專利名稱：Adamts－8蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ADAMTS-8蛋白及其衍生物和調(diào)節(jié)劑，以及使用它們治療疾病的方法，其中所述疾病表征為蛋白聚糖切割(proteoglycan cleavage)或代謝缺陷或異常。
背景技術(shù)：
ADAMTS(A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondinmotifs，含血小板反應(yīng)蛋白基序的解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶)家族包含至少19個(gè)基于它們共同結(jié)構(gòu)域而彼此相關(guān)的成員。與ADAM家族成員相比，ADAMTS蛋白缺少跨膜結(jié)構(gòu)域，但包含至少一個(gè)血小板反應(yīng)蛋白1型基序。典型的ADAMTS蛋白從N末端到C末端包含信號(hào)序列、前域、金屬蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域、解聯(lián)蛋白樣結(jié)構(gòu)域、中央血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)、富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域和間隔結(jié)構(gòu)域。參見Cal等人，GENE，28349-62(2002)。許多ADAMTS蛋白還在間隔結(jié)構(gòu)域之后包含一個(gè)或多個(gè)血小板反應(yīng)蛋白1型重復(fù)。ADAMTS蛋白能夠通過間隔結(jié)構(gòu)域和一個(gè)或多個(gè)血小板反應(yīng)蛋白1型重復(fù)內(nèi)的相互作用與胞外基質(zhì)的組分結(jié)合。見Kuno和Matsushima，J.BIOL.CHEM.，27313912-13917(1998)。
已經(jīng)闡明了小亞型ADAMTS家族成員的生理作用，而且在一些病例中已經(jīng)暗示了其在人類疾病中的異常表達(dá)。報(bào)道稱ADAMTS-2、ADAMTS-3和ADAMTS-14起前膠原酶(procollagenase)的作用。已經(jīng)確定ADAMTS-2為負(fù)責(zé)加工I型和II型前膠原的前膠原IN-蛋白酶(pNPI)。I型前膠原加工的缺失導(dǎo)致保持著氨基端前肽的膠原纖維(I型pN膠原蛋白)積累。由I型pN膠原蛋白組成的纖維不能提供正常水平的抗張強(qiáng)度，從而導(dǎo)致與疾病相關(guān)的結(jié)締組織缺陷。VIIC型Ehlers-Danlos綜合癥是由于不能將I型前膠原蛋白加工為膠原蛋白，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)完整性喪失和皮膚脆性的人類隱性基因病癥。在牛、羊和一些品系的貓中發(fā)現(xiàn)的相關(guān)疾病稱為皮膚脆裂癥(“皮膚流淚”)。這兩種疾病都與ADAMTS-2活性喪失有關(guān)。ADAMTS-2活性缺失時(shí)，殘余的I型膠原蛋白氨基前肽的切割，這導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)ADAMTS-14也能在體外切割I(lǐng)型膠原蛋白。已經(jīng)提出，ADAMTS-3是主要的II膠原N前肽酶。已經(jīng)確定ADAMTS-13是在A2結(jié)構(gòu)域內(nèi)特定的酪氨酸-甲硫氨酸鍵處切割血管性血友病因子(vonWillebrand factor，vWF)的血漿蛋白酶。血栓性血小板減少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)是表征為微血管血栓形成、低血小板計(jì)數(shù)以及貧血的綜合癥。假定從內(nèi)皮細(xì)胞釋放的大量vWF(UL-vWF)多聚體缺乏適當(dāng)切割可以導(dǎo)致TTP。對4個(gè)家族TTP譜系的遺傳分析表明，ADAMTS-13基因突變是這種病癥的主要原因。
已經(jīng)表明ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5和ADAMTS-9能夠以不同程度的效率切割胞外基質(zhì)的蛋白聚糖。例如，ADAMTS-1、ADAMTS-4和ADAMTS-5能切割聚集蛋白聚糖球間(interglobal)結(jié)構(gòu)域(IGD)中的谷氨酸373-丙氨酸374鍵。參見Caterson等人，MATRIXBIOLOGY，19333-344(2000)。這種蛋白酶解活性稱為聚集蛋白聚糖酶活性，而谷氨酸373-丙氨酸374鍵已知為聚集蛋白聚糖酶切割位點(diǎn)。具有聚集蛋白聚糖酶活性的蛋白稱為聚集蛋白聚糖酶。退行性關(guān)節(jié)疾病如骨性關(guān)節(jié)炎過程中，谷氨酸373-丙氨酸374鍵在體內(nèi)被水解。證據(jù)表明，聚集蛋白聚糖酶負(fù)責(zé)軟骨降解過程中主要的IGD切割。參見Caterson等人，supra。也發(fā)現(xiàn)ADAMTS-4在切割短小蛋白聚糖(成年人大腦中豐富的蛋白聚糖)中起作用，而且表明其和ADAMTS-1一起切割多功能蛋白聚糖。
血管發(fā)生中涉及ADAMTS-8(也已知為Meth2)。研究顯示，重組的ADAMTS-8能在體外抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并在體內(nèi)檢測中抑制血管形成。參見，例如Vazquez等人，J.BIOL.CHEM.，27423349-23357(1999)。ADAMTS-8在體內(nèi)或體外都表現(xiàn)出比血小板反應(yīng)蛋白-1或內(nèi)皮抑制素(endostain)更加有效地破壞血管發(fā)生、但仍不及ADAMTS-1有效。ADAMTS-8未鑒定出蛋白酶活性。
發(fā)明簡述本發(fā)明的特征在于分離的ADAMTS-8蛋白切割蛋白聚糖的用途。適合這個(gè)目的的方法包括用分離的ADAMTS-8蛋白接觸蛋白聚糖分子，其中所述ADAMTS-8蛋白切割蛋白聚糖分子。在許多實(shí)施方案中，被切割的蛋白聚糖分子是聚集蛋白聚糖分子，而且該分離的ADAMTS-8蛋白在谷氨酸373-丙氨酸374鍵處切割聚集蛋白聚糖分子。本發(fā)明所用ADAMTS-8蛋白可以是全長、成熟的ADAMTS-8蛋白。在一個(gè)實(shí)例中，所用ADAMTS-8蛋白包含或者由SEQ ID NO28的214-890位氨基酸組成。在另一實(shí)例中，所用ADAMTS-8蛋白由GeneBank登錄號(hào)AF060153編碼，但缺失信號(hào)肽和前域。
本發(fā)明的特征也在于以分離的ADAMTS-8衍生物切割蛋白聚糖的用途。這些ADAMTS-8衍生物包括ADAMTS-8的金屬蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域，并且具有全長、成熟的ADAMTS-8蛋白的蛋白聚糖切割活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)。用這種ADAMTS-8衍生物接觸蛋白聚糖分子(例如聚集蛋白聚糖分子)來切割蛋白聚糖分子。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明所用ADAMTS-8的金屬蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域包含或者由SEQ ID NO28的214-439位氨基酸組成。ADAMTS-8衍生物還可以包含ADAMTS-8解聯(lián)蛋白樣結(jié)構(gòu)域和/或ADAMTS-8中央血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)。
適合本發(fā)明的ADAMTS-8衍生物可以通過任意常規(guī)方法制備。在許多情況下，ADAMTS-8衍生物不包含信號(hào)肽或前域。ADAMTS-8衍生物可以從全長的ADAMTS-8蛋白通過刪除、插入或取代選定的氨基酸殘基來制備。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所用ADAMTS-8衍生物包含或者由SEQ ID NO28的214-588位氨基酸組成。已經(jīng)表明，由相應(yīng)氨基酸序列組成的ADAMTS-7或ADAMTS-9衍生物保持原始全長蛋白質(zhì)的聚集蛋白聚糖酶活性。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于重組產(chǎn)生的ADAMTS-8蛋白或它們的衍生物切割蛋白聚糖的用途。適合這個(gè)目的的方法包括從重組表達(dá)載體中表達(dá)ADAMTS-8蛋白或其衍生物。該表達(dá)的ADAMTS-8蛋白或衍生物接觸后切割蛋白聚糖分子(例如聚集蛋白聚糖分子)。本文描述的任意ADAMTS-8蛋白或衍生物都可以重組產(chǎn)生。在許多實(shí)施方案中，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)重組載體編碼的ADAMTS-8蛋白或衍生物，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞將表達(dá)的蛋白質(zhì)或衍生物分泌進(jìn)入培養(yǎng)基或胞外基質(zhì)區(qū)域。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明所用重組表達(dá)載體包含SEQ ID NO28的214-890位氨基酸的編碼序列。在另一實(shí)例中，本發(fā)明所用重組表達(dá)載體包含SEQ IDNO28的214-588位氨基酸的編碼序列。在另一實(shí)例中，本發(fā)明所用重組表達(dá)載體包含GeneBank登錄號(hào)AF060153的蛋白質(zhì)編碼序列。
根據(jù)本發(fā)明被切割的蛋白聚糖可以定位于組織、組織培養(yǎng)物或細(xì)胞培養(yǎng)物中。分離或重組產(chǎn)生的ADAMTS-8蛋白或衍生物可以通過任意常規(guī)方法遞送至組織部位，其中所述任意常規(guī)方法例如通過腸胃外、靜脈內(nèi)、局部、皮內(nèi)、經(jīng)皮或皮下給予，或者通過向組織部位上選定的細(xì)胞中引入編碼ADAMTS-8蛋白或衍生物的表達(dá)載體。
本發(fā)明的特征也在于鑒定ADAMTS-8調(diào)節(jié)劑的方法。這些方法包括在存在或不存在目的試劑時(shí)，用蛋白聚糖分子(例如聚集蛋白聚糖分子)接觸ADAMTS-8蛋白或衍生物；并測定存在或不存在該試劑時(shí)，ADAMTS-8蛋白或衍生物的蛋白聚糖切割活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)。
與不存在所述試劑時(shí)相比，存在該試劑時(shí)蛋白聚糖切割活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)的改變表明該試劑能夠調(diào)節(jié)ADAMTS-8蛋白或衍生物的蛋白聚糖切割活性。本文所述的任意ADAMTS-8蛋白或衍生物都可以用來篩選ADAMTS-8的調(diào)節(jié)劑。根據(jù)本發(fā)明鑒定的調(diào)節(jié)劑可以抑制(例如降低或消除)或增強(qiáng)ADAMTS-8蛋白的蛋白聚糖切割活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)。
本發(fā)明的特征也在于ADAMTS-8調(diào)節(jié)劑治療疾病的用途，其中所述疾病表征為蛋白聚糖切割(例如聚集蛋白聚糖切割)缺陷或異常。適合這個(gè)目的的方法包括向需要其的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的ADAMTS-8調(diào)節(jié)劑。只要ADAMTS-8調(diào)節(jié)劑能夠到達(dá)預(yù)期組織部位、并在該部位有效地改變蛋白聚糖切割活性，那么可以使用任何給藥途徑。通過本發(fā)明鑒定的任意ADAMTS-8調(diào)節(jié)劑都可以用來治療蛋白聚糖缺陷或異常。
組織部位的蛋白聚糖切割活性也可以通過在該部位引入分離的ADAMTS-8蛋白或衍生物、或者通過在該部位表達(dá)重組的ADAMTS-8蛋白或衍生物來調(diào)節(jié)。此外，胞外基質(zhì)區(qū)域中的蛋白聚糖切割活性可以通過抑制該區(qū)域所選細(xì)胞中ADAMTS-8的表達(dá)來調(diào)節(jié)。適合這個(gè)目的的方法包括但不局限于在所選細(xì)胞中引入或表達(dá)ADAMTS-8的RNAi或反義序列。許多情況下，所用RNAi或反義序列是ADAMTS-8基因特異的，并且不抑制其他蛋白酶基因的表達(dá)。
本發(fā)明的特征也在于包含ADAMTS-8蛋白或其衍生物或調(diào)節(jié)劑的藥物組合物。
本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點(diǎn)在下文的詳細(xì)描述中是顯而易見的。但是，應(yīng)當(dāng)理解的是，在說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案時(shí)的詳細(xì)描述僅作為示例性說明，并不作為限制。從詳細(xì)描述中可見本發(fā)明范疇之內(nèi)的多種改變或變更對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
附圖簡述附圖用來進(jìn)行示例性陳述而不作為限制。


圖1闡明了ADAMTS家族成員的進(jìn)化系統(tǒng)樹。用CLUSTALW比較了多個(gè)ADAMTS蛋白質(zhì)的氨基酸序列，并用TreeView展示。系統(tǒng)發(fā)生圖基于序列相關(guān)性對蛋白質(zhì)進(jìn)行分組。
圖2A顯示從CHO條件培養(yǎng)基分離的，以Strep-tag純化(IBA，Germany)的ADAMTS-8蛋白的蛋白質(zhì)級分的10％SDS-PAGE。SDS-PAGE用考馬斯亮藍(lán)染色。泳道1、CHO細(xì)胞的條件培養(yǎng)基；泳道2、超濾液(ultrafiltration)的流出級分(濾出液)；泳道3、濃縮超濾液的存留級分；泳道4、Streptactin柱流出級分；泳道5-9、Streptactin柱洗滌級分；泳道10-15、Streptactin柱洗脫級分。
圖2B是圖2A SDS-PAGE的Western印跡，其中使用抗Strep-TagII的多克隆抗血清(IBA)。
圖3A描述76種不同人組織中mRNA的多組織表達(dá)陣列，其中用人ADAMTS-8基因的cDNA片段探針探測。
圖3B顯示圖3A的多組織表達(dá)陣列中所用mRNA的來源?？瞻卓?blank box)表明在那些坐標(biāo)處沒有mRNA被雜交上斑點(diǎn)。具有高相對豐度ADAMTS-8mRNA的組織是肺(A8)、主動(dòng)脈(B4)和胎兒心臟(B11)，而在闌尾(G5)和大腦的多個(gè)區(qū)域(A1-G1、C3-H3和B3)檢測到低水平的ADAMTS-8mRNA。
圖4顯示通過實(shí)時(shí)PCR測定的無病和患骨性關(guān)節(jié)炎性軟骨的人臨床樣品中ADAMTS-8mRNA表達(dá)水平的柱狀圖。樣品W-04至W-13代表非OA感染(“無病”)的膝關(guān)節(jié)軟骨。樣品W-77M至W-96M代表代表晚期OA關(guān)節(jié)軟骨的可見非感染區(qū)域(“溫和OA”)。樣品88S-98S代表晚期OA關(guān)節(jié)軟骨的嚴(yán)重感染區(qū)域(“嚴(yán)重OA”)。每個(gè)樣品中ADAMTS-8mRNA的豐度都報(bào)道為標(biāo)準(zhǔn)值，其中用ADAMTS-8測得的平均數(shù)據(jù)除以同一樣品中GAPDH測得的平均數(shù)據(jù)。
圖5顯示用單克隆抗體AGG-C1進(jìn)行競爭性抑制ELISA的結(jié)果。用生物素化的aggc1肽包被鏈霉親和素包被的微量滴定板。抑制分析用下列競爭劑進(jìn)行合成肽GGLPLPRNITEGE(SEQ ID NO22，實(shí)心框)、GGLPLPRNITEGEARGSVILTVK-CONH2(SEQ ID NO23，空心框)、經(jīng)ADAMTS-4消化的聚集蛋白聚糖(實(shí)心圓)和未經(jīng)消化的聚集蛋白聚糖(空心圓)。
圖6A是經(jīng)ADAMTS-4和ADAMTS-8消化的牛聚集蛋白聚糖，用單克隆抗體BC-3進(jìn)行的Western印跡。將牛聚集蛋白聚糖不與或與ADAMTS-4或ADAMTS-8于37℃孵育16小時(shí)。用SDS-PAGE分離消化產(chǎn)物，并通過用單克隆抗體BC-3進(jìn)行Western免疫印跡來顯示。泳道1、未加入酶；泳道2、經(jīng)ADAMTS-4消化的聚集蛋白聚糖(1∶20摩爾比的酶∶底物)；泳道3-7、經(jīng)ADAMTS-8消化的聚集蛋白聚糖，其中酶與底物的摩爾比如每泳道上所示)。印跡左側(cè)顯示球形蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的遷移位置。
圖6B是經(jīng)ADAMTS-8消化的牛聚集蛋白聚糖，用單克隆抗體AGG-C1進(jìn)行的Western印跡。將牛聚集蛋白聚糖不與或與摩爾比率逐漸增加的ADAMTS-8于37℃孵育16小時(shí)。用SDS-PAGE分離消化產(chǎn)物，并通過用單克隆抗體AGG-C1進(jìn)行Western印跡來顯示。給出了每個(gè)消化物中酶∶底物的相對摩爾比率。
圖6C描述經(jīng)ADAMTS-4消化的牛聚集蛋白聚糖，用單克隆抗體AGG-C1進(jìn)行的Western印跡。將牛聚集蛋白聚糖(12.5pmol)不與或分別與0.05ng、0.1ng、0.25ng、0.5ng或1ng ADAMTS-4于37℃孵育16小時(shí)。用SDS-PAGE分離消化產(chǎn)物，并通過用AGG-C1進(jìn)行Wester免疫印跡來顯示。給出了每個(gè)消化物中酶∶底物的相對摩爾比率。
圖7顯示聚集蛋白聚糖酶活性的競爭性抑制ELISA結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)曲線通過用增加量的重組ADAMTS-4與牛聚集蛋白聚糖在37℃孵育16小時(shí)、隨后，往每個(gè)消化物中加入單克隆抗體AGG-C1制備。大約需要1ngADAMTS-4來產(chǎn)生導(dǎo)致競爭性抑制ELISA中45％抑制的聚集蛋白聚糖切割產(chǎn)物量。
發(fā)明詳述本發(fā)明的特征在于ADAMTS-8蛋白或其衍生物切割蛋白聚糖分子的用途。本發(fā)明的特征也在于鑒定能夠抑制或增強(qiáng)ADAMTS-8蛋白酶解活性的ADAMTS-8調(diào)節(jié)劑的方法。此外，本發(fā)明提供了包含ADAMTS-8蛋白或其衍生物或調(diào)節(jié)劑的藥物組合物。這些藥物組合物可以用來治療表征為蛋白聚糖切割或代謝缺陷或異常的病癥。
