專利名稱：以rna介導(dǎo)的干擾來控制陸生和水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)業(yè)種群中的疾病預(yù)防領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)業(yè)中的疾病預(yù)防主要目標(biāo)是將動(dòng)物健康和養(yǎng)殖動(dòng)物的商業(yè)生存力最大化。藥物和疫苗在該成果中居一席之地，但是為了使動(dòng)物不適最小化以及使其生長(zhǎng)收益最大化，需要更低花費(fèi)和具更低侵害性的方法來治療或預(yù)防特定疾病癥候群。
一個(gè)實(shí)施例為蝦水產(chǎn)養(yǎng)殖。在過去的幾十年，蝦(對(duì)蝦)養(yǎng)殖已經(jīng)從維持生計(jì)水平的養(yǎng)殖發(fā)展為能向全球數(shù)百萬人口直接或間接提供工作的主要工業(yè)。在蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的同時(shí)，其也被許多挑戰(zhàn)所平衡。其中，病毒病是蝦農(nóng)主要關(guān)心的問題。在過去的幾年，象由白斑綜合癥病毒(WSSV)引起的白斑病這樣的疾病，已經(jīng)在亞洲，中南美洲的蝦養(yǎng)殖區(qū)域引發(fā)了嚴(yán)重的動(dòng)物流行病并導(dǎo)致巨大損失(Krishna et al.，1997，World Aquaculture 1214-19；Joryet al.，1999，Aquacult.Mag.2583-91)。白斑綜合癥病毒含有約300kb長(zhǎng)的環(huán)形雙鏈DNA基因組，能感染對(duì)所有商業(yè)上重要的對(duì)蝦類的種類和許多其他的甲殼類動(dòng)物包括螃蟹和小龍蝦(Flegel，1997，World J.Micro.Biotech.13433-442；van Hulten et al.，2001，Virology 2867-22；Yanget al.，2001，J.Virol.7511811-11820)。自從1992年到1993年期間東亞有了白斑綜合癥病毒首次記載以來(Inouye et al.，1994，F(xiàn)ish Pathol.9149-158)，許多白斑綜合癥病毒編碼基因例如衣殼基因(van Hulten et al.，2000，J.Gen.Virol.812525-2529；van Hulten et al.，2000，Virology266227-236；Zhang et al.，2001，Virus Res.79137-144；Chen et al.，2002，Virology 29344-53；Marks et al.，2003，J.Gen.Virol.841517-1523)；核糖核酸還原酶基因(Tsai et al.，2000，Virology27792-99)；和胸苷激酶(Tsai et al.，2000b，Vi rology 277100-110)已經(jīng)被詳細(xì)研究。另外，也開發(fā)了基于實(shí)時(shí)PCR的高敏感性檢測(cè)方法來檢測(cè)并定量白斑綜合癥病毒(Dhar et al.，2001，J.Clin.Microbiol.392835-2845)。然而，開發(fā)白斑病治療的成果是非常有限的。不過在近期，據(jù)報(bào)道以10g/kg的水平加入β-1，3-葡聚糖作為蝦飲食添加劑持續(xù)20天，能提高蝦的免疫力及感染白斑綜合癥病毒后的存活能力(Chang et al.，2003，F(xiàn)ish Shellfish Immunol.15297-310)。使用噬菌體表面展示技術(shù)，Yi etal(2003，J.Gen.Virol.842545-255)已經(jīng)確定了一種對(duì)白斑綜合癥病毒具有高度特異性的10-mer的小肽(2E6)，并在小龍蝦中阻斷白斑綜合癥病毒感染。注射重組白斑綜合癥病毒衣殼蛋白(VP26和VP28)被證明能促進(jìn)蝦抗病性(P.japonicus；Namikoshia et al.，2004，Aquaculture 22925-35)。
與其他甲殼類動(dòng)物相似，蝦不具有獲得性免疫。相反他們依靠先天免疫反應(yīng)。雖然無脊椎動(dòng)物中細(xì)菌和真菌免疫所涉及的許多免疫基因已經(jīng)被詳細(xì)描述，但是至今蝦或任何其他無脊椎動(dòng)物中病毒發(fā)病機(jī)理所涉及的免疫基因沒幾個(gè)是已知的。因此，急需分離及描述蝦免疫基因并且急需開發(fā)抗擊蝦病毒病的療法。
近年來，一種被稱為RNA干擾(RNAi)的現(xiàn)象已被用于敲除靶基因的表達(dá)(細(xì)胞基因和病毒基因都可作為靶基因；Xia et al.，2002，Nat.Biotechnol.201006-1010；McCown et al.，2003，Virology 313514-524；Wilson et al.，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1002783-2788)，而不引起細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的全部變化。RNA干擾是一種現(xiàn)象，其中雙鏈RNA(dsRNA)通過增強(qiáng)互補(bǔ)目的mRNA的特異性降解來抑制靶基因的表達(dá)(Hannon，2002，Nature418244-251)。RNA干擾機(jī)制包括酶RNA酶III識(shí)別dsRNA并將其切割成21-23核苷酸長(zhǎng)的小片段干擾RNA(siRNA)。然后該siRNA結(jié)合成RNAi尋靶復(fù)合物，被稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)，并切割與siRNA同源的目的mRNA。這導(dǎo)致目標(biāo)mRNA快速降解并使蛋白質(zhì)合成減少(Hannon，2002，Nature418244-251)。最近已證明RNA介導(dǎo)的干擾可通過攝入華麗新小桿線蟲(Caenorhabditis elegans)dsRNA獲得(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。
該發(fā)明的目的在于利用RNAi現(xiàn)象開發(fā)控制蝦，水產(chǎn)養(yǎng)殖，及陸生物種中病毒性和細(xì)菌性疾病的療法。雙鏈RNA通過飲食口服喂食動(dòng)物，并可測(cè)量其在預(yù)防疾病中的功效。已開發(fā)出控制蝦白斑綜合癥疾病的方法。五種白斑綜合癥病毒基因被用作靶基因包括編碼白斑綜合癥病毒早期表達(dá)的基因(核糖核酸還原酶)，蛋白酶抑制因子，DNA聚合酶基因，核殼基因(VP26)和衣殼基因(VP28)。代表上述基因的21-23核苷酸長(zhǎng)的白斑綜合癥病毒DNA是化學(xué)合成的，并被克隆成給食載體(L4440)。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株(Escherichia coli)HT115DE3(攜帶有T7聚合酶的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并缺失雙鏈特異性核糖核苷酸III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。攜帶白斑綜合癥病毒特異性基因的重組克隆被測(cè)序以證實(shí)身份。完整細(xì)菌細(xì)胞或破碎細(xì)胞與飲食混合并喂食蝦類。蝦受到活體傳染性白斑綜合癥病毒口服攻擊，并記錄死亡率。可使用實(shí)時(shí)PCR在治療和對(duì)照動(dòng)物中測(cè)量五種白斑綜合癥病毒靶基因的mRNA表達(dá)(Dhar et al.，2003，Arch.Virol.I1482381-2396；Dhar et al.，2001，J.Clin.Microbiol.392835-2845)，以確定兩個(gè)處理組中的表達(dá)差異。
重大疾病攻擊也存在于其他水產(chǎn)養(yǎng)殖物種以及陸生動(dòng)物中。在母牛，綿羊，和山羊中慢速生長(zhǎng)的生物體例如分枝桿菌對(duì)牧群造成廣泛傷害和破壞。約尼氏病(由副結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium paratuberculosis johnii引起的)是一典型疾病實(shí)例。其他可用此方法治療的慢速生長(zhǎng)細(xì)菌是支原體。牛疾病例如新包蟲病(Neospora caninum)，普魯氏菌病，結(jié)核病，牛白血性增生，和腹瀉可用該發(fā)明控制。由原生動(dòng)物例如隱孢子蟲(Cryptosporidia)和藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(Giardia)引起的動(dòng)物原生動(dòng)物疾病能被處理。病毒病例如牛腹瀉和冠狀病毒也可被處理。雞飼養(yǎng)業(yè)中的長(zhǎng)期問題是存在沙門氏菌(salmonellidae)。另外存在許多能造成大范圍損害的病毒病，例如雞傳染性支氣管炎，外來紐卡斯?fàn)柌?，禽流?造成數(shù)百萬禽類毀滅)。
與細(xì)菌系統(tǒng)相對(duì)，存在其他替代系統(tǒng)能為在該系統(tǒng)中產(chǎn)生任何RNAi產(chǎn)物提供成本利益。該系統(tǒng)可以是藻類(例如，藍(lán)綠藻Synechocystis或小球藻Chlorella)，真菌(例如，黑曲霉Aspergillus niger，鏈孢霉Neurosporacrassa)，植物(例如，煙草，紫花苜蓿，馬鈴薯，擬南芥Arabidopsis))，和昆蟲(例如，粉紋夜蛾T.ni和草地夜蛾Spodoptera frugiperda)。至少為了達(dá)到該發(fā)明的目的，在細(xì)菌系統(tǒng)中生產(chǎn)dsRNA結(jié)構(gòu)所需的分子手段很可能適合于上述其他生物體，并能為生產(chǎn)與飼料結(jié)合的生物量提供生產(chǎn)成本利益。為了該發(fā)明的目的，焦點(diǎn)集中于植物系統(tǒng)。然而，在其他系統(tǒng)中表達(dá)手段被充分開發(fā)，正如以下參考文獻(xiàn)所證明的，該參考文獻(xiàn)包含于本文內(nèi)作為在真菌系統(tǒng)中表達(dá)手段的參考(el-Enshasy et al.，2001，Appl.Biochem.Biotechnol.9057-66；Wiebe et al.，2001，Biotechnol.Bioeng.76164-174；Liu et al.，2003，Lett.Appl.Microbiol.36358-361)，藻類(Mayfield et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872087-2091；US Patent no.5,270,175；US Patent no.5,977,437；PCT publication WO00/73455；Toyomizu et al.，2001，J.Appl.Phycol.13209-214；US patentpublication no.2002/0164706；US Patent no.6,379,968；Shapira et al.，2002，Plant Physiol.1297-12；Ton et al.，2002，F(xiàn)ASEB J.16A542；Mayfield et al.，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100438-442)，酵母(Guthrie et al.，1991，In；Abelson J，Simon M(eds.)Methods Enzymol.Academic Press，San Diego，CA；Mason et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8911745-11749；Wery et al.，1997，Gene 18489-97；Martinezet al.，1998，Antonie Van Leeuwenhoek 73147-153；Cereghino et al.，1999，Curr.Opin.Biotechnol.10422-427；Fischer et al.，1999，Biotechnol.Appl.Biochem.30(Pt2)117-120；Cereghino et al.，2000，F(xiàn)EMS Microbiol.Rev.2445-66；Cregg et al.，2000，Mol.Biotechnol.1623-52)，和昆蟲(Schmal john et al.，1990，J.Virol.643162-3170；Saliki et al.，1992，J.Gen.Virol.73369-374；Jarvis et al.，1998，Curr.Opin.Biotechnol.9528-533；Altmann et al.，1999，Glycoconj.J.16109-123；Cha et al.，1999，Biotechnol.Bioeng.65316-324)。在植物系統(tǒng)中充分開發(fā)了使用植物病毒作為傳遞遺傳物質(zhì)的載體。煙草花葉病毒(TMV)和紫花苜?；ㄈ~病毒(AMV)是上述系統(tǒng)中的兩種病毒，煙草花葉病毒被更廣泛利用。利用基于來自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA區(qū)域的Ti質(zhì)粒在不同植物中，例如，番茄，馬鈴薯，羽扁豆，和萵苣(Kapusta et al.，1999，F(xiàn)ASEB J.131796-1799；Walmsley et al.，2000，Curr.Opin.Biotechnol.11126-129；Khandelwal et al.，2003，Plant Sci.16577-84)，表達(dá)同源DNA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是產(chǎn)生21-23個(gè)核苷酸長(zhǎng)的小片斷干擾RNA(siRNA)，其對(duì)動(dòng)物病原體例如細(xì)菌，真菌，藻類，或酵母具有特異性。RNA可作為siRNA或雙鏈RNA(dsRNA)被遞送，然后將其加工成siRNA。siRNA或祖先dsRNA在細(xì)胞中產(chǎn)生，以完整細(xì)胞或破碎細(xì)胞配入食物并遞送給動(dòng)物。這些食物將會(huì)被喂給動(dòng)物以實(shí)現(xiàn)口服治療劑siRNA的傳遞，該治療劑siRNA對(duì)目標(biāo)病原體具有特異性以改善疾病或疾病癥狀。
