專利名稱：含有包含在脂質體中的調節(jié)性細胞配體的藥物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有包含在脂質體中的調節(jié)性細胞配體的藥物，更具體而言，涉及治療過敏性疾病、自身免疫疾病等免疫疾病的藥物。
背景技術：
免疫疾病是指過敏性疾病、自身免疫疾病、移植物抗宿主病(GVHDgraft-versus-host disease)等由于免疫系統(tǒng)異?；蛎庖呦到y(tǒng)不適所引起的疾病。
已報道其中過敏性疾病患者有逐年增加的趨勢，患有某種過敏性疾病的日本國民已達70％。眾所周知，過敏性疾病的范圍很廣，包括哮喘、特應性皮炎、花粉癥、食物過敏、皮膚過敏等各種疾病，并且大多數過敏患者連鎖并發(fā)稱為過敏進程(allergy march)的各種過敏性疾病。另外，近年來在日本并發(fā)過敏性鼻炎或過敏性結膜炎的花粉癥或小兒特應性哮喘的患者急劇增加，其理由被認為是免疫系統(tǒng)形成的嬰幼兒時期的生活環(huán)境特別是免疫學環(huán)境的改變(細菌感染減少、氣密性高的住房中室塵濃度增大)提高了IgE抗體的產生。很顯然，狹義上稱為過敏性疾病的過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、特應性哮喘是由IgE抗體及誘導其產生的Th2細胞相關的I型過敏反應所引起的。另外，已有很多報道表明在除此之外的各種過敏性疾病中IgE抗體或Th2的優(yōu)勢與發(fā)病階段密切相關?；谝陨鲜聦?，推測抑制控制I型過敏反應的IgE抗體的產生以及抑制Th2分化是過敏性疾病治療法的有效手段。針對今后預期會進一步增加的過敏患者而言，采用基于過敏發(fā)病機理制備的藥物的病因療法或使過敏防患于未然的預防法(疫苗)被認為是有效的，這其中有必要保證較高的安全性(副作用低)。
已揭示出人源化抗IgE抗體(rhuMAb-E25、Genentech Inc.)在以特應性哮喘患者為對象的臨床治療中具有高的有效性(參見非專利文獻1)。在使用人工化合物抑制抗原特異性IgE抗體產生的實驗中，在用整合了柳杉花粉抗原Cryjl基因的質粒DNA免疫的BALB/c小鼠中引起了Th1型的免疫應答，其結果是產生了IgG2a抗體，即使用Cryjl抗原和氫氧化鋁(alum)進行加強免疫，IgG1和IgE抗體的產生也被抑制(參見非專利文獻2)。另據報道，在用OVA-IL-12融合蛋白免疫小鼠時也會引起OVA特異性Th1型免疫應答，其效率遠比用OVA和IL-12的混合液免疫時的效率要好，使得產生OVA特異性IgG2a抗體(參見非專利文獻3)。該報告顯示可能出現(xiàn)由于抗原和細胞因子誘導因子復合體的免疫的Th1偏向，并抑制與之相伴的IgE抗體的抗原特異性的產生。
另外，為了預防和緩解過敏性疾病，對抑制產生Th或和產生IgE抗體的B細胞的分化增殖以及機能的調節(jié)性細胞的控制成為有效的手段。NKT細胞被認為是在排除癌細胞、寄生蟲或和原蟲，以及李斯特菌或結核菌等細胞內感染細菌中起著重要作用的調節(jié)性細胞(參見非專利文獻4)。已表明，NKT細胞為中度表達T細胞受體(TCR)的中間TCR細胞(TCRint細胞)，在表現(xiàn)出大顆粒淋巴細胞(LGL)樣的形態(tài)、組成性表達IL-2Rβ鏈和在具有穿孔素顆粒等方面為與自然殺傷(NK)細胞相似的細胞，但在具有TCR方面是與NK細胞完全不同的細胞群(參見非專利文獻5)。Vα14+NKT細胞為上述NKT細胞的一種亞型，大多數Vα14+NKT細胞表達Vα14Jα281mRNA，并將其作為TCRα鏈。與小鼠α14Jα281鏈相同的人同源物Vα24JaQ鏈在健康個體的外周血液中的CD4-/CD8-T細胞中存在20-50％(參見非專利文獻6)。
由于這些NKT細胞的配體化合物α-半乳糖神經酰胺可誘導IFN-γ和IL-4兩種細胞因子產生，因此NKT細胞被認為是Th1/Th2分化的調節(jié)細胞(參見非專利文獻7)。已知若將α-半乳糖神經酰胺給予C57BL/6小鼠，由DNP-OVA和氫氧化鋁引起的IgE抗體的產生就會被抑制，在使用Vα14-NKT細胞缺失小鼠的相同實驗中，未觀察到IgE抗體產生被抑制(參見非專利文獻8)。另外，由于在給予I型糖尿病模型NOD小鼠α-半乳糖神經酰胺的實驗中觀察到癥狀得到改善，因此提示Vα14-NKT細胞具有增強Th2介導的免疫應答的可能性(參見非專利文獻9)。但是，僅用α-半乳糖神經酰胺得到的效果并不理想，需要藥效得到進一步的改善。
另一方面也指出，盡管β-半乳糖神經酰胺和β-葡糖神經酰胺廣泛存在于生物體內，但是與α-半乳糖神經酰胺的免疫激活作用或抗腫瘤作用相比，卻只有非常低的活性(參見非專利文獻10-12、專利文獻1)。
另外已知NKT細胞對自身免疫疾病模型也具有有效的作用(參見專利文獻13-16)。因此可以認為，若能選擇性增強NKT細胞的免疫抑制機能如IL-10的產生，那么不僅僅對過敏疾病的治療有效，同時對自身免疫疾病或GVHD等其他免疫疾病的治療也有效。但是，單獨地能選擇性增強NKT細胞的免疫抑制機能的配體尚不為人所知。另外，尚沒有人基于此目的使用脂質體。
專利文獻1特開平1-93562號公報非專利文獻1Immunopharmacology，48307(2000)非專利文獻2Immunology，99179(2000)非專利文獻3J.Immunol.，1584137(1997)非專利文獻4Clin.Immunol.，28，1069(1996)非專利文獻5J.Immunol.，155，2972(1995)非專利文獻6J.Exp.Med.182，1163(1995)非專利文獻7Nakayama.T.，et al.，Int Arch Allergy Immunol 124，38-42(2001)非專利文獻8J.Exp.Med.，190，783-7921999非專利文獻9Nat.Med.，71052-1056(2001)非專利文獻10Biochem.Biophys.Acta，280，626(1972)非專利文獻11Biochem.Biophys.Acta，316，317(1973)非專利文獻12Biol.Pharm.Bull.，18，1487(1995)非專利文獻13J.Exp.Med.，186677(1997)非專利文獻14J.Immunol.，16662(2001)非專利文獻15J.Exp.Med.，1941801(2001)非專利文獻16Nature，413531(2001)

發(fā)明內容