下文部分詳細(xì)描述了本發(fā)明的多個(gè)方面。這些部分的用途不在于限制發(fā)明。每個(gè)部分都可以應(yīng)用于發(fā)明的任何方面。在本申請中，除非另外說明，否則“或”都用來表示“和/或”。
I.ADAMTS-8蛋白及其功能性衍生物本發(fā)明的特征在于成熟的ADAMTS-8蛋白切割聚集蛋白聚糖或其他蛋白聚糖分子的用途。成熟的ADAMTS-8蛋白缺少信號(hào)肽和前域。合適的成熟ADAMTS-8蛋白的實(shí)例包括但不局限于全長、成熟的ADAMTS-8蛋白(例如由GeneBank登錄號(hào)AF060153編碼、經(jīng)弗林蛋白酶加工的ADAMTS-8蛋白)，以及通過輔助結(jié)構(gòu)域的可變性RNA剪接或蛋白酶解加工產(chǎn)生的ADAMTS-8同工型。已經(jīng)在ADAMTS-8家族的某些成員中觀察到可變性RNA剪接，其導(dǎo)致刪除一個(gè)或多個(gè)C末端血小板反應(yīng)蛋白1型重復(fù)。也已經(jīng)報(bào)道，某些ADAMTS-8家族成員在成熟過程中蛋白酶解地移去C末端的輔助結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明也涉及未加工的ADAMTS蛋白質(zhì)切割聚集蛋白聚糖或其他聚糖分子的用途。這些未加工的蛋白質(zhì)包含信號(hào)肽或前域。在許多情況下，未加工的ADAMTS-8蛋白在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中重組表達(dá)，并分泌進(jìn)入培養(yǎng)基或胞外基質(zhì)區(qū)域。這些分泌的蛋白質(zhì)一般缺少信號(hào)序列。這些蛋白質(zhì)可以進(jìn)一步進(jìn)行蛋白酶解來除去前域。
本發(fā)明所用的ADAMTS-8蛋白可以是天然存在的蛋白質(zhì)，例如由GeneBank登錄號(hào)AF060153編碼的蛋白質(zhì)或其天然存在的蛋白酶解產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明所用的ADAMTS-8蛋白包含SEQ ID NO28的214-890位氨基酸。
本發(fā)明的特征也在于天然存在的ADAMTS-8蛋白變體切割聚集蛋白聚糖或其他蛋白聚糖分子的用途。這些變體保持著原始蛋白質(zhì)的蛋白聚糖切割活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)。變體的氨基酸序列與原始蛋白質(zhì)的氨基酸序列基本是同一性的。在一個(gè)實(shí)例中，變體的氨基酸序列具有與原始蛋白質(zhì)至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高的整體序列同一性或相似性。序列同一性或相似性可以用本領(lǐng)域已知的多種方法測定。例如，序列同一性或相似性可以用標(biāo)準(zhǔn)比對算法測定，如Altschul等人J.MOL.BIOL.，215403-410(1990)中描述的局部比對基本工具(Basic Local Alignment Tool，BLAST)、Needleman等人J.MOL.BIOL.，48444-453(1970)的算法、Meyers等人COMPUT.APPL.BIOSCI.，411-17(1988)的算法和點(diǎn)陣分析(dot matrixanalysis)。適合這個(gè)目的的軟件包括但不局限于國家生物技術(shù)信息中心(Bethesda，MD)提供的BLAST程序和DNASTAR公司(Madison，WI)提供的MegAlign。在一個(gè)實(shí)例中，序列同一性和相似性用GeneticsComputer Group(GCG)程序GAP(Needleman-Wunsch算法)測定。使用程序設(shè)計(jì)的默認(rèn)值(例如序列之一中空位罰分為11，而延伸空位罰分為8)。相似的氨基酸可以用BLOSUM62取代矩陣定義。
ADAMTS-8蛋白變體可以天然存在，例如通過等位基因變異或多態(tài)現(xiàn)象，或是故意產(chǎn)生的。在許多實(shí)例中，可以在蛋白質(zhì)序列中引入保守氨基酸取代而不顯著改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或生物學(xué)性質(zhì)。保守氨基酸取代可以在殘基極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性或兩親性質(zhì)相似的基礎(chǔ)上進(jìn)行。例如，保守氨基酸取代可以在具堿性側(cè)鏈例如賴氨酸(Lys或K)、精氨酸(Am或R)和組氨酸(His或H)的氨基酸、具酸性側(cè)鏈例如天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)的氨基酸、具不帶電荷極性側(cè)鏈例如天冬酰胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gln或Q)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)和酪氨酸(Tyr或Y)的氨基酸、具非極性側(cè)鏈例如丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、纈氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、異亮氨酸(Ile或I)、脯氨酸(Pro或P)、苯丙氨酸(Phe或F)、甲硫氨酸(Met或M)、色氨酸(Trp或W)和半胱氨酸(Cys或C)的氨基酸之間進(jìn)行。其他合適的氨基酸取代如表1所示。
表1.示例性氨基酸取代


非天然存在的氨基酸殘基也可以用于取代。這些氨基酸殘基一般通過化學(xué)肽合成引入，而非在生物系統(tǒng)中合成。
此外，ADAMTS-8變體可以包含增加分子穩(wěn)定性的氨基酸取代。其他期望的氨基酸取代(無論是保守的還是非保守的)也可以引入ADAMTS-8蛋白。例如，可以鑒定對ADAMTS-8蛋白的蛋白酶解性質(zhì)重要的氨基酸殘基?？梢赃x擇能夠或者降低蛋白酶解活性的取代。
此外，ADAMTS-8變體可以包含糖基化位點(diǎn)修飾。這些修飾可以涉及O-連接或N-連接的糖基化位點(diǎn)。例如，可以取代或刪除與天冬酰胺連接的糖基化識(shí)別位點(diǎn)處的氨基酸殘基，從而導(dǎo)致部分糖基化或者糖基化的完全缺失。與天冬酰胺連接的糖基化識(shí)別位點(diǎn)一般包含被適當(dāng)細(xì)胞糖基化酶識(shí)別的三肽序列。這些三肽序列可以是，例如天冬酰胺-X-蘇氨酸或天冬酰胺-X-絲氨酸，其中所述X一般為任意氨基酸。糖基化識(shí)別位點(diǎn)第一或第三個(gè)氨基酸位置上一處或兩處的多種氨基酸取代或刪除(或者第二個(gè)位置的氨基酸刪除)可以導(dǎo)致修飾的三肽序列處非糖基化。此外，細(xì)菌表達(dá)也導(dǎo)致產(chǎn)生非糖基化的蛋白質(zhì)，即使糖基化位點(diǎn)未被修飾。
也可以在ADAMTS-8變體中引入其他類型的修飾。這些修飾可以通過天然發(fā)生過程例如翻譯后修飾，或者通過人工或合成過程引入。修飾可以發(fā)生在多肽的任意位置，其中包括主鏈、氨基酸側(cè)鏈、以及氨基或羧基末端。相同類型的修飾可以以相同或不同程度出現(xiàn)在變體的幾個(gè)位置。變體也可以包括許多不同類型的修飾。適合本發(fā)明的修飾包括但不局限于乙?；?、?；饔谩DP-核糖基化、酰胺化、黃素共價(jià)吸附(covalentattachment)、血紅素部分共價(jià)吸附、核苷酸或核苷酸衍生物共價(jià)吸附、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物共價(jià)吸附、磷脂酰肌醇共價(jià)吸附、交叉連接、環(huán)化、形成二硫鍵、脫甲基作用、形成共價(jià)交叉連接、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸(pyroglutamate)、甲酰化、γ-羥基化、糖基化、形成GPI錨定、羧基化、碘化、甲基化、亞寇?；?、氧化、pegylation、蛋白酶水解加工、磷酸化、異戊二烯化(prenylation)、外消旋化、selenoylation、硫酸鹽化、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)氨基酸加入、例如精氨酸(arginylation)、泛素化或其任意組合。多肽變體可以是分支的(例如泛素化的結(jié)果)，或者是具或不具分支的環(huán)形。
本發(fā)明所用ADAMTS-8變體可以與原始的ADAMTS-8蛋白在一個(gè)或多個(gè)區(qū)域基本相同，而在其他區(qū)域不同。ADAMTS-8變體可以保持原始ADAMTS-8蛋白的整體結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，變體通過修飾天然存在的ADAMTS-8序列至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50個(gè)或更多氨基酸殘基來制備。示例性修飾包括但不局限于取代、刪除和插入。取代可以是保守的、非保守的或者兩者兼而有之。這些修飾不顯著地影響原始蛋白質(zhì)的蛋白酶解活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)。例如，變體可以保持原始ADAMTS-8蛋白至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的蛋白酶解活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)。變體也可以具有比最初ADAMTS-8蛋白提高了的蛋白酶解活性(例如提高了的聚集蛋白聚糖酶活性)。
本發(fā)明的特征還在于ADAMTS-8衍生物切割聚集蛋白聚糖或蛋白聚糖分子的用途。這些ADAMTS-8衍生物為具一個(gè)或更多氨基酸殘基刪除或修飾的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)例中，ADAMTS-8衍生物包括刪除全長ADAMTS-8蛋白輔助結(jié)構(gòu)域的實(shí)質(zhì)部分。在另一實(shí)例中，ADAMTS-8衍生物包括從全長ADAMTS-8蛋白中刪除間隔結(jié)構(gòu)域和C-末端血小板反應(yīng)蛋白1型重復(fù)。也可為刪除間隔結(jié)構(gòu)域和C末端血小板反應(yīng)蛋白1型重復(fù)之后的任意區(qū)域。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所用ADAMTS-8衍生物包括刪除實(shí)質(zhì)部分定位于SEQ ID NO28苯丙氨酸588之后的氨基酸殘基。已經(jīng)表明，具相應(yīng)序列刪除的ADAMTS-7或ADAMTS-9截短保持著原始蛋白質(zhì)的聚集蛋白聚糖酶活性。從全長ADAMTS-8蛋白刪除的氨基酸殘基可包括但不局限于定位在苯丙氨酸588C末端的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸殘基。被刪除的氨基酸殘基可以選自富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、間隔結(jié)構(gòu)域、C末端血小板反應(yīng)蛋白1型重復(fù)或任何定位于其間或其后的區(qū)域。被刪除的殘基可以是連續(xù)或非連續(xù)的。在一個(gè)實(shí)例中，ADAMTS-8衍生物包含或由SEQ IDNO28的214-588位氨基酸組成。
也可以修飾ADAMTS-8蛋白N末端區(qū)域中的氨基酸殘基。例如，可以刪除或修飾信號(hào)序列、前域、金屬蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域、解聯(lián)蛋白樣結(jié)構(gòu)域或中央血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)中的某些選定殘基，而不顯著降低ADAMTS-8蛋白的蛋白酶解活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)。
可以在ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物的N末端或C末端融合附加多肽。這些多肽的非限制性實(shí)例包括肽標(biāo)記、酶、抗體、受體、配體/受體結(jié)合蛋白或它們的組合。適合這個(gè)目的的抗體包括但不局限于多克隆的、單克隆的、單特異性的、多特異性的、非特異性的、人源化的、人的、單鏈的、嵌合的、合成的、重組的、雜合的、突變的、移植的或體外產(chǎn)生的抗體。也可以使用抗體片段。這些抗體的實(shí)例包含但不局限于Fab、F(ab’)2、Fv、Fd或dAb。
ADAMTS-8蛋白或其衍生物也可以加上肽標(biāo)記。適當(dāng)?shù)碾臉?biāo)記包括但不局限于Strep-tag(IBA)、多組氨酸或多組氨酸-甘氨酸標(biāo)記、FLAG表位標(biāo)記、KT3表位標(biāo)記、流感HA標(biāo)記多肽、c-myc標(biāo)記、單純皰疹糖蛋白D、β-半乳糖苷酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、鏈霉親和素標(biāo)記、微觀蛋白表位肽、T7基因10蛋白肽標(biāo)記和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。針對這些肽標(biāo)記的抗體可以容易地從多種商品化來源獲得。代表性抗體包括抗流感HA標(biāo)記多肽的抗體12CA5、以及抗c-myc標(biāo)記的抗體8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10。可以在肽標(biāo)記和原始蛋白質(zhì)之間加入肽接頭來增強(qiáng)肽標(biāo)記的可及性。
可以在加入的多肽和原始蛋白質(zhì)之間引入可蛋白酶解切割的位點(diǎn)。這些可切割位點(diǎn)使得能夠從加入的多肽中分離最初的蛋白質(zhì)。適合這個(gè)目的的酶包括但不局限于Xa因子、凝血酶和腸激酶。
所加入的多肽可以用來方便蛋白質(zhì)的純化、檢測、固定化、折疊或靶向、或者服務(wù)其他預(yù)期目的。這些多肽也可以用來增加融合蛋白的表達(dá)、可溶性或穩(wěn)定性。在許多實(shí)施方案中，所加入的多肽不顯著影響融合蛋白的蛋白酶解活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)。
II.編碼ADAMTS-8蛋白或其衍生物的多核苷酸編碼ADAMTS-8蛋白或其衍生物的多核苷酸可以用多種方法制備。這些多核苷酸可以是DNA、RNA或其他可表達(dá)的核酸分子。它們可以是單鏈或雙鏈。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用GeneBank登錄號(hào)AF060153來制備ADAMTS-8蛋白或其衍生物的編碼序列?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)在GeneBank登錄號(hào)AF060153的蛋白質(zhì)編碼序列中引入刪除或其他修飾。DNA刪除/修飾的示例性技術(shù)包括但不局限于PCR介導(dǎo)的誘變、寡核苷酸指導(dǎo)的“環(huán)出”誘變、PCR重疊延伸、用外切核酸酶III進(jìn)行的控時(shí)消化、megaprimer方法、反向PCR和自動(dòng)DNA合成。
也可以用缺失文庫。這些缺失文庫包括N末端、C末端和中間缺失的ADAMTS-8蛋白的編碼序列。構(gòu)建缺失文庫的示例性方法包括但不局限于Pues等人NUCLEIC ACIDS RES.，251303-1305(1997)中描述的方法。也可以用商品化的缺失試劑盒，例如EZ∷TN Plasmid-Based DeletionMachine和pWEB∷TNCTMDeletion Cosmid Transpositon Kit(Epicentre，Madison，WI)來產(chǎn)生ADAMTS-8缺失文庫。選擇保持著原始ADAMTS-8蛋白的蛋白酶解活性的缺失。
本發(fā)明所用多核苷酸可以通過修飾來增加它們的體內(nèi)穩(wěn)定性。可能的修飾包括但不局限于在5’或3’末端加入側(cè)翼序列、在主鏈中用硫代磷酸酯或2-O-甲基代替磷酸二酯酶連接、以及包含非傳統(tǒng)性堿基例如肌苷、辮苷和懷丁苷以及乙?；?、甲基、硫代或其他修飾形式的腺嘌呤、胞嘧啶核苷、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶核苷。
本發(fā)明的特征也在于編碼ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物的表達(dá)載體。這些表達(dá)載體包含與編碼ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物的蛋白質(zhì)編碼序列有效連接的5’或3’非翻譯調(diào)節(jié)序列。表達(dá)載體的設(shè)計(jì)取決于諸如對宿主菌和預(yù)期表達(dá)水平的選擇等因素。合適表達(dá)載體的非限制性實(shí)例包括細(xì)菌表達(dá)載體、酵母表達(dá)載體、昆蟲表達(dá)載體和哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。也可以使用病毒載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、甲病毒、星狀病毒、冠狀病毒、正黏病毒、乳多空病毒、副黏病毒、細(xì)小病毒、小RNA病毒、痘病毒或披膜病毒。本發(fā)明所用表達(dá)載體可以受組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制。
本發(fā)明也涉及組織特異性或發(fā)育調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子的用途。合適的組織特異性啟動(dòng)子包括但不局限于軟骨特異性啟動(dòng)子、腦特異性啟動(dòng)子、肺特異性啟動(dòng)子、主動(dòng)脈特異性啟動(dòng)子、闌尾特異性啟動(dòng)子、肝特異性啟動(dòng)子、淋巴特異性啟動(dòng)子、胰特異性啟動(dòng)子、乳腺特異性啟動(dòng)子、軟骨細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子和T細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。發(fā)育調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不局限于α-甲胎蛋白啟動(dòng)子。組織特異性或發(fā)育調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子的使用使得ADAMTS-8蛋白或其衍生物在預(yù)定組織中或者在特定發(fā)育階段選擇性表達(dá)。
