專利名稱：肺泡的分化誘導(dǎo)或再生誘導(dǎo)制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括作為活性成分的肝細(xì)胞生長因子，用于誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成肺泡細(xì)胞的制劑，還涉及通過這樣的分化誘導(dǎo)形成肺泡的制劑。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞生長因子(下文中為HGF)最初是作為成熟肝細(xì)胞的生長因子鑒定出來的，其基因(cDNA)已于1989年被克隆出來(參見非專利文獻(xiàn)1和2)。
迄今為止，HGF對(duì)多種細(xì)胞以及肝細(xì)胞發(fā)揮諸多生物學(xué)活性，例如細(xì)胞增值，促進(jìn)細(xì)胞遷移，形態(tài)發(fā)生誘導(dǎo)，細(xì)胞死亡抑制等(參見非專利文獻(xiàn)3-6)。
HGF的生物學(xué)活性通過其受體，即c-Met酪氨酸激酶進(jìn)行表達(dá)。HGF具有多種生物學(xué)活性，并對(duì)遭受多種損傷的不同組織具有修復(fù)和保護(hù)的功能。
血管生成促進(jìn)活性是HGF對(duì)組織進(jìn)行再生和保護(hù)的功能之一。HGF不僅能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，還在體內(nèi)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的血管生成誘導(dǎo)活性(參見非專利文獻(xiàn)7-10)。
此外，HGF具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞死亡的活性(參見非專利文獻(xiàn)11-13)。
肺是由大量肺泡構(gòu)成的器官。通過呼吸作用攝入機(jī)體的空氣先通過氣管，然后再進(jìn)入支氣管中。支氣管進(jìn)一步分支，每個(gè)細(xì)支氣管都與一個(gè)肺泡相連。人的肺泡是直徑約為0.2mm的小囊，并由毛細(xì)血管所圍繞。氣體交換是在肺泡中進(jìn)行的，即通過支氣管進(jìn)入肺泡的吸入的氣體攝取氧氣，而血液中的二氧化碳則作為廢氣釋放入肺泡中。肺氣腫是肺泡的生理性的進(jìn)行性破壞，隨著疾病的進(jìn)行，用于氣體交換的肺泡表面積降低。肺泡中不充分的氣體交換會(huì)導(dǎo)致血液中氧氣的短缺。隨著疾病的進(jìn)行，肺的彈性降低，從而導(dǎo)致呼吸困難。此外，由于成年肺是不能自發(fā)生長或再生的器官，肺氣腫就是進(jìn)行性和不可逆轉(zhuǎn)的疾病。Massaro等人報(bào)告了用全反式視黃酸(ATRA)處理在肺氣腫的動(dòng)物模型中解剖地和生理性地再生了肺(參見非專利文獻(xiàn)14)。此外，已知ATRA能夠激活參與肺發(fā)育的基因，并且促進(jìn)肺泡分隔和肺的生長。然而，在肺氣腫患者中利用ATRA的臨床試驗(yàn)并未表現(xiàn)出肺結(jié)構(gòu)或肺功能的明顯改善(參見非專利文獻(xiàn)15)。
據(jù)報(bào)道HGF促進(jìn)肺泡上皮II型細(xì)胞或支氣管上皮細(xì)胞的生長，且HGF也參與肺泡上皮細(xì)胞的修復(fù)(參見非專利文獻(xiàn)16-19)。此外，對(duì)于HGF對(duì)急性肺損傷效果的研究表明損傷后在肺中新生成了HGF，并且當(dāng)向肺部受損的動(dòng)物施用HGF時(shí)，刺激了肺組織中的細(xì)胞增值，并且促進(jìn)了對(duì)受損肺部的修復(fù)(參見專利文獻(xiàn)2)。
然而，以上所涉及的文獻(xiàn)中沒有任意一篇對(duì)HGF誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成肺泡細(xì)胞，以及通過這種分化誘導(dǎo)促進(jìn)肺泡的再生或形成有所描述。
JP-A-89869/1996[專利文獻(xiàn)2]JP-A-172207/1994[非專利文獻(xiàn)1]Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，1984，vol.122，p.1450-1459[非專利文獻(xiàn)2]Nature，1989，vol.342，p.440-443[非專利文獻(xiàn)3]The Journal of Cell Biology，1985，vol.129，p.1177-1185[非專利文獻(xiàn)4]The Journal of Biochemistry，1986，vol.119，p.591-600[非專利文獻(xiàn)5]International Review of Cytology)，1999，vol.186，p.225-260[非專利文獻(xiàn)6]Kidney International，2001，vol.59，p.2023-2038[非專利文獻(xiàn)7]The