與目標(biāo)RNA互補(bǔ)的長(zhǎng)達(dá)約1000個(gè)堿基的較長(zhǎng)核苷酸序列可在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生，以完整細(xì)胞或破碎細(xì)胞與食物混合并被遞送。
本發(fā)明的目的是通過充分利用RNA干擾現(xiàn)象特異性降解由互補(bǔ)的目的mRNA編碼的病原體以保護(hù)動(dòng)物免受病原體感染。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的目的可由以下實(shí)施方案描述。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生siRNA，其對(duì)水產(chǎn)業(yè)病原體具有特異性。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，產(chǎn)生的siRNA對(duì)病毒性水產(chǎn)業(yè)病原體具有特異性。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，產(chǎn)生的siRNA對(duì)蝦病毒性病原體具有特異性。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，產(chǎn)生的siRNA對(duì)白斑綜合癥病毒，黃頭病毒，桃拉綜合癥病毒，和傳染性表皮與造血組織壞死癥病毒具有特異性。
在另一實(shí)施方案中，siRNA對(duì)魚病毒性病原體具有特異性。
在另一實(shí)施方案中，siRNA對(duì)傳染性鮭魚貧血病毒，傳染性胰壞死病，鯉魚春季病毒血癥，草魚呼腸孤病毒，河鯰病毒，河鯰皰疹病毒，海洋雙RNA病毒，馬拉石斑神經(jīng)壞死病毒，龍膽石斑神經(jīng)壞死病毒，條紋石、胡瓜魚、大西洋鮭和大菱鲆輪狀病毒，虹鱒魚病毒性出血性敗血癥病毒，虹鱒魚棒狀病毒，虹鱒魚傳染性造血組織壞死病毒和發(fā)自睡病病毒有特異性。
本發(fā)明的目的在于提供保護(hù)動(dòng)物免受病毒感染的方法，包括在細(xì)菌或酵母宿主中產(chǎn)生病毒性病原體特異性RNA，加工含有生物量的該特異性RNA于不再進(jìn)一步純化的飼料或飼料補(bǔ)充物中，用所述飼料供給動(dòng)物以遞送足夠量的病毒病原體特異性RNA，以抑制病毒對(duì)生物體造成致病反應(yīng)。
在本發(fā)明一實(shí)施方案中，提供了保護(hù)動(dòng)物免受病毒感染的方法。該方法包括以下步驟在細(xì)菌宿主中生產(chǎn)白斑綜合癥病毒(WSSV)特異性RNA，加工含有用作生產(chǎn)白斑綜合癥病毒特異性RNA的細(xì)菌的生物量于不再進(jìn)一步純化的飼料或飼料補(bǔ)充物中，然后用所述飼料供給動(dòng)物，以遞送足夠數(shù)量的含有白斑綜合癥病毒特異性RNA的細(xì)菌，以阻止病毒對(duì)蝦造成的反應(yīng)。本發(fā)明對(duì)象白斑病這樣的病毒性疾病提供了快速保護(hù)。該方法也可應(yīng)用于其他類型的蝦類疾病中，其由其他病毒、細(xì)菌、真菌引起的，以及應(yīng)用于遭受真菌、細(xì)菌和病毒疾病的包括魚、軟體動(dòng)物的其他水產(chǎn)養(yǎng)殖物種疾病中。在水生無脊椎動(dòng)物物種中，例如蝦，具有“先天免疫系統(tǒng)”，本發(fā)明提供了通過遞送制備的RNAi分子治療急性和慢性疾病的方法。
在本發(fā)明一實(shí)施方案中，提供了保護(hù)動(dòng)物免受細(xì)菌感染的方法。該方法包括以下步驟在細(xì)菌宿主中生產(chǎn)細(xì)菌性病原體特異性RNA，加工含有用作生產(chǎn)細(xì)菌性病原體特異性RNA的細(xì)菌的生物量于不再進(jìn)一步純化的飼料或飼料補(bǔ)充物中，用所加工的生物量供給動(dòng)物，以占總飼料1％的量遞送含有細(xì)菌性病原體特異性RNA的細(xì)菌。
在水生脊椎動(dòng)物物種中，例如魚類，具有進(jìn)化良好的免疫系統(tǒng)，本發(fā)明提供了一種首選反應(yīng)法來延遲急性感染跡象的發(fā)作和消除慢性感染。
在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，其他類型的表達(dá)系統(tǒng)，例如，酵母，藻類，和真菌也被用來生產(chǎn)病原體特異性RNA。用以保護(hù)動(dòng)物的方法與上述描述的實(shí)施方案類似。
定義為了全面理解本發(fā)明，提供以下定義以明確該技術(shù)領(lǐng)域的術(shù)語，如果不在本文中做適當(dāng)?shù)亩x，這些術(shù)語可有不同的理解或者成為激烈研究的主題，這也許會(huì)改變本發(fā)明的范圍。對(duì)于本發(fā)明，以下術(shù)語以本文所給出的定義使用。
“基因沉默”是一新的基因調(diào)節(jié)機(jī)制，其通過抑制轉(zhuǎn)錄(稱為轉(zhuǎn)錄基因沉默)或通過激活序列特異性RNA降解過程(轉(zhuǎn)錄后基因沉默)限制轉(zhuǎn)錄水平。
“RNA干擾”或“RNAi”是基因沉默機(jī)制，其通過序列特異性RNA降解過程限制轉(zhuǎn)錄水平。
“小片斷干擾RNA”或“siRNA”是少于1000個(gè)堿基的雙鏈RNA。
“反義RNA”是單鏈RNA或RNA的非編碼鏈，其作為合成mRNA的模板。
“正義RNA”作為生成蛋白質(zhì)的模板或是與用作蛋白質(zhì)合成模板的mRNA相同的序列。
實(shí)施例目前所述的本發(fā)明以以下實(shí)施例為參考。提供這些實(shí)施例僅作舉例說明的目的，本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例，而是包括明顯作為本文所教導(dǎo)結(jié)果的所有改變。
實(shí)施例1構(gòu)建含有寡核苷酸的重組質(zhì)粒，該寡核苷酸由與白斑綜合癥病毒(WSSV)基因同源的21-23個(gè)核苷酸組成。
RNAi序列由Ambion，Inc.(Austin，Texas)用其所擁有的siRNA設(shè)計(jì)公式設(shè)計(jì)。RNAi序列是設(shè)計(jì)用于白斑綜合癥病毒的五個(gè)基因，該五個(gè)基因包括編碼核殼蛋白VP26、衣殼蛋白VP28、核苷酸還原酶、DNA聚合酶酶、和含有Kunitz蛋白酶抑制因子特征域的蛋白的基因。所有五種白斑綜合癥病毒的siRNA都是基于白斑綜合癥病毒基因組序列設(shè)計(jì)的，該基因組序列可在GenBank數(shù)據(jù)庫獲得，登記號(hào)AF369029。此外，siRNA也是設(shè)計(jì)用于感染性表皮與造血阻止壞死癥病毒的非結(jié)構(gòu)基因和衣殼基因(GenBank數(shù)據(jù)庫獲得，登記號(hào)AF273215)；黃頭病毒的糖蛋白基因(GenBank數(shù)據(jù)庫獲得，登記號(hào)AF540644)；桃拉綜合癥病毒的依賴于RNA的RNA聚合酶和衣殼蛋白基因，VP1(GenBank數(shù)據(jù)庫獲得，登記號(hào)AF277675)。
設(shè)計(jì)用于白斑綜合癥病毒基因VP28(AF369029)的siRNA能夠使用幾種不同方法完成。如Ambion所設(shè)計(jì)的，siRNA的一個(gè)設(shè)計(jì)是基于正義siRNA鏈(5’→3’)GGUUGGAUCA GGCUACUUCT T(SEQ ID NO___)和反義siRNA鏈(5’→3’)GAAGUAGCCU GAUCCAACCT C(SEQ ID NO___)的。為使用pSilencerTMsiRNA表達(dá)載體(來自Ambion的2.0，2.1，3.0，&3.1)而設(shè)計(jì)的模板是頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGTTG GATCAGGCTA CTTCTTCAAG AGAGAAGTAG CCTGATCCAACCTCTTTTTT GGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCAAAAAAGAGGT TGGATCAGGC TACTTCTCTC TTGAAGAAGT AGCCTGATCC AACCG-3’(SEQID NO___)。
第二個(gè)VP28 siRNA設(shè)計(jì)具有一正義siRNA鏈(5’→3’)GGCUACUUCAAGAUGACUGT T(SEQ ID NO___)和一反義siRNA鏈(5’→3’)CAGUCAUCUUGAAGUAGCCT G(SEQ ID NO___)。為pSilencer載體，頂鏈寡核苷酸模板為5’-GATCCGGCTA CTTCAAGATG ACTGTTCAAG AGACAGTCA TCTTGAAGTA GCCTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)而底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGCTACTTCAAGA TGACTGTCT CTTGAACAGT CATCTTGAAG TAGCC G-3’(SEQ ID NO___)。
第三個(gè)可能的VP28 siRNA設(shè)計(jì)具有一正義siRNA鏈(5’→3’)GGUGUGGAACAACACAUCAT T(SEQ ID NO___)和一反義siRNA鏈(5’→3’)UGAUGUGUUGUUCCACACCT T(SEQ ID NO___)。這需要為pSilencerTMsiRNA表達(dá)載體設(shè)計(jì)模板，其具有一條頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGTGT GGAACAACACATCATTCAAG AGA TGATGT GTTGTTCCAC ACCTTTTTTG GAAA-3’(SEQ ID NO___)和一條底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGTGT GGAACAACACATCATCTCTT GAA TGATGT GTTGTTCCAC ACC G-3’(SEQ ID NO___)。
設(shè)計(jì)用于白斑綜合癥病毒基因VP26(AF369029)的siRNA能夠使用幾種不同方法完成。如Ambion所設(shè)計(jì)的，siRNA的一個(gè)設(shè)計(jì)是基于正義siRNA鏈(5’→3’)GGGCAAAGGU AAUGUCAAUT T(SEQ ID NO___)和反義siRNA鏈(5’→3’)AUUGACAUUA CCUUUGCCCT T(SEQ ID NO___)的。為pSilencerTMsiRNA表達(dá)載體(2.0，2.1，3.0，&3.1)而設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGGCA AAGGTAATGT CAATTTCAA GAGAATTGAC ATTACCTTTG CCCTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAA GGGCAAAGGTAATG TCAATTCTCT TGAAATTGAC ATTACCTTTG CCC G-3’(SEQ ID NO___)。
