胞毒性拮抗作用量

CI＝置信區(qū)間；IFN-α2b＝干擾素-α2b
一般地，栗精胺與干擾素-α2b的組合具有強(qiáng)協(xié)同作用(協(xié)同作用量＞100(IU/mL)μM％)。栗精胺與利巴韋林的組合顯示了更為適度的協(xié)同作用(25μM2％和100μM2％之間)。在組合中觀察到的強(qiáng)拮抗作用量發(fā)生在高藥物濃度，它們?cè)谠隗w內(nèi)是不可能相關(guān)的。任一組合的細(xì)胞毒性量均為拮抗作用，顯示了組合對(duì)它們的細(xì)胞毒性作用沒(méi)有顯著影響。這些細(xì)胞毒性的拮抗作用可表明該組合可減少每種化合物的單獨(dú)細(xì)胞毒性。隨著添加的干擾素-α2b濃度的增加，可觀察到栗精胺EC50劑量依賴(lài)的減少(高達(dá)＞52倍)。EC50的這種減少隨著利巴韋林濃度的增加變得更加顯著。所述組合不增加干擾素-α2b或利巴韋林的細(xì)胞毒性。這些數(shù)據(jù)表明了栗精胺與干擾素-α2b的組合以及栗精胺與利巴韋林的組合有益于治療HCV感染患者。
實(shí)施例5栗精胺與金剛胺或NB-DNJ組合的協(xié)同作用和細(xì)胞毒性進(jìn)行細(xì)胞病變分析，以確定栗精胺與IFN-α2b或利巴韋林協(xié)同作用的可能性。采用平均的背景和顏色校正數(shù)據(jù)，在抑制細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)分析法中進(jìn)行雙向組合分析(two-way combination assay)，描述如下。通過(guò)產(chǎn)生“棋盤(pán)”實(shí)現(xiàn)該雙向藥物組合，其中一種藥物水平地、另一種藥物垂直地滴定到以0.01MOI的BVDV感染的MDBK細(xì)胞上。同樣的方法用在未感染的MDBK細(xì)胞上，以觀察該組合對(duì)藥物的細(xì)胞毒性的影響。每一雙向組合進(jìn)行兩次。EC50代表對(duì)BVDV誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(CPE)提供50％保護(hù)的化合物濃度。應(yīng)用MacSynergy軟件程序(由Dr.Mark Prichard贈(zèng)予，University of Alabama，Tuscaloosa，AL)分析EC50數(shù)據(jù)來(lái)確定任何協(xié)同作用(參見(jiàn)，例如上述Ouzounov et al.；Buckwold et al.，Antimicrob.Agents Chemother.472293，2003)。也將M-1914(HCV聚合酶的非核苷HCV抑制劑，不抑制BVDV)作為陰性對(duì)照進(jìn)行了測(cè)試。
對(duì)于每一組合實(shí)驗(yàn)，測(cè)定了每種藥物在MDBK細(xì)胞中抑制BVDV誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)的單獨(dú)效力(EC50)(見(jiàn)表9)
表9.保護(hù)MDBK細(xì)胞不受BVDV誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(EC50)

雙組合效力研究栗精胺與金剛胺的組合在MDBK細(xì)胞中抑制BVDV的細(xì)胞病變作用方面顯示了適度的協(xié)同作用(協(xié)同作用量為60.7μM2％)。栗精胺與NB-DNJ或M-194的組合在MDBK細(xì)胞中抑制BVDV的細(xì)胞病變作用方面沒(méi)有顯著的協(xié)同作用(協(xié)同作用量＜25μM2％)。在栗精胺和金剛胺、栗精胺和NB-DNJ、或栗精胺和M-194的組合之間沒(méi)有觀察到顯著的拮抗作用(協(xié)同作用量＞-25μM2％)(表10)。
表10.組合物治療的效力協(xié)同作用量

CI＝置信區(qū)間；測(cè)試的范圍栗精胺＝33.3-0.4μM；M-1914＝50-3.12μM；金剛胺＝250-31.3；NB-DNJ＝250-31.3雙組合的細(xì)胞毒性研究在未感染的MDBK細(xì)胞中測(cè)定了栗精胺與金剛胺、M-1914或NB-DNJ組合的細(xì)胞毒性。雙組合的細(xì)胞毒性量對(duì)栗精胺與金剛胺、M-1914或NB-DNJ的雙組合是相加性的(協(xié)同作用量＜25μM2％)。對(duì)栗精胺與NB-DNJ的組合沒(méi)有觀察到顯著的拮抗作用(協(xié)同作用量＞-25μM2％)，然而在栗精胺與金剛胺(協(xié)同作用量-40.1μM2％)或栗精胺-M-1914(協(xié)同作用量-26.3μM2％)的組合中觀察到適度的拮抗作用，表明了栗精胺與金剛胺或M-1914的組合可減少它們預(yù)期的毒性。
表11.組合治療的細(xì)胞毒性拮抗作用量