Journal of Cell Biology，1992，vol.119，p.629-641[非專利文獻(xiàn)8]Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America，1993，vol.90，p.1937-1941[非專利文獻(xiàn)9]Circulation，1998，vol.97，p.381-390[非專利文獻(xiàn)10]Hypertension，1999，vol.33，p.1379-1384[非專利文獻(xiàn)11]Journal of Hypertension，2000，vol.18，p.1411-1420[非專利文獻(xiàn)12]Hypertension，2001，vol.37，p.581-586[非專利文獻(xiàn)13]Diabetes，2002，vol.51，p.2604-2611[非專利文獻(xiàn)14]Massaro，G.D.，et.al，Nature Medicine，1997，vol.3，p.675-677[非專利文獻(xiàn)15]Mao，J.T.，et.al，American Journal of Respiratory &Critical Care Medicine，2002，vol.165，p.718-723[非專利文獻(xiàn)16]Mason RJ，et.al，American Journal of RespiratoryCell and Molecular Biology，1994，vol.11，p.561-567[非專利文獻(xiàn)17]Shiratori M，et.al，American Journal of RespiratoryCell and Molecular Biology，1995，vol.12，p.171-180[非專利文獻(xiàn)18]Ohmichi H，et.al，The American Journal ofPhysiology，1996，vol.270，p.L1031-L 1039[非專利文獻(xiàn)19]Sakamaki，Y，et.al，American Journal of RespiratoryCell and Molecular Biology，2002，vol.26，p.525-533.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成肺泡細(xì)胞的制劑。本發(fā)明的另一目的在于將上述分化誘導(dǎo)制劑用作促進(jìn)受損肺泡的再生或肺泡形成的制劑。
本發(fā)明人新近發(fā)現(xiàn)，在例如肺氣腫中觀察到的受損的肺泡是可再生的，所再生的肺泡是從骨髓細(xì)胞分化而來的，且HGF誘導(dǎo)這種分化。作為基于這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)行的深入研究的結(jié)果，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。
換言之，本發(fā)明涉及(1)包含肝細(xì)胞生長因子，誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成肺泡細(xì)胞的制劑，(2)上述(1)的分化誘導(dǎo)制劑，其中的肺泡細(xì)胞為肺泡上皮細(xì)胞，以及(3)上述(1)或(2)的分化誘導(dǎo)制劑，其是促進(jìn)肺泡再生或形成的制劑。
其次，本發(fā)明涉及通過對(duì)哺乳動(dòng)物施用HGF來誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成肺泡細(xì)胞的方法，本發(fā)明還涉及HGF在生產(chǎn)用于誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成肺泡細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。此外，本發(fā)明涉及與含有HGF的誘導(dǎo)分化制劑一起培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，以及將從骨髓細(xì)胞分化出的肺泡細(xì)胞移植入哺乳動(dòng)物的方法，或者是對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，再將增殖的骨髓細(xì)胞移植入哺乳動(dòng)物，同時(shí)施用含有HGF的誘導(dǎo)分化制劑，以及誘導(dǎo)移植的骨髓細(xì)胞分化成肺泡細(xì)胞的方法。再者，本發(fā)明包括含有引入HGF基因以及使用HGF進(jìn)行受損肺泡再生或新肺泡形成的基因治療。