第二個(gè)可能的VP26 siRNA設(shè)計(jì)具有一正義siRNA鏈(5’→3’)GGUCCUACAAUACUCCUCUT T(SEQ ID NO___)和一反義siRNA鏈(5’→3’)AGAGGAGUAUUGUAGGACC TC(SEQ ID NO___)。為pSilencerTMsiRNA表達(dá)載體(2.0，2.1，3.0，&3.1)而設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGTCC TACAATACTCCTCTTTCAAG AGAAGAGGA GTATTGTAGG ACCTCTTTTT TGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGAGGT CCTACAATAC TCCTCTTCTCTTGAAAGAGG AGTATTGTAG GACC G-3’(SEQ ID NO___)。
第三個(gè)可能的VP26 siRNA設(shè)計(jì)具有一正義siRNA鏈(5’→3’)GGAAACAUUAAGGGAAAUAT I(SEQ ID NO___)和一反義siRNA鏈(5’→3’)UAUUUCCCUUAAUGUUUCCT G(SEQ ID NO___)。為pSilencerTMisRNA表達(dá)載體設(shè)計(jì)模板具有一條頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGAAAC ATTAAGGGAA ATATTCAAGAGATATTTCCC TTAATGTTTC CTG TTTTTT GGAAA-3’(SEQ ID NO___)和一條底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAA GAAA CATTAAGGGA AATATCTCTTGAATATTTCC CTTAATGTTT CC G-3’(SEQ ID NO___)。
另一個(gè)白斑綜合癥病毒基因ProIn(AF369029)有一siRNA設(shè)計(jì)，其具有一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGGAAGAAUU CUACAAGAAT T(SEQ ID NO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)UUCUUGUAGA AUUCUUCCCT G(SEQ ID NO___)。為pSilencerTMsiRNA表達(dá)載體而設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板(5’→3’)5’-GATCCGGGAA GAATTCTACA AGAATTCAAG AGATTCTTGT AGAATTCTTCC CTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板(5’→3’)5’-AGCTTTTCCAAAAAACAGGG AAGAATTCTA CAAGAATCTC TTGAATTCTT GTAGAATTCT TCCC G-3’(SEQID NO___)。
為ProIn設(shè)計(jì)的第二個(gè)siRNA具有一正義siRNA鏈(5’→3’)GGGACCCUUUCAUGAAACAT T(SEQ ID NO___)和一反義siRNA鏈(5’→3’)UGUUUCAUGAAAGGGUCCCT T(SEQ ID NO___)。為pSilencerTMsiRNA表達(dá)載體設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGGAC CCTTTCATGA AACATTCAAG AGATGTTTCATGAAAGGGTC CC TTTTTTG GAAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAA GGGAC CCTTTCATGA AACATCTCTT GAATGTTTC ATGAAAGGGTCCC G-3’(SEQ ID NO___)。
為ProIn設(shè)計(jì)的第三個(gè)siRNA具有一正義siRNA鏈(5’→3’)GGCAUACAGAUGCCCUUUAT T(SEQ ID NO___)和一反義siRNA鏈(5’→3’)UAAAGGGCAUCUGUAUGCCT T(SEQ ID NO___)。為pSilencerTMsiRNA表達(dá)載體設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板(5’→3’)5’-GATCCGGCAT ACAGATGCCC TTTATTCAAGAGATAAAGGG CATCTGTATG CCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板(5’→3’)5’-AGCTTTTCC AAAAAA GGCA TACAGATGCC CTTTATCTCTTGAATAAAGG GCATCTGTAT GCC G-3’(SEQ ID NO___)。
用于RNA干擾的另一潛在基因是白斑病毒Rr092基因(AF369029)。為Rr092設(shè)計(jì)的一個(gè)可能的siRNA具有一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGAAGAUUCAUCUGUUCGAT T(SEQ ID NO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)UCGAACAGAUGAAUCUUCCT G(SEQ ID NO___)。為pSilencerTMsiRNA表達(dá)載體而設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板(5’→3’)5’-GATCCGAAGA TTCATCTGTT CGATTCAAGAGATCGAACAG ATGAATCTTC CTGTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板(5’→3’)5’-AGCTTTTCCA AAAAA CAGG AAGATTCATC TGTTCGATCTCTTGAATCGA ACAGATGAAT CTTCC G-3’(SEQ ID NO___)。
為Rr092設(shè)計(jì)的第二個(gè)可能的siRNA具有一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGACAUGAUU AUGCGUGUGT T(SEQ ID NO___)和一條反義小片斷干擾RNA鏈(5’→3’)CACACGCAUA AUCAUGUCCT G(SEQ ID NO___)。為pSilencerTMsiRNA表達(dá)載體而設(shè)計(jì)的模板具有一條頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGACATGATTATGCG TGTGTTCAAG AGACACACGC ATAATCATGT CCTGTTTTTT GGAAA-3’(SEQID NO___)和一條底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAA CAGGA CATGATTATGCGTGTGTCTC TTGAACACAC GCATAATCAT GTCC G-3’(SEQ ID NO___)。
為Rr092設(shè)計(jì)的第三個(gè)可能的siRNA具有一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGAUACCAUC AAUAGAAAGT T(SEQ ID NO___)和一條反義小片斷干擾RNA鏈(5’→3’)CUUUCUAUUG AUGGUAUCCT T(SEQ ID NO___)。為pSilencerTMsiRNA表達(dá)載體而設(shè)計(jì)的模板具有一條頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGATACCATCAATAG AAAGTTCAAG AGACTTTCTA TTGATGGTAT CCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ IDNO___)和一條底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGATA CCATCAATAGAAAG TCTCT TGAACTTTCT ATTGATGGTA TCC G-3’(SEQ ID NO___)。
可用RNAi調(diào)節(jié)的另一個(gè)白斑綜合癥病毒基因是DNAPol(AF369029)基因。為DNAPol設(shè)計(jì)的一個(gè)可能的siRNA具有一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGAAGUGGUC AUCUACGACT T(SEQ ID NO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)GUCGUAGAUG ACCACUUCCT T(SEQ ID NO___)。為pSilencerTMsiRNA表達(dá)載體而設(shè)計(jì)的模板具有一條頂鏈寡核苷酸模板(5’→3’)5’-GATCCGGAAGTGGTCATCTA CGACTTCAAG AGAGTCGTAG ATGACCACTT CCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ IDNO___)和一條底鏈寡核苷酸模板(5’→3’)5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGAAGTGGTCATCTA CGACTCTCTT GAAGTCGTAG ATGACCACTT CC G-3’(SEQ ID NO___)。
為DNAPol設(shè)計(jì)的第二個(gè)siRNA具有一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGAAGAACAU GAAACUGUCT T(SEQ ID NO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)GACAGUUUCA UGUUCUUCCT T(SEQ ID NO___)。為pSilencerTMsiRNA表達(dá)載體而設(shè)計(jì)的模板具有一條頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGAAGAACATGAAAC TGTC TTCAA GAGAGACAGT TTCATGTTCT TCCTTTTTTG GAAA-3’(SEQ IDNO___)和一條底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGAAG AACATGAAACTGTCTCTCTT GAAGACAGTT TCATGTTCTT CC G-3’(SEQ ID NO___)。
為DNAPol設(shè)計(jì)的第三個(gè)siRNA具有一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGAGCAUUGU CAUUUAAUAT T(SEQ ID NO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)UAUUAAAUGA CAAUGCUCCT C(SEQ ID NO___)。為pSilencerTMsiRNA表達(dá)載體而設(shè)計(jì)的模板具有一條頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGAGCATTGTCATTT AATA TTCAAG AGATATTAAA TGACAATGCT CCTCTTTTTT GGAAA-3’(SEQID NO___)和一條底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAA GAGGA GCATTGTCATTTAATATCTC TTGAATATTA AATGACAATG CTCC G-3’(SEQ ID NO___)。
對(duì)以下五種白斑綜合癥病毒基因具有特異性的21-23-mer長(zhǎng)的寡核苷酸被定做設(shè)計(jì)和合成核糖核酸還原酶，蛋白酶抑制因子，DNA聚合酶基因，核殼基因(VP26)和衣殼基因(VP28)?；诠_的白斑綜合癥病毒基因組序列，合成代表上述基因的正義和反義寡核苷酸，GenBank登記號(hào)AF369029(vanHulten et al.，2001，Virology 2867-22)。正義和反義寡核苷酸序列被退火產(chǎn)生雙鏈DNA，并被克隆成質(zhì)粒載體例如L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)或一可商業(yè)獲得的質(zhì)粒(例如，來自Clonetech的pSIREN-DNR或來自Ambion的pSILENCER)。該重組質(zhì)粒被用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)菌株HT115DE3(攜帶誘導(dǎo)表達(dá)T7聚合酶的IPTG，并缺失雙鏈特異性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。對(duì)攜帶有白斑綜合癥病毒特異性基因的重組克隆進(jìn)行測(cè)序以確定克隆的身份。基于不同的白斑綜合癥病毒菌株，制造可替代的克隆如Yang和其同事所描述的(Yang et al.，2001，J.Virol.7511811-11820)。