也可以用可調(diào)控的表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)ADAMTS-8蛋白或其衍生物。適合這個(gè)目的的系統(tǒng)包括但不局限于Tet開/關(guān)系統(tǒng)、蛻皮激素系統(tǒng)、孕酮系統(tǒng)和納巴霉素系統(tǒng)。
III.ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物的表達(dá)和純化可以將編碼ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物的表達(dá)載體穩(wěn)定或瞬時(shí)地引入宿主細(xì)胞來進(jìn)行表達(dá)。所表達(dá)的蛋白質(zhì)可以用常規(guī)方法從宿主細(xì)胞中分離。適合這個(gè)目的的宿主細(xì)胞包括但不局限于真核細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或酵母)和原核細(xì)胞(例如細(xì)菌)。合適的真核宿主細(xì)胞的非限制型性實(shí)例包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、HeLa細(xì)胞、COS細(xì)胞、293細(xì)胞和CV-1細(xì)胞。真核宿主細(xì)胞通常提供預(yù)期的翻譯后修飾，例如所表達(dá)蛋白質(zhì)的糖基化。合適的原核宿主細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括大腸桿菌(E.coli)(例如HB101、MC1O61)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和假單胞桿菌屬(Pseudomonas)。本發(fā)明所用宿主細(xì)胞可以是細(xì)胞系、原代細(xì)胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物。它們也可以是轉(zhuǎn)基因或嵌合動(dòng)物中的細(xì)胞。選擇合適的宿主細(xì)胞和培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、篩選以及產(chǎn)物生產(chǎn)和純化是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員水平內(nèi)的常規(guī)設(shè)計(jì)問題。
在一個(gè)實(shí)施方案中，ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)，其中所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞將所表達(dá)的蛋白質(zhì)分泌進(jìn)入培養(yǎng)基。分泌的產(chǎn)物可以用標(biāo)準(zhǔn)分離/純化技術(shù)分離或純化，例如親和層析(包括免疫親和層析)、離子交換層析、疏水作用層析、大小排斥層析、HPLC、蛋白質(zhì)沉淀(包括免疫沉淀)、差別溶解(differential solubilization)、電泳、離心、結(jié)晶或其任意組合?？梢杂眉兓瘶?biāo)記例如鏈霉親和素標(biāo)記、FLAG標(biāo)記、多組氨酸標(biāo)記或谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶來方便分離所表達(dá)的蛋白質(zhì)。在所表達(dá)的蛋白質(zhì)純化之后，可以將純化標(biāo)記從其上切割下來。純化標(biāo)記也可以用來從細(xì)胞裂解物中分離或純化非分泌的ADAMTS-8蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)，并在這些細(xì)胞的包涵體中濃縮。經(jīng)濃縮的蛋白質(zhì)可以從包涵體中溶解、重折疊、然后用上述方法分離。
所分離的ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分析或鑒定，例如SDS-PAGE或免疫印跡。分離的蛋白質(zhì)也可以通過蛋白質(zhì)測序或質(zhì)譜法分析。在一個(gè)實(shí)例中，手工從膠中切下SDS-PAGE中的目的蛋白質(zhì)條帶，然后還原、烷化、并用胰蛋白酶或內(nèi)肽酶Lys-C(Promega，Madison，WI)消化。消化可以用自動(dòng)膠內(nèi)消化儀器在原位進(jìn)行。消化之后，濃縮肽抽提物，并用微電噴射(microelectrospray)反相HPLC分離。肽分析可以在Finnigan LCQ離子阱質(zhì)譜儀(ThermoQuest，San Jose，CA)上進(jìn)行?？梢杂冒贔innigan Bioworks數(shù)據(jù)分析軟件包(ThermoQuest，San Jose，CA)的SEQUEST計(jì)算機(jī)算法進(jìn)行MS/MS數(shù)據(jù)的自動(dòng)分析。
本發(fā)明的特征也在于ADAMTS-8蛋白或其衍生物在無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)中的表達(dá)。適當(dāng)?shù)臒o細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)包括但不局限于麥胚提取物、網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物和Hela核提取物。所表達(dá)的蛋白質(zhì)可以用上述方法進(jìn)行分離和純化。
IV.蛋白酶解活性檢測聚集蛋白聚糖酶活性可以用熒光肽測試、新肽Western印記、聚集蛋白聚糖ELISA或活性測試來評測。前兩個(gè)測試適合檢測在聚集蛋白聚糖IGD中谷氨酸373-丙氨酸374鍵的切割能力。
在熒光肽測試中，用包含聚集蛋白聚糖酶切割位點(diǎn)氨基酸序列的合成肽與ADAMTS-8蛋白(或其衍生物)孵育。在合成肽的N末端或C末端標(biāo)記熒光團(tuán)，而在另一末端包含淬滅劑。肽的切割分離了熒光團(tuán)和淬滅劑，從而誘導(dǎo)出熒光。相對熒光可以用來測定蛋白質(zhì)的相對聚集蛋白聚糖酶活性。
在新肽Western印跡中，用完整的聚集蛋白聚糖與ADAMTS-8蛋白(或其衍生物)孵育。然后將切割產(chǎn)物進(jìn)行幾種生物化學(xué)處理，再通過SDS-PAGE分離。生物化學(xué)處理包括例如透析、軟骨素酶處理、冷凍干燥和重建。將SDS-PAGE中的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到膜(例如硝化纖維素膜)上，并用新肽特異性抗體染色。新肽抗體特異地識(shí)別由于聚集蛋白聚糖蛋白酶解切割而暴露的新N末端或C末端氨基酸酸序列。抗體不結(jié)合最初或未切割分子的此類表位。合適的新肽抗體包括但不局限于抗體Mab BC-13、Mab BC-3和I19C。參見，例如Caterson等人，supra和Hashimoto等人FEBS LETTERS，494192-195(2001)。在一個(gè)實(shí)例中，經(jīng)切割的聚集蛋白聚糖片段用綴合有堿性磷酸酶的二抗以及氮藍(lán)四唑色原和溴氯吲哚磷酸鹽底物(NBT/BCIP)來顯示。條帶的相對密度表示相對聚集蛋白聚糖酶活性。
聚集蛋白聚糖ELISA可以用來檢測聚集蛋白聚糖分子中的任何切割。在這個(gè)測試中，用預(yù)先粘附至塑料孔的完整聚集蛋白聚糖與ADAMTS-8蛋白(或其衍生物)孵育。對孔進(jìn)行洗滌，然后與檢測聚集蛋白聚糖的抗體孵育?？着c二抗作用。如果孔中保持著最初數(shù)量的聚集蛋白聚糖，那么抗體染色將很密集。如果聚集蛋白聚糖被ADAMTS-8蛋白(或其衍生物)消化，那么所粘附的聚集蛋白聚糖分子將從孔上掉下來，進(jìn)而減弱隨后的抗體染色。這個(gè)測試可以用來檢測ADAMTS-8蛋白(或其衍生物)是否能夠切割聚集蛋白聚糖。也可以用這個(gè)測試來測定相對切割活性。
在活性測試中，微量滴定板先用透明質(zhì)酸(ICN)包被，然后用軟骨素酶處理的牛聚集蛋白聚糖包被。軟骨素酶可以從例如SeikagakuChemicals獲得。向聚集蛋白聚糖包被的板上加入包含ADAMTS-8蛋白(或其衍生物)的培養(yǎng)基。洗去在IGD中的谷氨酸373-丙氨酸374處被切割的聚集蛋白聚糖。剩余的未切割聚集蛋白聚糖可以用抗體3B3(ICN)、然后用抗IgM-HRP二抗(Southern Biotechnology)檢測。用例如3，3”，5，5”四甲基聯(lián)苯胺(TMB，BioFx Laboratories)來獲得最終顯色。
對短小蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、神經(jīng)蛋白聚糖或其他蛋白聚糖或胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的蛋白酶解活性也可以用常規(guī)方法評測。參見，例如，Somerville等人，J.BIOL.CHEM.，2789503-9513(2003)(描述了評測多功能蛋白聚糖酶活性的測試)。這些方法一般涉及用蛋白聚糖分子接觸ADAMTS-8蛋白(或其衍生物)、然后檢測蛋白聚糖分子的任何切割。V.ADAMTS-8抑制劑、反義多核苷酸和RNAi序列的開發(fā)本發(fā)明的特征在于鑒定ADAMTS-8抑制劑。適合這個(gè)目的的篩選測試包括在存在或不存在目的化合物時(shí)用蛋白聚糖底物接觸ADAMTS-8蛋白(或其衍生物)。評測存在或不存在待測化合物時(shí)，ADAMTS-8蛋白(或其衍生物)的蛋白酶解活性來測定該化合物是否對蛋白酶解活性具有抑制效應(yīng)。參見，例如Hashimoto等人supra?？梢杂酶咄亢Y選測試或化合物文庫來方便ADAMTS-8抑制劑的鑒定。ADAMTS-8增強(qiáng)劑可以類似地鑒定。
也可以用三維結(jié)構(gòu)分析或計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)來鑒定ADAMTS-8抑制劑。后一種方法使得可以基于ADAMTS-8蛋白或它們的蛋白聚糖底物(例如聚集蛋白聚糖)的三維結(jié)構(gòu)來測定抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)。選擇與ADAMTS-8或其底物上的結(jié)合位點(diǎn)反應(yīng)的分子。然后測試候選分子以測定任何抑制效應(yīng)。適合研發(fā)蛋白酶抑制劑的其他方法也可以用于鑒定ADAMTS-8抑制劑。
ADAMTS-8抑制劑可以是例如蛋白質(zhì)、肽、抗體、化合物或小分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過本發(fā)明鑒定的ADAMTS-8抑制劑可以抑制ADAMTS-8蛋白至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的ADAMTS-8蛋白的蛋白酶解活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過本發(fā)明鑒定的ADAMTS-8抑制劑可以特異地抑制ADAMTS-8蛋白的蛋白酶解活性，而不抑制其他非ADAMTS蛋白酶例如MMP。此外，在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過本發(fā)明鑒定的ADAMTS-8抑制劑可以特異地抑制ADAMTS-8蛋白的蛋白酶解活性，而不抑制其他ADAMTS家族成員。所述“特異地抑制”表示抑制劑能夠降低或消除靶蛋白的活性，而不顯著影響其他蛋白質(zhì)的活性。在一些實(shí)例中，特異針對ADAMTS-8蛋白的抑制劑抑制其他蛋白質(zhì)低于10％、5％或1％的活性。在其他一些實(shí)例中，特異針對ADAMTS-8蛋白的抑制劑對其他蛋白酶檢測不到效應(yīng)。
本發(fā)明的ADAMTS-8抑制劑可以用來測定樣品中存在或不存在，或者定量ADAMTS-8蛋白。通過將ADAMTS-8蛋白的存在或其表達(dá)水平與疾病關(guān)聯(lián)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將ADAMTS-8蛋白用作診斷疾病或測定其嚴(yán)重性的生物標(biāo)記。
當(dāng)ADAMTS-8抑制劑用于診斷目的時(shí)，可以預(yù)期對其進(jìn)行修飾，例如用配體基團(tuán)(例如生物素或其他具有特異結(jié)合配偶體的分子)或可檢測的標(biāo)記基團(tuán)(例如熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、放射性原子、電子致密反應(yīng)物或酶)。具有特異結(jié)合配偶體的分子包括但不局限于生物素和抗生物素蛋白或鏈霉親和素IgG和蛋白A以及許多本領(lǐng)域已知的受體-配體對。與ADAMTS-8抑制劑綴合的酶標(biāo)記可以通過它們的酶活性進(jìn)行檢測。例如，辣根過氧化物酶可以通過其可將四甲基聯(lián)苯胺(TMB)轉(zhuǎn)化為可用分光光度計(jì)定量的藍(lán)色色素的能力進(jìn)行檢測。
本發(fā)明的特征也在于與ADAMTS-8序列反義的多核苷酸。反義多核苷酸可以與正義多核苷酸形成氫健，其中所述正義多核苷酸編碼ADAMTS-8蛋白。反義多核苷酸也可以與ADAMTS-8序列的編碼區(qū)或非編碼區(qū)互補(bǔ)。反義多核苷酸可以與ADAMTS-8轉(zhuǎn)錄物全鏈互補(bǔ)，也可以僅與其部分互補(bǔ)。反義多核苷酸可以包括但不局限于大約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多個(gè)核苷酸殘基。
本領(lǐng)域已知的任何方法都可以用來制備反義多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義多核苷酸用天然存在的核苷酸化學(xué)合成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義多核苷酸用經(jīng)修飾的核苷酸合成，以增加分子的生物學(xué)穩(wěn)定性，或者反義和正義多核苷酸之間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性。經(jīng)修飾的核苷酸實(shí)例包括但不局限于硫代磷酸酯衍生物、吖啶取代的核苷酸、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖辮苷、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖辮苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-isopentenyladen4exine、尿嘧啶-5-氧化乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、辮苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧化乙酸甲酯、3-(3-氨基-3N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。反義多核苷酸也可以用天然存在和經(jīng)修飾的核苷酸一起制備。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義多核苷酸用表達(dá)載體生物學(xué)產(chǎn)生。這些表達(dá)載體如下方向編碼多核苷酸，即從其轉(zhuǎn)錄的RNA為靶多核苷酸反義方向的方向。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義分子為α-端基異構(gòu)的多核苷酸分子。α-端基異構(gòu)多核苷酸分子可以與互補(bǔ)RNA形成與通常的β單元不同的特異雙鏈雜交體，在所述雙鏈雜交中鏈彼此平行。此外，在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義分子包括2’-o-甲基核糖核苷酸或嵌合RNA-DNA類似物。
此外，在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義分子為核酶。核酶是能夠切割單鏈多核苷酸(例如mRNA)的催化性RNA分子，其中核酶具有與單鏈多核苷酸互補(bǔ)的區(qū)域。可以用本領(lǐng)域已知的多種方法設(shè)計(jì)或選擇ADAMTS-8RNA的特異性核酶。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義分子能夠與ADAMTS-8基因的調(diào)節(jié)區(qū)形成三股螺旋結(jié)構(gòu)，從而抑制ADAMTS-8基因轉(zhuǎn)錄。
反義多核苷酸一般以藥物組合物中給予受試者，或者從表達(dá)載體中原位產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)例中，直接將反義多核苷酸注射至組織部位(例如關(guān)節(jié)軟骨)。在另一實(shí)例中，全身施用反義多核苷酸。全身施用時(shí)，可以先修飾反義分子，使其能夠特異結(jié)合于所選細(xì)胞表面表達(dá)的受體或抗原。編碼反義分子的表達(dá)載體可以通過任意常規(guī)方法施用至組織部位。為了使反義分子達(dá)到足夠的胞內(nèi)濃度，可以在表達(dá)載體中使用強(qiáng)啟動(dòng)子，例如pol II或pol III啟動(dòng)子。直接施用或載體產(chǎn)生的反義分子可以與細(xì)胞mRNA或基因組DNA雜交或結(jié)合，從而抑制ADAMTS-8蛋白的翻譯或轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用RNA干擾(“RNAi”)來抑制ADAMTS-8蛋白的表達(dá)。RNAi提供了在mRNA水平使基因沉默的機(jī)制。本發(fā)明的RNAi序列可以具有任意預(yù)期長度。在許多實(shí)例中，RNAi序列具有至少10、15、20、25或更多個(gè)連接的核苷酸。RNAi序列可以是dsRNA或其他類型的多核苷酸，只要它們能夠形成降解靶mRNA轉(zhuǎn)錄物的功能性沉默復(fù)合體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNAi序列包含或者由短干擾RNA(siRNA)組成。在許多應(yīng)用中，siRNA為具有大約19-25個(gè)核苷酸的dsRNA。siRNA可以通過RNA酶III相關(guān)性核酸酶Dicer降解更長的dsRNA分子內(nèi)源性產(chǎn)生。siRNA也可以外源性或者通過從表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄來引入細(xì)胞。一旦產(chǎn)生，siRNA與蛋白質(zhì)組分組裝，形成包含內(nèi)切核酶的復(fù)合體，即已知的RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)。激活的RISC切割并破壞互補(bǔ)的mRNA轉(zhuǎn)錄物。這個(gè)序列特異性mRNA降解導(dǎo)致基因沉默。