因?yàn)楸景l(fā)明的分化誘導(dǎo)制劑誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成肺泡細(xì)胞，所以可以在諸如肺氣腫，蜂窩肺的肺纖維化，肺淋巴管肌瘤病(LAM)，肺切除術(shù)之后受破壞的肺等肺泡細(xì)胞受損的疾病中形成新的肺泡。此外，當(dāng)在有本發(fā)明的分化誘導(dǎo)制劑存在的條件下培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，也可以制備由所述骨髓細(xì)胞分化而來的肺泡細(xì)胞。
此外，通過與本發(fā)明的分化誘導(dǎo)制劑一起培養(yǎng)骨髓細(xì)胞獲得的從骨髓細(xì)胞分化而來的肺泡細(xì)胞可以在再生醫(yī)藥領(lǐng)域中作為用于移植的細(xì)胞。


圖1所示為肺氣腫誘導(dǎo)的受體小鼠肺中的組織學(xué)發(fā)現(xiàn)。
圖2所示為肺氣腫誘導(dǎo)的受體小鼠中肺泡的平均線性截距。
圖3所示為在肺氣腫誘導(dǎo)的受體小鼠的肺中GFP陽性細(xì)胞與肺泡細(xì)胞的比率。
優(yōu)選實(shí)施方式本發(fā)明使用的HGF是公知的物質(zhì)。采用多種方法制備的HGF可用于本發(fā)明中，只要其純度足以被用作醫(yī)用制劑。就HGF的生產(chǎn)過程而言，例如，HGF可通過培養(yǎng)產(chǎn)生HGF的原始培養(yǎng)細(xì)胞或已建立的細(xì)胞系的細(xì)胞，從培養(yǎng)上清液等中分離HGF并對(duì)所分離的HGF進(jìn)行純化得到?；蛘撸部梢酝ㄟ^向合適的載體中整合編碼HGF的基因，將所述載體插入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞進(jìn)行其轉(zhuǎn)化并從所轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中收集目的重組HGF的遺傳工程技術(shù)獲得重組HGF(參見，例如JP-A-111382/1993；Biochem.Biophys.Res.Commun.，1989，vol.163，p.967)。
對(duì)上述宿主細(xì)胞并沒有特殊的限制，常規(guī)用于遺傳工程技術(shù)中的多種宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌，酵母，動(dòng)物細(xì)胞等都可以使用。所得到的HGF，只要其具有與天然HGF基本相同的作用，就可以在其氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)(例如幾個(gè))氨基酸的替換，缺失，添加和/或插入。類似地，HGF也可以包含糖鏈的替換，缺失和/或添加。在本文中，在氨基酸序列中的“一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失，替換，添加或插入”是指某一數(shù)量的天然存在(一個(gè)至若干個(gè)氨基酸)的氨基酸可以通過諸如遺傳工程技術(shù)，位點(diǎn)特異性突變誘導(dǎo)等公知的技術(shù)方法缺失，替換，添加和/或插入所述氨基酸序列中。
同樣，“包含糖鏈的替換，缺失和/或添加的HGF”是指，例如，(1)通過用酶對(duì)天然糖基化的HGF進(jìn)行處理從而去除糖鏈獲得的糖基化缺失的HGF，(2)其氨基酸序列在糖基化位點(diǎn)發(fā)生了突變從而抑制糖基化的HGF，或(3)其氨基酸序列以在不同于天然糖基化位點(diǎn)的位點(diǎn)發(fā)生糖基化的方式進(jìn)行突變的HGF。
此外，HGF還包括與HGF的氨基酸序列具有至少60％或更高同源性，優(yōu)選為80％或更高同源性，更優(yōu)選為90％或更高同源性，以及更優(yōu)選95％或更高同源性的蛋白質(zhì)，并且具有誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成肺泡細(xì)胞的活性。上述的氨基酸序列之間的“同源性”通常是指當(dāng)對(duì)所述蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較時(shí)，組成氨基酸序列的氨基酸殘基之間的同源性水平。
只要其具有與天然HGF基本相同的作用，應(yīng)用于本發(fā)明中的HGF可以具有在其C末端的羧酸根(-COO-)，酰胺基(-CONH2)或酯基(-COOR)以及羧基(-COOH)。在本文中，涉及到通常用作口服給藥的酯等，可被低級(jí)烷基(例如，甲基，乙基，丙基，環(huán)戊基，苯甲基，苯乙基等)，芳基(例如，苯基，α-萘基等)，新戊?；跫谆芜x地取代酯中的R。此外，可用于本發(fā)明中的HGF可以包括在其N-末端的甲硫氨酸殘基的氨基被保護(hù)基團(tuán)(例如，諸如甲酰基，乙?；鹊孽；?保護(hù)的HGF，其中通過體內(nèi)對(duì)N-末端進(jìn)行剪切產(chǎn)生的谷氨?；兂山构劝彼岬腍GF等等。
在本發(fā)明中，肺泡的再生或形成是指新肺泡的形成或受損肺泡的再生。肺泡是由肺泡上皮細(xì)胞，含有肺毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞的毛細(xì)血管等以及結(jié)締組織構(gòu)成的氣體交換器官。此外，本發(fā)明中的肺泡包括與所述肺泡相連接的分支的支氣管部分。