實(shí)施例2用于表達(dá)白斑綜合癥病毒dsRNA及飼料配方的細(xì)菌誘導(dǎo)。
攜帶有可誘導(dǎo)白斑綜合癥病毒基因的IPTG的大腸桿菌菌株HT115DE3在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，然后以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)白斑綜合癥病毒特異性RNA。依經(jīng)驗(yàn)使IPTG誘導(dǎo)最優(yōu)化，以獲得最大程度上的dsRNA表達(dá)誘導(dǎo)。含有表達(dá)白斑綜合癥病毒基因的細(xì)胞細(xì)菌量與蝦飼料混合，微結(jié)合成由藻酸鹽和淀粉組成的以聚合形式存在的小珠。存在替代微結(jié)合形式，例如聚交酯(Bootland et al.，2002，InHarrington K(ed)4th Intl.Symp.Aquatic Animal Health，New Orleans，p228)，角叉菜，藻酸鹽(Sultana etal.，2000，Int.J.Food Microbiol.6247-55；USpatent publication no.2002/0137723；PCT publication WO 03/103692)，和殼聚糖(US patentpublication no.2001/0055807)。加入引誘劑制成對(duì)目的物種更加美味的小珠(以蝦為例，磷蝦粉是很好的引誘劑)。
實(shí)施例3保護(hù)蝦類免受白斑綜合癥病毒感染的方法。
用控制飲食或含有白斑綜合癥病毒特異性dsRNA細(xì)菌生物量(實(shí)施例2)的飲食喂養(yǎng)蝦類。動(dòng)物受到白斑綜合癥病毒攻擊，適應(yīng)病毒感染的存活率被測(cè)量。載入對(duì)照樣品和治療樣品中的白斑綜合癥病毒通過下面公開的實(shí)時(shí)PCR方法測(cè)量(Dhar et al.，2001，J.Clin.Microbiol.392835-2845)。使用下面公開的實(shí)時(shí)PCR方法在治療動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物中測(cè)量五種白斑綜合癥病毒靶基因的mRNA表達(dá)，以確定兩個(gè)處理組中的表達(dá)差異(Dhar et al.，2003，Arch.Virol.I1482381-2396)。
實(shí)施例4構(gòu)建含有寡核苷酸的重組質(zhì)粒，該寡核苷酸由與傳染性胰壞死病毒(IPNV)基因同源的21-23個(gè)核苷酸組成。
RNAi序列由Ambion，Inc.(Austin，Texas)用其所擁有的siRNA設(shè)計(jì)公式設(shè)計(jì)。siRNA也設(shè)計(jì)用于傳染性表皮與造血組織壞死癥病毒的非結(jié)構(gòu)基因和衣殼基因(GenBank數(shù)據(jù)庫，登記號(hào)AF273215)。對(duì)以下兩種傳染性胰壞死病毒基因具有特異性的21-23-mer長(zhǎng)的寡核苷酸被定做設(shè)計(jì)和合成衣殼蛋白VP2和VP3?；诠_的傳染性胰壞死病毒基因組序列，合成代表上述基因的正義和反義寡核苷酸，GenBank登記號(hào)AF283780。正義和反義寡核苷酸序列被退火產(chǎn)生雙鏈DNA，并被克隆成質(zhì)粒載體L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。該重組質(zhì)粒被用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株HT115DE3(攜帶能誘導(dǎo)表達(dá)T7聚合酶的IPTG并缺失雙鏈特異性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。對(duì)攜帶有傳染性胰壞死病毒特異性基因的重組克隆進(jìn)行測(cè)序以確定克隆的身份。
實(shí)施例5用于表達(dá)傳染性胰壞死病毒dsRNA及飼料配方的細(xì)菌誘導(dǎo)。
攜帶有可誘導(dǎo)傳染性胰壞死病毒基因的IPTG的大腸桿菌菌株HT115DE3在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)傳染性胰壞死病毒特異性RNA。依經(jīng)驗(yàn)使IPTG誘導(dǎo)最優(yōu)化，以獲得最大程度上的dsRNA表達(dá)誘導(dǎo)。含有表達(dá)傳染性胰壞死病毒基因的細(xì)胞細(xì)菌量與蝦飼料混合，微結(jié)合成由藻酸鹽和淀粉組成的以聚合形式存在的小珠。存在替代的微結(jié)合形式，例如聚交酯(Bootland et al.，2002，InHarrington K(ed)4th Intl.Symp.Aquatic Animal Health，New Orleans，p228)，角叉菜，藻酸鹽，和殼聚糖。加入引誘劑制成對(duì)目的物種更加美味的小珠(以魚類為例，魚粉是很好的引誘劑)。
實(shí)施例6保護(hù)蝦類免受傳染性胰壞死病毒感染的方法。
用控制飲食或含有傳染性胰壞死病毒特異性dsRNA細(xì)菌生物量(實(shí)施例5)的飲食喂養(yǎng)虹鱒魚。動(dòng)物受到傳染性胰壞死病毒攻擊，適應(yīng)病毒感染的存活率被測(cè)量。載入對(duì)照樣品和治療樣品的傳染性胰壞死病毒通過下面的實(shí)時(shí)PCR方法測(cè)量，該方法與測(cè)量蝦中白斑綜合癥病毒的方法相似(Dhar et al.，2001，J.Clin.Microbiol.392835-2845)。通過使用實(shí)時(shí)PCR，在治療動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物中測(cè)量?jī)煞N傳染性胰壞死病毒靶基因的mRNA表達(dá)，以確定兩個(gè)處理組中的表達(dá)差異，依據(jù)與測(cè)量蝦中細(xì)胞基因表達(dá)的方法相似的方法(Dhar et al.，2003，Arch.Virol.I1482381-2396)。
實(shí)施例7構(gòu)建含有寡核苷酸的重組質(zhì)粒，該寡核苷酸由與傳染性鮭魚貧血病毒(ISAV)基因同源的21-23個(gè)核苷酸組成。
對(duì)以下兩種傳染性鮭魚貧血病毒基因具有特異性的21-23-mer長(zhǎng)的寡核苷酸被定做設(shè)計(jì)和合成血凝素(HA)和糖蛋白P3?；诠_的傳染性鮭魚貧血病毒基因組序列，合成代表上述基因的正義和反義寡核苷酸，GenBank登記號(hào)AF309075(Krossoy et al.，2001，J.Gen.Virol.821757-1765)和AJ514403(Snow et al.，2003，Virus Res.9299-105)。正義和反義寡核苷酸序列被退火產(chǎn)生雙鏈DNA，并被克隆成質(zhì)粒載體L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。該重組質(zhì)粒被用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株HT115DE3(攜帶能誘導(dǎo)表達(dá)T7聚合酶的IPTG并缺失雙鏈特異性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。對(duì)攜帶有傳染性鮭魚貧血病毒特異性基因的重組克隆進(jìn)行測(cè)序以確定克隆的身份。
實(shí)施例8用于表達(dá)傳染性鮭魚貧血病毒dsRNA及飼料配方的細(xì)菌誘導(dǎo)。
攜帶有可誘導(dǎo)傳染性鮭魚貧血病毒(ISAV)基因的IPTG的大腸桿菌菌株HT115DE3(實(shí)施例7)在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，然后以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)傳染性鮭魚貧血病毒特異性RNA。依經(jīng)驗(yàn)使IPTG誘導(dǎo)最優(yōu)化，以獲得最大程度上的dsRNA表達(dá)誘導(dǎo)。含有表達(dá)HA和/或糖蛋白P3基因的細(xì)胞細(xì)菌量與鮭魚飼料混合，微結(jié)合成由藻酸鹽和淀粉組成的以聚合形式存在的小珠。存在替代的微結(jié)合形式，例如聚交酯(Bootland et al.，2002，InHarringtonK(ed)4th Int l.Symp.Aquatic Animal Health，New Orleans，p228)，角叉菜，藻酸鹽，和殼聚糖。加入引誘劑制成對(duì)目的物種更加美味的小珠(以鮭魚為例，AQUASAVOR(RTM)是很好的引誘劑)。
實(shí)施例9保護(hù)鮭魚類免受傳染性鮭魚貧血病毒感染的方法用控制飲食或含有傳染性鮭魚貧血病毒特異性dsRNA細(xì)菌量的飲食喂養(yǎng)鮭魚類，例如鮭魚和虹鱒魚(實(shí)施例8)。動(dòng)物受到傳染性鮭魚貧血病毒攻擊，適應(yīng)病毒感染的存活率被測(cè)量。通過下面的實(shí)時(shí)PCR方法測(cè)量，該方法與測(cè)量白斑綜合癥病毒的方法相似(Dhar et al.，2001，J.Clin.Microbiol.392835-2845)，載入對(duì)照樣品和治療樣品的傳染性鮭魚貧血病毒。使用實(shí)時(shí)PCR方法在治療動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物中測(cè)量?jī)煞N傳染性鮭魚貧血病毒靶基因的mRNA表達(dá)，以確定兩個(gè)處理組中的表達(dá)差異，下面的方法與測(cè)量白斑綜合癥病毒使用的方法相似(Dhar et al.，2003，Arch.Virol.I1482381-2396)。
實(shí)施例10構(gòu)建含有寡核苷酸的重組質(zhì)粒，該寡核苷酸由與鯉魚春季病毒血癥基因同源的21-23個(gè)核苷酸組成鯉魚春季病毒血癥，其是由鯉魚春季病毒血癥病毒(SVCV)引起的，是普通鯉魚中存在的一種重要的病毒性疾病。在歐洲和亞洲鯉魚飼養(yǎng)中，該種疾病被廣泛傳播(Ahne et al.，2002，Dis.Aquat.Organ.52261-272)。受鯉魚春季病毒血癥病毒感染的鯉魚表現(xiàn)出腎、脾、及肝臟組織損壞，導(dǎo)致大出血，水鹽平衡失調(diào)以及免疫應(yīng)答缺陷(Ahne et al.，2002，Dis.Aquat.Organ.52261-272)。鯉魚春季病毒血癥病毒基因組含有單一線性，反義，單鏈RNA，其編碼核蛋白(N)，磷蛋白(P)，基質(zhì)蛋白(M)，糖蛋白(G)，和依賴RNA的RNA聚合酶(L)的單一分子，并在3’→5’方向具有一段短的前導(dǎo)序列和尾隨序列(Hoffman et al.，2002，Virus Res.8489-100)。
對(duì)上述五種鯉魚春季病毒血癥病毒基因(N，P，M，G，和L)具有特異性的21-23-mer長(zhǎng)的寡核苷酸被定做設(shè)計(jì)和合成，基于公開的鯉魚春季病毒血癥病毒基因組序列，GenBank登記號(hào)AJ318079(Hoffman et al.，2002，Virus Res.8489-100)。正義和反義寡核苷酸序列被退火產(chǎn)生雙鏈DNA，并被克隆成質(zhì)粒載體L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。該質(zhì)粒被用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株HT115DE3(攜帶能誘導(dǎo)表達(dá)T7聚合酶的IPTG并缺失雙鏈特異性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。對(duì)攜帶有鯉魚春季病毒血癥病毒特異性基因的重組克隆進(jìn)行測(cè)序以確定克隆的身份。
實(shí)施例11用于表達(dá)鯉魚春季病毒血癥dsRNA及飼料配方的細(xì)菌誘導(dǎo)。
攜帶有可誘導(dǎo)鯉魚春季病毒血癥病毒基因的IPTG的大腸桿菌菌株HT115DE3在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，然后以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)鯉魚春季病毒血癥病毒特異性RNA。依經(jīng)驗(yàn)使IPTG誘導(dǎo)最優(yōu)化，以獲得最大程度上的dsRNA表達(dá)誘導(dǎo)。表達(dá)鯉魚春季病毒血癥病毒基因的細(xì)菌細(xì)胞與鮭魚飼料混合，微結(jié)合成由藻酸鹽和淀粉組成的以聚合形式存在的小珠，并加入引誘劑制成對(duì)目的物種更加美味的小珠。