至少兩種方法可以用來實(shí)現(xiàn)siRNA介導(dǎo)的基因沉默。在第一個(gè)方法中，siRNA在體外合成，然后引入細(xì)胞來瞬時(shí)抑制基因表達(dá)。合成的siRNA提供了一種實(shí)現(xiàn)RNAi的簡單而有效方法。在許多實(shí)施方案中，siRNA為混合短多核苷酸的雙鏈體，其中所述混合短多核苷酸包括大約19-23個(gè)核苷酸，并且具有對稱二核苷酸3’突出端(例如UU或dTdT3’突出端)。這些siRNA能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中特異地抑制靶基因翻譯，而不激活依賴DNA的蛋白質(zhì)激酶(PKR)。已經(jīng)有報(bào)道，PKR的激活導(dǎo)致許多蛋白質(zhì)翻譯的非特異性抑制。
在第二個(gè)方法中，siRNA從載體表達(dá)。這個(gè)方法可以用來在細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中穩(wěn)定或瞬時(shí)表達(dá)siRNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因改造siRNA表達(dá)載體來驅(qū)使siRNA從聚合酶III(pol III)轉(zhuǎn)錄單元轉(zhuǎn)錄。在許多例子中，pol III轉(zhuǎn)錄單元采用短的富含AT的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，這導(dǎo)致在發(fā)夾siRNA上加入2bp的突出端(例如UU)，該特征有助于siRNA的功能。pol III表達(dá)載體也可以用來產(chǎn)生表達(dá)siRNA的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。此外，也可以用組織特異性啟動(dòng)子在所選細(xì)胞或組織中表達(dá)siRNA。相似的方法也可以用來產(chǎn)生組織特異性敲除動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，首先，從載體表達(dá)長的雙鏈RNA(dsRNA)。然后，Dicer將長的dsRNA加工為siRNA來產(chǎn)生基因特異性沉默。
大量3’二核苷酸突出端(例如UU)可用于siRNA的設(shè)計(jì)。在許多情況下，在突出端中避免G殘基，以減少siRNA被RNA酶在單鏈G殘基處切割的風(fēng)險(xiǎn)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的siRNA具有大約30-50％的GC含量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)設(shè)計(jì)從RNA pol III啟動(dòng)子表達(dá)的siRNA時(shí)，避免靶序列中超過4個(gè)連續(xù)的T或A序列。此外，在另一個(gè)實(shí)施方案中，選擇靶mRNA序列不是構(gòu)象化或與調(diào)控蛋白質(zhì)高度結(jié)合的siRNA。此外，在另一個(gè)實(shí)施方案中，將可能的靶位點(diǎn)與適當(dāng)?shù)幕蚪M數(shù)據(jù)庫比較。不考慮與其他編碼序列具多于16-17個(gè)連續(xù)同源堿基對的靶序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將siRNA設(shè)計(jì)為具有兩個(gè)反向重復(fù)序列，其中所述反向重復(fù)序列用間隔序列分開，并且以一串作為轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的T結(jié)束。這個(gè)設(shè)計(jì)產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄物將折疊為短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的siRNA。為了實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的，可以改變下列參數(shù)，即對siRNA靶序列的選擇、編碼所假定發(fā)夾結(jié)構(gòu)莖區(qū)的反向重復(fù)序列的長度、反向重復(fù)序列的順序、編碼發(fā)夾結(jié)構(gòu)環(huán)的間隔序列的長度和組成以及5’突出端的存在或不存在。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)建的發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA表達(dá)盒包含靶標(biāo)的正義鏈，隨后是短間隔、靶標(biāo)的反義鏈和作為轉(zhuǎn)錄終止子的5-6個(gè)T。siRNA表達(dá)構(gòu)建體中的正義和反義鏈的順序可以改變，而不影響發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA的基因沉默活性。然而，在一些情況下，順序的逆轉(zhuǎn)可能會(huì)導(dǎo)致基因沉默活性的部分降低。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，用作siRNA表達(dá)盒莖區(qū)的核苷酸序列長度在大約19-29的范圍內(nèi)。環(huán)的大小可以在3-23個(gè)核苷酸的范圍內(nèi)。也可以使用其他莖區(qū)長度或環(huán)大小。
有多種方法可以選擇siRNA靶標(biāo)。在一個(gè)實(shí)例中，掃描mRNA序列尋找二核苷酸AA，并記錄緊鄰該AA下游的19個(gè)核苷酸來選擇siRNA靶標(biāo)。在另一實(shí)例中，siRNA靶序列的選擇純粹依賴于經(jīng)驗(yàn)，只要靶序列以GC起始、并且通過BLAST搜索分析其與其他基因沒有顯著的序列同源性。在另一實(shí)例中，siRNA靶序列的選擇基于下列觀察結(jié)果，即靶向內(nèi)源mRNA中能被合成的寡脫氧核糖核苷酸/RNA酶H法(Lee等人，NATUREBIOTECHNOLOGY，20500-505(2002))降解的可及位點(diǎn)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于RNAi的靶序列為基于ADAMTS-8編碼序列選擇的21-mer序列片段。每個(gè)靶序列的5’末端包含二核苷酸“NA”，其中“N”可以是任意堿基，而“A”代表腺嘌呤。剩余的19-mer序列具有35％-55％的GC含量。此外，剩余的19-mer序列在一排中不包含任意4個(gè)連續(xù)的A或T(即AAAA或TTTT)、三個(gè)連續(xù)的G或C(即GGG或CCC)、或者7個(gè)“GC”。
對于RNAi靶序列設(shè)計(jì)也可以包括附加條件。例如，可以將剩余19-mer序列的GC含量限制在45％-55％之間。此外，可以排除任何具有三個(gè)連續(xù)同一堿基(即GGG、CCC、TTT或AAA)或具5個(gè)或更多個(gè)堿基的回文序列的19-mer序列。此外，剩余的19-mer序列可以選擇為與其他基因具有低的序列同源性。在一個(gè)實(shí)例中，用BLASTN對NCBI的人類UniGene簇序列數(shù)據(jù)庫搜索可能的靶序列。人類UniGene數(shù)據(jù)庫包含非冗余的基因起源聚簇集合。每個(gè)UniGene聚簇包含代表唯一基因的序列。選擇在BLASTN搜索下沒有命中其他人類基因的19-mer序列。進(jìn)行搜索時(shí)，可以將e-值設(shè)置為嚴(yán)格值(例如“1”)。
可以用許多方法評測本發(fā)明siRNA序列的有效性。例如，可以將本發(fā)明的siRNA序列引入表達(dá)ADAMTS-8的細(xì)胞。檢測細(xì)胞中ADAMTS-8的多肽或mNRA水平。引入siRNA序列之后ADAMTS-8表達(dá)水平降低則表明引入的siRNA序列有效誘導(dǎo)RNA干擾。
也可以在引入siRNA序列之前或之后監(jiān)測其他基因的表達(dá)水平。選擇對ADAMTS-基因8表達(dá)具有抑制效應(yīng)但不影響其他基因的siRNA序列。此外，可以在相同細(xì)胞中引入不同siRNA序列來抑制ADAMTS-8基因。
VI.疾病治療本發(fā)明的特征在于ADAMTS-8調(diào)節(jié)劑治療蛋白酶相關(guān)疾病的用途。ADAMTS-8調(diào)節(jié)劑包括但不局限于ADAMTS-8抗體、ADAMTS-8抑制劑、ADAMTS-8反義序列或RNAi序列，以及編碼或包含ADAMTS-8反義序列或RNAi序列的載體。本發(fā)明對應(yīng)的蛋白酶相關(guān)疾病包括但不局限于癌、炎性關(guān)節(jié)疾病、骨性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、牙周疾病、角膜潰瘍、蛋白尿、動(dòng)脈粥樣斑塊破裂的冠狀動(dòng)脈血栓形成、動(dòng)脈瘤性主動(dòng)脈疾病、腸炎疾病、克隆病、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合癥、哮喘、慢性非梗阻肺病、阿爾茨海默病、腦和造血癌、骨質(zhì)疏松癥、帕金森病、偏頭痛、抑郁癥、周圍神經(jīng)病、亨廷頓病、多發(fā)性硬化、眼血管發(fā)生、黃斑變性、主動(dòng)脈瘤心肌梗塞、自身免疫紊亂、創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)損傷后的退化軟骨丟失、頭部創(chuàng)傷、dystrophobic表皮水泡癥、脊髓損傷、急性和慢性神經(jīng)退行性疾病、骨質(zhì)減少、顳下頜關(guān)節(jié)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾病、器官移植毒性及排斥、惡病質(zhì)、變態(tài)反應(yīng)、組織潰瘍、再狹窄以及表征為胞外基質(zhì)蛋白或蛋白聚糖分子異常降解的其他疾病。
治療可以包括治療處理，以及預(yù)防或防范方法。需要治療的個(gè)體包括已經(jīng)患有特定醫(yī)學(xué)病癥的個(gè)體以及最終會(huì)患病癥的個(gè)體。在許多實(shí)例中，所預(yù)期的治療調(diào)節(jié)ADAMTS-8的蛋白酶解活性或基因表達(dá)，從而預(yù)防或者改善疾病的臨床癥狀。ADAMTS-8調(diào)節(jié)劑可以通過例如預(yù)防ADAMTS-8與其蛋白聚糖底物的相互作用、降低或消除ADAMTS-8的催化活性、或者降低或消除ADAMTS-8基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯起作用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，ADAMTS-8調(diào)節(jié)劑(例如抗體或抑制劑)以藥物組合物中施用于人或動(dòng)物。藥物組合物一般包含可藥用載體和治療有效量的ADAMTS-8調(diào)節(jié)劑?？伤幱幂d體的實(shí)例包括能與藥物施用兼容的溶劑、增溶劑、填料、穩(wěn)定劑、粘合劑、吸收劑、基質(zhì)、緩沖劑、潤滑劑、控釋載體、稀釋劑、乳化劑、濕潤劑、潤滑劑、分散介質(zhì)、涂層、抗菌或抗真菌試劑、等滲和吸收延遲劑等。本領(lǐng)域熟知載體介質(zhì)和藥劑對藥物活性物質(zhì)的用途。補(bǔ)充劑也可以整合進(jìn)入組合物。
本發(fā)明的藥物組合物可與其期望的給藥途徑兼容性配制。給藥途徑的實(shí)例包括腸胃外給藥、靜脈內(nèi)給藥、皮內(nèi)給藥、皮下給藥、口服、吸入給藥、經(jīng)皮膚給藥、直腸給藥、跨粘膜給藥、局部給藥和全身給藥。在一個(gè)實(shí)例中，通過使用植入物進(jìn)行給藥。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于腸胃外、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或懸浮液包括下列組分無菌稀釋劑例如水、鹽溶液、固定油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他合成的溶劑、抗菌劑例如苯甲醇或羥苯甲酸甲酯、抗氧化劑例如抗壞血酸或硫酸氫鈉、鰲合劑例如乙二胺四乙酸、緩沖劑例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽、以及調(diào)節(jié)張力的試劑例如氯化鈉或葡萄糖。藥物組合物的pH可以用酸或堿調(diào)節(jié)，例如鹽酸或氫氧化鈉。在一個(gè)實(shí)例中，腸胃外的制劑封裝在安瓿、一次性注射器或用玻璃或塑料制備的多劑量小管中。
本發(fā)明的藥物組合物可給予患者或動(dòng)物，以便其中包含的ADAMTS-8調(diào)節(jié)劑的數(shù)量足以降低或消除所靶向的ADAMTS-8的活性或表達(dá)。ADAMTS-8抗體或抑制劑的合適治療劑量可不限于5mg-110mg、15mg-85mg、30mg-70mg或40mg-60mg之間。也可以使用低于5mg或高于100mg的劑量。ADAMTS-8抗體或抑制劑可以以單劑量或多劑量施用。這些劑量可以間隔施用，例如(不限于)每天一次、每周一次或者每月一次。施用ADAMTS-8抗體或抑制劑的劑量時(shí)間表可以基于下列因素調(diào)整，即例如抗體/抑制劑與其靶標(biāo)點(diǎn)的親和力、抗體/抑制劑的半衰期和患者病癥的嚴(yán)重程度。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或抑制劑以大丸劑劑量施用，以便最大化它們的循環(huán)水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在大丸劑劑量之后使用連續(xù)輸注。
ADAMTS-8調(diào)節(jié)劑的毒性和治療功效可以在細(xì)胞培養(yǎng)模型或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物模型中通過標(biāo)準(zhǔn)藥物學(xué)方法測定。例如，可以測定LD50(50％數(shù)量致死的劑量)和ED50(50％數(shù)量治療有效的劑量)。毒性和治療作用的劑量比率即為治療指數(shù)，其可表達(dá)為LD50/ED50的比率。在一個(gè)實(shí)例中，選擇呈現(xiàn)大治療指數(shù)的調(diào)節(jié)劑。
從細(xì)胞培養(yǎng)測試或動(dòng)物研究中獲得的數(shù)據(jù)可以用來確定在人類中使用的劑量范圍。在許多情況下，這類化合物或調(diào)節(jié)劑的劑量處于呈現(xiàn)低毒或無毒的ED50的循環(huán)濃度范圍之內(nèi)。劑量依賴所用劑式和所用給藥途徑可以在這個(gè)范圍內(nèi)變化。對于根據(jù)本發(fā)明使用的任意調(diào)節(jié)劑，其治療有效劑量都可以先在細(xì)胞培養(yǎng)測試或動(dòng)物模型中進(jìn)行評測。在一個(gè)實(shí)施方案中，在動(dòng)物模型中，可將劑量確定為達(dá)到呈現(xiàn)IC50(即，達(dá)到最大抑制癥狀一半時(shí)的測試抑制劑濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍，其中所述IC50通過細(xì)胞培養(yǎng)測試測定。例如，可以通過高效液相層析測定血漿中的水平。任何特定劑量的作用都可以通過合適的生物測定檢測。生物測定的實(shí)例包括DNA復(fù)制測定、基于轉(zhuǎn)錄的測定、GDF蛋白質(zhì)/受體結(jié)合測定、肌酸激酶測定、基于前脂肪細(xì)胞分化的測定、基于脂肪細(xì)胞中葡萄糖吸收的測定和免疫學(xué)測定。
施用本發(fā)明藥物組合物的劑量方案可以詢問醫(yī)師基于多種因素確定，例如病理學(xué)部位、疾病嚴(yán)重性、患者年齡、性別和食譜、任何炎癥的嚴(yán)重性、給藥時(shí)間以及其他臨床因素。在某些實(shí)施方案中，全身給藥或注射給藥起始于最低有效劑量，并且該劑量將在預(yù)定時(shí)間內(nèi)增加直至觀察到陽性效應(yīng)。隨后，在考慮任何可能出現(xiàn)的副作用的同時(shí)，將劑量的逐漸增加限制在產(chǎn)生相應(yīng)增加作用的水平。在最終組合物中加入其他已知因子也可能影響劑量。
本發(fā)明也涉及由聚集蛋白聚糖或其他蛋白聚糖異常聚集造成或相關(guān)疾病的治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療包括向患有所述疾病的人或動(dòng)物施用包含ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物的藥物組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用基于載體的療法來校正蛋白聚糖的異常聚集。這些療法一般包括向需要其的人或動(dòng)物引入編碼ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物的表達(dá)載體或基因呈遞載體。
應(yīng)當(dāng)理解的是，上述實(shí)施方案和下列實(shí)施例僅作為舉例，而不作為限制。在本發(fā)明范疇之內(nèi)對本說明書所做的多種改變或修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