本發(fā)明的分化誘導(dǎo)制劑可用于對(duì)患有諸如肺氣腫，蜂窩肺的肺纖維化，肺淋巴管肌瘤病(LAM)，肺切除術(shù)之后的受損肺等肺泡受損的動(dòng)物(例如，牛，馬，豬，羊，狗，貓)包括人肺泡再生或形成的目的。
本發(fā)明的分化誘導(dǎo)制劑可具有多種劑型，例如液體制劑，固體制劑，膠囊等，然而，通常都是單獨(dú)與HGF，或與HGF以及常規(guī)載體一起配制成注射劑，吸入劑，栓劑或口服給藥的制劑。上述注射劑可以是水性注射劑或油性注射劑。
在水性注射劑的情況下，可以以下方式進(jìn)行制備將HGF溶于，例如，將適當(dāng)?shù)闹T如如下物質(zhì)的藥用載體加入水性溶劑(例如，可注射的水，純凈水等)制備的溶液中，然后按公知的方法將所述溶液經(jīng)過濾器等過濾，滅菌，并填充于無菌容器中等滲制劑(例如氯化鈉，氯化鉀，甘油，甘露醇，山梨醇，硼酸，硼砂，葡萄糖，丙二醇等)，緩沖液(例如，磷酸緩沖液，乙酸緩沖液，硼酸緩沖液，碳酸緩沖液，檸檬酸緩沖液，Tris緩沖液，谷氨酸緩沖液，ε-氨基己酸(aminocarproic)緩沖液等)，防腐劑(例如，對(duì)-羥苯甲酸甲酯，對(duì)羥苯甲酸乙酯，對(duì)-羥苯甲酸丙酯，對(duì)-羥苯甲酸丁酯，氯丁醇，苯甲醇，苯扎氯銨，脫氫乙酸鈉，乙二胺四乙酸鈉，硼酸，硼砂等)，增稠劑(例如，羥乙基纖維素，羥丙基纖維素，聚乙烯醇，聚乙二醇等)，穩(wěn)定劑(例如，亞硫酸氫鈉，硫代硫酸鈉，乙二胺四乙酸鈉，檸檬酸鈉，抗壞血酸，二丁基羥基甲苯等)，pH調(diào)節(jié)劑(例如，鹽酸，氫氧化鈉，磷酸，乙酸等)。此外，也可以使用諸如醇(例如，乙醇等)，多元醇(例如，丙二醇，聚乙二醇等)，或非離子表面活性劑(例如，聚山梨醇酯80，聚氧乙烯氫化蓖麻油50等)的適當(dāng)?shù)脑鋈軇?br> 在油性制劑的情況下，可將蓖麻油，大豆油等用作油性溶劑，并可將苯甲酸芐酯，苯甲醇等用作增溶劑。所得的可注射溶液通常填充于安瓿或小管中。在所述注射制劑中，HGF的含量一般調(diào)節(jié)為約0.0002-0.2W/V％，優(yōu)選為約0.001-0.1W/V％。優(yōu)選地可將諸如注射液的液體制劑在經(jīng)過冷凍保存或冷凍干燥去除水分后進(jìn)行保存。在使用之前，可將冷凍干燥的制劑在可注射用的蒸餾水中重新溶解。
在可口服給藥制劑的情況中，所述劑型包括，例如，片劑，粒劑，細(xì)粒劑，粉劑，膠囊，液劑，乳劑，懸劑，糖漿等。這些制劑可通過常規(guī)方法制備。在粒劑和片劑的情況中，可通過使用諸如賦型劑(例如，乳糖，白砂糖，葡萄糖，淀粉，結(jié)晶纖維素等)，潤滑劑(例如，硬脂酸鎂，滑石，硬脂酸，硬脂酸鈣等)，崩解劑(例如，淀粉，羧甲基纖維素鈉，碳酸鈣等)，粘合劑(例如，淀粉糊，羥丙基纖維素溶液，羧甲基纖維素溶液，阿拉伯樹膠溶液，明膠溶液，海藻酸鈉溶液等)等的藥用添加劑進(jìn)行制備。同樣，粒劑或片劑可用適當(dāng)?shù)陌聞?例如，明膠，白砂糖，阿拉伯樹膠，巴西棕櫚蠟等)，腸衣劑(例如，醋酸鄰苯二甲酸纖維素，甲基丙烯酸共聚物，鄰苯二甲酸羥丙基纖維素，羧甲基乙基纖維素等)等進(jìn)行包衣。
在膠囊的情況中，可以適當(dāng)?shù)剡x擇增強(qiáng)流動(dòng)性和潤滑性的諸如硬脂酸鎂，硬脂酸鈣，滑石和輕質(zhì)無水硅酸的公知賦型劑；在壓力下增加流動(dòng)性的結(jié)晶纖維素或乳糖；以及上述的崩解劑?？蓪GF與上述的賦型劑均勻地混合或成粒，或者可將所述顆粒用適當(dāng)?shù)陌聞┻M(jìn)行包衣，然后填充入膠囊中，或者可將所述顆粒用加入甘油，山梨醇等賦予塑性增加的膠囊基質(zhì)(例如，明膠)進(jìn)行封裝。如果需要，可向所述膠囊制劑中加入著色劑或防腐劑(例如，二氧化硫，對(duì)-羥苯甲酸甲酯，對(duì)羥苯甲酸乙酯，對(duì)-羥苯甲酸丙酯，對(duì)-羥苯甲酸丁酯等)。除了常規(guī)的膠囊制劑，所述膠囊制劑還可采用腸衣膠囊，抗胃酸的膠囊，控釋膠囊等形式。
在腸衣膠囊制劑的情況下，將用腸衣劑包衣的HGF，或加入了適當(dāng)賦型劑的HGF填充至常規(guī)的膠囊中?；蛘?，可將HGF單獨(dú)，或加入了上述適當(dāng)賦型劑的HGF封裝入腸衣膠囊，或封裝入由含有腸聚合物的基質(zhì)材料形成的膠囊中。
在糖漿的情況中，可適當(dāng)?shù)倪x擇并使用穩(wěn)定劑(例如，乙二酸四乙酸鈉等)，懸劑(例如，阿拉伯樹膠，羧甲基纖維素等)，矯正劑(例如，簡單糖漿，葡萄糖等)，香味劑等。
此外，可使用常規(guī)的栓劑基質(zhì)(例如，可可脂，月桂油，甘油明膠，大粒凝膠(macrpgol)，Witepsol等)通過常規(guī)的配置方法等制備栓劑。