實(shí)施例12用于表達(dá)鯉魚春季病毒血癥dsRNA及飼料配方的真菌誘導(dǎo)。
制作缺失突變或者使用缺乏dsRNA酶活性的菌株。使用的真菌可選自半知菌(酵母例如釀酒酵母，粟酒裂殖酵母(Raponi et al.，2003，Nucl.AcidsRes.314481-4489)或紅法夫酵母)，也可選自絲狀真菌(例如，粗糙脈孢菌；Buxton et al.，1990，Biotechnol.Adv.8388-389)。已知紅法夫酵母菌株以dsRNA存在，此dsRNA與病毒感染有關(guān)(Castillo et al.，1994，Curr.Genet.26364-368)。為達(dá)到本實(shí)施例的目的，使用標(biāo)準(zhǔn)分子技術(shù)剔除與公開的酵母基因組一致的dsRNA酶以構(gòu)建釀酒酵母dsRNA酶缺失突變株。然后用載體例如pESC-URA(Stratagene)來轉(zhuǎn)化該突變株。轉(zhuǎn)化載體需要具備的主要功能是存在兩個(gè)能共同表達(dá)互補(bǔ)的RNA的強(qiáng)啟動(dòng)子。用類似于實(shí)施例1和2所述的方法，pESC-URA載體被修改以含有兩個(gè)DNA片斷，該DNA片斷對(duì)鯉魚春季病毒血癥dsRNA具有特異性。制成感受態(tài)的酵母，按Stratagene使用者手冊(cè)中所述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化(Ausubel et al.，1997，InShort Protocols in Molecular Biology，3edn.John Wiley & Sons，Inc.，New York)。營養(yǎng)缺陷型篩選將被使用，在尿嘧啶上生長(zhǎng)的菌株將含有載體。在半乳糖培養(yǎng)基中擴(kuò)增酵母突變株，以驅(qū)使由pESC載體提供的兩個(gè)啟動(dòng)子(Ga11和Ga110)插入兩個(gè)序列。然后此酵母可用作對(duì)鯉魚春季病毒血癥病毒具特異性的dsRNA源。作為生物量提供的酵母可直接加入到飼料中或微囊化并混入飼料以阻止感染。
實(shí)施例13保護(hù)鮭魚類免受鯉魚春季病毒血癥病毒感染的方法用控制飲食或含有表達(dá)代表鯉魚春季病毒血癥病毒N，P，M，G，和L基因的dsRNA的細(xì)菌(實(shí)施例11)或真菌(實(shí)施例12)的飲食喂養(yǎng)鯉魚。動(dòng)物受到被鯉魚春季病毒血癥病毒污染的水的攻擊，因?yàn)樗穫鞑ケ徽J(rèn)為是感染鯉魚春季病毒血癥病毒的主要途徑(Ahne et al.，2002，Dis.Aqua t.Organ.52261-272)。受鯉魚春季病毒血癥病毒攻擊后，將動(dòng)物維持在10-17℃，因?yàn)樵诖藴囟葧?huì)出現(xiàn)高死亡率。記錄適應(yīng)鯉魚春季病毒血癥病毒攻擊的存活率，并通過實(shí)時(shí)PCR測(cè)量載入對(duì)照樣品和治療樣品的鯉魚春季病毒血癥病毒。
實(shí)施例14構(gòu)建含有魚型鏈球菌基因21-23個(gè)核苷酸的重組質(zhì)粒魚型鏈球菌是一種重要的魚類細(xì)菌性病原體，其感染在全世界其他魚類中的鮭魚類，羅非魚類，河鯰魚，斑馬魚(Zlotkin et al.，1998，Appl.Environ.Microbiol.644065-4067；Shoemaker et al.，2001，Am.J.Vet.Res.62174-177；Neely et al.，2002，Infect.Immun.703904-3914)。除了魚類，在北美洲和亞洲也有魚型鏈球菌感染人類的報(bào)道(Weinstein et al.，1997，N.Engl.J.Med.337589-594；Lau et al.，2003，J.Clin.Microbiol.411004-1009)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，按常規(guī)使用抗生素來控制魚型鏈球菌感染?？紤]到在陸生和水生動(dòng)物飼養(yǎng)業(yè)中廣泛使用抗生素對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)的擔(dān)憂，急需開發(fā)控制細(xì)菌性疾病的替代手段。為達(dá)到此目的，本發(fā)明提出了控制魚型鏈球菌以及其他感染魚類的細(xì)菌性疾病的解決辦法。
對(duì)魚型鏈球菌和乳酸氧化酶基因具有特異性的21-23-mer長(zhǎng)的寡核苷酸被定做設(shè)計(jì)和合成，基于公開的魚型鏈球菌序列(Gibello et al.，1999，Appl.Environ.Microbiol.654346-4350；Fuller et al.，2002，Infect.Immun.705730-5739)。細(xì)胞溶素與由A組鏈球菌產(chǎn)生的鏈球菌溶血素功能上同源，而且局部組織壞死需要細(xì)胞溶素表達(dá)(Fuller et al.，2002，Infect.Immun.705730-5739)。另一方面，乳酸氧化酶基因涉及魚型鏈球菌的左旋乳酸代謝。代表細(xì)胞溶素和乳酸氧化酶基因的正義和反義寡核苷酸被退火產(chǎn)生雙鏈DNA，并在轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株HT115DE3(攜帶能誘導(dǎo)表達(dá)T7聚合酶的IPTG并缺失雙鏈特異性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)之前被克隆成質(zhì)粒載體L4440。對(duì)攜帶有魚型鏈球菌基因的重組克隆進(jìn)行測(cè)序以確定重組克隆的身份。
實(shí)施例15表達(dá)魚型鏈球菌雙鏈RNA及飼料配方的細(xì)菌誘導(dǎo)。
攜帶有可誘導(dǎo)魚型鏈球菌基因的IPTG的大腸桿菌菌株HT115DE3在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，然后以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)魚型鏈球菌特異性RNA。通過變換在細(xì)菌介質(zhì)中的IPTG濃度，依經(jīng)驗(yàn)最優(yōu)化表達(dá)雙鏈RNA。表達(dá)魚型鏈球菌基因的細(xì)菌細(xì)胞與魚飲食混合，以微結(jié)合成由藻酸鹽和淀粉組成的以聚合形式存在的小珠，并加入引誘劑制成對(duì)魚類更加美味的小珠。
實(shí)施例16保護(hù)魚類免受魚型鏈球菌感染的方法用控制飲食或含有表達(dá)魚型鏈球菌雙鏈RNA的飲食喂養(yǎng)條紋石。條紋石 受到魚型鏈球菌的攻擊。然后在控制組和治療組魚中記錄適應(yīng)魚型鏈球菌攻擊的存活率。
實(shí)施例17
構(gòu)建含有豬細(xì)小病毒(PPV)，一種豬病原體，的21-23個(gè)核苷酸的重組質(zhì)粒對(duì)豬細(xì)小病毒的VP1衣殼蛋白基因具有特異性的21-23-mer長(zhǎng)的寡核苷酸被定做設(shè)計(jì)和合成?；诠_的豬細(xì)小病毒基因組序列，GenBank登記號(hào)NC001718(Bergeron et al.，1993，Virology 19786-98)，合成代表上述基因的正義和反義寡核苷酸。豬細(xì)小病毒的主要抗原決定部位是在VP2衣殼基因內(nèi)，選擇該基因用于此設(shè)計(jì)(Kamstrup et al.，1998，Virus Res.53163-173)。正義和反義寡核苷酸被退火產(chǎn)生雙鏈DNA，并被克隆成質(zhì)粒載體L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。該重組質(zhì)粒被用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株HT115DE3(攜帶能誘導(dǎo)表達(dá)T7聚合酶的IPTG，并缺失雙鏈特異性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。對(duì)攜帶有豬細(xì)小病毒特異性基因的重組克隆進(jìn)行測(cè)序以確定克隆的身份。然后將這些siRNA配入飼料中，按前面實(shí)施例描述的方法治療其他動(dòng)物(實(shí)施例2和3)，被用于預(yù)防豬感染豬細(xì)小病毒的治療，。
實(shí)施例18構(gòu)建含有外來紐卡斯?fàn)柤膊?，一種雞病毒性病原體，的21-23個(gè)核苷酸的重組質(zhì)粒對(duì)外來紐卡斯?fàn)柤膊〔《疽職さ鞍谆蚓哂刑禺愋缘?1-23-mer長(zhǎng)的寡核苷酸被定做設(shè)計(jì)和合成。基于公開的犬細(xì)小病毒基因組序列，GenBank登記號(hào)NC002617(Sellers et al.，2000，Complete sequence for the B1 strainof Newcastle disease virus.InU.S.Department ofAgriculture/Agriculture Research Services)，合成代表上述基因的正義和反義寡核苷酸。正義和反義寡核苷酸序列被退火產(chǎn)生雙鏈DNA，并被克隆成質(zhì)粒載體例如L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)，其含有兩個(gè)啟動(dòng)子以產(chǎn)生RNA。該重組質(zhì)粒被用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株HT115DE3(攜帶能誘導(dǎo)表達(dá)T7聚合酶的IPTG，并缺失雙鏈特異性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。對(duì)攜帶有犬細(xì)小病毒特異性基因的重組克隆進(jìn)行測(cè)序以確定克隆的身份。然后將這些siRNA配入飼料中，并且按前面實(shí)施例描述的方法治療其他動(dòng)物(例如見，實(shí)施例15)，被用于預(yù)防雞感染外來紐卡斯?fàn)柤膊〔《镜闹委煛?br> 實(shí)施例19構(gòu)建含有寡核苷酸的重組質(zhì)粒，該寡核苷酸由與口蹄疫(FMD)，一種牛病毒性病原體，互補(bǔ)的21-23個(gè)核苷酸長(zhǎng)組成對(duì)VP1衣殼蛋白基因具有特異性的21-23-mer長(zhǎng)的寡核苷酸被定做設(shè)計(jì)和合成?；诠_的犬細(xì)小病毒基因組序列，GenBank登記號(hào)NC004915(Saravanan et al.，2003，F(xiàn)oot-and-mouth disease virus Asia 1(FMDV-Asial)，InMolecular Virolgy，Indian Veterinary ResearchInstitute，India)，合成代表上述基因的正義和反義寡核苷酸。比口蹄疫單鏈菌株，各種菌株的可選序列能夠平行使用來，提供更廣泛的預(yù)防。正義和反義寡核苷酸序列被退火產(chǎn)生雙鏈DNA，并被克隆成質(zhì)粒載體L4440(Kamathet al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。該重組質(zhì)粒被用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株HT115DE3(攜帶能誘導(dǎo)表達(dá)T7聚合酶的IPTG，并缺失雙鏈特異性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。對(duì)攜帶有犬細(xì)小病毒特異性基因的重組克隆進(jìn)行測(cè)序以確定克隆的身份。然后將這些siRNA配入飼料中，按前面實(shí)施例描述的方法治療其他動(dòng)物(見實(shí)施例15)，用于預(yù)防牛感染犬細(xì)小病毒的治療。
實(shí)施例20構(gòu)建含有貓白血病病毒(FLV)，一種貓病毒性病原體，的21-23個(gè)核苷酸的重組質(zhì)粒對(duì)包膜蛋白基因具有特異性的21-23-mer長(zhǎng)的寡核苷酸被定做設(shè)計(jì)和合成?；诠_的含有包膜蛋白基因的貓白血病病毒片斷序列，GenBank登記號(hào)AF403716(Anderson et al.，2001，J.Virol.7510563-10572)，合成代表上述基因的正義和反義寡核苷酸。正義和反義寡核苷酸序列被退火產(chǎn)生雙鏈DNA，并被克隆成質(zhì)粒載體L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010。該重組質(zhì)粒被用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株HT115DE3(攜帶能誘導(dǎo)表達(dá)T7聚合酶的IPTG，并缺失雙鏈特異性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。對(duì)攜帶有貓白血病病毒特異性基因的重組克隆進(jìn)行測(cè)序以確定克隆的身份。然后將這些siRNA配入飼料中，使用類似于前面實(shí)施例所描述的方法治療其他動(dòng)物(實(shí)施例2和3)，被用于預(yù)防貓感染貓白血病病毒的治療。