僅采用常規(guī)試驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員就會(huì)意識(shí)到或能確定許多本文中描述的具體實(shí)施方案的等同物。這些等同物也包括在所附權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.治療黃病毒科病毒感染的方法，包括給予個(gè)體栗精胺、或其藥物可接受的鹽，以及改變免疫功能的藥劑。
2.治療黃病毒科病毒感染的方法，包括給予個(gè)體栗精胺、或其藥物可接受的鹽，以及改變黃病毒科病毒復(fù)制的藥劑。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述個(gè)體為人。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述黃病毒科病毒為黃病毒屬成員。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述黃病毒科病毒為瘟病毒屬成員。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述黃病毒為丙肝病毒屬病毒，以及其中所述丙肝病毒屬病毒為丙型肝炎病毒(HCV)。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述改變免疫功能的藥劑為干擾素。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述干擾素為干擾素-α。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述干擾素-α被聚乙二醇化。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中栗精胺和所述改變免疫功能的藥劑順序給藥。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述改變免疫功能的藥劑先于栗精胺給藥。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其中栗精胺先于所述改變免疫功能的藥劑給藥。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中栗精胺和所述改變免疫功能的藥劑同時(shí)給藥。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中栗精胺和所述改變免疫功能的藥劑混合為單一的組合物，并且同時(shí)給藥。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，包括給予個(gè)體(a)包含栗精胺和藥物可接受的載體的組合物，和(b)包含所述改變免疫功能的藥劑和藥物可接受的載體的組合物。
16.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述改變病毒復(fù)制的藥劑為利巴韋林。
17.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述改變病毒復(fù)制的藥劑為干擾素-α。
18.如權(quán)利要求2所述的方法，其中栗精胺和所述改變病毒復(fù)制的藥劑順序給藥。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述改變病毒復(fù)制的藥劑先于栗精胺給藥。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其中栗精胺先于所述改變病毒復(fù)制的藥劑給藥。
21.如權(quán)利要求2所述的方法，其中栗精胺和所述改變病毒復(fù)制的藥劑同時(shí)給藥。
22.如權(quán)利要求2所述的方法，其中栗精胺和所述改變病毒復(fù)制的藥劑混合成為單一組合物，并且同時(shí)給藥。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其中栗精胺和所述改變免疫功能的藥劑協(xié)同地相互作用。
24.如權(quán)利要求2所述的方法，其中栗精胺和所述改變病毒復(fù)制的藥劑協(xié)同地相互作用。
25.治療黃病毒科病毒感染的方法，包括栗精胺與選自如下的藥劑組合(a)抑制黃病毒科病毒感染細(xì)胞的化合物；(b)抑制病毒RNA從病毒衣殼中釋放或抑制黃病毒科病毒基因產(chǎn)物功能的化合物；(c)改變黃病毒科病毒復(fù)制的化合物；(d)改變免疫功能的化合物；(e)改變黃病毒科病毒感染癥狀的化合物；以及(f)治療黃病毒科病毒相關(guān)感染的化合物。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述改變免疫功能的化合物為干擾素。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述干擾素為干擾素-α。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述干擾素為聚乙二醇化干擾素-α。
29.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述改變黃病毒科病毒復(fù)制的化合物為利巴韋林或干擾素-α。
30.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述黃病毒科病毒相關(guān)感染為乙型肝炎病毒(HBV)感染或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒感染為人免疫缺陷病毒感染(HIV)。
32.治療黃病毒科病毒感染的方法，包括給予個(gè)體栗精胺、或其藥物可接受的鹽，以及干擾素。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述干擾素為干擾素-α。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述干擾素為聚乙二醇化干擾素-α。
35.如權(quán)利要求32所述的方法，其中栗精胺和所述干擾素協(xié)同地相互作用。
36.組合物在制備治療黃病毒科病毒感染的藥物中的用途，其中所述組合物包含栗精胺、或其藥物可接受的鹽、以及改變免疫功能的藥劑。
37.如權(quán)利要求36所述的用途，其中所述改變免疫功能的藥劑為干擾素。
38.如權(quán)利要求37所述的用途，其中所述干擾素為干擾素-α。
39.如權(quán)利要求37所述的用途，其中所述干擾素為聚乙二醇化干擾素-α。
40.組合物在制備治療黃病毒科病毒感染的藥物中的用途，其中所述組合物包括栗精胺、或其藥物可接受的鹽，以及改變黃病毒科病毒復(fù)制的藥劑。
41.如權(quán)利要求36所述的用途，其中所述改變黃病毒科病毒復(fù)制的藥劑為利巴韋林。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容主要涉及應(yīng)用栗精胺與其它治療藥劑組合以治療或阻止由Flaviviridae科病毒引起、或與其相關(guān)的感染，尤其是由丙型肝炎病毒(HCV)引起、或與其相關(guān)的感染，以及應(yīng)用這些化合物研究HCV感染的生物機(jī)制。
文檔編號(hào)A61K31/7056GK101035555SQ200580034258
公開(kāi)日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2005年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月6日
發(fā)明者多米尼克·迪古爾 申請(qǐng)人:麥根克斯有限公司