再者，可采用常規(guī)的配制方法生產(chǎn)吸入制劑。在吸入制劑的配制中，可以采用任意的添加劑，只要其通常被應(yīng)用于吸入制劑中。例如，除了促進(jìn)劑，還可以使用以上所述的賦型劑，粘合劑，潤滑劑，防腐劑，穩(wěn)定劑，等滲劑，pH調(diào)節(jié)劑和矯正劑(例如，檸檬酸，薄荷醇，甘草酸銨，甘氨酸，香料等)。作為促進(jìn)劑，液化氣體促進(jìn)劑，壓縮氣體等也可以使用。液化氣體促進(jìn)劑包括，例如，諸如選擇性的含氯氟烴(例如，HCFC-22，HCFC-123，HCFC-134a，HCFC-142等)，液化石油醚，二甲醚等的氟化烴。所述壓縮氣體包括，例如，可溶性氣體(例如，二氧化碳?xì)怏w，一氧化二氮?dú)怏w等)和惰性氣體(例如氮?dú)獾?。
此外，用于本發(fā)明中的HGF可與生物可降解的聚合物一起配制成緩釋制劑。在HGF的緩釋制劑中，可以期待維持血液水平，減少給藥頻率，緩解副作用等的效果。可以根據(jù)，例如，在藥物傳遞系統(tǒng)(DrugDelivery System)第3章1986(CMC出版，日本)中描述的常規(guī)方法制備這種緩釋制劑。用于本發(fā)明的生物可降解聚合物可適當(dāng)?shù)貜墓纳锟山到饩酆衔镏羞x擇，其包括，例如，多糖(例如，淀粉，葡聚糖，脫乙酰殼多糖等)，蛋白質(zhì)(例如，膠原，明膠等)，聚氨基酸(例如，聚谷氨酸，聚賴氨酸，聚亮氨酸，聚丙氨酸，聚甲硫氨酸等)，聚酯(例如，聚乳酸，聚乙醇酸，乳酸/乙醇酸聚合物或共聚物，聚己酸內(nèi)酯，聚β-羥基丁酸，聚蘋果酸，聚酸酐，延胡索酸-聚乙二醇-乙烯吡咯烷酮共聚物等)，聚(原酸酯)，聚烷基氰基丙烯酸(例如，聚甲基-α-氰基丙烯酸等)，聚碳酸酯(例如，聚碳酸亞乙基酯，聚碳酸亞丙基酯等)，其中優(yōu)選聚酯，并更優(yōu)選聚乳酸，乳酸/乙醇酸聚合物或共聚物。當(dāng)使用聚乳酸/乙醇酸聚合物或共聚物時(shí)，在為期兩周至三個(gè)月的緩釋時(shí)間，優(yōu)選為兩周至一個(gè)月的情況中，乳酸/乙醇酸的成分比(mol％)為約100/0-50/50，盡管這樣的比例會(huì)隨緩釋時(shí)間的變化而變化。這些聚乳酸/乙醇酸聚合物或共聚物的平均分子量通常為5,000-20,000?？蓞⒄展姆椒?，例如JP-A-28521/1986描述的方法，制備聚乳酸/乙醇酸均聚物或共聚物。雖然對(duì)HGF與生物可降解聚合物的混合比例沒有限制，但一般而言，所使用的HGF與所述生物可降解聚合物的比例為約0.01W/W％至30W/W％。
根據(jù)所述劑型，適應(yīng)癥，疾病的程度，年齡等等，可對(duì)上述制劑中的HGF含量進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)。
本發(fā)明的分化誘導(dǎo)劑可包含適當(dāng)?shù)钠渌幱没钚猿煞?，只要這些成分不與本發(fā)明的目的相抵觸。這些活性成分的實(shí)例包括，例如，抗膽堿能藥物(例如，異丙托溴銨(ipratropium bromide)，氟托溴銨(flutropium bromide)，氧托溴銨(oxitropium bromide)，噻托溴銨(tiotropium bromide)等)，吸入性β2興奮劑(例如，非諾特羅(fenoterol)，沙丁胺醇(sabutamol)，福莫特羅(formoterol)，沙美特羅(salmeterol)等)，吸入型類固醇(例如，倍氯米松(beclomethasone)，氟替卡松(fluticasone)，布地奈德(budesonide)等)，平喘藥(例如，膽茶堿(theophylline)，丙卡特羅(procaterol)，酮替芬(ketotifen)，氮卓斯汀(azelastine)等)，抗過敏藥(例如，酮替芬(ketotifen)，特非那定(terfenadine)，氮卓斯汀(azelastine)，依匹那丁等(epinastine))，抗炎藥(例如，雙氯滅痛(diclofenac sodium)，布洛芬(ibuprofen)，茚甲新(indomethacin)等)，抗生素(例如，頭孢甲肟(cefmenoxime)，頭孢地尼(cefdinir)，氧氟沙星(ofloxacin)，tosfloxacin，氟哌酸(norfloxacin)等)，抗真菌藥(例如，氟康唑(fluconazole)，伊曲康唑(itraconazole)等)，等等。同樣，含有這些藥物活性成分的制劑可以與本發(fā)明的制劑組合使用。只要可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，對(duì)這些藥物活性成分就沒有限制，且可以適當(dāng)?shù)幕旌媳壤蚪M合比例對(duì)這些活性成分進(jìn)行使用。
根據(jù)其劑型，可通過適當(dāng)?shù)亟o藥途徑對(duì)本發(fā)明的分化誘導(dǎo)劑進(jìn)行給藥。例如，可通過靜脈內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，皮下或肌內(nèi)等途徑進(jìn)行注射給藥。注射劑量為通常基于HGF為0.001mg至1000mg，優(yōu)選0.01mg至100mg，其可以通過分開的方式，以每天一次或每天幾次的方式進(jìn)行適當(dāng)給藥，盡管可根據(jù)患者的病癥，年齡，體重等進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)。