本發(fā)明的課題是提供以活體內的調節(jié)性細胞作為靶標的藥物，主要是提供針對過敏性疾病、自身免疫疾病等免疫疾病的藥物。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)脂質體中含有β-半乳糖神經酰胺、α-半乳糖神經酰胺等調節(jié)性細胞配體的組合物，具有在僅有這類化合物的溶液中并不能表現(xiàn)出的對產生IL-10的T細胞的誘導作用和抑制IgE抗體產生的作用，并且作為過敏性疾病等免疫疾病的預防劑或治療劑是有效的。另外還發(fā)現(xiàn)，脂質體中含有α-半乳糖神經酰胺的組合物通過選擇性增強NKT細胞的免疫抑制機能，能抑制病原性T細胞的分化增殖，因此，作為自身免疫疾病或移植物抗宿主病的預防劑或治療劑也是有用的。到此完成本發(fā)明。
或者說，本發(fā)明為如下所述(1)含有調節(jié)性細胞配體的脂質體作為有效成分的藥物。
(2)(1)的藥物，其中調節(jié)性細胞為NKT細胞。
(3)(1)或(2)的藥物，其中調節(jié)性細胞配體為β-半乳糖神經酰胺。
(4)(1)或(2)的藥物，其中調節(jié)性細胞配體為α-半乳糖神經酰胺。
(5)(1)～(4)任一項的藥物，其中上述脂質體進一步含有CpG寡核苷酸或咪喹莫特。
(6)(1)～(5)任一項的藥物，其中上述脂質體進一步含有過敏原。
(7)(1)～(6)任一項的藥物，為免疫疾病的預防劑或治療劑。
(8)(7)的藥物，其中免疫疾病為過敏性疾病。
(9)(8)的藥物，其中過敏性疾病為特應性支氣管哮喘、過敏性鼻炎、花粉癥或特應性皮炎。
(10)(4)的藥物，為自身免疫疾病或移植物抗宿主病的預防劑或治療劑。
(11)含有調節(jié)性細胞配體的脂質體作為有效成分的調節(jié)性細胞誘導劑。


圖1示出在BALB/c小鼠脾臟中CD11c+DC培養(yǎng)系統(tǒng)中添加Lipo-β或其它脂質體組合物或生理鹽水后，體外產生細胞因子的實驗結果。縱軸表示添加之后培養(yǎng)上清中的各種細胞因子的濃度。
圖2示出在C57BL/6 小鼠脾臟中CD11c+DC培養(yǎng)系統(tǒng)中添加Lipo-β或其它脂質體組合物或生理鹽水后，體外產生細胞因子的實驗結果?？v軸表示添加之后培養(yǎng)上清中的各種細胞因子的濃度。
圖3示出在BALB/c小鼠脾臟中CD11c+DC培養(yǎng)系統(tǒng)中添加Lipo-β或其它脂質體組合物或生理鹽水后，體外產生細胞因子的實驗結果?？v軸表示添加之后培養(yǎng)上清中的IL-10的濃度。
圖4示出用DNP-OVA和氫氧化鋁初次免疫給予Lipo-β或生理鹽水的BDF1小鼠之后，以及僅用DNP-OVA加強免疫之后，用ELISA法測定血漿中DNP-OVA特異性抗體產生的結果。
圖5示出給予Lipo-β或生理鹽水(陰性對照)的BALB/c小鼠第七天的脾臟中CD11c+DC細胞和DO11.10(OVA特異性TCRαβ轉基因)小鼠來源的CD4+T細胞在OVA肽存在下培養(yǎng)四天后培養(yǎng)上清中細胞因子濃度的測量結果。
圖6示出在將圖5的實驗中增殖的細胞過繼轉移到BALB/c小鼠中后，用DNP-OVA和氫氧化鋁免疫第14天的血液中抗體效價的測定結果。
圖7示出在C57BL/6小鼠脾臟的全細胞(上部分)、添加了抗CD1d中和抗體的相同細胞(下部分)或NKT缺失小鼠脾臟的全細胞(下部分)的培養(yǎng)液中添加培養(yǎng)液、α-半乳糖神經酰胺水溶液(α-GalCer)、對照脂質體組合物(Lipo-(-))或含有α-半乳糖神經酰胺的脂質體(Lipo-αGC)后體外細胞因子產生的實驗結果。橫軸表示添加后第2天的培養(yǎng)上清中各種細胞因子的濃度。
圖8示出將生理鹽水、Lipo-(-)或Lipo-αGC給予C57BL/6小鼠后第3天或第7天，用流式細胞術分析脾臟中Vα14-NKT細胞數的結果。橫軸表示FITC標記的抗TCRβ抗體的熒光強度，縱軸表示PE標記的CD1d四聚體+α-Galcer的熒光強度。
圖9示出在C57BL/6小鼠(上部分)或IL-10基因缺失小鼠(下部分)中給予生理鹽水、α-Galcer、Lipo-(-)或Lipo-αGC后第三天用DNP-OVA和氫氧化鋁免疫，此后，第14天測定得到的血液中抗DNP-IgE、-IgG1、-IgG2a的抗體效價。
圖10示出在給予BDF1小鼠生理鹽水、α-Galcer、Lipo-(-)或Lipo-αGC后第三天(day0)用DNP-OVA和氫氧化鋁免疫，此后，在day55僅用DNP-OVA進行加強免疫的實驗中，day0、14、55、64測定得到的血液中抗DNP-IgE、-IgG1、-IgG2a的抗體效價以及IgE、IgG1、IgG2a的總值。
圖11示出在給予BDF1小鼠生理鹽水、α-Galcer、Lipo-(-)或Lipo-αGC后第3天用DNP-OVA和氫氧化鋁免疫，第7天的脾臟CD4+T細胞與放射線照射的正常BDF1小鼠脾臟全細胞一起用DNP-OVA或PMA和離子霉素(Ionomycin)刺激48小時后，用MTT法測定得到的細胞增殖能力的結果。左圖的橫軸和縱軸分別表示DNP-OVA濃度和在波長570nm的吸光度。
圖12表示給予BALB/c小鼠生理鹽水、α-Galcer、Lipo-(-)或Lipo-αGC后第3天的脾臟中的細胞用抗CD11c抗體和抗CD45RB抗體染色后，用流式細胞術分析得到的結果。
圖13表示采用圖11的流式細胞術分析得到的細胞數比值和脾臟的全部細胞數相乘得到的CD11clowCD45RBhigh細胞數和CD11chighCD45RBlow細胞數。
圖14表示給予BALB/c小鼠Lipo-αGC后，第3天從脾臟細胞分離回收CD11clowCD45RBhigh細胞和CD11chighCD45RBlow細胞，用LPS刺激后第2天培養(yǎng)上清中的細胞因子的測定結果。橫軸表示培養(yǎng)上清中的細胞因子濃度。
圖15表示用OVA323-339肽脈沖的CD11clowCD45RBhigh細胞或CD11chighCD45RBlow細胞與DO11.10小鼠脾臟來源的CD4+T細胞共培養(yǎng)，48小時后用MTT法測定得到的細胞增殖能力的結果。橫軸表示波長為570nM的吸光度。
圖16表示用OVA323-339肽脈沖的CD11clowCD45RBhigh細胞或CD11chighCD45RBlow細胞與DO11.10小鼠脾臟來源的CD4+T細胞共培養(yǎng)，用抗CD4抗體和抗CD25、CD28、CD152、ICOS抗體對增殖的細胞進行流式細胞術的分析結果。
圖17表示用OVA323-339肽脈沖的CD11clowCD45RBhigh細胞或CD11chighCD45RBlow細胞與DO11.10小鼠脾臟來源的CD4+T細胞共培養(yǎng)，用PMA和離子霉素刺激增殖的細胞后，用流式細胞術分析細胞內細胞因子表達的結果。上部分和下部分分別表示同種型對照抗體、細胞因子特異性抗體的細胞內染色模式。