實(shí)施例21構(gòu)建含有犬細(xì)小病毒(CPV)，一種犬科病毒性病原體，的21-23個(gè)核苷酸的重組質(zhì)粒對(duì)VP1衣殼蛋白基因具有特異性的21-23-mer長(zhǎng)的寡核苷酸被定做設(shè)計(jì)和合成?；诠_的犬細(xì)小病毒基因組序列，GenBank登記號(hào)NC001539(Reedet al.，1988，J.Virol.62266-276)，合成代表上述基因的正義和反義寡核苷酸。VP1的N-終點(diǎn)區(qū)域選擇自這種設(shè)計(jì)，由于衣殼的核子傳輸和這種病毒的有效傳染已經(jīng)被顯示(Vihinen-Ranta et al.，2002，J.Virol.761884-1891)。正義和反義寡核苷酸序列被退火產(chǎn)生雙鏈DNA，并被克隆成質(zhì)粒載體L4440(Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010。該重組質(zhì)粒被用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株HT115DE3(攜帶能誘導(dǎo)表達(dá)T7聚合酶的IPTG并缺失雙鏈特異性RNA酶III；Kamath et al.，2002，Genome Biol.20002.0001-0002.0010)。對(duì)攜帶有犬細(xì)小病毒特異性基因的重組克隆進(jìn)行測(cè)序以確定克隆的身份。然后將這些siRNA配入飼料中，用于預(yù)防狗感染犬細(xì)小病毒的治療，使用類似于前面實(shí)施例所述的方法治療其他動(dòng)物(實(shí)施例2和3)。
實(shí)施例22構(gòu)建在植物中表達(dá)的含有白斑綜合癥病毒(WSSV)基因的21-23個(gè)核苷酸的重組質(zhì)粒對(duì)以下五種白斑綜合癥病毒基因具有特異性的21-23-mer長(zhǎng)的寡核苷酸被定做設(shè)計(jì)和合成，正義和反義寡核苷酸序列被退火產(chǎn)生雙鏈DNA，如實(shí)施例1中所述。為了用于植物系統(tǒng)，使用基于agrobacterium ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)域的不同質(zhì)粒。存在大量這樣的質(zhì)粒，其適用于各種植物物種(插入?yún)⒖紩?。退火雙鏈DNA被克隆成在負(fù)鏈上含有兩個(gè)的啟動(dòng)子例如，lac，trp，或PL啟動(dòng)子，的質(zhì)粒載體，用標(biāo)準(zhǔn)方法構(gòu)建質(zhì)粒并擴(kuò)增構(gòu)建(Clark，1997，PlantMolecular Biology.Springer，Berlin)。該重組質(zhì)粒被用來轉(zhuǎn)化紫花苜蓿細(xì)胞(Taschner et al.，1994，Virology 203269-276；Larrick et al.，2001，Biomol.Eng.1887-94；Kelemen et al.，2002，Transgenic Res.1169-72)。對(duì)攜帶有白斑綜合癥病毒特異性基因的重組愈傷組織培養(yǎng)物進(jìn)行測(cè)序以確定克隆的身份。使用愈傷組織重組表達(dá)白斑綜合癥病毒特異性RNA的基因工程植物。通過風(fēng)干溫和干燥植物材料，然后將其混合到飼料中，使用類似于實(shí)施例2和3中的方法，來用于預(yù)防蝦類免受白斑綜合癥病毒感染。
實(shí)施例23使用頂部涂層配制可替代飼料生物量制作飼料的頂部涂層是使用標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)技術(shù)完成的，其中含有上述實(shí)施例(例如，實(shí)施例2，5，8，11，&12)所述生物量的生物量被涂到現(xiàn)存飼料上并喂養(yǎng)動(dòng)物，以提供想要的活性調(diào)節(jié)。
實(shí)施例24桃拉綜合癥病毒siRNA設(shè)計(jì)RNA干擾設(shè)計(jì)用于可被RNA干擾調(diào)節(jié)的桃拉綜合癥病毒(TSV)RdRp基因(AF277675)能使用幾個(gè)不同的方法來完成。正如由Ambion設(shè)計(jì)的一個(gè)siRNA設(shè)計(jì)是基于一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGAGUGUCUA AUGCGGAGAT T(SEQ IDNO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)UCUCCGCAUU AGACACUCCT G(SEQ IDNO___)。為使用pSilencerTMsiRNA載體設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGAGT GTCTAATGCG GAGATTCAAG AGATCTCCGC ATTAGACACT CCTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGAGTGTCTAATG CGGAGATCTC TTGAATCTCC GCATTAGACA CTCCG-3’(SEQ ID NO___)。
另一個(gè)RNA干擾設(shè)計(jì)用于可被RNA干擾調(diào)節(jié)的桃拉綜合癥病毒(TSV)的RdRp基因(AF277675)能使用幾個(gè)不同的方法來完成。正如由Ambion設(shè)計(jì)的一個(gè)siRNA設(shè)計(jì)是基于一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGGAAGAGCG GAAAGCAGATT(SEQ ID NO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)UCUGCUUUCC GCUCUUCCCT T(SEQID NO___)。為使用pSilencerTMsiRNA載體設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGGAA GAGCGGAAAGCAGATTCAAG AGATCTGCTT TCCGCTCTTCCCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCAAAAAAGGGAA GAGCGGAAAG CAGATCTCTT GAATCTGCTT TCCGCTCTTC CCG-3’(SEQ IDNO___)。
另一個(gè)RNA干擾設(shè)計(jì)用于可被RNA干擾調(diào)節(jié)的桃拉綜合癥病毒(TSV)的RdRp基因(AF277675)能使用幾個(gè)不同的方法來完成。正如由Ambion設(shè)計(jì)的一個(gè)siRNA設(shè)計(jì)是基于一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGAAUUCAUU GUUGACAACTT(SEQ ID NO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)GUUGUCAACA AUGAAUUCCT C(SEQID NO___)。為使用pSilencerTMsiRNA載體設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGAAT TCATTGTTGA CAACTTCAAG AGAGTTGTCA ACAATGAATTCCTCTTTTTT GGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCAAAAAAGAGGA ATTCATTGTT GACAACTCTC TTGAAGTTGT CAACAATGAA TTCCG-3’(SEQ IDNO___)。
RNA干擾用于被RNA干擾調(diào)節(jié)的桃拉綜合癥病毒(TSV)vp1基因(AF277675)能使用幾個(gè)不同的方法來完成。正如由Ambion設(shè)計(jì)的一個(gè)siRNA設(shè)計(jì)是基于一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGAUUGGAUG AGAUGUCUAT T(SEQ ID NO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)UAGACAUCUC AUCCAAUCCT T(SEQ ID NO___)。為使用pSilencerTMsiRNA載體設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGATTGGATGAGATG TCTATTCAAG AGATAGACAT CTCATCCAAT CCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ IDNO___)和底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGATT GGATGAGATGTCTATCTCTT GAATAGACAT CTCATCCAAT CCG-3’(SEQ ID NO___)。
另一個(gè)RNA干擾設(shè)計(jì)用于可被RNA干擾調(diào)節(jié)的桃拉綜合癥病毒(TSV)的vp1基因(AF277675)能使用幾個(gè)不同的方法來完成。正如由Ambion設(shè)計(jì)的一個(gè)siRNA設(shè)計(jì)是基于一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGUACGCUUG CUAAAGCAGT T(SEQID NO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)CUGCUUUAGC AAGCGUACCT G(SEQ IDNO___)。為使用pSilencerTMsiRNA載體設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGTAC GCTTGCTAAA GCAGTTCAAG AGACTGCTTT AGCAAGCGTA CCTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGTACGCTTGCTA AAGCAGTCTC TTGAACTGCT TTAGCAAGCG TACCG-3’(SEQ ID NO___)。
另一個(gè)RNA干擾設(shè)計(jì)用于可被RNA干擾調(diào)節(jié)的桃拉綜合癥病毒(TSV)的vp1基因(AF277675)能使用幾個(gè)不同的方法來完成。正如由Ambion設(shè)計(jì)的一個(gè)siRNA設(shè)計(jì)是基于一條正義s iRNA鏈(5’→3’)GGAUACGAAG GUGUCUUUGT T(SEQID NO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)CAAAGACACC UUCGUAUCCT G(SEQ IDNO___)。為使用pSilencerTMsiRNA載體設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGATA CGAAGGTGTC TTTGTTCAAG AGACAAAGAC ACCTTCGTAT CCTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGATACGAAGGTG TCTTTGTCTC TTGAACAAAG ACACCTTCTT ATCCG-3’(SEQ ID NO___)。
實(shí)施例25蝦黃頭病毒siRNA設(shè)計(jì)RNA干擾設(shè)計(jì)用于可被RNA干擾調(diào)節(jié)的黃頭病毒(YHV)結(jié)構(gòu)糖蛋白基因YHVgp(AF540644)可使用幾個(gè)不同的方法完成。正如由Ambion設(shè)計(jì)的一個(gè)siRNA設(shè)計(jì)是基于一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGCUCGCAUA UCAUUUAUAT T(SEQID NO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)UAUAAAUGAU AUGCGAGCCT G(SEQ IDNO___)。為使用pSilencerTMsiRNA載體設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGCTC GCATATCATT TATATTCAAG AGATATAAAT GATATGCGAG CCTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGCTCGCATATCA TTTATATCTC TTGAATATAA ATGATATGCG AGCCG-3’(SEQ ID NO___)。