本發(fā)明的分化誘導(dǎo)劑可用于誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成肺泡細(xì)胞。至于骨髓細(xì)胞，任意哺乳動(dòng)物包括人類的骨髓細(xì)胞都可以使用，盡管優(yōu)選地是使用游走的骨髓細(xì)胞。例如，可通過公知的方法收獲人骨髓細(xì)胞，將其懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中，接種于塑料培養(yǎng)皿中，并進(jìn)行培養(yǎng)從中僅收集游走細(xì)胞。隨后，將所述游走的骨髓細(xì)胞與本發(fā)明的分化誘導(dǎo)劑共培養(yǎng)。至于細(xì)胞培養(yǎng)液，可以使用常規(guī)的培養(yǎng)液，例如，DMEM，MEM，RPMI1640，IMDM等。盡管可以向上述的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入諸如胎牛血清的常用于細(xì)胞培養(yǎng)的添加劑，從移植免疫學(xué)的方面考慮優(yōu)選使用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液。在分化誘導(dǎo)劑中，HGF的濃度為約1ng/mL至約100ng/mL。培養(yǎng)條件采用的是在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中的條件，例如，在約35℃±2℃，5％二氧化碳存在的條件。將如此培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞培養(yǎng)一至五周，使其分化成肺泡細(xì)胞。根據(jù)以上獲得的來自骨髓細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的肺泡細(xì)胞可用作器官移植所需要的細(xì)胞。更具體地，通過給患者靜脈內(nèi)注射從肺氣腫患者的骨髓細(xì)胞分化和增殖而來的肺泡細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)向肺的移植。根據(jù)這一過程，有可能從患者本身的骨髓細(xì)胞獲得大量肺氣腫患者所需要移植的肺泡細(xì)胞。
此外，還有另一實(shí)施方案，包括培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，將所獲得的增殖、未分化的骨髓細(xì)胞作為用于移植的細(xì)胞，以及給受體施用本發(fā)明的分化誘導(dǎo)劑。根據(jù)本發(fā)明，由于從肺氣腫患者收集的少量骨髓細(xì)胞被培養(yǎng)和增殖，并且大量所得的骨髓細(xì)胞可在施用本發(fā)明的分化誘導(dǎo)劑的同時(shí)返回患者，因此可在患者體內(nèi)有效地發(fā)生所移植的骨髓細(xì)胞向肺泡細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。
至于那些用于上述適應(yīng)性移植中的骨髓細(xì)胞，從移植免疫學(xué)的角度考慮，優(yōu)選那些從待移植的個(gè)體自身收集來的細(xì)胞。
近年來，已有關(guān)于使用HGF進(jìn)行基因治療的報(bào)道(參見Circulation，1997，vol.96，No.3459；Nature Medicine，1999，vol.5，p.226-230；Circulation，1999，vol.100，No.1672；Gene Therapy，2000，vol.7，p.417-427)，并建立了這種基因治療的技術(shù)。本發(fā)明包括基因治療制劑，包括為了肺泡的再生或形成以及為了誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成肺泡細(xì)胞，導(dǎo)入HGF基因，以及施用以上所述的HGF。下文，將對(duì)HGF基因治療進(jìn)行詳細(xì)描述。
在本文中，“HGF基因”是指能夠表達(dá)HGF的基因。更具體地，本發(fā)明列舉了一種基因，其中HGF的cDNA被整合入合適表達(dá)載體(非病毒載體，病毒載體)中，如非專利文獻(xiàn)2；日本專利2,777,678；Biochem.Biophys.Res.Commun.，1989，vol.163，p.967；或Biochem.Biophys.Res.Commun.，1990，vol.172，p.321.所述。編碼HGF的cDNA堿基序列在以上文獻(xiàn)中已有描述，且也在諸如Genebank的數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行了注冊(cè)。根據(jù)以上序列數(shù)據(jù)，例如，可以通過使用適當(dāng)?shù)腄NA片段作為PCR引物，對(duì)來自肝臟等的mRNA進(jìn)行RT-PCR，從而進(jìn)行HGF的cDNA克隆。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員基于諸如Molecular Cloning，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版(1989)的基礎(chǔ)書籍可以很容易完成這樣的克隆。