實(shí)施例實(shí)施例1.創(chuàng)建系統(tǒng)發(fā)生圖收集下列人ADAMTS家族成員的蛋白質(zhì)來創(chuàng)建系統(tǒng)發(fā)生圖ADAMTS-1/AB037767、ADAMTS-2/AJ003125(已公開序列與系統(tǒng)發(fā)生圖中使用的序列相比有下列改變W643C、P1001L和S1089C)、ADAMTS-3/AF247668、ADAMTS-4/AF148213、ADAMTS-5/AF142099、ADAMTS-6/美國專利申請公開20020120113中的“SEQ ID NO2”、ADAMTS-7/AF140675、ADAMTS-8/AF060153(已公開序列與系統(tǒng)發(fā)生圖中使用的序列相比有下列改變L11P、F13L、L21P、P23Δ、L24Δ和L129Q，其中Δ表示缺失)、ADAMTS-9/AF261918(已公開序列與系統(tǒng)發(fā)生圖中使用的序列相比有下列改變G64S和S96T)、ADAMTS-10/PCT公開號(hào)WO 02/60942中的“SEQ ID NO9”(已公開序列與系統(tǒng)發(fā)生圖中使用的序列相比有下列改變V267I)、ADAMTS-12/AJ250725、ADAMTS-13/AJ305314、ADAMTS-14/AF358666(已公開序列與系統(tǒng)發(fā)生圖中使用的序列相比有下列改變L937M)、ADAMTS-15/AJ315733、ADAMTS-16/PCT公開號(hào)WO 02/31163中的“SEQ ID NO4”、ADAMTS-17/AJ315735(已公開序列與系統(tǒng)發(fā)生圖中使用的序列相比有下列改變用氨基酸序列713GYIEAAVIPAGARRIRVVEDKPAHSFLALKDA743(SEQ ID NO1)替換氨基酸序列713ALKDA716)、ADAMTS-18/AJ311903ADAMTS-19/AJ311904和ADAMTS-20/PCT公開號(hào)WO 01/83782中的“SEQ ID NO57”。將這19個(gè)蛋白質(zhì)序列文件連接成為一個(gè)多-FASTA文件，并將其輸入CLUSTALW1.81(見，例如網(wǎng)址www.ebi.ac.uk)，并在IRIX64上運(yùn)行。CLUSTALW在默認(rèn)設(shè)置下運(yùn)行。所得.dnd樹文件(treefile)輸入TREEVIEW1.6.6(PAGE，COMPUT.APPL.BIOSCA.，12357-358(1996)，網(wǎng)址taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html)來產(chǎn)生系統(tǒng)發(fā)生圖。
ADAMTS家族成員的系統(tǒng)樹如圖1所示?；谛蛄邢嚓P(guān)性，系統(tǒng)發(fā)生圖將蛋白質(zhì)分組。被程序分為一組的ADAMTS家族成員與已表征的ADAMTS家族成員的已知功能信息相比較。例如，預(yù)測ADAMTS-2、3和14為前膠原蛋白加工酶。這些家族成員在序列同源性上彼此最相似，并且在進(jìn)化系統(tǒng)樹上形成特有的簇(cluster)。對于另一實(shí)例，已經(jīng)顯示ADAMTS-13突變引起vWF加工缺陷，從而導(dǎo)致血栓性血小板減少性紫癜。這個(gè)家族成員在系統(tǒng)樹上形成起自己的節(jié)點(diǎn)。此外，已經(jīng)顯示ADAMTS-1、4、5和9能以不同效力切割聚集蛋白聚糖。序列同源性分析證實(shí)一個(gè)簇包含所有這些降解聚集蛋白聚糖的ADAMTS以及ADAMTS-8、15和20，這表明ADAMTS-8也可能具有聚集蛋白聚糖切割活性。隨后克隆、表達(dá)并純化ADAMTS-8來檢測其切割聚集蛋白聚糖的能力。
迄今，至少已經(jīng)鑒定了ADAMTS家族的19個(gè)成員。少于一半的ADAMTS蛋白質(zhì)具有屬于它們的功能，剩下至少10個(gè)成員沒有已知功能?；诩易宄蓡T之間的序列相似性創(chuàng)建的系統(tǒng)樹(圖1)導(dǎo)致下列發(fā)現(xiàn)，即那些具相似功能(例如已證實(shí)的聚集蛋白聚糖降解活性和前膠原蛋白加工活性)的ADAMTS家族成員被分為一組。這表明，系統(tǒng)樹假定的“聚集蛋白聚糖降解”節(jié)點(diǎn)的其他成員可能具有顯著的聚集蛋白聚糖酶活性，并且可能比ADAMTS-4或ADAMTS-5顯示與骨性關(guān)節(jié)炎更高的疾病相關(guān)性。如下列實(shí)施例所述，“聚集蛋白聚糖降解”節(jié)點(diǎn)的另一成員ADAMTS-8能夠在骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的谷氨酸373-丙氨酸374鍵處切割聚集蛋白聚糖，因此對于這個(gè)蛋白質(zhì)由序列同源性預(yù)測的結(jié)構(gòu)/功能聯(lián)系是正確的。
實(shí)施例2.構(gòu)建ADAMTS-8表達(dá)載體ADAMTS-8的DNA序列由Vázquez等人，supra存放于GeneBank(登錄號(hào)AF060153)。為了分離基因，設(shè)計(jì)了跨越ADAMTS-8開放閱讀框的4套寡核苷酸引物對第一對引物包括ATGTTCCCCGCCCCCGCCGCCCCCCGGTG(SEQ ID NO2)和GGATCCCCCGAGGCGCTCGATCTTGAACT(SEQ ID NO3)。第二對引物包括GGATCCGGCCGGGCGACCGGGGGC(SEQ ID NO4)和CTCTAGAAGCTCTGTGAGATACATGGCGCT(SEQ ID NO5)。第三對引物包括CTCTAGACGGCGGGCACGGAGACTGTCTCCTGGATGCCCCTGGTGCGGCCCTGCCCCTCCCCACA(SEQ ID NO6)和ACGTGTATTTGACTTTTGGGGGGAAGACCTCGCCAGGGACTGTCAGGAGCTGCACTGTCAGAGGCTC(SEQ ID NO7)。第四對引物包括CACACGTTCTTTGTTCCTAATGACGTGGACTTTAG(SEQ ID NO8)和GCGGCCGCTCACAGGGGGCACAGCTGGCTTTC(SEQ ID NO9)。
成人肺cDNA文庫的PCR擴(kuò)增使用Clontech的GC試劑盒，按照產(chǎn)品說明進(jìn)行。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增在Perkin Elmer 9600上進(jìn)行。將50微升PCR反應(yīng)物加熱至95℃進(jìn)行1分鐘的預(yù)先溫育步驟，然后立即進(jìn)行25個(gè)由95℃溫育15秒、緊接著68℃溫育2分鐘組成的循環(huán)。純化所得PCR產(chǎn)物，并用適當(dāng)限制酶(分別用EcoR I/BamH I、BamH I/Xba I、Xba I/Afl III、Afl III/Not I)消化，然后一起連接進(jìn)入CHO表達(dá)載體pHTop(pED的衍生物)。PCR插入片段通過DNA測序確定。
通過加入Strep-tag序列(IBA)來修飾ADAMTS-8表達(dá)構(gòu)建體。標(biāo)記用具3’突出端、編碼5個(gè)氨基酸的接頭(GSGSA(SEQ ID NO10))、并跟隨編碼8個(gè)氨基酸的Strep標(biāo)記(WSHPQFEK(SEQ ID NO11))的附加序列的PCR引物加入。這13個(gè)氨基酸作為C末端的翻譯融合加入到ADAMTS-8開放閱讀框最終的氨基酸中。PCR引物對由正向引物CTTCTAGACGGCGGGCACGGAGAC(SEQ ID NO12)和反向引物TTCTAGAGCGGCCGCCTTATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAAGCAGATCCGGATCCCAGGGGGCATAGCTGGCTTTCGCA(SEQ IDNO13)組成。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增在Perkin Elmer 9600上進(jìn)行。DNA聚合酶使用Pfu Turbo Hotstart(Stratagene)，而反應(yīng)條件遵循制造商的建議。PCR反應(yīng)物先加熱至94℃2分鐘，然后進(jìn)行25個(gè)94℃15秒/70℃2分鐘的循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)后，將PCR反應(yīng)物在72℃保持5分鐘。已純化的PCR產(chǎn)物用合適的限制酶(Bgl II/Not I)消化，然后一起與適當(dāng)?shù)腁DAMTS-8片段連接在一起進(jìn)入pHTop表達(dá)載體。
當(dāng)比較AF060153和所克隆的序列時(shí)，鑒定出幾個(gè)氨基酸變異。所發(fā)現(xiàn)的改變限于信號(hào)肽和前域中。在提交的GeneBank數(shù)據(jù)庫序列(登錄號(hào)AAB74946)中也發(fā)現(xiàn)ADAMTS-8分離物(isolate)的信號(hào)序列中有兩個(gè)變異。ADAMTS-8分離物中所觀察到的變化不能歸因于等位基因變異(例如F13和F14刪除和L129Q)，所述變化導(dǎo)致25個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和前域中的一個(gè)氨基酸改變。這些改變并不由于它們的定位而影響成熟蛋白質(zhì)的表達(dá)和活性，而在表達(dá)構(gòu)建體中保持不變。蛋白質(zhì)成熟部分預(yù)測的蛋白質(zhì)序列與AF060153一致。
實(shí)施例3.建立表達(dá)ADAMTS-8的CHO細(xì)胞系用CHO/A2細(xì)胞來建立ADAMTS-8穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。CHO/A2細(xì)胞系來自通過穩(wěn)定整合轉(zhuǎn)錄激活因子tTA、包含Tet阻抑蛋白和皰疹病毒VP16轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域的融和蛋白的CHO DUKX B11。ADAMTS-8/pHTop表達(dá)載體在ADAMTS-8序列上游包含6個(gè)tet操縱子重復(fù)。在pHTop中，tTA與Tet操縱子結(jié)合即激活下游基因轉(zhuǎn)錄。也可以在pHTop表達(dá)載體中包含編碼二氫葉酸還原酶的基因，從而能夠通過病毒的氨甲蝶呤抗性來篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。也可以通過用制造商建議的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(InVitrogen的Lipofectin)方案將pHTop/ADAMTS-8 DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入CHO/A2細(xì)胞來建立細(xì)胞外表達(dá)ADAMTS-8的CHO細(xì)胞系。用0.02μM的氨甲蝶呤篩選克隆。通過用Western印跡監(jiān)控CHO條件培養(yǎng)基中的ADAMTS-8抗原來篩選ADAMTS-8蛋白表達(dá)水平最高的細(xì)胞系，其中所述Western印跡使用綴合有辣根過氧化物酶(HRP)(Southern Biotech)的抗Strep標(biāo)記抗體，然后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光(Amersham Biosciences)和放射自顯影。
實(shí)施例4.純化ADAMTS-8收集表達(dá)ADAMTS-8的穩(wěn)定CHO細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基(300ml)，并用裝有10KDa MWCO(分子量截短)濾器的攪拌杯(stir cell)(Amicon)超濾濃縮3倍(10ml)。用Sigma的固定有抗生物素蛋白的6％交聯(lián)珠狀瓊脂糖(1毫升)與濃縮的條件培養(yǎng)基在4℃混合1小時(shí)，以便移去任何污染的生物素。離心之后回收上清，并將其上樣于1毫升的Strep-Tactin柱(IBA)。用5等分試樣的1毫升W緩沖液(100mM Tris，pH8.0，150mMNaCl)洗滌柱子，然后用包含2.5mM脫硫生物素(Sigma)的W緩沖液洗脫所結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過10％SDS-PAGE凝膠分析(圖2A)分析等分試樣的濃縮條件培養(yǎng)基、柱流出液、洗滌級分和洗脫級分，然后用抗Srep-TagII多克隆抗血清(IBA)和通過放射自顯影的ECL檢測(圖2B)進(jìn)行Western分析。
圖2A顯示來自CHO條件培養(yǎng)基的Strep-標(biāo)記純化的ADAMTS-8蛋白級分的10％SDS-PAGE。用考馬斯亮藍(lán)染色SDS-PAGE。泳道1顯示CHO細(xì)胞的條件培養(yǎng)基；泳道2顯示超濾液的流出級分(濾出液)；泳道3是濃縮超濾液的存留級分；泳道4代表Strep-tactin柱的流出級分；泳道5-9是Strep-tactin柱洗滌級分；泳道10-15描述Strep-tactin柱洗脫級分。
圖2B顯示圖2A SDS-PAGE的Western印跡。該Western分析使用抗Strep-TagII的多克隆抗血清(IBA)。
包含Strep-Tag的未加工和弗林蛋白酶加工的ADAMTS-8的預(yù)期分子量分別為95KDa和75KDa，其不能說明由于糖基化作用引起的遷移率改變。純化的主要產(chǎn)物是兩條在SDS-PAGE上遷移時(shí)表觀分子量為110KDa和95KDa(圖2A，泳道12)、并且在Western印跡(圖2B，泳道12)上結(jié)合Strep-tag的條帶。在CHO/A2細(xì)胞中共表達(dá)可溶性PACE(弗林蛋白酶或成對的堿性氨基酸切割酶)和ADAMTS-8表達(dá)構(gòu)建體，導(dǎo)致110KDa的前ADAMTS-8條帶的消除，同時(shí)伴隨著95KDa條帶的增加，這表明110KDa的條帶代表分泌的前ADAMTS-8。在成熟的ADAMTS-8蛋白中有5個(gè)假定的N連接糖基化位點(diǎn)，這有可能是成熟的ADAMTS-8的表觀分子量從預(yù)測的75KDa增加至所觀察到的95KDa的原因。純化的蛋白質(zhì)級分的Western分析顯示全長蛋白質(zhì)占優(yōu)勢，而降低分子量的免疫原性條帶只有很小的比例(圖2B，泳道12)。這些次要產(chǎn)物可能是成熟的ADAMTS-8蛋白自催化降解的結(jié)果。既包含前ADAMTS-8又包含經(jīng)加工成熟的ADAMTS-8的洗脫級分用于隨后的活性分析。
在這個(gè)實(shí)例中，全長的ADAMTS-8 cDNA附加有羧基末端Strep-Tag的編碼序列，并在CHO細(xì)胞中表達(dá)。蛋白質(zhì)有效表達(dá)，并分泌進(jìn)入條件培養(yǎng)基。全長蛋白質(zhì)聚集在條件培養(yǎng)基中，并不略微蛋白酶解為更小的產(chǎn)物。這個(gè)觀察結(jié)果得到下列支持和驗(yàn)證，即用抗Strep-tag抗體的Western印跡證實(shí)保持羧基末端標(biāo)簽，并且大多數(shù)蛋白質(zhì)能夠結(jié)合Strep-Tactin樹脂。相反，用于比較的重組ADAMTS-4在C末端結(jié)構(gòu)域內(nèi)的位點(diǎn)自發(fā)蛋白酶解產(chǎn)生缺少間隔結(jié)構(gòu)域的截短分子。ADAMTS-4的截短似乎是自發(fā)蛋白酶解現(xiàn)象，因?yàn)橥ㄟ^E362Q活性位點(diǎn)突變使其催化活性喪失的ADAMTS-4修飾形式并沒有表現(xiàn)出這種自發(fā)C末端截短(Flannery等人，J.Bio.Chem.，27742775-42780(2002))。此外，重組ADAMTS-5(聚集蛋白聚糖酶-2)能自身截短其C末端。雖然通過已發(fā)表的報(bào)告還不清楚這是自發(fā)蛋白酶解事件還是通過其他蛋白酶介導(dǎo)的，但是重組的ADAMTS-12也表現(xiàn)出這種第二個(gè)C末端蛋白酶解的特性(Cal等人，J.Bio.Chem.，27617932-17940(2001))。此外，據(jù)報(bào)道，在293T細(xì)胞中表達(dá)ADAMTS-1產(chǎn)生三種形式的蛋白，即代表ADAMTS-1前體的p110形式、推斷為全長成熟ADAMTS-1的p87形式和在間隔結(jié)構(gòu)域內(nèi)組成成熟ADAMTS-1的C末端截短的p65形式(Rodrígues-Manzaneque等人，J.BIO.CHEM.，27533471-33479(2000))。與ADAMTS-4的觀察結(jié)果一致，活性位點(diǎn)突變的ADAMTS-1沒有C末端截短，這表明自發(fā)蛋白酶解機(jī)制負(fù)責(zé)移去C末端結(jié)構(gòu)域。
基于這些數(shù)據(jù)，令人驚訝的是這個(gè)實(shí)施例中分離的大多數(shù)重組ADAMTS-8保留了它的C末端結(jié)構(gòu)域、而且似乎不自發(fā)蛋白酶解或者被其他蛋白酶切割。這種重組ADAMTS-8蛋白的蛋白酶解活性通過使用α-2巨球蛋白結(jié)合測試來證實(shí)。因此，ADAMTS-8羧基末端的血小板反應(yīng)蛋白和間隔結(jié)構(gòu)域?qū)τ谕ㄟ^其自身催化活性或其他加工酶進(jìn)行的第二處理是非特征性不反應(yīng)的，這就提供了評測穩(wěn)定全長ADAMTS蛋白的催化效率的獨(dú)特機(jī)會(huì)。
實(shí)施例5從關(guān)節(jié)軟骨中分離RNA從Clinomics(Pittsfield，MA)獲得人非骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨，從新英格蘭Bsptist醫(yī)院(Boston，MA)獲得人骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨。樣品在采集時(shí)用液氮速凍并儲(chǔ)存于-80℃。為了分離RNA，取1克冷凍的關(guān)節(jié)軟骨在Spex Certiprep Freezer研磨器(型號(hào)6750)中以15Hz在液氮中研磨兩次(每次一分鐘，每次研磨之間有2分鐘的冷卻步驟)。然后根據(jù)McKenna等人，ANAL.BIOCHEM.，28680-85(2000)的方法分離RNA，并進(jìn)行列修改。將研磨后的軟骨懸浮在4mL含2.5μl 2-巰基乙醇(2-ME)的冰冷4M異硫氰酸胍(GITC，Gibco-BRL)中。立即用Polytrin勻漿器(Kinematica AG)在冰上以最高速度勻漿懸浮液一分鐘。將勻漿的軟骨裂解液在4℃下以1500×g離心10分鐘，收集上清，并將所得沉淀再次如前與另外4mlGITC/2-ME勻漿，并在4℃下以1500×g下再離心10分鐘。合并每次勻漿的上清級分，并在合并的上清級分中加入0.65ml25％Triton-100(100％儲(chǔ)液購于Sigma，在無RNA酶去離子水中稀釋至25％)。在冰上孵育15分鐘后，加入8ml無RNA酶的3M NaOAc緩沖液(、pH5.5，Ambion)，將溶液在冰上再孵育15分鐘。然后用15ml酸性的5∶1的苯酚∶氯仿(pH4.5，Ambion)通過劇烈攪拌1分鐘、冰上孵育15分鐘、4℃下以15000×g離心20分鐘來抽提勻漿。然后回收水相，重新用酸性苯酚∶氯仿用上述相同步驟抽提。然后用15ml 25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶IAA(pH6.7/8.0)(Ambion)通過劇烈混勻1分鐘、冰上孵育15分鐘、然后4℃下以15000×g、離心20分鐘來第三次抽提經(jīng)第二次的酸性苯酚∶氯仿抽提的水相。回收水相，并加入0.8倍體積的100％2-丙醇?；旌先芤?，冰上孵育5分鐘，4℃下以15000×g下離心30分鐘。小心倒出所得上清，并將沉淀重新懸浮在0.9ml RLT+2-ME(Qiagen RNeasy kit)緩沖液。此步之后按照McKenna等人，supra所述的步驟完成方案。