另一個(gè)RNA干擾設(shè)計(jì)用于可被RNA干擾調(diào)節(jié)的黃頭病毒(YHV)結(jié)構(gòu)糖蛋白基因YHVgp(AF540644)可使用幾個(gè)不同的方法來完成。正如由Ambion設(shè)計(jì)的一個(gè)siRNA設(shè)計(jì)是基于一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGAUAUCCUC CCGCCAACATT(SEQ ID NO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)UGUUGGCGGG AGGAUAUCCT T(SEQID NO___)。為使用pSilencerTMsiRNA載體設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGATA TCCTCCCGCC AACATTCAAG AGATGTTGGC GGGAGGATATCCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCAAAAAAGGATA TCCTCCCGCC AACATCTCTT GAATGTTGGC GGGAGGATAT CCG-3’(SEQ IDNO___)。
另一個(gè)RNA干擾設(shè)計(jì)用于被RNA干擾調(diào)節(jié)的黃頭病毒(YHV)結(jié)構(gòu)糖蛋白基因YHVgp(AF540644)可使用幾個(gè)不同的方法完成。正如由Ambion設(shè)計(jì)的一個(gè)siRNA設(shè)計(jì)是基于一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGUCUUUGUU AUGAAGUAGT T(SEQID NO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)CUACUUCAUA ACAAAGACCT T(SEQ IDNO___)。為使用pSilencerTMsiRNA載體設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGTCT TTGTTATGAA GTAGTTCAAG AGACTACTTC ATAACAAAGA CCTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGTCTTTGTTATGAA GTAGTCTCTT GAACTACTTC ATAACAAAGA CCG-3’(SEQ ID NO___)。
實(shí)施例26傳染性表皮與造血組織壞死癥病毒(IHHNV)siRNA設(shè)計(jì)siRNA設(shè)計(jì)用于傳染性表皮與造血組織壞死癥病毒(IHHNV)基因orf1(AF273215)可使用幾個(gè)不同的方法來完成。正如由Ambion設(shè)計(jì)的一個(gè)siRNA設(shè)計(jì)是基于一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGACAUACUG CAUACACGUT T(SEQ IDNO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)ACGUGUAUGC AGUAUGUCCT T(SEQ IDNO___)。為使用pSilencerTMsiRNA表達(dá)載體(來自Ambion的2.0，2.1，3.0，&3.1)設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGACA TACTGCATACACGTTTCAAG AGAACGTGTA TGCAGTATGT CCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGACA TACTGCATAC ACGTTCTCTTGAAACGTGTA TGCAGTATGT CCG-3’(SEQ ID NO___)。
第二個(gè)RNA干擾設(shè)計(jì)用于傳染性表皮與造血組織壞死癥病毒基因orf1(AF273215)可使用幾個(gè)不同的方法來完成。正如由Ambion設(shè)計(jì)的一個(gè)siRNA設(shè)計(jì)是基于一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGUCCAAAUC AAGACCCUAT T(SEQ IDNO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)UAGGGUCUUG AUUUGGACCT G(SEQ IDNO___)。為使用pSilencerTMsiRNA載體設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGTCC AAATCAAGAC CCTATTCAAG AGATAGGGTC TTGATTTGGA CCTGTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGTCCAAATCAAG ACCCTATCTC TTGAATAGGG TCTTGATTTG GACCG-3’(SEQ ID NO___)。
另一個(gè)RNA干擾設(shè)計(jì)用于為傳染性表皮與造血組織壞死癥病毒基因orf1(AF273215)可使用幾個(gè)不同的方法來完成。正如由Ambion設(shè)計(jì)的一個(gè)siRNA設(shè)計(jì)是基于一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGACAAUAUA AAGACAAACT T(SEQ IDNO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)GUUUGUCUUU AUAUUGUCCT C(SEQ IDNO___)。為使用pSilencerTMsiRNA載體設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGACA ATATAAAGAC AAACTTCAAG AGAGTTTGTC TTTATATTGT CCTCTTTTTTGGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGAGGACAATATAAAG ACAAACTCTC TTGAAGTTTG TCTTTATATT GTCCG-3’(SEQ ID NO___)。
RNA干擾設(shè)計(jì)用于被RNA干擾調(diào)節(jié)的傳染性表皮與造血組織壞死癥病毒基因orf2(AF273215)可使用幾個(gè)不同的方法來完成。。正如由Ambion設(shè)計(jì)的一個(gè)siRNA設(shè)計(jì)是基于一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGAUCAAGUG GACCAGACCTT(SEQ ID NO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)GGUCUGGUCC ACUUGAUCCT T(SEQID NO___)。為使用pSilencerTMsiRNA載體設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGATC AAGTGGACCA GACCTTCAAG AGAGGTCTGG TCCACTTGATCCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板5’一AGCTTTTCCAAAAAAGGATC AAGTGGACCA GACCTCTCTT GAAGGTCTGG TCCACTTGAT CCG-3’(SEQ IDNO___)。
另一個(gè)RNA干擾設(shè)計(jì)用于被RNA干擾調(diào)節(jié)的傳染性表皮與造血組織壞死癥病毒基因orf2(AF273215)可使用幾個(gè)不同的方法來完成。。正如由Ambion設(shè)計(jì)的一個(gè)siRNA設(shè)計(jì)是基于一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGAGGCACAUCAUUUGAGAT T(SEQ ID NO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)UCUCAAAUGAUGUGCCUCCT G(SEQ ID NO___)。為使用pSilencerTMsiRNA載體設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGAGG CACATCATTT GAGATTCAAG AGATCTCAAATGATGTGCCT CCTGTTTTTT GGAAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAACAGGA GGCACATCAT TTGAGATCTC TTGAATCTCA AATGATGTGCCTCCG-3’(SEQ ID NO___)。
另一個(gè)RNA干擾設(shè)計(jì)用于可被RNA干擾調(diào)節(jié)的傳染性表皮與造血組織壞死癥病毒基因orf2(AF273215)可使用幾個(gè)不同的方法完成。正如由Ambion設(shè)計(jì)的一個(gè)siRNA設(shè)計(jì)是基于一條正義siRNA鏈(5’→3’)GGAUACUACUGGACUACAUT T(SEQ ID NO___)和一條反義siRNA鏈(5’→3’)AUGUAGUCCAGUAGUAUCCT T(SEQ ID NO___)。為使用pSilencerTMsiRNA載體設(shè)計(jì)的模板具有頂鏈寡核苷酸模板5’-GATCCGGATA CTACTGGACT ACATTTCAAG AGAATGTAGTCCAGTAGTAT CCTTTTTTGG AAA-3’(SEQ ID NO___)和底鏈寡核苷酸模板5’-AGCTTTTCCA AAAAAGGATA CTACTGGACT ACATTCTCTT GAAATGTAGT CCAGTAGTATCCG-3’(SEQ ID NO___)。
實(shí)施例27在細(xì)菌質(zhì)粒載體中克隆siRNA正義和反義寡核苷酸序列被退火生成雙鏈DNA，并被克隆成PetDirectional TOPTM表達(dá)載體(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，California)或Pcx-TOPO PuruProTM柄細(xì)菌質(zhì)粒表達(dá)載體(Invitrogen，Inc.)或L4440質(zhì)粒載體(Kamath et al.，2002)。用重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21StarTM(DE3)One Shot Chemically Competent cells(Invitrogen，Inc.)或新月柄桿菌細(xì)胞或大腸桿菌HT115DE3細(xì)胞(Kamath et al.，2001)。對(duì)重組克隆進(jìn)行測(cè)序以確定克隆的身份。含有病毒特異性基因的克隆在含有氨芐青霉素和IPTG的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。依經(jīng)驗(yàn)確定IPTG的濃度以獲得最大程度的雙鏈RNA表達(dá)。含有表達(dá)siRNA細(xì)胞的細(xì)菌量與蝦飼料混合，微結(jié)合成由藻酸鹽和淀粉組成的以多聚形存在小珠。加入引誘劑例如磷蝦粉制成對(duì)蝦類更加美味的小珠。
實(shí)施例30水生和陸生動(dòng)物疾病I.水生動(dòng)物疾病A.原生動(dòng)物i.卵圓鞭毛蟲(腰鞭毛蟲)(Amyloodinium ocellatum(dinoflagellate))ii.布魯克原蟲(纖毛蟲)(Brooklynella hostilis(ciliate))iii.刺激隱核蟲(纖毛蟲)(Cryptocaryon irritans(ciliate))iv.多子小瓜蟲(一種魚型纖毛蟲)(Ichthyopthirius multifilis(Ich-aciliate))v.鯉斜管蟲(一種纖毛蟲)(Chilodonella cyprini(a ciliate))vi.六鞭毛蟲(鞭毛蟲)(Hexamita(a fagellate))B.微孢子綱i.格留蟲屬，微孢子蟲屬(Glugea，Spraguea spp.)C.粘孢子i.尾孢蟲屬(Henneguya spp.)ii.粘體蟲屬(Myxobolus spp.)D.扁形動(dòng)物門i.單殖目(吸蟲綱)ii.復(fù)殖目(吸蟲綱)iii.絳蟲綱(吸蟲綱)E.線蟲i.cappilaria(艾美蟲屬)F.甲殼類i.魚虱屬(短尾亞目甲殼動(dòng)物蟹)(Argulus spp.(Brachyuran))ii.鮭瘡痂魚虱(鮭魚虱-一種繞足動(dòng)物)(Lepeophtheirus salmonis(Salmon lice-a copepod))
iii.針蟲屬(棘頭蟲)(Learnea spp.(Acanthocephalan))G.孢子蟲綱.