圖18表示給予Lipo-αGC或Lipo-αGC+OVA的BDF1小鼠脾臟來源的CD4+T細胞與在體外用同種放射線照射的脾細胞一起在OVA蛋白質存在下培養(yǎng)，第6天用PMA和離子霉素刺激后，用流式細胞術分析細胞內細胞因子表達的結果。上部分和下部分分別表示給予Lipo-αGC的小鼠脾臟來源的CD4+T細胞和給予Lipo-αGC+OVA的小鼠脾臟來源的CD4+T細胞的細胞內染色。
圖19表示在用DNP-OVA和氫氧化鋁免疫BDF1小鼠后第21、28、35天給予單獨的脂質體(載體)、Lipo-αGC或Lipo-αGC+OVA，此后，第42天僅用DNP-OVA抗原進行加強免疫，第48天測定得到的血液中抗DNP-IgE、-IgG1、-IgG2a抗體效價(上部分)和IgE、IgG1、IgG2a總值(下部分)。*，p＜0.05；**，p＜0.005；***，p＜0.00具體實施方式
在本說明書中，所述“調節(jié)性細胞”是指NKT細胞(自然殺傷T細胞)、產生IL-10的Tr1細胞、DC細胞(樹突細胞)等，其中特別優(yōu)選NKT細胞。
所述“調節(jié)性細胞配體”沒有特別的限制，只要它能夠與上述調節(jié)性細胞的細胞表面受體相結合，促進該調節(jié)性細胞的分化增殖或活化，如下文所列舉的物質。但是，調節(jié)性細胞配體不僅限于此。
(i)NKT細胞的配體α-半乳糖神經酰胺、β-半乳糖神經酰胺等半乳糖神經酰胺類；(ii)對調節(jié)性樹突細胞(DC)的分化增殖起作用的維生素D3、地塞米松、TGF-β、IL-10等；(iii)對調節(jié)性T細胞的分化增殖起作用、誘導IL-10或FoxP3等表達的物質。
本發(fā)明所述的“調節(jié)性細胞誘導劑”是指誘導調節(jié)性細胞的分化增殖或活化的藥劑。調節(jié)性細胞的分化增殖或活化的促進可通過例如下述方法確定如實施例所示，使用脾臟CD11c+DC等，可以對其中所含有的NKT細胞和產生IL-10的Tr1細胞的增殖情況進行測定，也可以對由NKT細胞和產生IL-10的Tr1細胞產生的細胞因子(IFN-γ、IL-10、IL-4等)進行定量。
本發(fā)明所述“含有調節(jié)性細胞配體的脂質體”優(yōu)選可誘導作為調節(jié)性細胞的NKT細胞和產生IL-10的Tr1細胞，還具有抑制輔助T細胞活化的活性，并且具有抑制B細胞釋放IgE抗體產生的作用。具體而言，脂質體中含有上述“調節(jié)性細胞配體”，其中優(yōu)選的是在脂質體的雙層脂質膜內含有α-半乳糖神經酰胺或β-半乳糖神經酰胺的組合物。此外，本發(fā)明的“含有調節(jié)性細胞配體的脂質體”也可以含有2種以上“調節(jié)性細胞配體”。
本發(fā)明所述“含有調節(jié)性細胞配體的脂質體”除含調節(jié)性細胞配體外，還可含有TLRs(Toll樣受體)家族配體類物質。通過添加TLRs家族配體類物質，能增加調節(jié)“調節(jié)性細胞”作用的細胞因子的產生，更能提高效果。TLRs家族配體類物質可為CpG寡核苷酸(CpGODN)咪喹莫特(imiquimod1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺，1-(2-methylproryl)-1H-imidazo[4，5-c]quinolin-4-amine)等。
此外，所述“含有調節(jié)性細胞配體的脂質體”還可含有過敏原。過敏原是引起過敏的物質，優(yōu)選為花粉抗原或螨抗原。具體而言，過敏原可為OVA(卵白蛋白)。
本發(fā)明提供包括作為水溶性高分子物質的上述調節(jié)性細胞配體、優(yōu)選半乳糖神經酰胺等脂溶性化合物的脂質體。
在本發(fā)明書中，微團(由含有親水性區(qū)域和疏水性區(qū)域的兩親性分子凝集得到的水溶性顆粒)是具有封閉的囊泡結構的物質，被稱為脂質體。脂質體組分可為用現(xiàn)有的方法能形成囊泡的兩親性分子中的任何物質，優(yōu)選脂質。在本發(fā)明中，脂質為例如二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等磷脂、神經鞘脂等脂質、甘油糖脂等，可將一種或兩種以上這類物質用于脂質體的制備，或者將其與脂質衍生物等組合用于脂質體的制備，該脂質衍生物是膽固醇等非極性物質或聚乙二醇等水溶性高分子結合在脂質上所形成的物質。
脂質體可用公知的方法制備。例如可采用記載在《脂質體技術》(Liposome Technology，vol.1，2ndedition(by Gregory Gregoriadis(CRC Press，Boca Raton，Ann Arbor，London，Tokyo))第4章第67-80頁，第10章第167-184頁和第17章第261-276頁(1993)中的方法。更具體而言，例如超聲處理法、乙醇注入法、French壓力法、乙醚注入法、膽酸法、鈣融合法、凍融法、反相蒸發(fā)法等，但不限于此。本發(fā)明的脂質體的大小并沒有特別的限制，通常優(yōu)選平均為100～200nm，更優(yōu)選100-150nm。脂質體的結構也沒有特別的限定，單層、多層等任何脂質體均可。在脂質體的內部所含有的溶液，除水之外，可以使用緩沖液、生理鹽水等。也可在其中添加適量的水溶性有機溶劑(例如丙三醇等)使用。
此外，為了將“含有調節(jié)性細胞配體的脂質體”靶向到目標位置，也可以將本發(fā)明的藥物中所使用的脂質體的表面進行修飾。目標位置為例如肝臟、脾臟、淋巴結、骨髓、肺、眼、皮膚、眼、鼻等。
修飾脂質體表面的物質可為低分子化合物、高分子化合物、核酸、肽、蛋白質、糖鏈等。高分子化合物可為聚乙二醇等(參見例如特許第2948246號)。核酸可為例如識別目標細胞Toll樣受體TLR-7或TLR-9的單鏈RNA或單鏈DNA以及這些核酸的衍生物等。蛋白質可為例如識別在抗原提呈細胞樹突細胞(DC)或其前體細胞等目標細胞表面特異性表達的分子的抗體或受體等。用糖鏈修飾包括使用能與在DC細胞表面表達的甘露糖受體相結合的甘露糖結合脂質的修飾等(參見例如Copland，M.J.，et al.，(2003)Liposome delivery of antigento human dendritic cells，Vaccine，21883-890)。
將配體裝入脂質體可通過常規(guī)方法進行。例如，如實施例所示，將脂質體成分和配體分別溶解到有機溶劑中，然后將其混合，通過加水就可得到含有調節(jié)性細胞配體的脂質體。但是，含有調節(jié)性細胞配體的脂質體的制備方法不限于上述方法。
“含有調節(jié)性細胞配體的脂質體”可作為藥物的有效成分使用。