此外，用于本發(fā)明中的HGF不僅限于上述的基因，任意的HGF基因都可以用作本發(fā)明的HGF基因，只要其表達(dá)與HGF具有基本相同活性的蛋白質(zhì)。換言之，在可與上述cDNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的DNA，和編碼由上述cDNA所編碼的氨基酸序列中一至多個(gè)氨基酸(優(yōu)選幾個(gè)氨基酸)被替換，缺失，添加和/或插入的蛋白質(zhì)的DNA中，任意編碼具有HGF活性的蛋白的DNA都包含在本發(fā)明所使用的HGF基因的范圍中。這樣的DNA可方便地通過常規(guī)的雜交方法，PCR方法等獲得，尤其是參考諸如以上所述的Molecular Cloning的基礎(chǔ)文獻(xiàn)。
應(yīng)用于本發(fā)明中HGF基因可采用與上述HGF蛋白相同的方式，用來再生或形成肺泡細(xì)胞以及誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成肺泡細(xì)胞。
當(dāng)給患者施用含有作為活性成分的HGF基因的基因治療劑時(shí)，可以采用諸如在Basic Technology of Gene Therapy，Separate Volume ofExperimental Medicine published by Yodosha，，日本，1996；GeneIntroduction and Expression Analysis Method，Separate Volume ofExperimental Medicine，Yodosha出版，日本，1997；Gene TherapyDevelopment Research Handbook，The Japan Society of Gene Therapy編，NTS出版，日本，1999中描述的常規(guī)方式進(jìn)行這種施用。
劑型可包括多種適用于上述每種給藥方式的公知形式。根據(jù)患者的目標(biāo)疾病，年齡和體重等，可以對(duì)所述制劑中的DNA含量進(jìn)行適當(dāng)?shù)目刂?，通常，本發(fā)明中的DNA含量為0.0001至100mg，優(yōu)選為0.001至10mg。
此外，HGF基因和HGF可以各自獨(dú)立地使用或組合使用。
下面，通過以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但并非是對(duì)本發(fā)明的限制。除非另有說明，百分?jǐn)?shù)(％)是指重量百分?jǐn)?shù)％。
實(shí)施例骨髓的重建在日本大阪大學(xué)，建立了轉(zhuǎn)有增強(qiáng)綠色熒光蛋白(GFP)的C57BL/6轉(zhuǎn)基因小鼠品系。根據(jù)Morishita等人在Hypertension，1999，vol.33，p.1379-1384中的描述，將收集到的13.5天GFP胚胎的胎肝的肝細(xì)胞移植入在移植前用12Gy劑量輻射過的C57BL/6雄性小鼠體內(nèi)。移植三周之后，超過95％的循環(huán)白細(xì)胞(外周白細(xì)胞)都完全被GFP小鼠來源的骨髓細(xì)胞所替換的那些小鼠被用作該實(shí)驗(yàn)中的受體小鼠。
肺氣腫的誘導(dǎo)和治療向受體小鼠鼻內(nèi)灌注豬胰腺彈性蛋白酶誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性的肺氣腫。彈性蛋白酶灌注三周之后，受體小鼠在其肺部表現(xiàn)出了氣腫性變化。此時(shí)，將誘導(dǎo)成肺氣腫的受體小鼠隨機(jī)分成兩組，即介質(zhì)給藥組和HGF給藥組，對(duì)這兩組小鼠分別腹膜內(nèi)注射均衡飲食和每天一次，每次1mg/kg的劑量的HGF，共12天。