實(shí)施例6.ADAMTS-8的組織分布用393bp的ADAMTS-8片段來探測人多組織表達(dá)陣列(CloneTech的MTE)的mRNA斑點(diǎn)免疫，其中所述ADAMTS-8片段是用Bgl II/Hind III消化ADAMTS-8序列(Genbank登錄號(hào)AF060153)相應(yīng)的2070堿基對至2463堿基對的片段。該片段包含部分解聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域和部分中央1型TSP基序。將該片段序列用NCBI的局部比對搜索基本工具(版本2)(NCBI-BlastN)查詢GenBank。BlastN搜索發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫中沒有其他人轉(zhuǎn)錄物與該ADAMTS-8探針序列顯著同源，這表明在MTE雜交條件下探針片段不與其他人轉(zhuǎn)錄物交叉反應(yīng)。
純化ADAMTS-8探針片段，并用Amersham Pharmacia Biotech的Ready-To-Go DNA標(biāo)記珠(-dCTP)按照使用說明進(jìn)行放射性標(biāo)記。用Nick柱(Amersham Pharmacia Biotech)按照使用說明將放射性標(biāo)記的片段從引物和未整合的放射性核苷酸中純化出來，然后用來探測MTE。MTE的雜交條件以及隨后的洗滌條件遵從生產(chǎn)商針對放射性標(biāo)記cDNA探針建議的條件(Clontech MTE Array用戶手冊)。
圖3A顯示用76種不同人組織mRNA的MTE雜交分析結(jié)果。圖3B顯示說明不同組織mRNA放置的關(guān)鍵因素?？瞻卓虮硎灸切┳鴺?biāo)沒有mRNA被雜交上斑點(diǎn)。MTE雜交分析顯示，ADAMTS-8比有著廣泛組織分布的、降解聚集蛋白聚糖的ADAMTS-1和ADAMTS-4的轉(zhuǎn)錄物有著更窄的組織分布以及整體更低的轉(zhuǎn)錄物豐度。ADAMTS-8最高的表達(dá)水平之一可見于成人肺中(圖3，行A，列8)，但在胎兒肺中卻發(fā)現(xiàn)較低的水平(圖3，行G，列11)。除了大動(dòng)脈顯示高表達(dá)水平(圖3，行B，列4)外，成人心臟中可以檢測到表達(dá)，但是較低(圖3，列4)。胎兒心臟(圖3，行B，列11)顯示中等水平的轉(zhuǎn)錄物豐度，而在大腦、闌尾和膀胱的多個(gè)亞區(qū)中見到中度至低水平的表達(dá)(例如，G5、A1-G1、C3-H3和B3)。多種癌細(xì)胞系(圖3，列10)表現(xiàn)出低水平或者無法檢測水平的表達(dá)。
實(shí)施例7.實(shí)時(shí)PCR在人關(guān)節(jié)軟骨中的組織表達(dá)通過使用TaqMan(Applied Biosystems)進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR來證實(shí)。用Applied Biosystems的Primer Express程序來設(shè)計(jì)下列ADAMTS-8引物和探針5P引物GGACCGCTGCAAGTTGTTCT(SEQ ID NO14)、3P引物GGACACAGCTGGCCAGTGTT(SEQ ID NO15)和探針CCATCAATCACCTTGGCCTCGAACA(SEQ ID NO16)。ADAMTS-8的探針重疊了外顯子/內(nèi)含子邊界，從而使它不能和基因組DNA雜交。設(shè)計(jì)了如下的GAPDH的引物和探針5P引物CCACATCGCTCAGACACCAT(SEQ ID NO17)、3P引物GCGCCCAATACGACCAAA(SEQ ID NO18)和探針GGGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACG(SEQ ID NO19)。TaqMan探針(由Wyeth Resea rch Core Technologies Group合成)包含5P-報(bào)告染料6-FAM和3P-淬滅劑TAMRA。
從未患骨性關(guān)節(jié)炎(無疾病)患者的膝關(guān)節(jié)、以及從患骨性關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)的中度感染和嚴(yán)重感染病灶區(qū)域分離關(guān)節(jié)軟骨RNA。在進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR之前，通過下列方案將純化的關(guān)節(jié)軟骨RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，并在mRNA反轉(zhuǎn)錄后，在無疾病和骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨的cDNA第一鏈上進(jìn)行TaqMan分析?？俁NA(5μg)與200pmol包含噬菌體T7啟動(dòng)子位點(diǎn)和24個(gè)堿基的聚T尾巴(GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO20))的引物在70℃下孵育10分鐘。然后在20μl反應(yīng)混合物中用10單位每微升的Superscript II(Invitrogen)于50℃反轉(zhuǎn)錄RNA1小時(shí)。反應(yīng)混合物包含0.25μg/μl總RNA、10pmo/μl T7T24引物、1×第一鏈緩沖液(Invitrogen)、10mM DTT(Invitrogen)、0.5mM dNTP(Invitrogen)和1單位每微升的SUPERase-In(Ambion)。緊接著合成第一鏈，進(jìn)行第二鏈合成。反應(yīng)混合物終體積為150μl。反應(yīng)物包含第一鏈混和物以及下列試劑(終濃度)即1×第二鏈緩沖液(Invitrogen)、0.2mMdNTP(Invitrogen)、0.067單位每微升的大腸桿菌連接酶(New England Biolabs)、0.27單位每微升的DNA聚合酶I(Invitrogen)和0.013單位每微升的RNase H(Invitrogen)。第二條鏈的合成反應(yīng)物在16℃下孵育2小時(shí)。在孵育的最后5分鐘時(shí)，加入終濃度為0.067單位每微升的T4 DNA聚合酶(Invitrogen)。孵育之后，往反應(yīng)物中加入16.67mM的EDTA，并用PerSeptive Biosystems的BioMag Carboxyl Terminated bead純化所得cDNA。向第二鏈的反應(yīng)混合物中加入10％PEG-8000/1.25M NaCl，并加入10μl BioMag小珠(用0.5MEDTA預(yù)洗滌)。混和cDNA和洗滌后的BioMag小珠，并在室溫下孵育10分鐘。小珠借助于GibcoBRL的Magna-Sep磁體用300μl 70％乙醇洗滌2次。最后洗滌之后，小珠在室溫下干燥兩分鐘。用10mM Tris-乙酸鹽(pH 7.8)從小珠上洗脫經(jīng)純化的cDNA。洗脫的cDNA通過用分光光度計(jì)測量等份洗脫液280nm處的吸收值來定量。每個(gè)TaqMan PCR反應(yīng)使用該ADAMTS-8探針/引物集的100ng關(guān)節(jié)軟骨cDNA，重復(fù)二次。用GAPDH探針/引物集(Applied Biosystems)標(biāo)準(zhǔn)化組織間的表達(dá)水平。反應(yīng)物組分來自Applied Biosystems的TaqMan Universal PCR Master Mix，遵從使用說明，引物終濃度為900nmol/μl、探針終濃度為250nmol/μl。反應(yīng)物在50℃孵育2分鐘，接著95℃孵育10分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)95℃15秒和60℃1分鐘的循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)物在25℃孵育2分鐘。
圖4圖示了用實(shí)時(shí)PCR測定的在無疾病和患有骨性關(guān)節(jié)炎(OA)的人軟骨臨床樣品中A，DAMTS-8mRNA表達(dá)水平的柱狀圖。樣品W-04至W-13代表非OA感染(“無病”)的膝關(guān)節(jié)軟骨。樣品W-77M至W-96M代表晚期OA關(guān)節(jié)軟骨的可見非感染區(qū)域(“溫和OA”)。樣品88S-98 S代表晚期OA關(guān)節(jié)軟骨的嚴(yán)重感染區(qū)域(“嚴(yán)重OA”)。每個(gè)樣品中ADAMTS-8mRNA的豐度稱為標(biāo)準(zhǔn)值，其中用ADAMTS-8測得的平均數(shù)據(jù)除以同一樣品中GAPDH測得的平均數(shù)據(jù)。TaqMan分析結(jié)果表明，未感染的軟骨與骨性關(guān)節(jié)炎軟骨(至少是本研究所用晚期OA軟骨)在平均轉(zhuǎn)錄物水平上沒有明顯差異。然而，ADAMTS-8的表達(dá)水平在OA軟骨樣品96M中顯著增加。這個(gè)觀察結(jié)果支持對軟骨組織中ADAMTS-8表達(dá)上升的選定患者采用個(gè)性化方法來治療骨性關(guān)節(jié)炎。
實(shí)施例8.生產(chǎn)單克隆抗體AGG-C1(MAb AGG-C1)將合成肽CGGPLPRNITEGE(肽aggc1，SEQ ID NO21)與載體蛋白KLH綴合，然后將該綴合體作為免疫原通過標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)來生產(chǎn)單克隆抗體。簡而言之，用完全弗式佐劑中的20μg免疫原皮下免疫BALB/c小鼠。用不完全弗式佐劑中的肽重復(fù)注射兩次(每兩周一次)。對免疫小鼠取測試血，并通過ELISA評測血清對免疫肽和經(jīng)ADAMTS-4消化的牛關(guān)節(jié)軟骨聚集蛋白聚糖(Flannery等人，supra)的活性。在雜交瘤融合前三天，對呈現(xiàn)最高抗體效價(jià)的小鼠進(jìn)行無佐劑的最終免疫。分離這只小鼠的脾細(xì)胞，并與FO骨髓瘤細(xì)胞融合(American Type Culture Collection，Manassas，VA)，然后在HAT選擇培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中培養(yǎng)。通過ELISA篩選抗KLH-CGGPLPRNITEGE抗原的雜交瘤培養(yǎng)物上清，并通過Western印跡篩選抗經(jīng)ADAMTS-4消化的聚集蛋白聚糖的雜交瘤培養(yǎng)物上清。陽性雜交瘤克隆通過有限稀釋來挑選亞克隆。在培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)單一的雜交瘤細(xì)胞系，命名為AGG-C1。用MouseMonoclonal Antibody Isotyping kit(Roche，Indianapolis，IN)確定抗體同種型為IgG1，然后通過蛋白A親和層析從1升培養(yǎng)基中純化IgG。
實(shí)施例9.競爭性抑制ELISA測試競爭性抑制ELISA測試用來證實(shí)MAb AGG-C1能特異識(shí)別合適的聚集蛋白聚糖新表位。通過每孔用100μl b-aggc1(100ng/ml)在室溫下孵育1小時(shí)來用N-末端生物素肽aggc1(b-aggc1)包被鏈霉親和素包被的微量滴定板(Pierce，Rockford，IL)。在用含0.01％Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBS-Tween)洗滌4次后，孔用100μl含2％BSA的PBS-Tween在室溫下封閉1小時(shí)，然后用PBS-Tween洗滌4次。
為了驗(yàn)證MAb AGG-C1的新表位性質(zhì)，將包含MAb AGG-C1(0.04μg/ml)和1.0-1000nmol/ml合成肽GGLPLPRNITEGE(SEQ ID NO22)、GGLPLPRNITEGEARGSVILTVK-CONH2(SEQ ID NO23)、未消化聚集蛋白聚糖或ADAMTS-4消化的聚集蛋白聚糖的競爭性混合物(100μl)在室溫下預(yù)孵育1小時(shí)。然后將混合物轉(zhuǎn)移至用b-aggcl包被的孔中。進(jìn)一步在室溫下孵育1小時(shí)后，用PBS-Tween洗滌平板4次，然后與100μl綴合過氧化物酶的山羊抗鼠IgG二抗(1∶10000)在室溫下孵育1小時(shí)。隨后用PBS-Tween最后洗滌4次，并用TMB1組分微孔過氧化物酶底物(BioFX Laboratories，Owings Mills，MD)孵育孔。加入0.18M H2SO4來終止顯色，并分光光度地檢測450nm處的吸光度。
為了制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，用ADAMTS-4(0.001ng-5ng)在37℃下消化牛聚集蛋白聚糖(25μg/50μl)16小時(shí)。然后向每個(gè)消化物中加入MAbAGG-C1(最終抗體濃度0.04μg/ml)，并在室溫下預(yù)孵育這些混合物1小時(shí)，隨后轉(zhuǎn)移到b-aggc1包被的平板上完成競爭性ELISA。
圖5顯示使用MAb AGG-C1進(jìn)行的競爭性抑制ELISA的結(jié)果。合成肽GGLPLPRNITEGE(SEQ ID NO22，其C末端對應(yīng)聚集蛋白聚糖核心蛋白的E373)和ADAMTS-4消化的聚集蛋白聚糖(分別為實(shí)心框和實(shí)心圓)之間觀察到劑量依賴性競爭。合成肽GGPLPRNITEGEARGSVILTVK(SEQ ID NO23)和未消化的聚集蛋白聚糖在測試中沒有競爭(分別表示為空心框和空心圓)。
圖7顯示另一個(gè)針對聚集蛋白聚糖酶活性的競爭性抑制ELISA。標(biāo)準(zhǔn)曲線由用數(shù)量增加的重組ADAMTS-4和牛聚集蛋白聚糖在37℃孵育16小時(shí)、隨后在每個(gè)消化物中加入MAb AGG-C1產(chǎn)生。進(jìn)行類似的測試來估測ADAMTS-8的相對聚集蛋白聚糖酶活性。在競爭性抑制ELISA中產(chǎn)生45％的抑制需要0.0135pM的ADAMTS-4，需要46.6±4.8pM的ADAMTS-8來獲得相似水平的活性。
實(shí)施例10.ADAMTS-8和ADAMTS-4消化的聚集蛋白聚糖的Western印跡用兩種不同單克隆抗體-即MAb BC-3和MAb AGG-C1證實(shí)了ADAMTS-8在聚集蛋白聚糖酶切割位點(diǎn)(谷氨酸373-丙氨酸374)處切割聚集蛋白聚糖的能力，其中這種能力用來定義骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)聚集蛋白聚糖酶活性。MAb BC-3特異地檢測新表位N末端序列374ARGXX...(SEQ IDNO24)。MAb AGG-C1特異地檢測新表位C末端序列...NITEGE373(SEQID NO25)。這兩個(gè)新表位都由聚集蛋白聚糖酶切割位于聚集蛋白聚糖球間結(jié)構(gòu)域的谷氨酸373-丙氨酸374鍵產(chǎn)生。
圖6A-6C顯示使用MAb BC-3和MAb AGG-C1對ADAMTS-4和ADAMTS-8消化的聚集蛋白聚糖的Western印跡分析結(jié)果。圖6A顯示使用MAb BC-3的Western印跡。泳道1、未加入酶；泳道2顯示ADAMTS-4消化的聚集蛋白聚糖，其中酶∶底物的摩爾比1∶20；泳道3-7顯示ADAMTS-8消化的聚集蛋白聚糖，其中酶∶底物的摩爾比分別為1∶2、1∶0.5、1∶0.2、1∶0.1和1∶0.07。MAb BC-3免疫反應(yīng)條帶的密度隨ADAMTS-8蛋白相對聚集蛋白聚糖底物增加的量而增加(圖6A，泳道3-7)，這表明聚集蛋白聚糖在OA相關(guān)的位置被切割。但是，使用ADAMTS-4時(shí)，底物對應(yīng)需要更多數(shù)量的酶(比較圖6A中的泳道3-7和泳道2)。
圖6B是使用AGG-C1的Western印跡。顯示了每個(gè)消化物中酶∶底物的相對摩爾比率。圖6B中顯示使用酶∶底物比率在1∶1到1∶0.3范圍內(nèi)的MAb AGG-C1免疫反應(yīng)條帶。在相同測試中，ADAMTS-4也產(chǎn)生MAbAGG-C1的免疫反應(yīng)條帶，但酶∶底物的比率更低(圖6C，泳道2-6)。每個(gè)印跡左側(cè)顯示球形蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的遷移位置。
作為陰性對照，高達(dá)2.5μg rhMMP-13消化的聚集蛋白聚糖(25μg)的Western印跡沒有產(chǎn)生免疫反應(yīng)肽，這證明MAb AGG-C1并不識(shí)別由MMP切割聚集蛋白聚糖產(chǎn)生的新表位序列..DIPEN341(SEQ ID NO26)。此外，用與ADAMTS-8相似的酶∶底物比率的MMP-13消化的聚集蛋白聚糖與MAb BC-14有免疫反應(yīng)，MAb BC-14能識(shí)別MMP產(chǎn)生的新表位序列342FFG..(SEQ ID NO27)，但不能被識(shí)別聚集蛋白聚糖酶產(chǎn)生的新表位序列373ARGXX..(SEQ ID NO24)的MAb BC-3識(shí)別。
Western印跡分析的詳細(xì)步驟闡明如下。將牛骨關(guān)節(jié)軟骨聚集蛋白聚糖與純化的ADAMTS-8或ADAMTS-4在37℃下，與含100mM NaCl和5mM CaCl2的50mM Tris(PH 7.3)孵育16小時(shí)。消化產(chǎn)物通過在存在軟骨素酶ABC(Seikagaku America，F(xiàn)almouth，MA；1mU/μg聚集蛋白聚糖)、角蛋白酶(keratanase)(Seikagaku；1mU/μg聚集蛋白聚糖)和角蛋白酶II(Seikagaku；0.02mU/μg聚集蛋白聚糖)下于37℃孵育2小時(shí)而去糖基化。消化產(chǎn)物在4-12％Bis-Tis NuPAGE SDS PAGE凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA)上分離，然后經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。免疫反應(yīng)產(chǎn)物通過用MAb AGG-C1(0.04μg/ml)或者M(jìn)Ab BC-3(Caterson等人，supra)進(jìn)行Western印跡檢測。隨后用綴合堿性磷酸酶的山羊抗鼠IgG二抗(Promega Corp.，Madsion，WI；1∶7500)與膜孵育，并用NBT/BCIP底物(Promega)來顯示免疫反應(yīng)條帶。所有抗體孵育都在室溫下進(jìn)行1小時(shí)，而免疫印跡與底物在室溫下孵育5-15分鐘來實(shí)現(xiàn)合適的顯色。