也就是說，由于“含有調節(jié)性細胞配體的脂質體”可誘導調節(jié)性細胞NKT或產生IL-10的Tr1細胞、具有抑制輔助T細胞活化的活性，并且具有抑制從B細胞釋放IgE抗體產生的作用，因此本發(fā)明的藥物作為IgE抗體所引起的過敏性疾病的預防劑或治療劑是有效的。IgE抗體與過敏性疾病的關系特別密切，通過對其產生(分泌)進行抑制，能獲得對I型過敏性疾病的預防或治療效果。與IgE抗體相關的過敏性疾病包括特應性支氣管哮喘、特應性皮炎以及過敏性鼻炎或花粉癥等過敏性鼻炎。此外，在本發(fā)明中，過敏性疾病的預防不僅包括使包括未患過敏性疾病的人在內的哺乳動物不患該疾病，并且還包括暫時未出現(xiàn)癥狀的過敏性疾病患者(包括人在內的哺乳動物)中也不出現(xiàn)該癥狀。
另外，由于“含有調節(jié)性細胞配體的脂質體”具有抑制T細胞活化的作用，因此本發(fā)明的藥物作為暴發(fā)性肝炎等疾病的預防劑或治療劑也是有效的。
另外，由于含有α-半乳糖神經酰胺的脂質體具有選擇性增強NKT細胞的免疫抑制機能的效果，因此含有作為有效成分的脂質體的藥物作為具有免疫抑制能力的藥物也是有效的，該脂質體含有α-半乳糖神經酰胺。具體而言，作為針對風濕病、多發(fā)性硬化癥、全身性紅斑狼瘡、膠原病等自身免疫疾病的藥物，或者作為針對移植時出現(xiàn)的排異反應等GVHD的藥物是有效的。
此外，α-半乳糖神經酰胺沒有特別的限制，只要它能夠結合NKT細胞表面受體、選擇性增強NKT細胞的免疫抑制機能，優(yōu)選結合在人中由Vα24JαQ、在小鼠中由Vα14Jα281構成的受體，分子量優(yōu)選400～2000。
另一方面，本發(fā)明中所用的β-半乳糖神經酰胺優(yōu)選分子量為400～2000。
本發(fā)明的另一個實施方案提供了含有將米喹莫特的脂質體作為有效成分的藥物。由于脂質體中含有米喹莫特，與單獨使用米喹莫特時相比，IL-10和IFN-α等的產量上升，由此NKT細胞被活化。因此，含有米喹莫特的脂質體作為有效成分的藥物作為預防或治療上述過敏性疾病的藥物是有用的。
作為本發(fā)明的藥物的給予途徑，口服給予和非口服給予均可，由臨床醫(yī)生適當選擇。另外，可單獨或與通常使用的載體一起給予有效成份“含有調節(jié)性細胞配體的脂質體”。
口服給予本發(fā)明的藥物時，藥物的形態(tài)可為片劑、包被片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑等固體制劑，液劑(如滴眼劑、點鼻藥等)，懸濁劑、乳劑、糖漿劑等液體制劑、氣霧劑、霧化劑、噴霧劑等吸入劑以及脂質體封入劑等。
非口服給予本發(fā)明的藥物時，藥劑的形態(tài)可為在靜脈注射、皮下注射、皮內注射、肌肉注射以及腹腔內注射等中所使用的注射劑(液劑、懸濁劑等)、液劑、懸濁劑、乳劑、點滴劑等。
本發(fā)明的藥物為液體制劑時，可冷凍保存或通過冷凍干燥等除去水分保存。冷凍干燥制劑在使用時加入注射用蒸餾水再次溶解后使用。
本發(fā)明的藥物中所使用的可藥用的載體為例如根據制劑的使用狀態(tài)通常所使用的結合劑、分解劑、表面活性劑、吸收促進劑、保濕劑、吸附劑、潤滑劑、填充劑、擴張劑、付濕劑、防腐劑、安定劑、乳化劑、增溶劑、調節(jié)滲透壓的鹽、緩沖劑等稀釋劑或賦形劑，這些載體應根據得到的制劑的給藥單位形態(tài)適當選擇使用。
進一步而言，必要時本發(fā)明的藥物中還可含有著色劑、防腐劑、香料、調味劑、甜味劑等其它醫(yī)藥品，可以藥劑方式制備。
技術人員參照現(xiàn)有的技術可很容易地決定“含有調節(jié)性細胞配體的脂質體”的有效量，如體重1kg為0.1-100mg，優(yōu)選1-10mg，可將其在1天里分1到3次給予，優(yōu)選根據各種制劑的形態(tài)、患者的性別、年齡、疾病程度作適合調整。
實施例以下通過列舉實施例說明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不由這些實施例作任何限制，因此無需說明在本發(fā)明的技術領域里能進行常規(guī)改變。
實施例1《含有配體的脂質體的制備和活性測定》1.含有β-半乳糖神經酰胺的脂質體(Lipo-β)的制備將L-α-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE，和光純藥#166-16183)0.77mg、3β-N-(二甲基氨乙基)鹽酸碳酸酯-膽固醇(DC-Chol，cholesteryl3β-N-(dimethylaminoethyl)carbonate hydrochloride，SIGMA-Aldrich)0.83mg、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](1，2-distearoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(polyethylene glycol)-2000]，AVANTI POLAR-LIPIDS，INC.#i88653)0.0029mg溶解在250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶劑中。再將β-半乳糖神經酰胺(Ceramide β-D-galactoside，Sigma-Aldrich#C4905)0.16mg溶解在另外250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶劑中。然后，將兩者混合、用蒸發(fā)器干燥后，在真空干燥器內干燥一晚上。然后添加800μl水，置于超聲破碎裝置中處理1分鐘后，用擠壓機(AVESTIN；LiposoFast-Basic)通過加壓過濾制備成顆粒，用孔徑為0.22μm的膜滅菌。該脂質體組合物(Lipo-β)的最終濃度為200μl/ml。用相同的方法制備不含β-半乳糖神經酰胺的脂質體組合物(Lipo-0)。另外，將寡核苷酸CpGODN(1668)(SIGMA GENOSIS制備)以重量比1∶5混合在Lipo-β中之后，過脫鹽柱NAP-10回收洗脫物Lipo-β-CpG。
2.含有米喹莫特的脂質體的制備將L-α-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE，和光純藥#166-16183)0.77mg、3β-N-(二甲基氨乙基)鹽酸碳酸酯-膽固醇(DC-Chol，SIGMA-Aldrich)0.83mg、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](AVANTI POLAR-LIPIDS，1NC.#i88653)0.029mg溶解在250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶劑中。再將米喹莫特(Imiquimod，SequoiaResearch Products Ltd；SRP0058i)0.16mg溶解在另外250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶劑中。然后，將兩者混合、用蒸發(fā)器干燥后，在真空干燥器內干燥一晚上。然后添加800μl水，置于超聲破碎裝置中處理1分鐘后，用擠壓機(AVESTIN；LiposoFast-Basic)通過加壓過濾制備成顆粒，用孔徑為0.22μm的膜滅菌。該脂質體組合物(Lipo-Imq)的最終濃度為200μl/ml。用與制備上述組合物相同的方法再制備含有β-D-半乳糖神經酰胺(Sigma-Aldrich#C4905)的脂質體組合物(Lipo-Imq-βGC)。另外，將寡核苷酸CpGODN(1668)以重量比1∶5混合在Lipo-Imq中之后，過脫鹽柱NAP-10回收洗脫物Lipo-Imq-CpG。