組織學(xué)解剖在20cm H2O的壓力下，用4％的低聚甲醛-PBS(磷酸緩沖鹽水)對(duì)所述受體小鼠的肺進(jìn)行固定，根據(jù)常規(guī)方法制備石蠟切片。用蘇木精-曙紅(HE)對(duì)石蠟切片染色。使用抗-GFP抗體(Abcam，劍橋，英國)檢測GFP并用3，3’-二氨基聯(lián)苯胺顯色。對(duì)從每只小鼠分離到的200個(gè)肺泡中GFP-陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(每組n＝5)。根據(jù)Thurlbeck的方法(參見，Ono，M.et.al，Circulation 2002，vol.106，p.1264-1269)，通過測定肺泡分隔得平均線性截距(下文中簡稱為Lm)對(duì)氣腫性損傷的程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。換言之，在400倍放大倍數(shù)下，對(duì)每只小鼠兩張載玻片上的20個(gè)隨機(jī)取的視野中肺泡細(xì)胞的Lm進(jìn)行測定?？偟木嚯x除以肺泡截距的數(shù)量得到Lm。由三位觀察者(K.I.，T.S.和H.K.)互盲(blindly)進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。
可對(duì)冷凍切片進(jìn)行免疫熒光染色來鑒定GFP-陽性細(xì)胞的表型。從Chemicon(Temecula，CA，USA)購買了抗細(xì)胞角蛋白5和8抗體，從Pharmingen(San Diego，CA，USA)購買抗-CD34和抗-CD45抗體。
統(tǒng)計(jì)分析所述數(shù)據(jù)表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用方差分析進(jìn)行比較，并且當(dāng)總差異得以確定之時(shí)，將利用Bonferroni校正的多重比較用來鑒定哪一組具有顯著性差異。統(tǒng)計(jì)顯著性定義為p＜0.05。
結(jié)果使用光學(xué)顯微鏡對(duì)組織切片進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在患有彈性蛋白酶誘導(dǎo)的肺氣腫受體小鼠的肺泡被破壞，與未使用彈性蛋白酶處理的小鼠相比，每個(gè)肺泡都擴(kuò)大約3-5倍。在另一方面，在HGF給藥組中的肺泡與沒有彈性蛋白酶處理組的肺泡幾乎相同(參見圖1)。在肺氣腫誘導(dǎo)的受體小鼠中的平均線性截距如圖2所示。患有彈性蛋白酶誘導(dǎo)的肺氣腫的受體小鼠的平均線性截距增大了約1.7倍，而與未進(jìn)行彈性蛋白酶處理組相比，HGF給藥組中的平均線性截距幾乎相同。
受體小鼠肺中GFP陽性肺泡與總肺泡的比率如圖3所示。沒有進(jìn)行彈性蛋白酶處理的受體小鼠的GFP陽性細(xì)胞的比率為約1％。彈性蛋白酶誘導(dǎo)的肺氣腫受體小鼠的GFP陽性細(xì)胞的比率增加約10％，而HGF給藥組的該比率增加了約17.5％。此外，免疫熒光染色得到的組織學(xué)觀察結(jié)果說明這些來自于GFP小鼠源骨髓細(xì)胞的GFP陽性細(xì)胞分化成了肺泡上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞。這些結(jié)果說明HGF能夠促進(jìn)誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成肺泡(肺泡上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞等)。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的分化誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成肺泡細(xì)胞，且可用作由于肺氣腫破壞等的肺泡的再生劑。而且，從骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的肺泡可用作再生藥物領(lǐng)域中用于移植的細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.用于誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成肺泡細(xì)胞的制劑，包含肝細(xì)胞生長因子。
2.權(quán)利要求1的分化誘導(dǎo)制劑，其中的肺泡細(xì)胞為肺泡上皮細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1或2的分化誘導(dǎo)制劑，其是用于促進(jìn)肺泡再生/形成的制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有HGF用于誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成肺泡細(xì)胞的制劑。本發(fā)明還提供了在肺泡被破壞的肺氣腫等等情況中用于肺泡形成的含有HGF的制劑。
文檔編號(hào)A61K38/20GK1929854SQ200580007430
公開日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2005年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月9日
發(fā)明者久保裕司, 石沢興太, 佐佐木英忠, 中村敏一 申請(qǐng)人:株式會(huì)社東北宏橋技術(shù), 克霖固魯制藥股份有限公司