據(jù)報(bào)道，除了ADAMTS-4(聚集蛋白聚糖酶1)和ADAMTS-5(聚集蛋白聚糖酶2)，另外兩個(gè)ADAMTS家族成員(ADAMTS1和ADAMTS9)能在蛋白質(zhì)某位點(diǎn)切割軟骨聚集蛋白聚糖蛋白，并且它們兩者在進(jìn)化系統(tǒng)樹上分組在相同的節(jié)點(diǎn)，例如聚集蛋白聚糖酶1，聚集蛋白聚糖酶2和ADAMTS-8。圖6A-6C顯示ADAMTS-8與其他ADAMTS家族成員相比，作為聚集蛋白聚糖酶活性的效率。此外，ADAMTS-8的聚集蛋白聚糖酶活性似乎對谷氨酸373-丙氨酸374位點(diǎn)特異，這是因?yàn)橛弥亟M人ADAMTS-8消化的聚集蛋白聚糖的BC-3 Western印跡(監(jiān)測產(chǎn)生的C末端聚集蛋白聚糖切割片段)和AGG-C1 Western印跡(監(jiān)測產(chǎn)生的N末端切割片段)都顯示下列結(jié)果，即ADAMTS-8處理產(chǎn)生合適的新表位，而且所產(chǎn)生的兩個(gè)聚集蛋白聚糖片段似乎都保持完整而不進(jìn)一步降解，這就表明在聚集蛋白聚糖的G1-G2球間結(jié)構(gòu)域中存在特異切割。
圖6A-6C也表明，用BC-3新表位MAb能夠輕易地檢測到由1∶0.5酶∶底物比率的ADAMTS-8對牛骨關(guān)節(jié)軟骨聚集蛋白聚糖的切割，用AGG-C1新表位MAb甚至可能更低。這個(gè)在聚集蛋白聚糖谷氨酸373-丙氨酸374肽鍵處的切割效率和報(bào)道的ADAMTS-1和ADAMTS-9的聚集蛋白聚糖酶活性相當(dāng)。
在相同Western印跡上比較ADAMTS-8和ADAMTS-4對聚集蛋白聚糖的切割，揭示在實(shí)驗(yàn)條件下ADAMTS-8在谷氨酸373-丙氨酸374肽鍵處切割軟骨聚集蛋白聚糖的效率似乎比ADAMTS-4要低。已經(jīng)表明，ADAMTS-4的羧基末端蛋白酶解加工可能在激活其蛋白酶解活性和酶活化(mobilizing)中起著重要作用，其中所述酶活化是通過從催化結(jié)構(gòu)域移去推定的C末端ECM結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及降低對胞外基質(zhì)中存在的GAG的親和性。所以，存在這種可能，即ADAMTS-8的酶活性可受穩(wěn)定存在的C末端結(jié)構(gòu)域的抑制，并且C末端截短的ADAMTS-8可顯示增強(qiáng)的聚集蛋白聚糖酶活性。為了說明這個(gè)問題，構(gòu)建并表達(dá)了修飾的ADAMTS-8cDNA，其中刪除了C末端解聯(lián)蛋白和間隔結(jié)構(gòu)域的編碼序列。有效地表達(dá)并分泌這個(gè)重組的C末端截短ADAMTS-8，并通過α2-巨球蛋白測試判定所純化的蛋白質(zhì)是有活性的，但是AGG-C1 Western印跡發(fā)現(xiàn)其并不比全長重組的ADAMTS-8對聚集蛋白聚糖底物更有活性。然而，ADAMTS-8維持其C末端GAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的能力可使ADAMTS-8在體內(nèi)更加有效地切割軟骨聚集蛋白聚糖，這是通過將酶定位于軟骨基質(zhì)而增加酶的有效濃度達(dá)到的。在正常和骨性關(guān)節(jié)炎人骨關(guān)節(jié)軟骨中存在ADAMTS-8導(dǎo)致對下列可能的進(jìn)一步支持，即ADAMTS-8在體內(nèi)作為聚集蛋白聚糖酶行使功能。
ADAMTS-8可以更加有效地切割其他相關(guān)的類透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白聚糖，例如神經(jīng)聚糖、短小蛋白聚糖或多功能蛋白聚糖。在大腦的多種亞區(qū)可以輕易地檢測到ADAMTS-8mRNA，這與神經(jīng)聚糖和短小蛋白聚糖的表達(dá)模式一致。鼠ADAMTS-8最先描述為Meth2，其是血管發(fā)生測試(Vázquez等人，supra)中顯示抑制作用的兩個(gè)ADAMTS家族成員中的一個(gè)(ADAMTS-1是另外一個(gè))。少數(shù)幾個(gè)ADAMTS-8mRNA表達(dá)最豐富的位點(diǎn)之一是大動(dòng)脈，這是富含多功能蛋白聚糖的組織。多功能蛋白聚糖是一種重要的血管胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，其在細(xì)胞粘附、增殖以及遷移方面具廣泛作用。所以，可以嘗試下列猜測，即ADAMTS-8可能在內(nèi)皮中行使多功能蛋白聚糖酶的功能，可能在G1結(jié)構(gòu)域之后切割多功能蛋白聚糖并將其釋放到基質(zhì)中。這種由ADAMTS-8介導(dǎo)的增殖性內(nèi)皮細(xì)胞多功能蛋白聚糖缺失可以解釋所觀察到的ADAMTS-8抗血管生成活性。下列觀察結(jié)果支持這種可能性，即在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)在谷氨酸441-丙氨酸442鍵處被切割的大動(dòng)脈多功能蛋白聚糖片段，反映了我們在本研究中顯示的ADAMTS-8切割特異性。ADAMTS-1和ADAMTS-4也已經(jīng)顯示出多功能蛋白聚糖酶活性，這增加了ADAMTS-8能夠以某種水平的效率和特異性切割多功能蛋白聚糖的可能性。
實(shí)施例11.表達(dá)載體本發(fā)明可以使用p91023(b)的衍生物哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pMT2CXM。pMT2 CXM載體與p91023(b)不同，前者包含用氨芐青霉素抗性基因取代了四環(huán)素抗性基因、并進(jìn)一步包含cDNA克隆插入的Xho I位點(diǎn)。pMT2 CXM的功能元件包括腺病毒VA基因、SV40復(fù)制起點(diǎn)(包括72bp的增強(qiáng)子)、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(包括腺病毒晚期mRNA上存在的5’剪接位點(diǎn)和大部分的腺病毒三聯(lián)前導(dǎo)序列)、3’剪接受體位點(diǎn)、DHFR插入片段、SV40早期多聚腺苷酸位點(diǎn)(SV40)和在大腸桿菌(E.coli)中繁殖必需的pBR322序列。
質(zhì)粒pMT2 CXM通過EcoR I消化pMT2-VWF獲得，其中所述pMT2-VWF已經(jīng)保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American TypeCluture Collection，ATCC)、Rockvill、MD(美國)，入藏號(hào)為ATCC 67122。EcoRI消化切割pMT2-VWF中存在的cDNA插入序列，從而獲得線性形式的pMT2，其中所述線性形式的pMT2可以連接并用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB 101或DH-5以獲得氨芐青霉素抗性。質(zhì)粒pMT2 DNA可以通過常規(guī)方法制備。然后用環(huán)內(nèi)/外誘變來構(gòu)建pMT2 CXM。這移去了pMT2的SV40復(fù)制起點(diǎn)和增強(qiáng)子序列附近相對于Hind III位點(diǎn)的1075至1145位堿基。此外，其插入了包含限制性內(nèi)切核酸酶Xho I識(shí)別位點(diǎn)的序列。名為pMT23的pMT2 CXM衍生物包含限制性內(nèi)切核酸酶PstI、EcoR I、SalI和XhoI的識(shí)別位點(diǎn)。質(zhì)粒pMT2 CXM和pMT23 DNA可以通過常規(guī)方法制備。
從pMT21衍生而來的pEMC2β1也合用于進(jìn)行本發(fā)明。pMT21從pMT2衍生而來，而pMT2從pMT2-VWF衍生而來。如上所述，EcoRI消化切割pMT2-VWF中的cDNA插入序列，從而獲得線性形式的pMT2，其中所述線性形式的pMT2可以連接并用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB 101或DH-5以獲得氨芐青霉素抗性。質(zhì)粒pMT2 DNA可以通過常規(guī)方法制備。
pMT21由pMT2經(jīng)過下列兩種修飾衍生而得。首先，刪除DHFR cDNA的5’非翻譯區(qū)的75bp的片段，其中所刪除的片段包括來自cDNA克隆的G/C加尾的19個(gè)G殘基串。在這個(gè)過程中，Pst I、EcoR I和XhoI位點(diǎn)緊挨著插入在DHFR上游。
然后，通過用EcoRV和XbaI消化、用DNA聚合酶I的Klenow片段處理、并與ClaI接頭(CATCGATG)連接來引入唯一的ClaI位點(diǎn)。這刪除了腺病毒相關(guān)RNA(VAI)區(qū)域250bp的片段，但并不影響VAI RNA基因的表達(dá)和功能。pMT21用EcoRI和XhoI消化，然后用來產(chǎn)生pEMC2B1載體。
用EcoRI和PstI消化pMT 2-ECAT1，產(chǎn)生2752bp片段，從而獲得部分EMCV前導(dǎo)序列。用TaqI消化這個(gè)片段，產(chǎn)生508bp的EcoR I-TaqI片段，并用低熔點(diǎn)瓊脂糖膠電泳純化該片段。合成68bp，具5’TaqI突出末端和3’XhoI突出末端的銜接頭及其互補(bǔ)鏈。
銜接頭序列與EMC病毒前導(dǎo)序列的763-827位核苷酸匹配。它也將EMC病毒前導(dǎo)子內(nèi)10位的ATG變成ATT，后面緊跟著Xho I位點(diǎn)。pMT21EcoR I-Xho I片段、EMC病毒EcoRI-TaqI片段和68bp多聚核苷酸接頭Taq I-Xho I銜接頭的三步連接產(chǎn)生載體pEMC2β1。
這個(gè)載體包含適當(dāng)關(guān)系的SV40復(fù)制起點(diǎn)和增強(qiáng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、腺病毒三聯(lián)前導(dǎo)序列的大部分cDNA拷貝、小的雜交插入序列、SV40多聚腺苷酸信號(hào)和腺病毒VAI基因、DHFR和β-半乳糖苷酶標(biāo)記和EMC序列，以在哺乳細(xì)胞中指導(dǎo)目的cDNA的高水平表達(dá)。
載體構(gòu)建可涉及聚集蛋白聚糖酶相關(guān)DNA序列的修飾。例如，可以通過移去編碼區(qū)域5’和3’末端的非編碼核苷酸來修飾編碼聚集蛋白聚糖酶的cDNA?？梢詫⑺鶆h除的非編碼核苷酸置換或非置換為其他已知利于表達(dá)的序列。將這些載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入合適的宿主細(xì)胞來表達(dá)本發(fā)明的聚集蛋白聚糖酶。
在一個(gè)具體實(shí)施例中，用細(xì)菌序列消除或取代聚集蛋白聚糖酶編碼序列側(cè)翼的哺乳動(dòng)物調(diào)節(jié)序列，從而產(chǎn)生胞內(nèi)或胞外聚集蛋白聚糖酶分子表達(dá)的細(xì)菌載體。可以進(jìn)一步操作編碼序列(例如，與其他已知的接頭連接，或通過刪除其非編碼序列來修飾，或通過其他已知技術(shù)來改變其核苷酸)。然后用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法將聚集蛋白聚糖酶編碼序列插入到已知的細(xì)菌載體中。該細(xì)菌載體可以轉(zhuǎn)化到細(xì)菌宿主細(xì)胞中來表達(dá)本發(fā)明的聚集蛋白聚糖酶。在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生胞外聚集蛋白聚糖酶蛋白的胞外表達(dá)策略參照見例如歐洲專利申請177,343。
相似操作可以用來構(gòu)建在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的昆蟲載體(見例如已公開的歐洲專利申請155,476中所述的步驟)。也可以用酵母調(diào)節(jié)序列構(gòu)建酵母載體，以在酵母細(xì)胞中進(jìn)行本發(fā)明蛋白質(zhì)的胞內(nèi)或者胞外表達(dá)(見例如已公開的PCT申請WO86/00639和歐洲專利申請123,289中所述的步驟)。
在哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、酵母或昆蟲宿主細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生高水平聚集蛋白聚糖酶蛋白的方法涉及構(gòu)建包含多拷貝異源聚集蛋白聚糖酶基因的細(xì)胞。該異源基因可以連接可擴(kuò)增的標(biāo)記例如二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，以便可以通過在增加氨甲蝶呤(MTX)濃度中培養(yǎng)來選擇含有增加的基因拷貝的細(xì)胞。這個(gè)方法可以應(yīng)用于許多不同的細(xì)胞類型。
例如，可以通過多種方法將包含與其他能夠表達(dá)的質(zhì)粒序列有效相連的聚集蛋白聚糖酶DNA序列的質(zhì)粒和DHFR表達(dá)質(zhì)粒(例如，pAdA26SV(A)3)共同引入DHFR缺陷的CHO細(xì)胞(DUKX-BII)中，其中所述多種方法包括磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔或原生質(zhì)體融合。DHFR表達(dá)轉(zhuǎn)化體在含經(jīng)透析的胎牛血清的α培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性生長，然后在增加濃度的MTX(例如，0.02、0.2、1.0和5μM MTX的連續(xù)步驟)下用氨芐青霉素進(jìn)行選擇性生長?？寺∞D(zhuǎn)化體，然后用至少一種上述測試來監(jiān)測生物學(xué)活性的聚集蛋白聚糖酶的表達(dá)。聚集蛋白聚糖酶蛋白質(zhì)的表達(dá)應(yīng)當(dāng)隨著MTX抗性水平的增加而增加。用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來表征聚集蛋白聚糖酶多肽，例如脈沖標(biāo)記35S甲硫氨酸或半胱氨酸，以及多聚丙稀酰氨凝膠電泳。相似方法可以用生產(chǎn)其他聚集蛋白聚糖酶。
實(shí)施例12.轉(zhuǎn)染表達(dá)載體作為一個(gè)實(shí)施例，將本發(fā)明的聚集蛋白聚糖酶核苷酸序列克隆進(jìn)入表達(dá)載體pED6。通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(LF2000，Invitrogen)，將聚集蛋白聚糖酶序列瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS和CHO DUKX B11細(xì)胞(+/-在分離的PED6質(zhì)粒上共轉(zhuǎn)染PACE)。每個(gè)目的分子進(jìn)行重復(fù)轉(zhuǎn)染(a)一個(gè)轉(zhuǎn)染集合用來收獲條件培養(yǎng)基進(jìn)行活性測試，而(b)另一個(gè)轉(zhuǎn)染集合用來進(jìn)行35-S-甲硫氨酸/半胱氨酸代謝標(biāo)記。
第1天，將為了進(jìn)行活性測試而將待收獲的集合(a)的孔中的培養(yǎng)基換成加入1％熱滅活胎牛血清+/-100μg/ml肝素的DME(COS)或者α(CHO)培養(yǎng)基。48小時(shí)以后，收集條件培養(yǎng)基進(jìn)行活性測試。第3天，集合(b)重復(fù)的孔換成加入1％熱滅活胎牛血清、100μg/ml肝磷脂和100μCi/ml35S-甲硫氨酸/半胱氨酸(Redivue Pro mix，Amersham)的MEM(無甲硫氨酸/半胱氨酸)培養(yǎng)基。在37℃孵育6小時(shí)之后，收集條件培養(yǎng)基，并在還原條件下進(jìn)行SDA-PAGE凝膠電泳。蛋白質(zhì)通過放射自顯影顯示。
本發(fā)明的上述描述提供了實(shí)例和描述，但并不詳盡或者不將本發(fā)明限制在明確公開的某一點(diǎn)。修飾和變化可能與上述教導(dǎo)一致，或者可以從本發(fā)明的應(yīng)用中獲得。所以，需要注意的是，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求書及其等同物定義。
序列表序列表<110>惠氏公司<120>ADAMTS-8蛋白及其用途<130>031896-034001(AM101372)<150>US 60/562,687<151>2004-04-16<160>28<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>31<212>PRT<213>人<400>1Gly Tyr Ile Glu Ala Ala Val Ile Pro Ala Gly Ala Arg Arg Ile Arg1 5 10 15Val Val Glu Asp Lys Pro Ala His Ser Phe Leu Ala Leu Lys Asp20 25 30<210>2<211>29<212>DNA<213>人<400>2atgttccccg cccccgccgc cccccggtg29<210>3<211>29<212>DNA<213>人<400>3ggatcccccg aggcgctcga tcttgaact29
<210>4<211>24<212>DNA<213>人<400>4ggatccggcc gggcgaccgg gggc 24<210>5<211>30<212>DNA<213>人<400>5ctctagaagc tctgtgagat acatggcgct30<210>6<211>65<212>DNA<213>人<400>6ctctagacgg cgggcacgga gactgtctcc tggatgcccc tggtgcggcc ctgcccctcc 60ccaca 65<210>7<211>67<212>DNA<213>人<400>7acgtgtattt gacttttggg gggaagacct cgccagggac tgtcaggagc tgcactgtca 60gaggctc 67<210>8<211>35<212>DNA<213>人<400>8cacacgttct ttgttcctaa tgacgtggac tttag 35