3.針對含有配體的脂質體的樹突細胞(DC)的體外活性測定在BALB/c或C57BL/6 小鼠的脾臟中注入1mg/ml的膠原酶D(Roche)，在CO2培養(yǎng)箱內孵育45分鐘。再將從脾臟中提取的細胞懸浮于3ml HistoDenz(14.1％，SIGMA)中后，將含有50μM 2-巰基乙醇(2-ME)的X-VIVO 15(Takara Bio公司)覆于其上。1500rpm離心5分鐘后，回收中間層的細胞，在含有50μM 2ME、0.5％胎牛血清和20ng/ml rmGM-CSF(Pharmingen)的X-VIVO 15培養(yǎng)基中、CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)1小時30分鐘。輕輕吹打后，除去未貼壁細胞，加入含有50μM 2ME、0.5％胎牛血清和20ng/ml rmGM-CSF(Pharmingen)的X-VIVO 15培養(yǎng)基，在CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)18小時。將未貼壁細胞回收之后，回收與抗CD11c抗體磁性微球(Miltenyi)結合的細胞，此即脾臟CD11c+DC。在將1×104個CD11c+DC懸浮于200μl含有10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中后，添加最終濃度為1μg/ml脂質體組合物，在96孔U底微量培養(yǎng)板中，于37℃、含有5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。48小時后回收培養(yǎng)上清，用ELISA法測定IFN-α、IL-10、IL-12(圖1、2)。在Lipo-β和Lipo-Imq添加組中，IL-10和IFN-α的產生較高，IL-12的產生較低，相反的是，在Lipo-β-CpG和Lipo-Imq-CpG添加組中，IL-10和IFN-α的產生較低，IL-12的產生較高。另一方面，在非添加組(對照組)以及Lipo-0或β-半乳糖神經酰胺(β-GalCer)溶液添加組中，全部細胞因子的產生不能檢出或者值較低。另外，用相同的評估方法測定在Lipo-Imq-βGC的影響下CD11c+DC產生IL-10的產生能力，結果表明與僅有Lipo-β或僅有Lipo-Imq相比，具有顯著提高的IL-10產生能力(圖3)。
實施例2《Lipo-β抑制體內IgE抗體產生的效果》以2μg/只的用量腹腔內給予BDF1小鼠(5只/組)Lipo-β，第7天(0天)用DNP-OVA 0.1μg(Cosmobio)和氫氧化鋁10mg進行初次免疫。初次免疫后第14天眼窩采血，用ELISA法測定小鼠血漿中的抗DNP-IgG1、-IgE、-IgG2a抗體效價(圖4中的14天)。然后，在初次免疫后第35天僅用DNP-OVA抗原進行加強免疫，此后第7天眼窩采血，用ELISA法測定血漿中的抗DNP-IgG1、-IgE抗體效價(圖4的42天)。在Lipo-β給予組中，在14天觀察到對IgG1抗體和IgE抗體的產生已經具有抑制傾向，在加強免疫后的42天IgG1抗體和IgE抗體的增加被完全抑制。
實施例3《(給予Lipo-β的小鼠來源樹突細胞(DC)對調節(jié)性T細胞的誘導作用》
1.體外的T細胞活化能力的評價2μg/只腹腔內給予BALB/c小鼠Lipo-β或生理鹽水，7天后取出脾臟。將1mg/ml膠原酶D(Roche)注入脾臟，CO2培養(yǎng)箱中孵育45分鐘。再將從脾臟中提取的細胞懸浮于3ml HistoDenz(14.1％，SIGMA)中后，將含有50μM 2-巰基乙醇(2-ME)的X-VIVO 15覆于其上。1500rpm離心5分鐘后，回收中間層的細胞，在含有50μM2ME、0.5％胎牛血清和20ng/ml rmGM-CSF(Pharmingen)的X-VIVO 15培養(yǎng)基中、于CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)1小時30分鐘。輕輕吹打后，除去未貼壁細胞，加入含有50μM 2ME、0.5％胎牛血清和20ng/ml rmGM-CSF(Pharmingen)的X-VIVO 15培養(yǎng)基，在CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)18小時。將未貼壁細胞回收之后，回收與抗CD11c抗體磁性微球(Miltenyi)結合的細胞，此即脾臟CD11c+DC。用抗體磁性微球(Miltenyi)從OVA特異性TCRαβ轉基因DO11.10小鼠(Science，1990，vol.250，p1720；從千葉大學研究生院醫(yī)學研究院中山俊憲氏獲得)的脾臟回收CD4+T細胞。然后將2×104個CD11c+DC和1×105個CD4+T細胞在OVA肽存在下于CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4天，然后回收培養(yǎng)上清，用ELISA法測定IFN-γ、IL-4和IL-10的產量(圖5)。其結果是在使用給予Lipo-β小鼠脾臟來源的DC和給予生理鹽水小鼠(正常)脾臟來源的DC時，未觀察到IL-4和IFN-γ的產量存在差異，IL-10的產生僅僅在給予Lipo-β小鼠脾臟DC中、OVA肽濃度為3nM和30nM時才被檢出。另外同時也確認了調節(jié)性細胞的增殖情況。
2.通過過繼轉移法對體內IgE抗體產生的抑制作用的評價回收在上述1.的體外實驗中給予Lipo-β的小鼠來源脾臟DC和在OVA肽濃度為3nM或30nM下增殖的DO11.10-CD4+T細胞，將1×106個細胞轉移到BALB/c小鼠(3只/組)的腹腔內。此后1個小時后，用DNP-OVA(10μg)和氫氧化鋁(10mg)進行初次免疫，第14天進行眼窩采血。用ELISA法測定血漿中的抗DNP-IgG1、抗DNP-IgE、抗DNP-IgG2a各自的抗體效價(圖6)。其結果是在用濃度為3nM的OVA肽刺激后增殖得到的DO11.10-CD4+T細胞過繼轉移的小鼠中，IgE抗體的產生被完全抑制。另一方面，在用濃度為30nM的OVA肽刺激后增殖得到的DO11.10-CD4+T細胞過繼轉移的小鼠中，對IgE抗體產生的抑制效果較低。另外，對IgG1抗體和IgG2a抗體的抑制在兩組中均不顯著。