i.球蟲屬(Coccidia spp)H.真菌i.寄生水霉(一種卵菌)(Saprolegnia parasitica(an oomycete))ii.小□蝦瘟疫(一種卵菌)(Aphanomyces astaci(an oomycete))iii.魚孢霉菌病(類真菌制劑)(Ichthyophonus hoferi(fungus-like agent))iv.茄病鐮刀菌(絲孢綱)(Fusarium solani(a hyphomycete))v.鮭魚外瓶霉(絲孢綱)(Exophiala salmonis(a hyphomycete))II.陸生動(dòng)物疾病非洲馬病病毒(馬科動(dòng)物)(African horse sickness virus(equine))非洲豬瘟病毒(豬)(African swine fever virus(porcine))偽狂犬病病毒(豬皰疹病毒1)(Aujeszky′s disease virus(porcineherpesvirus 1))禽流感病毒(家禽)(Avian influenza viruses(poultry))駑巴貝斯蟲和馬巴貝西蟲(馬科動(dòng)物)(Babesia caballi and B.equi(equine))炭疽桿菌(所有動(dòng)物)(Bacillus anthracis(all))藍(lán)舌病病毒(牛，綿羊，山羊，鹿)(Bluetongue virus(cattle，sheep，goats，deer))馬耳他熱布魯氏菌(牛屬動(dòng)物)(Brucella melitensis(bovine))羊布氏桿菌(綿羊科動(dòng)物)(Brucella ovis(ovine))豬布魯菌(豬科動(dòng)物)(Brucella suis(porcine))馬鼻疽伯克霍爾德氏菌(鼻疽假單孢菌)(Burkholdaria(Pseudomonas)mallei equine))傳統(tǒng)豬瘟病毒(豬科動(dòng)物)(Classical swine fever virus(porcine))螺旋蠅蛆病(綿羊科動(dòng)物，牛科動(dòng)物)(Cochliomya hominivorax(ovines，bovines))
東西方馬腦炎病毒(馬科動(dòng)物)(Eastern and western equine encephalomyelitisviruses(equine))多包絳蟲和細(xì)粒棘球絳蟲(犬科動(dòng)物)(Echinococcus multilocularis and E.granulosus(canine))馬傳染性貧血癥(馬科動(dòng)物)(Equine infectious anaemia virus(equine))口蹄疫病毒(綿羊科動(dòng)物，?？苿?dòng)物)(Foot and mouth disease virus(ovine，bovine)皮疽組織胞漿菌(許多類真菌物種)(Histoplasma farciminosum(fungus-like many species))馬痘病毒(馬科動(dòng)物)(Horse pox virus(equine))支原體無乳癥(?？苿?dòng)物，綿羊科動(dòng)物)(Mycoplasma agalactiae(bovine，ovine))絲狀支原體絲狀亞種(Mycoplasma mycoides mycoides)山羊絲狀支原體(公山羊)(Mycoplasma mycoides var Capri(caprine))紐卡斯?fàn)柤膊〔《?鳥類)(Newcastle disease virus(avian))小反芻獸疫病毒(Peste de petis ruminants virus)狂犬病毒和狂犬病相關(guān)病毒，如下杜文哈根病毒(Duvenhage)拉各斯蝙蝠病毒(Lagos bat)莫科拉病毒(Mokola)歐洲蝙蝠狂犬病毒I和II(European bat lyssaviruses I and II)里夫特裂谷熱病毒(Riff Valley Fever virus)牛瘟病毒(綿羊科動(dòng)物，?？苿?dòng)物，公山羊)(Rinderpest virus(ovine，bovine，caprine))綿羊和山羊痘病毒(Sheep and goat pox virus)豬水泡病(Swine vesicular disease)捷申病病毒(Teschen disease virus)泰勒蟲癥(綿羊科動(dòng)物，?？苿?dòng)物)(Theileria annulata(ovine，bovine)
旋毛蟲(豬科動(dòng)物)一種原生動(dòng)物(Trichinella spiralis(porcine)aprotozoan)馬疫錐蟲，伊氏錐蟲&泰勒錐蟲(原生動(dòng)物)(Trypanosome equiperdum，T.evansi & T.theileri)委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒(馬科動(dòng)物)(Venezuelan equineencephalomyelitis virus(equine))水泡性口炎病毒(豬科動(dòng)物)(Vesicular stomatitis virus(porcine))布魯氏菌病(Brucellosis)慢性萎縮病(Chronic Wasting Disease)馬傳染性貧血癥(Equine Infectious anemia)馬病毒性動(dòng)脈炎(Equine viral artertis)約尼氏病(Johnes)狂犬病(Psedorabies)癢病(Scrapie)結(jié)核病(Tuberculosis)上述的是紊亂及紊亂引發(fā)制劑的非詳細(xì)列表，可使用本文所述的方法和組合物對(duì)其進(jìn)行治療或抑制。
本文引用的每個(gè)專利，專利申請(qǐng)，及出版物所公開的內(nèi)容被全部編入本文以供參考。
當(dāng)本發(fā)明就其特定實(shí)施方案被公開時(shí)，很顯然本技術(shù)領(lǐng)域的其他技術(shù)人員可以在不脫離本發(fā)明的基本精神和范圍的條件下，設(shè)計(jì)本發(fā)明的其他實(shí)施方案及對(duì)本發(fā)明做變更。所附權(quán)利要求包括所有這樣的實(shí)施方案和相對(duì)應(yīng)的變更。
權(quán)利要求
1.一種飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，包括小片段干擾RNA和雙鏈RNA，該小片段干擾RNA或雙鏈RNA表達(dá)于生物體內(nèi)，并能被加工成抑制動(dòng)物病原體的小片段干擾RNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述病原體為病毒，細(xì)菌，或真菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述病毒選自白斑綜合癥病毒、桃拉綜合癥病毒、黃頭病毒、和傳染性皮下及造血組織壞死病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述病毒選自豬細(xì)小病毒(PPV)、外來紐卡斯?fàn)柤膊?、口蹄?FMD)、貓白血病病毒(FLV)、犬細(xì)小病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述細(xì)菌選自水產(chǎn)業(yè)或農(nóng)業(yè)細(xì)菌性病原體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述水產(chǎn)業(yè)細(xì)菌性病原體選自氣單胞菌屬、愛德華氏菌屬、產(chǎn)黃菌屬、屈桿菌屬、分枝桿菌屬、鏈球菌屬、沙門氏菌屬、弧菌屬、和魯氏耶爾森菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述農(nóng)業(yè)細(xì)菌性病原體選自分枝桿菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬、沙門氏菌屬、和鼠疫耶爾森氏菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述真菌選自水產(chǎn)業(yè)或農(nóng)業(yè)真菌性病原體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述水產(chǎn)業(yè)真菌性病原體選自卵菌綱真菌，蝦瘟疫真菌，和魚孢霉菌屬。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述農(nóng)業(yè)真菌性病原體選自發(fā)癬菌屬、茄鐮孢菌、和假絲酵母屬。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述病原體為真核生物。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述真核生物選自纖毛蟲、變形蟲、原生動(dòng)物、微孢子綱、粘孢子、扁形動(dòng)物、線蟲、和孢子蟲。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述動(dòng)物為水生動(dòng)物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述水生動(dòng)物為甲殼綱動(dòng)物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述甲殼綱動(dòng)物選自蝦、豐年蟲、龍蝦、螃蟹、小龍蝦或?qū)ξr。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述動(dòng)物為魚類。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述魚類選自鮭魚、鱒魚、庸鰈、大菱鲆、條紋石、河鱸、羅非魚、鯰魚，和鯉魚。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述動(dòng)物為陸生動(dòng)物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述陸生動(dòng)物選自馬、狗、貓，母牛，綿羊，山羊，家禽，鳥類，水貂，豬，倉鼠，小鼠，兔，大鼠，沙鼠和豚鼠。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述小片段干擾RNA或雙鏈RNA表達(dá)于選自昆蟲，細(xì)菌，真菌，噬菌體，植物，和酵母的生物體中。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述生物體以完整或大部分完整細(xì)胞包含在飼料中。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述生物體以破碎或大部分破碎細(xì)胞包含在飼料中。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述生物體的生物量被封裝。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述的封裝是使用選自可消化聚合物、不可消化聚合物、磷脂、殼聚糖和藻酸鹽的材料完成。
25.一種保護(hù)動(dòng)物免受病原體感染的方法，包括喂食所述動(dòng)物飼料，其進(jìn)一步包括小片段干擾RNA或雙鏈RNA，其中所述的小片段干擾RNA或雙鏈RNA表達(dá)于生物體內(nèi)，并且所述的小片段干擾RNA或雙鏈RNA能被加工成小片段干擾RNA，以及通過RNA干擾，負(fù)調(diào)節(jié)動(dòng)物病原體的表達(dá)。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述病原體為病毒、細(xì)菌、或真菌。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述病毒選自白斑綜合癥病毒、桃拉綜合癥病毒、黃頭病毒、和傳染性皮下及造血組織壞死病毒。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述病毒選自豬細(xì)小病毒(PPV)、外來紐卡斯?fàn)柌?、口蹄?FMD)、貓白血病病毒(FLV)、犬細(xì)小病毒。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述細(xì)菌選自水產(chǎn)業(yè)或農(nóng)業(yè)細(xì)菌性病原體。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述水產(chǎn)業(yè)細(xì)菌性病原體選自氣單胞菌屬、愛德華氏菌屬、產(chǎn)黃菌屬、屈桿菌屬、分枝桿菌屬、鏈球菌屬、沙門氏菌屬、弧菌屬、和魯氏耶爾森菌。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述農(nóng)業(yè)細(xì)菌性病原體選自分枝桿菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬、沙門氏菌屬、和鼠疫耶爾森氏菌。
32.根據(jù)權(quán)利要求26所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述真菌選自水產(chǎn)業(yè)或農(nóng)業(yè)真菌性病原菌。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述水產(chǎn)業(yè)真菌性病原體選自卵菌綱真菌、蝦瘟疫真菌、和魚孢霉菌屬。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述農(nóng)業(yè)真菌性病原體選自發(fā)癬菌屬、茄鐮孢菌、和假絲酵母菌屬。
35.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述病原體為真核生物。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述真核生物選自纖毛蟲、變形蟲、原生動(dòng)物、微孢子綱、粘孢子、扁形動(dòng)物、線蟲、和孢子蟲。
37.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述動(dòng)物為水生動(dòng)物。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述水生動(dòng)物為甲殼綱動(dòng)物。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述甲殼綱動(dòng)物選自蝦、豐年蟲、龍蝦、螃蟹、小龍蝦、對(duì)蝦。
40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述水生動(dòng)物為魚類。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述魚類選自鮭魚、鱒魚、庸鰈、大菱鲆、條紋石、河鱸、羅非魚、鯰魚、和鯉魚。
42.根據(jù)權(quán)利要求25所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述動(dòng)物為陸生動(dòng)物。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的飼料、飼料補(bǔ)充物、或治療組合物，其中所述陸生動(dòng)物選自馬、狗、貓、母牛、綿羊、山羊、家禽、鳥類、水貂、豬、倉鼠、小鼠、兔、大鼠、沙鼠或豚鼠。
44.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的小片段干擾RNA或雙鏈RNA表達(dá)在選自昆蟲、細(xì)菌、真菌、噬菌體、植物、和酵母的生物體中。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述生物體以完整或大部分完整細(xì)胞包含在飼料中。
46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述生物體以破碎或大部分破碎細(xì)胞包含在飼料中。
47.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述生物體的生物量被封裝。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述的封裝是使用選自可消化聚合物、不可消化聚合物、磷脂、殼聚糖和藻酸鹽的材料完成。
49.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中飼料補(bǔ)充有含有21-23個(gè)核苷酸長(zhǎng)的重組細(xì)菌細(xì)胞，其選擇性分解與疾病引起的成分同源的mRNA來減少或減輕疾病狀態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用RNA干擾技術(shù)來抑制動(dòng)物病原體的組合物(例如，飼料、飼料補(bǔ)充物和治療產(chǎn)品)和方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1946733SQ200580007978
公開日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2005年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月6日
發(fā)明者大衛(wèi)·J·凱爾, 阿倫·K·達(dá)爾 申請(qǐng)人:高級(jí)生物營養(yǎng)公司