<210>9<211>32<212>DNA<213>人<400>9gcggccgctc acagggggca cagctggctt tc 32<210>10<211>5<212>PRT<213>人<400>10Gly Ser Gly Ser Ala1 5<210>11<211>8<212>PRT<213>人<400>11Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys1 5<210>12<211>24<212>DNA<213>人<400>12cttctagacg gcgggcacgg agac 24<210>13<211>82<212>DNA<213>人<400>13ttctagagcg gccgccttat ttttcgaact gcgggtggct ccaagcagat ccggatccca 60
gggggcatag ctggctttcg ca82<210>14<211>20<212>DNA<213>人<400>14ggaccgctgc aagttgttct 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人<400>15ggacacagat ggccagtgtt 20<210>16<211>25<212>DNA<213>人<400>16ccatcaatca ccttggcctc gaaca 25<210>17<211>20<212>DNA<213>人<400>17ccacatcgct cagacaccat 20<210>18<211>18<212>DNA<213>人<400>18gcgcccaata cgaccaaa 18<210>19<211>25
<212>DNA<213>人<400>19gggaaggtga aggtcggagt caacg 25<210>20<211>63<212>DNA<213>人<400>20ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggaggcggt tttttttttt tttttttttt60ttt 63<210>21<211>13<212>PRT<213>人<400>21Cys Gly Gly Pro Leu Pro Arg Asn Ile Thr Glu Gly Glu1 5 10<210>22<211>13<212>PRT<213>人<400>22Gly Gly Leu Pro Leu Pro Arg Asn Ile Thr Glu Gly Glu1 5 10<210>23<211>23<212>PRT<213>人<400>23Gly Gly Leu Pro Leu Pro Arg Asn Ile Thr Glu Gly Glu Ala Arg Gly1 5 10 15
Ser Val Ile Leu Thr Val Lys20<210>24<211>5<212>PRT<213>人<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(5)<223>Xaa可以是天然存在的氨基酸<400>24Ala Arg Gly Xaa Xaa1 5<210>25<211>6<212>PRT<213>人<400>25Asn Ile Thr Glu Gly Glu1 5<210>26<211>5<212>PRT<213>人<400>26Asp Ile Pro Glu Asn1 5<210>27<211>3<212>PRT<213>人
<400>27Phe Phe Gly1<210>28<211>890<212>PRT<213>人<400>28Met Leu Pro Ala Pro Ala Ala Pro Arg Trp Pro Pro Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ala Arg Gly Ala Pro Ala Arg Pro20 25 30Ala Ala Gly Gly Gln Ala Ser Glu Leu Val Val Pro Thr Arg Leu Pro35 40 45Gly Ser Ala Gly Glu Leu Ala Leu His Leu Ser Ala Phe Gly Lys Gly50 55 60Phe Val Leu Arg Leu Ala Pro Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro Glu Phe65 70 75 80Lys Ile Glu Arg Leu Gly Gly Ser Gly Arg Ala Thr Gly Gly Glu Arg85 90 95Gly Leu Arg Gly Cys Phe Phe Ser Gly Thr Val Asn Gly Glu Pro Glu100 105 110Ser Leu Ala Ala Val Ser Leu Cys Arg Gly Leu Ser Gly Ser Phe Leu115 120 125Leu Asp Gly Glu Glu Phe Thr Ile Gln Pro Gln Gly Ala Gly Gly Ser130 135 140Leu Ala Gln Pro His Arg Leu Gln Arg Trp Gly Pro Ala Gly Ala Arg145 150 155 160Pro Leu Pro Arg Gly Pro Glu Trp Glu Val Glu Thr Gly Glu Gly Gln165 170 175
Arg Gln Glu Arg Gly Asp His Gln Glu Asp Ser Glu Glu Glu Ser Gln180 185 190Glu Glu Glu Ala Glu Gly Ala Ser Glu Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala195 200 205Thr Ser Arg Thr Lys Arg Phe Val Ser Glu Ala Arg Phe Val Glu Thr210 215 220Leu Leu Val Ala Asp Ala Ser Met Ala Ala Phe Tyr Gly Ala Asp Leu225 230 235 240Gln Asn His Ile Leu Thr Leu Met Ser Val Ala Ala Arg Ile Tyr Lys245 250 255His Pro Ser Ile Lys Asn Ser Ile Asn Leu Met Val Val Lys Val Leu260 265 270Ile Val Glu Asp Glu Lys Trp Gly Pro Glu Val Ser Asp Asn Gly Gly275 280 285Leu Thr Leu Arg Asn Phe Cys Asn Trp Gln Arg Arg Phe Asn Gln Pro290 295 300Ser Asp Arg His Pro Glu His Tyr Asp Thr Ala Ile Leu Leu Thr Arg305 310 315 320Gln Asn Phe Cys Gly Gln Glu Gly Leu Cys Asp Thr Leu Gly Val Ala325 330 335Asp Ile Gly Thr Ile Cys Asp Pro Asn Lys Ser Cys Ser Val Ile Glu340 345 350Asp Glu Gly Leu Gln Ala Ala His Thr Leu Ala His Glu Leu Gly His355 360 365Val Leu Ser Met Pro His Asp Asp Ser Lys Pro Cys Thr Arg Leu Phe370 375 380Gly Pro Met Gly Lys His His Val Met Ala Pro Leu Phe Val His Leu385 390 395 400Asn Gln Thr Leu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Met Tyr Leu Thr Glu405 410 415
Leu Leu Asp Gly Gly His Gly Asp Cys Leu Leu Asp Ala Pro Arg Ala420 425 430Ala Leu Pro Leu Pro Thr Gly Leu Pro Gly Arg Met Ala Leu Tyr Gln435 440 445Leu Asp Gln Gln Cys Arg Gln Ile Phe Gly Pro Asp Phe Arg His Cys450 455 460Pro Asn Thr Ser Ala Gln Asp Val Cys Ala Gln Leu Trp Cys His Thr465 470 475 480Asp Gly Ala Glu Pro Leu Cys His Thr Lys Asn Gly Ser Leu Pro Trp485 490 495Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly Pro Gly His Leu Cys Ser Glu Gly Ser500 505 510Cys Leu Pro Glu Glu Glu Val Glu Arg Pro Lys Pro Val Ala Asp Gly515 520 525Gly Trp Ala Pro Trp Gly Pro Trp Gly Glu Cys Ser Arg Thr Cys Gly530 535 540Gly Gly Val Gln Phe Ser His Arg Glu Cys Lys Asp Pro Glu Pro Gln545 550 555 560Asn Gly Gly Arg Tyr Cys Leu Gly Arg Arg Ala Lys Tyr Gln Ser Cys565 570 575His Thr Glu Glu Cys Pro Pro Asp Gly Lys Ser Phe Arg Glu Gln Gln580 585 590Cys Glu Lys Tyr Asn Ala Tyr Asn Tyr Thr Asp Met Asp Gly Asn Leu595 600 605Leu Gln Trp Val Pro Lys Tyr Ala Gly Val Ser Pro Arg Asp Arg Cys610 615 620Lys Leu Phe Cys Arg Ala Arg Gly Arg Ser Glu Phe Lys Val Phe Glu625 630 635 640Ala Lys Val Ile Asp Gly Thr Leu Cys Gly Pro Glu Thr Leu Ala Ile645 650 655
Cys Val Arg Gly Gln Cys Val Lys Ala Gly Cys Asp His Val Val Asp660 665 670Ser Pro Arg Lys Leu Asp Lys Cys Gly Val Cys Gly Gly Lys Gly Asn675 680 685Ser Cys Arg Lys Val Ser Gly Ser Leu Thr Pro Thr Asn Tyr Gly Tyr690 695 700Asn Asp Ile Val Thr Ile Pro Ala Gly Ala Thr Asn Ile Asp Val Lys705 710 715 720Gln Arg Ser His Pro Gly Val Gln Asn Asp Gly Asn Tyr Leu Ala Leu725 730 735Lys Thr Ala Asp Gly Gln Tyr Leu Leu Asn Gly Asn Leu Ala Ile Ser740 745 750Ala Ile Glu Gln Asp Ile Leu Val Lys Gly Thr Ile Leu Lys Tyr Ser755 760 765Gly Ser Ile Ala Thr Leu Glu Arg Leu Gln Ser Phe Arg Pro Leu Pro770 775 780Glu Pro Leu Thr Val Gln Leu Leu Thr Val Pro Gly Glu Val Phe Pro785 790 795 800Pro Lys Val Lys Tyr Thr Phe Phe Val Pro Asn Asp Val Asp Phe Ser805 810 815Met Gln Ser Ser Lys Glu Arg Ala Thr Thr Asn Ile Ile Gln Pro Leu820 825830Leu His Ala Gln Trp Val Leu Gly Asp Trp Ser Glu Cys Ser Ser Thr835 840 845Cys Gly Ala Gly Trp Gln Arg Arg Thr Val Glu Cys Arg Asp Pro Ser850 855 860Gly Gln Ala Ser Ala Thr Cys Asn Lys Ala Leu Lys Pro Glu Asp Ala865 870 875 880Lys Pro Cys Glu Ser Gln Leu Cys Pro Leu885 890
權(quán)利要求
1.一種切割蛋白聚糖的方法，其包括用切割所述蛋白聚糖的分離ADAMTS-8蛋白接觸該蛋白聚糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白聚糖是聚集蛋白聚糖分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述ADAMTS-8蛋白是成熟的ADAMTS-8蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述成熟的ADAMTS-8蛋白由GeneBank登錄號(hào)AF060153編碼，但缺失信號(hào)肽和前域。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述成熟的ADAMTS-8蛋白包含SEQ ID NO28的214-890位氨基酸。
6.一種切割蛋白聚糖的方法，其包括用分離的蛋白酶接觸所述蛋白聚糖來切割該蛋白聚糖，其中所述蛋白酶包含ADAMTS-8的金屬蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述蛋白聚糖是聚集蛋白聚糖分子。
8.權(quán)利要求6或7的方法，其中所述ADAMTS-8的金屬蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域由SEQ ID NO28的214-439位氨基酸組成。
9.權(quán)利要求6、7或8中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白酶包含SEQ IDNO28的214-588位氨基酸。
10.一種切割蛋白聚糖的方法，其包括從重組表達(dá)載體表達(dá)蛋白酶，其中所述蛋白酶包含ADAMTS-8的金屬蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域，并且所述蛋白酶切割所述蛋白聚糖。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述蛋白聚糖是聚集蛋白聚糖分子，并且所述重組表達(dá)載體在分泌所述蛋白酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中所述重組表達(dá)載體包含SEQ IDNO28的214-890位氨基酸的編碼序列。
13.權(quán)利要求10、11或12中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組表達(dá)載體包含SEQ ID NO28的214-588位氨基酸的編碼序列。
14.一種鑒定能夠調(diào)節(jié)ADAMTS-8蛋白的聚集蛋白聚糖切割活性的試劑的方法，所述方法包括在存在或不存在所述試劑時(shí)，用聚集蛋白聚糖分子接觸所述ADAMTS-8蛋白；并且測定存在或不存在所述試劑時(shí)，所述ADAMTS-8蛋白的聚集蛋白聚糖切割活性，其中與不存在所述試劑時(shí)相比，存在所述試劑時(shí)聚集蛋白聚糖切割活性的改變表明所述試劑能夠調(diào)節(jié)所述聚集蛋白聚糖的切割活性。
15.一種包含根據(jù)權(quán)利要求14的方法鑒定的所述試劑的藥物組合物。
16.一種在哺乳動(dòng)物中治療聚集蛋白聚糖切割異常的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用根據(jù)權(quán)利要求14的方法鑒定的所述試劑。
17.一種鑒定能夠調(diào)節(jié)ADAMTS-8蛋白的聚集蛋白聚糖切割活性的試劑的方法，所述方法包括在存在或不存在所述試劑時(shí)，用聚集蛋白聚糖分子接觸蛋白酶，所述蛋白酶包含ADAMTS-8的金屬蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域并且具有聚集蛋白聚糖切割活性；并且測定存在或不存在所述試劑時(shí)，所述蛋白酶的聚集蛋白聚糖切割活性，其中與不存在述試劑時(shí)相比，存在所述試劑時(shí)聚集蛋白聚糖切割活性的改變表明所述試劑能夠調(diào)節(jié)所述聚集蛋白聚糖的切割活性。
18.一種調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞外區(qū)域中聚集蛋白聚糖切割活性的方法，其包括在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制ADAMTS-8的表達(dá)。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述抑制包括向所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引入包含或編碼ADAMTS-8RNAi或反義序列的多核苷酸。
20.一種在哺乳動(dòng)物中治療聚集蛋白聚糖切割異常的方法，其包括在所述哺乳動(dòng)物的選定細(xì)胞中抑制ADAMTS-8的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明的特征在于使用ADAMTS－8蛋白或其功能性衍生物切割聚集蛋白聚糖或其他蛋白聚糖分子的用途。本發(fā)明的特征也在于鑒定能夠抑制或增強(qiáng)ADAMTS－8蛋白酶解活性的ADAMTS－8調(diào)節(jié)劑的方法。此外，本發(fā)明的特征在于包含ADAMTS－8蛋白或其衍生物或調(diào)節(jié)劑的藥物組合物。這些藥物組合物可用來治療表征為蛋白聚糖切割或代謝缺陷或異常的疾病。
文檔編號(hào)A61K38/46GK1969043SQ200580019595
公開日2007年5月23日 申請日期2005年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月16日
發(fā)明者E·R·拉瓦利, L·A·科林斯-拉奇, C·J·科科倫, M·J·阿戈斯蒂諾, B·A·弗里曼, M·阿賴, C·R·弗蘭納里, M·X·吉恩 申請人:惠氏公司