實施例4《含有配體的脂質體的制備和活性測定》1.含有α-半乳糖神經酰胺的脂質體的制備將L-α-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE，和光純藥#166-16183)0.77mg、3β-N-(二甲基氨乙基)鹽酸碳酸酯-膽固醇(DC-Chol，SIGMA-Aldrich#C2832)0.83mg溶解在250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶劑中。然后再將α-半乳糖神經酰胺(獨立行政法人理化學研究所免疫過敏科學綜合研究中心制；KRN7000、參見國際公開小冊子第98/44928號)0.16mg溶解在另外250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶劑中。然后，將兩者混合、用蒸發(fā)器干燥后，在真空干燥器內干燥一晚上。然后添加800μl水，置于超聲破碎裝置中處理1分鐘，然后通過孔徑為0.22μm的滅菌用膜。該脂質體組合物(Lipo-αGC)的最終濃度為200μg/ml。再用同樣的方法制備不含有α-半乳糖神經酰胺的對照用脂質體組合物(Lipo-(-))。
2.Lipo-αGC的細胞因子產生能力的測定將C57BL/6小鼠脾臟的全細胞2×105個懸浮在200μl含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基添加了100ng/ml的Lipo-(-)、Lipo-αGC或α-半乳糖神經酰胺水溶液(α-GalCer)，然后添加到96孔U底培養(yǎng)板中，于37℃、含有5％CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2天。用ELISA法測定培養(yǎng)上清中的IFN-γ、IL-4、IL-10(圖7上部分)。Lipo-αGC添加組的IF-γ、IL-4的產量與α-GalCer添加組相同，但是Lipo-α添加組的IL-10的產生大約是α-GalCer水溶液添加組的5倍。另外在最終濃度為10μg/ml的抗CDld中和抗體(1B1，BDBioscience Pharmingen)存在下進行相同的實驗時，以及使用Vα14-NKT細胞缺失小鼠(C57BL/6本底)脾臟的全細胞時，在培養(yǎng)上清中不能檢出IFN-γ、IL-4、IL-10(圖7下部分)。
3-Lipo-αGC的Vα14-NKT細胞增殖能力的評價以2μg/小鼠腹腔內給予C57BL/6小鼠Lipo-αGC、作為對照的Lipo-(-)或生理鹽水，第3天(DAY3)和第7天(DAY7)的脾臟中用α-GalCer/CD1d四聚體和抗TCRβ抗體染色雙陽性的細胞(Vα14-NKT細胞)數用流式細胞術分析。其結果表明給予Lipo-α后DAY3的小鼠脾臟中Vα14-NKT細胞數相對于生理鹽水組增殖了2倍以上，而在DAY7與給予對照的小鼠相比反而有所減少(圖8)。
實施例5《Lipo-αGC的體內抗體產生的抑制效果》1.使用C57BL/6小鼠和IL-10缺失小鼠的體內抗體產生系統(tǒng)的活性評價以2μg/小鼠腹腔內給予C57BL/6小鼠(5只/組)生理鹽水、α-GalCer、Lipo-(-)或Lipo-αGC，在第3天用DNP-OVA和氫氧化鋁免疫。免疫后第14天眼窩采血，用ELISA法測定小鼠血漿中的抗DNP-IgG1、-IgE、IgG2a抗體效價。其結果表明與α-GalCer給予組相比，在Lipo-αGC給予組中抗體產生的抑制效果就全部同種型而言有較高的傾向(圖9上部分)。另外，用C57BL/6本底IL-10缺失小鼠進行同樣的實驗，結果沒有觀察到上述抗體產生的抑制效果(圖9下部分)。
2.使用BDF1小鼠的體內抗體產生系統(tǒng)的活性評價以2μg/小鼠腹腔內給予BDF1小鼠(C57BL/6×DBA/2F1)(5只/組)生理鹽水、α-GalCer、Lipo-(-)或Lipo-αGC，在第3天(day0)用DNP-OVA和氫氧化鋁進行初次免疫，初次免疫后第55天(day55)僅用DNP-OVA抗原進行加強免疫。分別在day0、14、55、64眼窩采血，用ELISA法測定小鼠血漿中的抗DNP-IgE、-IgG1、IgG2a抗體效價以及IgE、IgG1、IgG2a的總值。其結果表明Lipo-αGC給予組的全部同種型抗DNP抗體的效價的上升以及全部IgE的產生基本被完全抑制(圖10)。另一方面，IgG1和IgG2a的總值變化在Lipo-αGC給予組和α-GalCer或Lipo-(-)給予組間基本相同(圖10)。
3.使用BDF1小鼠的T細胞活化能力的評估以2μg/小鼠腹腔內給予BDF1小鼠生理鹽水、α-GalCer、Lipo-(-)或Lipo-αGC，在第3日用DNP-OVA和氫氧化鋁進行初次免疫，此后第7天取出脾臟，用磁性微球(Miltenyi)制備CD4+T細胞。然后用20Gy放射線照射正常BDF1小鼠脾臟全細胞，制備抗原提呈細胞。在96孔U底培養(yǎng)板的1個孔內，加入200μl培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液中懸浮了2×105個CD4+T細胞和用DNP-OVA脈沖的2×105個抗原提呈細胞，于37℃、含有5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48小時后用MTT法(Promega#G4000)測定細胞增殖能力，結果表明給予Lipo-αGC的BDF1小鼠脾臟來源的CD4+T細胞針對所有濃度的DNP-OVA沒有增殖能力，其他CD4+T細胞按照α-GalCer、生理鹽水、Lipo-(-)的順序增殖能力遞增(圖11左圖)。另一方面，在37℃、含有5％CO2的培養(yǎng)箱內，分別用50ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA；Sigma-aldrich#P-1585)和500nM離子霉素(Sigma-aldrich，#I-0634)對2×105個CD4+T細胞施加48小時的抗原非特異性刺激時，給予Lipo-αGC的小鼠來源的CD4+T細胞與其他細胞相比，表現(xiàn)出雖然比較低但顯著的增殖能力(圖11右圖)。
4.對給予Lipo-αGC的小鼠脾臟中樹突細胞(DC)的分析4-1流式細胞術分析以2μg/小鼠腹腔內給予BALB/c小鼠生理鹽水、α-GalCer、Lipo-(-)或Lipo-αGC，在第3日取出脾臟。脾臟中注入1mg/ml膠原酶D(Roche)、CO2培養(yǎng)箱中孵育45分鐘。再將從脾臟中提取的細胞懸浮于3ml HistoDenz(14.1％，Sigma-aldrich)中后，將含有50μM2-巰基乙醇(2-ME)的X-VIVO 15培養(yǎng)基(CAMBREX Bio SicenceWalkerville，Inc.)覆于其上。1500rpm離心5分鐘后，回收中間層的細胞，用含有50μM 2ME、10％FCS的X-VIVO 15培養(yǎng)基洗滌細胞后、懸浮于含有0.5％FCS的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，添加生物素化抗CD3、CD11b、CD19、CD49b、Gr-1、TER-119、B220抗體(以上購自BD Bioscience Pharmingen)。10℃孵育20分鐘后，用含有0.5％FCS的PBS洗滌一次，然后添加結合磁性微球的鏈霉親和素(SA，Miltenyi)。10℃孵育15分鐘，接著用含0.5％FCS的PBS洗滌兩次，然后用微球分離柱和磁石(以上購自Miltenyi)回收磁性微球陰性細胞。用PE標記抗CD11c抗體(BD Bioscience Pharmingen)和APC標記抗CD45RB抗體(BD Bioscience Pharmingen)將此細胞染色后，用流式細胞術分析。其結果是在給予Lipo-αGC的小鼠脾臟來源細胞中，CD45RBhighCD11clow細胞的比例比CD45RBlowCD11chigh細胞的比例高，與之相對的是，在給予生理鹽水、Lipo-(-)或α-GalCer的小鼠來源的細胞中，該比例反而降低(圖12)。此后換算脾臟中的細胞數，結果表明給予Lipo-αGC的小鼠脾臟中的CD45RBhighCD11clow細胞數較給予α-GalCer的小鼠脾臟中相應細胞數增加了大約三倍，與之相對的是，CD45RBlowCD11chigh細胞數在給予α-GalCer小鼠中的與給予Lipo-αGC小鼠的相比反而有所增加(圖13)。
由于CD45RBhighCD11clow細胞被報道是調節(jié)性樹突細胞的細胞群，能引起免疫抑制，相反，CD45RBlowCD11chigh細胞是活化T細胞的樹突細胞，能引起免疫激活，因此認為NKT細胞的免疫抑制機能是由于CD45RBhighCD11clow細胞數的增加所引起的。
4-2細胞因子產生能力的評價用流式細胞儀(FACS Vantage SE、BD Bioscience)分別回收用上述1中所記載的方法分離得到的CD45RBhighCD11clow細胞團和CD45RBlowCD11chigh細胞團，在96孔U底培養(yǎng)板的1個孔內加入1×105個細胞/200μl培養(yǎng)液。在含有或不含最終濃度為1μg/ml脂多糖(LPS，T3382、Sigma-ald rich)的情況下將細胞培養(yǎng)2天。ELISA法測定培養(yǎng)上清中的細胞因子IL-10和IL-12的結果是在LPS刺激的CD45RBhighCD11clow細胞的培養(yǎng)上清中檢出IL-10，而未檢出IL-12，另一方面不管有無LPS刺激，在CD45RBlowCD11chigh細胞的培養(yǎng)上清中檢出IL-12，而未檢出IL-10(圖14)。
4-3T細胞活化能力的評價在96孔U底培養(yǎng)板的1個孔內以1×104個細胞/200μl培養(yǎng)液加入通過上述2中所述的方法分離得到的CD45RBhighCD11clow細胞或CD45RBlowCD11chigh細胞，然后以4×105個細胞/200μl培養(yǎng)液加入用磁性微球(Miltenyi)從DO11.10小鼠脾臟純化得到的CD4+T細胞。在添加或未添加最終濃度為600nM OVA323-339肽的條件下，于37℃、含5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。48小時后，用MTT法(Promega#G4000)測定細胞增殖能力，結果表明CD45RBhighCD11clow細胞和OVA肽刺激的CD4+T細胞與CD45RBlowCD11chigh細胞所引起的增殖能力相比，略為遜色，但增殖能力依然很強(圖15)。在培養(yǎng)第7天回收用CD45RBhighCD11clow細胞和OVA肽刺激增殖得到的CD4+T細胞，在添加OVA肽條件下，與剛剛分離回收得到的CD45RBhighCD11clow細胞或CD45RBlowCD11chigh細胞進行兩個7天的培養(yǎng)，之后第5天用流式細胞術分析培養(yǎng)液中的細胞。其結果表明增殖的細胞群為CD4+CD25+CD28+CD152-ICOS+基本均一的細胞團(圖16)。然后在最終濃度PMA為50ng/ml、離子霉素為500nM以及莫能霉素(Monensin，Sigma-aldrich#M-5273)為2μM存在下將5×105個該細胞于37℃、含有5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4小時。回收細胞后，懸浮于100μl BD Cytofix/Cytoperm液(BD Bioscience)中，4℃孵育15分鐘。用BD Perm/Wash液(BD Bioscience)洗滌后，用FITC標記抗IFN-γ抗體、PE標記抗IL-4抗體(BD Bioscience Pharmingen)和APC標記抗IL-10抗體(BD Bioscience Pharmingen)進行細胞內三重染色，并且采用與之相同的熒光標記的同種型對照抗體進行細胞內三重染色(圖17上部分)，用流式細胞術分析。其結果表明在表達細胞因子的細胞群中，僅僅表達IL-4的細胞基本不存在，并且依照僅僅表達IFN-γ的細胞、表達IL-10和IFN-γ的細胞、僅僅表達IL-10的細胞的順序，細胞數增多(圖17下部分)。
實施例6《含有過敏原和調節(jié)性細胞配體的脂質體對IgE抗體產生的抑制效果》1.含有卵白蛋白和α-半乳糖神經酰胺的脂質體的制備將L-α-二油酰磷脂酰膽堿(DOPC，和光純藥)0.77mg和3β-N-(二甲基氨乙基)鹽酸碳酸酯-膽固醇(DC-Chol，Sigama-Aldrich)0.83mg和1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](銨鹽)(PEG-PE；Avanti Polar Lipids)0.029mg溶解在250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶劑中。然后再將α-半乳糖神經酰胺(獨立行政法人理化學研究所免疫過敏科學綜合研究中心制)0.16mg溶解在另外250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶劑中。然后，將兩者混合、用蒸發(fā)器干燥后，在真空干燥器內干燥一晚上。然后添加200μl卵白蛋白(OVA，生化學工業(yè))濃度為0.4mg/ml的水溶液，置于超聲破碎裝置中處理10分鐘后，然后通過孔徑為0.22μm的滅菌用膜。然后在裝有孔徑為100nm的聚碳酸酯膜的LiposoFast-Basic擠壓機(Avestin Inc.)上通過25次，借此制備成顆粒。用Amicon Ultra-4離心過濾器(PL-100)(Millipore)對封入OVA的脂質體進行濃縮，并用純水洗滌以除去未封入脂質體的OVA蛋白質，最后用純水調整成為800μl水溶液。含有該脂質體組合物(Lipo-αGC+OVA)的水溶液用SDS電泳分析，結果表明OVA蛋白質濃度為50μg/ml。另外假定α-GalCer完全進入脂質體膜內，那么Lipo-αGC+OVA溶液中的α-GalCer的最終濃度為200μg/ml。
2.Lipo-αGC+OVA對產生IL-10的調節(jié)性CD4+T細胞的誘導BDF1小鼠(C57BL/6×DBA/2F1)腹腔內給予Lipo-αGC或Lipo-αGC+OVA(以α-GalCer的量計相當于2μg)后，第7日取出脾臟，用磁性微球(Miltenyi)制備CD4+T細胞。然后用20Gy的放射線照射正常BDF1小鼠脾細胞，制備抗原提呈細胞。在6孔U底培養(yǎng)板的1個孔中，添加3ml培養(yǎng)液和1.5×106個CD4+T細胞以及7.5×106個抗原提呈細胞，并添加最終濃度為100μg/ml的OVA蛋白質的，在37℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)6天。然后在最終濃度PMA為50ng/ml和離子霉素為500nM以及莫能霉素(Sigma-aldrich)為2μM存在下將5×105個細胞于37℃、含有5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4小時。回收細胞后，用生物素化抗CD4抗體和鏈霉親和素-Per CP-Cy5.5(BD Bioscience)染色。然后在100μl BD Cytofix/Cytoperm液(BD Bioscience)中懸浮，4℃孵育15分鐘。用BD Perm/Wash液(BDBioscience)洗滌后，用FITC標記抗IFN-γ抗體、PE標記抗IL-4抗體(BD Bioscience Pharmingen)和APC標記抗IL-10抗體(BDBioscience Pharmingen)進行細胞內染色，用流式細胞術分析(圖18)。其結果是在給予未封入OVA的Lipo-αGC的小鼠脾細胞來源的CD4+T細胞中，檢出1.4％的細胞僅表達IL-4、1.1％的細胞僅表達IFN-γ，而基本沒有檢出僅產生IL-10、或者同時產生IL-10和IFN-γ兩者的CD4+調節(jié)性T細胞團。另一方面，在給予Lipo-αGC+OVA的小鼠脾細胞來源的CD4+T細胞的分析中，檢出僅表達IL-4(1.0％)、僅表達IFN-γ(9.9％)的輔助T細胞團和產生IL-10的CD4+調節(jié)性T細胞(14.1％)、IL-10和IFN-γ兩者均表達的CD4+調節(jié)性T細胞(9.1％)。以上結果提示含有過敏原的Lipo-αGC能使具有抑制IgE產生作用的過敏原特異性CD4+調節(jié)性T細胞在體內分化增殖。
3.Lipo-αGC+OVA對小鼠二次抗體應答的抑制效果用DNP-OVA(0.1μg)和氫氧化鋁凝膠(2mg)初次免疫BDF1小鼠，之后，第14天測定血液中抗-DNP-IgE抗體效價，將平均抗體效價相同的組分為3組(5只/組)。初次免疫后第21、28、35天，分別腹腔內給予以α-GalCer的量計相當于2μg的單獨的脂質體(載體)、Lipo-αGC或Lipo-αGC+OVA。初次免疫后第42天僅用DNP-OVA抗原進行加強免疫，用ELISA法測定第48日的血液中DNP-IgE、-IgG1、-IgG2a抗體效價以及IgE、IgG1、IgG2a的全值(圖19)。其結果是在Lipo-αGC+OVA給予組中抗DNP-IgE、-IgG1、-IgG2a抗體效價被顯著抑制。另一方面，在不含OVA的Lipo-αGC給予組中，沒有觀察到除抗DNP-IgG1以外的抗體效價被顯著抑制。以上結果提示，含有過敏原的Lipo-αGC能抑制由于過敏原所引起的二次抗體產生。
工業(yè)實用性本發(fā)明的“含有調節(jié)性細胞配體的脂質體”由于能誘導調節(jié)性細胞的分化增殖以及活化，因此具有抑制輔助T細胞的活化作用以及IgE抗體產生的作用。因此，作為IgE抗體密切相關的I型過敏性反應所引起的過敏性疾病，特別是特應性支氣管哮喘、特應性皮炎以及花粉癥等過敏性鼻炎和結膜炎的預防劑和治療劑是有用的。
另外，由于“含有α-半乳糖神經酰胺的脂質體”通過選擇性增強NKT細胞的免疫抑制機能，能抑制病原性T細胞的分化增殖，因此作為針對自身免疫疾病或移植物抗宿主病等的藥物也是有用的。
另外，由于本發(fā)明的藥物不僅保持了選擇性結合目標細胞的分子，而且在脂質膜內含有細胞配體的脂質體作為有效成分，因此沒有令人擔心的副作用。
權利要求
1.含有調節(jié)性細胞配體的脂質體作為有效成分的藥物。
2.權利要求1所述的藥物，其中調節(jié)性細胞為NKT細胞。
3.權利要求1或2所述的藥物，其中調節(jié)性細胞配體為β-半乳糖神經酰胺。
4.權利要求1或2所述的藥物，其中調節(jié)性細胞配體為α-半乳糖神經酰胺。
5.權利要求1到4任一項所述的藥物，其中所述脂質體進一步含有CpG寡核苷酸或咪喹莫特。
6.權利要求1到5任一項所述的藥物，其中所述脂質體進一步含有過敏原。
7.權利要求1到6任一項所述的藥物，為免疫疾病的預防劑或治療劑。
8.權利要求7所述的藥物，其中免疫疾病為過敏性疾病。
9.權利要求8所述的藥物，其中過敏性疾病為特應性支氣管哮喘、過敏性鼻炎、花粉癥或特應性皮炎。
10.權利要求4所述的藥物，為自身免疫疾病或移植物抗宿主病的預防劑或治療劑。
11.含有調節(jié)性細胞配體的脂質體作為有效成分的調節(jié)性細胞誘導劑。
全文摘要
含有α－半乳糖神經酰胺、β－半乳糖神經酰胺等調節(jié)性細胞配體的脂質體作為預防或治療免疫疾病等疾病的藥物的有效成分。
文檔編號A61K31/7088GK1997395SQ200580019128
公開日2007年7月11日 申請日期2005年6月3日 優(yōu)先權日2004年6月11日
發(fā)明者石井保之, 野澤理咲, 谷口克 申請人:獨立行政法人理化學研究所